BR112021009432A2 - aparelho autônomo e sistema para a detecção de micro-organismos. - Google Patents

Abstract

APARELHO AUTÔNOMO E SISTEMA PARA A DETECÇÃO DE MICROORGANISMOS. São aqui divulgados dispositivos, métodos, e sistemas para a rápida detecção de micro-organismos utilizando um bacteriófago recombinante. A especificidade dos bacteriófagos recombinantes para ligação aos micro-organismos permite a detecção direcionada e altamente específica de um micro-organismo de interesse.

Description

APARELHO AUTÔNOMO E SISTEMA PARA A DETECÇÃO DE MICRO- ORGANISMOS REFERÊNCIA CRUZADA PARA O PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica a prioridade dos pedidos provisórios nos Estados Unidos no. US 62/777.473, depositado em 10 de dezembro de 2018, e US 62/798.980, depositado em 30 de janeiro de 2019. As divulgações dos pedidos de patente nos Estados Unidos no. US 13/773.339, 14/625.481, 15/263.619, 15/409.258, 16/298.695 e os pedidos provisórios nos Estados Unidos no. US 62/616.956, 62/628.616, 62/661.739, 62/640.793, e 62/798.980 são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A invenção se refere um métodos, aparelhos, dispositivos, e sistemas para a detecção de micro-organismo de interesse utilizando bacteriófagos recombinantes.

ANTECEDENTES

[0003] Há um grande interesse em melhorar a rapidez e a sensibilidade para a detecção de bactérias, vírus, e outros micro-organismos em amostras biológicas, de alimentos, de água e clínicas. Patógenos microbianos podem causar morbidade substancial entre humanos e animais domésticos, bem como imensa perda econômica. A detecção de micro- organismos é uma alta prioridade para a Administração de Alimentos e Fármacos (em inglês, Food and Drug Administration - FDA) e Centros de Controle de Doenças (em inglês, Centers for Disease Control - CDC) devido a surtos de doenças com risco de vida ou fatais causadas pela ingestão de alimentos contaminados com determinados micro-organismos, por exemplo, Staphylococcus spp., Escherichia coli ou Salmonella spp.

[0004] Os testes microbiológicos tradicionais para a detecção de bactérias contam com culturas de enriquecimento não seletivo e seletivo seguido de plaqueamento em meios seletivos e testes adicionais para a confirmação de colônias suspeitas. Os referidos procedimentos podem levar diversos dias. Uma variedade de métodos rápidos foram investigados e introduzidos na prática para reduzir a exigência de tempo. No entanto, até o momento, os métodos que reduzem a exigência de tempo apresentam desvantagens. Por exemplo, técnicas que envolvem imunoensaios diretos ou sondas de genes geralmente requerem uma etapa de enriquecimento durante a noite para obter a sensibilidade adequada e, portanto, não apresentam a capacidade de fornecer resultados no mesmo dia. Os testes de reação em cadeia da polimerase (PCR) também incluem uma etapa de amplificação e, portanto, são capazes de ambas sensibilidade e seletividade muito altas; no entanto, o tamanho da amostra que pode ser economicamente submetida ao teste de PCR é limitado. Suspensões de bactérias diluídas capazes de serem submetidas a PCR estarão livres de células e, portanto, etapas de purificação e / ou enriquecimento demoradas ainda são necessárias.

[0005] O tempo requerido para o enriquecimento biológico tradicional é ditado pela taxa de crescimento da população bacteriana alvo de uma amostra, pelo efeito de uma matriz de amostra e pela sensibilidade requerida. Na prática, a maioria dos métodos de alta sensibilidade emprega uma incubação durante a noite e leva cerca de 24 horas no total. Devido ao tempo requerido para o cultivo, esses métodos podem levar até três dias, dependendo do organismo a ser identificado e da origem da amostra. Esse intervalo de tempo é geralmente inadequado, uma vez que esses atrasos permitem que alimentos, água ou outros produtos contaminados cheguem ao gado ou aos humanos. Além disso, os aumentos nas bactérias resistentes a antibióticos e considerações sobre a biodefesa tornam a identificação rápida de bactérias patogênicas em amostras de água, alimentos e clínicas prioridades críticas em todo o mundo.

[0006] Sendo assim, existe uma necessidade de detecção e identificação mais rápida, simples e sensível de micro- organismos, tais como bactérias e outros micro-organismos potencialmente patogênicos.

SUMÁRIO

[0007] Modalidades da invenção compreendem dispositivos, composições, métodos, aparelhos, sistemas, e kits para a detecção de micro-organismos. A invenção pode ser incorporada de diversas maneiras.

[0008] Aspectos da invenção compreendem dispositivos para facilitar a facilidade e simplicidade de detecção dos micro-organismos. São aqui descritos um aparelho ou dispositivo para a realização de um ensaio para detectar um micro-organismo em uma amostra teste utilizando bacteriófago recombinante.

[0009] Em um aspecto, a presente invenção utiliza a alta especificidade de bacteriófago que pode se ligar um micro-organismos para detectar níveis baixos de um micro- organismo. Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar. Em outras modalidades, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos. Em algumas modalidades, a amostra não é enriquecida antes da incubação com bacteriófago recombinante.

[0010] Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante é geneticamente modificado para incluir um gene repórter tal como previamente descrito. Em modalidades adicionais o bacteriófago recombinante é derivado de bacteriófago específico para o micro-organismo a ser detectado. Por exemplo, o bacteriófago recombinante pode ser derivado de qualquer um dos seguintes bacteriófagos: fago de Salmonella SPN1S, fago de Salmonella 10, fago de Salmonella epsilon15, fago de Salmonella SEA1, fago de Salmonella Spn1s, fago de Salmonella P22, fago de Listeria LipZ5, fago de Listeria P40, fago de Listeria vB_LmoM_AG20, fago de Listeria P70, fago de Listeria A511, fago de Staphylococcus P4W, fago de Staphylococcus K, fago de Staphylococcus Twort, fago de Staphylococcus SA97 ou fago de Escherichia coli O157:H7 CBA120.

[0011] Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser estabilizado ou preservado. Por exemplo, o bacteriófago recombinante pode ser liofilizado.

[0012] Em determinadas modalidades, o gene repórter classifica uma porção indicadora. Em determinadas modalidades a porção indicadora pode gerar um sinal intrínseco. Em outras modalidades, a porção indicadora compreende uma enzima que gera um sinal quando reage com um substrato. Ainda em outras modalidades, a porção indicadora compreende um cofator que gera sinal quando reage com um ou mais sinais adicionais que produzem componentes. Por exemplo, a porção indicadora compreende pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima. A enzima pode compreender pelo menos um de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase. O gene da luciferase pode ser de um gene de ocorrência natural, tal como luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, ou luciferase de Renilla, ou ela pode ser um gene geneticamente projetado.

[0013] Algumas modalidades da invenção compreendem um dispositivo ou aparelho para realizar o método de detecção. Em algumas modalidades, um dispositivo pode incluir compartimentos separados. Em algumas modalidades, os compartimentos separados de um dispositivo podem ser configurados para permitir que um usuário combine os conteúdos de diferentes compartimentos em diversos estágios do método de detecção. Por exemplo, a amostra a ser testada pode ser combinada com um bacteriófago em um compartimento e permitido incubar por algum período de tempo antes de ser adicionado ao conteúdo de outro compartimento do dispositivo, tal como um substrato. Nas referidas modalidades o substrato pode reagir com qualquer repórter (ou porção indicadora) produzida como um resultado de infecção pelo bacteriófago recombinante (por exemplo, se o micro-organismo alvo está presente na amostra).

[0014] Algumas modalidades incluem um dispositivo compreendendo um primeiro compartimento compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; e um segundo compartimento compreendendo um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal facilita a detecção do produto do gene indicador produzido como um resultado da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um substrato e o gene indicador que codifica uma enzima. Em algumas modalidades, a enzima é uma luciferase.

[0015] Em algumas modalidades, o aparelho compreende um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante, uma entrada / portal para adição de uma porção de uma amostra teste ao bacteriófago recombinante, e um segundo compartimento compreendendo um substrato ou outro reagente pareado e em que o método ainda compreende adicionar a substância do segundo compartimento à amostra, simultaneamente com ou após a adição do bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, em que o aparelho compreende um terceiro compartimento. O terceiro compartimento pode, por exemplo, compreender meio de crescimento para enriquecimento de uma amostra. Em outras modalidades, o aparelho está livre de meio.

[0016] Em algumas modalidades, o aparelho ainda compreende um segundo compartimento compreendendo um substrato, e em que a detecção do produto do gene indicador é por colocar em contato o produto do gene indicador com um substrato. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um grânulo. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), ácido poli láctico (PLA) e cloreto de polivinila (PVC). Em algumas modalidades, o suporte sólido é secado antes de colocar em contato a amostra. Em algumas modalidades, o suporte sólido é embebido em meio antes de colocar em contato a amostra. Em algumas modalidades, o suporte sólido que capturou o um ou mais organismos é incubado com o meio de crescimento no terceiro compartimento antes de colocar em contato com o bacteriófago recombinante.

[0017] Em algumas modalidades, o suporte sólido é revestido com um componente de ligação com a célula que se liga com alta afinidade ao micro-organismo de interesse na amostra. Isto permite que mais bactérias se liguem ao suporte sólido e aumentar a sensibilidade e especificidade do ensaio. Em outras modalidades, o suporte sólido é revestido com um anticorpo capaz de se ligar ao micro-organismo de interesse.

[0018] Em algumas modalidades, o primeiro compartimento compreende uma selagem, e em que colocar em contato o bacteriófago recombinante com a amostra é por rompimento da selagem, em que o rompimento da selagem faz com que o bacteriófago recombinante do primeiro compartimento esteja em contato com a amostra e infecte o um ou mais micro-organismos na amostra, assim produzindo o produto do gene indicador (proteína indicadora). Em modalidades adicionais, o aparelho compreende um bloqueio para a mistura faseada do meio, o bacteriófago recombinante, e o substrato com a amostra.

[0019] Em algumas modalidades, o produto do gene indicador compreende pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima. Em algumas modalidades, a enzima compreende pelo menos um de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase. Em algumas modalidades, a luciferase é um gene da luciferase geneticamente projetada. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de alimento, meio ambiente, água, amostra comercial ou clínica.

[0020] Em outro aspecto, o método para a detecção de um ou mais micro-organismos de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: colocar a amostra em contato com um suporte sólido de um aparelho, em que o suporte sólido captura o um ou mais micro-organismos na amostra, se presente, em que o aparelho compreende: um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; colocar em contato o bacteriófago recombinante do primeiro compartimento com a amostra de tal modo que o bacteriófago recombinante infecte o um ou mais micro-organismos na amostra, assim produzindo o produto do gene indicador, e detectando o produto do gene indicador.

[0021] Em algumas modalidades, o método compreendendo incubar o suporte sólido que capturou o um ou mais micro- organismos de interesse no meio de crescimento por um período de tempo antes de adicionar o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, a incubação é de 0 - 2 horas. Em algumas modalidades, em que o bacteriófago tenha sido colocado em contato com a amostra por 0.5 - 3 horas antes da detecção do produto do gene indicador.

[0022] Em algumas modalidades, o método detecta tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar. Em algumas modalidades, a amostra compreende carne ou vegetais. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de alimentos, água, laticínios, amostra ambiental, comercial ou clínica.

[0023] Em algumas modalidades, a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

[0024] Modalidades adicionais incluem sistemas e kits para a detecção de micro-organismos tal como Listeria, Salmonella, Staphylococcus, ou E. coli O157:H7, compreendendo um bacteriófago recombinante. Algumas modalidades ainda incluem um substrato para reagir com uma porção indicadora do bacteriófago recombinante. Esses sistemas ou kits podem incluir características descritas para o bacteriófago, composições, e métodos da invenção. Ainda em outras modalidades, a invenção compreende mídia legível por computador não transitória para uso com métodos ou sistemas de acordo com a invenção.

[0025] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um sistema para a detecção de micro-organismo de interesse em uma amostra compreendendo: um aparelho, que compreende: um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; e um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal pode detectar o produto do gene indicador produzido a partir da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um luminômetro portátil.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0026] A presente invenção pode ser melhor entendida ao se referir às figuras não limitativas a seguir.

[0027] A Figura 1 mostra uma modalidade de um método para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando um bacteriófago recombinante.

[0028] A Figura 2 mostra os resultados da detecção de uma cultura de L. monocytogenes utilizando uma modalidade de um aparelho autônomo com um swab como um suporte sólido. Os sinais que correspondem à presença das bactérias foi detectada por luminômetros Hygiena, GloMax e GloMax 20 / 20. A Tabela 1 mostra resultados a partir da cultura na fase log e a Tabela 2 mostra os resultados de uma cultura durante a noite.

[0029] A Figura 3A e 3B são gráficos gerados a partir de dados mostrados na Tabela 1. A Figura 3A mostra medidas de sinais detectadas utilizando Hygiena. Os swabs foram inoculados com células fase log no nível de UFC indicado. A amostra foi imediatamente infectada com coquetel de fagos de Listeria por 4 horas. O substrato foi adicionado e amostras foram lidas em um luminômetro Hygiena. Um sinal de > 10 RLU é considerado positivo. Com este método, aproximadamente

25.000 de UFC é requerido para gerar um resultado positivo.

[0030] A Figura 3B mostra as medidas de sinais detectados utilizando luminômetros GloMax 20 / 20 e GloMax (também conhecido como, GloMax 96). Os swabs foram inoculados com células na fase log no nível de UFC indicado. A amostra foi imediatamente infectada com coquetel de fago de Listeria por 4 horas. O substrato foi adicionado e amostras foram lidos tanto em um luminômetro GloMax 20 / 20 (1 mL de amostra)

ou GloMax (150 µl de amostra). Uma proporção sinal / fundo de > 3.0 é considerado positivo. Com este método, aproximadamente 5.000 UFC são requeridas para gerar um resultado positivo.

[0031] A Figura 4 mostra os resultados da detecção Salmonella em peru moído que tenha sido inoculado com Salmonella. A Tabela 3 mostra a amostra controle não inoculada, e a Tabela 4 mostra a amostra de peru inoculada. Os testes foram repetidos com tempos de incubação e de infecção variados.

[0032] A Figura 5A e a Figura 5B são gráficos gerados a partir de dados da Figura 4. A Figura 6A mostra que as amostras de peru inoculadas com Salmonella foram detectadas como positivas com cada tempo de incubação e de infecção testado. A amostra de peru foi cultivada por 24 horas a 41 ºC após a inoculação antes do teste com os métodos divulgados no pedido. Para o sinal relativo: incubação de 0HR, infecção de 2HR > incubação de 1HR, infecção de 0.5HR > incubação de 0HR, infecção de 0.5HR. Em adição, a comparação do sinal do RLU mostra que os luminômetros GloMax apresentam um sinal muito mais alto do que aquele do luminômetro Hygiena.

[0033] A Figura 5B mostra que a detecção utilizando luminômetros GloMax 20 / 20 e GloMax produziram proporções de sinal / fundo similar para as mesmas amostras. Embora o GloMax 20 / 20 apresentou um sinal melhor (Fig 5A), o fundo foi significativamente maior do que aquele com o GloMax. Então, quando da determinação do sinal / fundo, os dois luminômetros funcionam de forma similar.

[0034] A Figura 6 mostra os dados para a detecção de Salmonella em três amostras de peru (amostras 21, 24, e 26)

as quais foram inoculadas com Salmonella antes dos ensaios utilizando o aparelho autônomo. As amostras foram infectadas por diferentes tempo de duração tal como indicado antes da detecção do sinal.

[0035] As Figuras 7A - 7C são gráficos gerados a partir de dados mostrados na Figura 6. As Figuras 7A - 7C mostram resultados dos experimentos nos quais três amostras de peru moído inoculadas foram enriquecidas por 24 horas e amostras de swab foram tomadas e testadas. A amostra 24 (FIG. 7B) e 26 (FIG. 7C) não mostraram sinal no luminômetro portátil Hygiena para as amostras que apresentaram 30 min de infecção por fago, porém mostraram para amostra que apresentou infecção de 2 horas. O luminômetro GloMax 20 / 20 e GloMax gerou sinais relativamente baixos.

[0036] As Figuras 8A - 8C são gráficos gerados a partir dos dados mostrados na Figura 6. Os gráficos mostra ambos GloMax 20 / 20 e GloMax foram capazes de detectar a Amostra 21 (Figura 8A) e 26 (Figura 8B) como positivas com infecção de 30 minutos (proporção sinal / fundo de > 3.0 é positivo), no entanto a Amostra 24 (Figura 8C) requereu uma infecção de 2 horas para mostrar um resultado positivo. Os resultados do luminômetro GloMax 20 / 20 e GloMax foram similares.

[0037] A Figura 9 mostra os dados para a detecção de amostras de esponjas do meio ambiente L. monocytogenes a partir de superfícies inoculadas e enriquecidas por 24 horas.

[0038] A Figura 10 mostra a detecção de micro- organismos em amostras de peru inoculadas com Salmonella utilizando o aparelho. Os sinais foram medidos utilizando três diferentes luminômetros: GloMax, 3M, e Hygiena.

[0039] As Figuras 11A, 11B, e 11C mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de micro-organismos, apresentando um swab (Figura 11A) ou um grânulo (Figura 11B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento contém fago, o segundo compartimento contém substrato, e o terceiro compartimento contém meio. Em algumas modalidades o suporte sólido é um swab. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 11C).

[0040] As Figuras 12A, 12B e 12C mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de micro-organismos, apresentando um swab (Figura 12A) ou um grânulo (Figura 12B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento contém fago, o segundo compartimento contém meio, e o terceiro compartimento contém substrato. Após a incubação com o fago e meio, a selagem que separa o segundo e terceiro compartimentos pode ser rompida. Em algumas modalidades o suporte sólido é um swab. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 12C).

[0041] As Figuras 13A, 13B, e 13C mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de micro-organismos, apresentando um swab (Figura 13A) ou um grânulo (Figura 13B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento contém meio, o segundo compartimento contém fago, e o terceiro compartimento contém substrato. Em algumas modalidades o suporte sólido é um swab. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 13C).

[0042] As Figuras 14A, 14B, e 14C mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de micro-organismos, apresentando um swab (Figura 14A) ou um grânulo (Figura 14B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento contém meio, o segundo compartimento contém fago, e o terceiro compartimento contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de bloqueio para a mistura faseada dos reagentes. Em algumas modalidades o suporte sólido é um swab. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 14C).

[0043] As Figuras 15A, 15B, e 15C mostram uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para a detecção de micro-organismos, apresentando um swab (Figura 15A) ou um grânulo (Figura 15B) inserido dentro de um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada compartimento é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento contém meio, o segundo compartimento contém fago, e o terceiro compartimento contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de bloqueio para a mistura faseada de reagentes. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um swab. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 15C).

[0044] A Figura 16 mostra uma vista de uma modalidade de um sistema de aparelho autônomo para o sistema para a detecção de micro-organismos, apresentando um swab inserido dentro de um recipiente compreendendo dois compartimentos. Cada compartimento é separado por uma selagem de ação rápida.

O primeiro compartimento contém fago e o segundo compartimento contém substrato. Em algumas modalidades, o suporte sólido é um swab.

[0045] A Figura 17 mostra um diagrama de fluxo de uma modalidade utilizando um sistema de aparelho autônomo para a detecção de micro-organismos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[0046] A menos que aqui definido de outra forma, termos científicos e técnicos utilizados em conexão com a presente invenção deve apresentar os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que seja exigido de outra forma pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclaturas usadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química das proteína e do ácido nucleico e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. Os métodos e as técnicas conhecidos são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica, conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, tal como comumente realizado na técnica ou conforme descrito neste documento. As nomenclaturas usadas em conexão com os procedimentos de laboratório e técnicas aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica.

[0047] Os termos a seguir, a menos que indicado de outra forma, devem ser entendidos como apresentando os seguintes significados:

[0048] Tal como aqui utilizado, os termos “um”, “uma”, e “o / a” pode se referir a um ou mais a menos que especificamente indicado de outra forma.

[0049] O uso do termo “ou” é utilizado para significar “e / ou” a menos que explicitamente indicado para se referir a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas às alternativas e “e / ou”. Tal como aqui utilizado, “outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.

[0050] Ao longo deste pedido, o termo “cerca de” é utilizado para indicar que um valor inclui a variação inerente do erro para o dispositivo, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre as amostras.

[0051] O termo “suporte sólido” ou “suporte” significa uma estrutura que fornece um substrato e / ou superfície na qual biomoléculas pode ser ligadas. Por exemplo, um suporte sólido pode ser um poço de ensaio (isto é, tal como uma placa de micro titulação ou placa de múltiplos poços), ou o suporte sólido pode ser uma localização em um filtro, uma matriz, ou um suporte móvel, tal como um grânulo ou uma membrana (por exemplo, uma placa de filtro ou faixa de fluxo lateral).

[0052] O termo “indicador” ou “porção indicadora” ou “porção detectável” ou “biomolécula detectável” ou “repórter” ou “etiqueta” se refere a uma molécula que fornece um sinal que pode ser medido em um ensaio qualitativo ou quantitativo. Por exemplo, uma porção indicadora pode compreender uma enzima que pode ser usada para converter um substrato em um produto que pode ser medido. Uma porção indicadora pode ser uma enzima que catalisa uma reação que gera emissões bi luminescentes (por exemplo, luciferase, HRP, ou AP). Ou, uma porção indicadora pode ser um radioisótopo que pode ser quantificado. Ou, uma porção indicadora pode ser um fluoróforo. Ou, outras moléculas detectáveis podem ser utilizadas.

[0053] Tal como aqui utilizado, “bacteriófago” ou “fago” inclui um ou mais de uma pluralidade de vírus bacterianos. Nesta divulgação, os termos “bacteriófago” e “fago” incluem vírus tal como micobacteriófago (tal como para TB e paraTB), micófago (tal como para fungos), fago de micoplasma, e qualquer outro termo que se refira a um vírus que pode invadir bactérias, fungos, micoplasmas, protozoários, leveduras vivas e outros organismos microscópicos vivos e os utiliza para se replicar. Aqui, “microscópico” significa que a maior dimensão é um milímetro ou menos. Os bacteriófagos são vírus que evoluíram na natureza para usar bactérias como um meio de se replicar.

[0054] Tal como aqui utilizado, “enriquecimento da cultura”, “cultura para enriquecimento”, “cultivo para enriquecimento”, ou “cultura para enriquecimento”, se refere ao cultivo tradicional, tal como incubação em meio favorável à propagação de micro-organismos, e não deve ser confundido com outros possíveis usos da palavra “enriquecimento,” tal como enriquecimento para remoção de componente líquido de uma amostra para concentrar o micro-organismo nela contido,

ou outras formas de enriquecimento que não incluem facilitação tradicional da propagação do micro-organismo. A cultura para enriquecimento por períodos curtos de tempo pode ser empregadas em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, porém não é necessário e é por um período de tempo muito mais curto do que a cultura tradicional para enriquecimento, se é que é usado.

[0055] Tal como aqui utilizado “recombinante” se refere a modificações genéticas (isto é, ácido nucleico) tal como usualmente realizado em um laboratório para reunir material genético que de outra forma não seria encontrado. Este termo é aqui usado de forma intercambiável com o termo “modificado”.

[0056] Tal como aqui utilizado “RLU” se refere a unidades de luz relativa, conforme medido por um luminômetro (por exemplo, GLOMAX® 96) ou instrumento similar que detecta luz. Por exemplo, a detecção da reação entre a luciferase e um substrato apropriado (por exemplo, NANOLUC® com NANO- GLO®) é frequentemente reportado em RLU detectadas. Visão geral

[0057] A presente invenção utiliza a alta especificidade do bacteriófago recombinante que pode se ligar a um micro-organismo particular com alta afinidade para detectar a presença de e / ou quantificar o micro- organismo específico na amostra.

[0058] São aqui divulgados composições, métodos, kits, e sistemas que demonstram sensibilidade e velocidade surpreendente para a detecção de um micro-organismo de interesse nas amostras testes (por exemplo, amostras de alimento, água, laticínio, meio ambiente, amostras comerciais, clínicas, ou outras amostras biológicas) utilizando ensaios realizados sem a cultura para enriquecimento, ou em algumas modalidades com tempos de incubação mínimos durante os quais os micro-organismos podem potencialmente se multiplicar. Estas composições, métodos, kits, e sistemas permitem que a detecção de micro-organismos seja alcançada em um período de tempo mais curto do que se pensava ser possível.

[0059] As modalidades das composições, métodos, kits, e sistema da invenção pode ser aplicadas à detecção de uma variedade de micro-organismos (por exemplo, bactérias, fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não se limitando a, detecção de patógenos em amostras de alimentos, água, laticínios, amostras ambientais, comerciais, clínicas, ou outras amostras biológicas. As modalidades de detecção com base em bacteriófago recombinante aqui divulgadas podem ser adaptadas a quaisquer bactérias ou outros micro-organismos de interesse (por exemplo, micro-organismos patogênicos) para os quais um bacteriófago específico está disponível o qual não reconhece os micro-organismos para os quais a detecção não é de interesse. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade e especificidade de detecção rapidamente e sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo). Logo, uma variedade de micro-organismos pode ser detectada utilizando os métodos da invenção.

[0060] As modalidades dos métodos e sistemas da invenção pode ser aplicadas à detecção e quantificação de uma variedade de micro-organismos (por exemplo, bactérias,

fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não se limitando a, detecção de patógenos em amostras de alimentos, água, laticínios, amostras ambientais, comerciais, clínicas, ou outras amostras biológicas. Os métodos da presente invenção pode rapidamente fornecer uma detecção de alta sensibilidade e especificidade sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo), o qual é um aspecto surpreendente uma vez que todos os métodos disponíveis com a sensibilidade e especificidade desejada requerem cultivo.

[0061] São também aqui divulgados sistemas e métodos que utilizam um aparelho para detectar os micro-organismos nas amostras testes (por exemplo, amostras de alimentos, água, laticínios, amostras ambientais, comerciais, clínicas, ou outras amostras biológicas). O método utiliza um aparelho autônomo o qual compreende um suporte sólido, o qual pode ser utilizado para coletar a amostra. O aparelho ainda compreende um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago apresentando um constructo genético inserido dentro do genoma do bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador. O método compreende colocar em contato o bacteriófago recombinante do primeiro compartimento com a amostra de tal modo que o bacteriófago recombinante infecta um ou mais micro- organismos na amostra assim produzindo um produto do gene indicador (“indicador”), e detectando o indicador. Em alguns aspectos, o aparelho ainda compreende um segundo compartimento, o qual contém um substrato específico para a detecção do indicador. Em algumas modalidades, o método ainda compreende colocar em contato a amostra a qual foi infectada pelo bacteriófago com o substrato, assim detectando o indicador. Nestas modalidades, cada compartimento é separado do compartimento imediatamente adjacente por uma selagem de ação rápida, a qual, quando rompida, permite que o conteúdo dos compartimentos saia do compartimento e se misture com o conteúdo da amostra ou conteúdos de outros compartimentos. Por exemplo, um usuário pode romper a selagem de ação rápida de tal modo que o bacteriófago recombinante do primeiro compartimento entre em contato com a amostra no suporte sólido, assim infectando os micro-organismos que se ligam na mesma. Quando da infecção dos micro-organismos, o gene indicador é expresso para produzir uma proteína indicadora, a qual pode ser detectada por diversos dispositivos de detecção. A presença dos sinais indica a presença dos micro- organismos na amostra.

[0062] Modalidades do aparelho, composições, métodos, kits, e sistema da invenção pode ser aplicados à detecção de uma variedade de micro-organismos (por exemplo, bactérias, fungos, leveduras) em uma variedade de circunstâncias, incluindo, porém não se limitando a, detecção de patógenos em amostras de alimentos, água, laticínios, amostras ambientais, comerciais, clínicas, ou outras amostras biológicas. As modalidades de detecção aqui divulgadas podem ser adaptadas para quaisquer bactérias ou outros micro- organismos de interesse (por exemplo, micro-organismos patogênicos) para os quais um bacteriófago específico recombinante está disponível o qual não reconhece outros micro-organismos os quais não são de interesse. Os métodos da presente invenção fornecem alta sensibilidade e especificidade de detecção rapidamente e sem a necessidade de enriquecimento biológico tradicional (por exemplo, cultivo). Isto é um aspecto surpreendente uma vez que todos os métodos disponíveis com a sensibilidade e especificidade desejada requerem cultivo. A detecção de micro-organismos em uma amostra utilizando o aparelho autônomo, o qual hospeda reagentes requeridos para a detecção do micro-organismo em compartimentos separados até o momento da detecção, é conveniente e eficiente. O aparelho é fácil de utilizar e não requer treinamento extensivo. Amostras

[0063] Cada uma das modalidades das composições, métodos, kits, e sistemas da invenção permite a rápida detecção e / ou quantificação de micróbios em uma amostra. Por exemplo, métodos de acordo com a presente invenção pode ser realizados em período de tempo encurtado com resultados superiores.

[0064] Em determinadas modalidades, um bacteriófago recombinante é usado para detectar micro-organismos de interesse. Os micro-organismos os quais podem ser detectados pelas composições, métodos, kits e sistemas da presente invenção incluem patógenos que são de interesse comercial, médico ou veterinário. Qualquer micro-organismo para o qual um bacteriófago recombinante específico para o micróbio particular foi identificado pode ser detectado pelos métodos da presente invenção. Aqueles com habilidades na técnica apreciarão que não há limite para a aplicação dos presentes métodos além da disponibilidade dos pares de bacteriófago recombinante / micróbio necessários.

[0065] Células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, células bacterianas as quais são patógenos de origem alimentar ou hídrica. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, todas as espécies de Salmonella, todas as cepas de Escherichia coli, incluindo, porém não limitadas a E. coli O157:H7 (e outras toxinas Shiga - e cepas produtoras de enterotoxinas de E. coli), todas as espécies de Listeria, incluindo, porém não limitadas a L. monocytogenes, e todas as espécies de Campylobacter. As células bacterianas detectáveis pela presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, células bacterianas as quais são patógenos de significado médico ou veterinário. Os referidos patógenos incluem, porém não estão limitados a, Bacillus spp., Bordetella pertussis, Brucella spp., Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Enterobacter spp., Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei, Yersinia spp., Vibrio spp. Staphylococcus aureus, e Streptococcus spp.

[0066] A amostra pode ser uma amostra ambiental ou de comida ou de água. Algumas modalidades podem incluir amostras médicas ou veterinárias. As amostras podem ser líquida, sólida, ou semissólida. As amostras podem ser swabs de superfícies sólidas. As amostras podem incluir materiais ambientais, tal como amostras de água, ou os filtros a partir de amostras de ar, ou amostras de aerossol a partir de coletores do tipo ciclone. As amostras podem ser de carne bovina, aves, alimentos processados, leite, queijo, ou outros laticínios. As amostras médicas ou veterinárias incluem, porém não estão limitadas a, amostras de sangue,

expectoração, líquido cefalorraquidiano e fecal. Em algumas modalidades, as amostras pode ser diferentes tipos de swabs.

[0067] Em algumas modalidades, as amostras podem ser usadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração, ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, porém não se limitando a, leite e sucos, podem ser testadas diretamente. Em outras modalidades, as amostras pode ser diluídas ou suspendidas em solução, as quais podem incluir, porém não estão limitadas a, uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriano. Uma amostra que é sólida ou semissólida pode ser suspendida em um líquido picando, misturando ou macerando o sólido no líquido. Em algumas modalidades, uma amostra deve ser mantida dentro de uma faixa de pH que promova a ligação do bacteriófago recombinante às células bacterianas hospedeiras. Em algumas modalidades, a faixa de pH preferida pode ser uma adequada para que o bacteriófago se ligue às células bacterianas. Uma amostra deve também conter as concentrações adequadas de cátions divalentes e monovalentes, incluindo, porém não se limitando a Na+, Mg2+, e K+.

[0068] Em algumas modalidades, a amostra é mantida em uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula patogênica presente na amostra. Durante as etapas nas quais o bacteriófago está ligado às células bacterianas, a amostra pode ser mantida em uma temperatura que facilita a atividade do bacteriófago. As referidas temperaturas são de pelo menos cerca de 25 ºC e não maiores do que cerca de 45 ºC. Em algumas modalidades a amostra é mantida a cerca de 37 ºC. Em algumas modalidades as amostras são submetidas à mistura ou agitação suave durante a ligação do bacteriófago recombinante ou infecção. Métodos de utilização do bacteriófago recombinante para a detecção de micro-organismos

[0069] Métodos de utilização de bacteriófago recombinante para detectar micro-organismos de interesse já foram descritos anteriormente. Ensaios podem incluir diversas amostras controle adequadas. Por exemplo, as amostras controle que não contém bacteriófagos recombinantes e / ou amostras controle contendo bacteriófagos recombinantes sem bactérias podem ser testadas como controles para os níveis do sinal de fundo.

[0070] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender métodos de utilização do bacteriófago recombinante para a detecção de micro-organismos. Os métodos da invenção pode ser incorporados de várias maneiras.

[0071] Em alguns aspectos, a invenção compreende um método para a detecção de um micro-organismo de interesse. O método pode utilizar um bacteriófago recombinante para a detecção do micro-organismo de interesse. Por exemplo, em determinadas modalidades, o micro-organismo de interesse é uma bactéria e o bacteriófago recombinante é derivado de um bacteriófago que reconhece especificamente a bactéria de interesse. Em determinadas modalidades, o método pode compreender a detecção de uma bactéria de interesse em uma amostra pela incubação da amostra com uma pluralidade de bacteriófago recombinante que pode se ligar à bactéria de interesse. Uma pluralidade de bacteriófago recombinante ligado a um único micro-organismo é qualquer número maior que 1, porém é preferencialmente pelo menos 5 x 104, ou pelo menos 1 x 105, ou pelo menos 1 x 106, ou pelo menos 1 x 108, ou pelo menos 1 x 109, ou pelo menos 1 x 1010 bacteriófago recombinante.

[0072] Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende uma porção indicadora. Os métodos podem compreender detectar a porção indicadora do bacteriófago recombinante, em que a detecção positiva da porção indicadora indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0073] Em algumas modalidades, a invenção pode compreender um método para a detecção de tão pouco quanto um único micro-organismo de interesse em uma amostra compreendendo as etapas de: incubar a amostra com uma pluralidade de bacteriófago recombinante que se liga ao micro-organismo de interesse, em que o bacteriófago recombinante compreende uma porção indicadora e é colocado em contato com a amostra a ser testada sob condições de tal modo que a pluralidade de bacteriófago recombinante se liga à bactéria de interesse; separar o bacteriófago recombinante não ligado do bacteriófago recombinante ligado à célula; e detectar a porção indicadora resultante da infecção da bactéria, em que a detecção positiva da porção indicadora indica que o micro-organismo de interesse está presente na amostra. As modalidades podem incluir incubar a amostra com pelo menos 5 x 108, ou pelo menos 5 x 109, ou pelo menos 5 x 1010, ou pelo menos 5 x 1011, ou pelo menos 5 x 1012, ou pelo menos 5 x 1013 bacteriófago recombinante.

[0074] Em algumas modalidades, a etapa de detecção irá requerer a adição de um substrato para a enzima indicadora agir. A seleção de um indicador particular não é crítica para a presente invenção, porém o indicador será capaz de gerar um sinal detectável por si só, ou ser instrumentalmente detectável, ou ser detectável em conjunto com um ou mais componentes que produzem sinais adicionais, tal como um sistema de produção de sinal enzima / substrato.

[0075] Em determinadas modalidades, o ensaio pode ser realizado para utilizar um bacteriófago recombinante para identificar a presença de um micro-organismo específico. O ensaio pode ser modificado para acomodar diferentes tipos de amostra ou tamanhos e formatos de ensaio. As modalidades que empregam o bacteriófago recombinante da invenção pode permitir a rápida detecção de cepas bacterianas específicas, com tempos totais de inferiores a 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5,

4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5,

10.0, 10.5, 11.0, 11.5, ou 12 horas, dependendo do tipo de amostra, tamanho da amostra e formato do ensaio. Por exemplo, a quantidade de tempo necessária pode ser um pouco mais curta ou mais longa dependendo da afinidade do bacteriófago recombinante e / ou e dos tipos de bactérias a serem detectados no ensaio, tipo e tamanho da amostra a ser testada, complexidade física / química do ambiente, e concentração de contaminantes bacterianos endógenos não- alvo.

[0076] A Figura 1 ilustra uma modalidade de um ensaio para a detecção de uma bactéria de interesse utilizando um bacteriófago recombinante de acordo com uma modalidade da invenção. Uma grande variedade de configurações e etapas para combinar reagentes são possíveis. Na modalidade aqui ilustrada, alíquotas de fago indicador (ou fago indicador liofilizado) estão contidas em um primeiro compartimento de um dispositivo. Um swab contendo bactérias é introduzido no primeiro compartimento e incubado por um período de tempo (por exemplo, 45 minutos a 37 °C) suficiente para o fago se replicar e gerar indicador solúvel (por exemplo, luciferase). A selagem entre o primeiro compartimento contendo indicador solúvel e fago e um segundo compartimento pode então ser rompida para permitir que a proteína indicadora solúvel entre em contato com um substrato contido dentro do segundo compartimento. Um luminômetro pode ser usado para detectar a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com um substrato. Experimentos que utilizam este método são aqui descritos. Em algumas modalidades, após a infecção, o conteúdo do dispositivo pode ser puxado de volta para o primeiro compartimento a fim de misturar as bactérias infectadas com o substrato. Em modalidades adicionais, o conteúdo pode então ser empurrado de volta para o segundo compartimento de tal modo que o sinal indicador pode ser lido no luminômetro.

[0077] Em algumas modalidades, a amostra pode ser enriquecida antes de ser testada por incubação em condições que estimulam o crescimento. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou até 8 horas ou mais longo, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0078] Portanto, em algumas modalidades, o bacteriófago indicador compreende uma porção indicadora detectável, e a infecção de uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectada por um sinal amplificado gerado por meio da porção indicadora. Portanto o método pode compreender detectar uma porção indicadora produzida durante a replicação do fago, em que detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0079] Em algumas modalidades, o bacteriófago indicador compreende uma porção indicadora detectável, e a infecção de uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectada por um sinal amplificado gerado por meio da porção indicadora. Portanto o método pode compreender detectar uma porção indicadora produzido durante a replicação do fago, em que a detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0080] Tal como aqui descrito em mais detalhes, os métodos e sistemas da invenção pode utilizar uma faixa de concentrações de bacteriófago indicador parental para infectar bactérias presente na amostra. Em algumas modalidades o bacteriófago indicador é adicionado a amostra em uma concentração suficiente para rapidamente encontrar, se ligar, e infectar bactérias alvo que estão presentes em números muito baixos na amostra, tal como uma única célula. Em algumas modalidades, a concentração do fago pode ser suficiente para encontrar, se ligar, e infectar as bactérias alvo em menos do que uma hora. Em outras modalidades, estes eventos podem ocorrer em menos do que duas horas, ou menos do que três horas, após a adição de fago indicador à amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, a concentração do bacteriófago para a etapa de incubação é maior do que 1 x 105 PFU / mL, maior do que 1 x 106 PFU / mL, ou maior do que 1 x 107 PFU / mL.

[0081] Métodos da invenção pode compreender várias outras etapas para aumentar a sensibilidade. Por exemplo, tal como aqui discutido em mais detalhes, o método pode compreender uma etapa para capturar e lavar as bactérias capturadas e ligadas, para remover o excesso de bacteriófago recombinante e aumentar a proporção sinal / ruído. Em algumas modalidades, a detecção positiva da porção indicadora requer que a proporção de sinal para o fundo gerado pela detecção da porção indicadora é de pelo menos 2.0 ou pelo menos 2.5.

[0082] As Figuras 2 - 10 demonstram os dados e gráficos daqueles dados a partir das modalidades de exemplo dos ensaios do bacteriófago recombinante.

[0083] As Figuras 2, 3A, e 3B se referem à detecção de L. monocytogenes. A Figura 2 mostra os dados da detecção da cultura de L. monocytogenes utilizando uma modalidade de um aparelho autônomo com um swab com um suporte sólido. Os sinais correspondentes à presença das bactérias foi detectado por luminômetros Hygiena, GloMax, e GloMax 20 /

20. A Tabela 1 mostra os resultados da cultura em fase log e a Tabela 2 mostra os resultados da cultura durante a noite.

[0084] As Figura 3A e 3B são gráficos gerados a partir dos dados mostrados na Tabela 1. A Figura 3A mostra as medidas dos sinais detectados utilizando Hygiena. Os swabs foram inoculados com células na fase log no nível de UFC indicado. A amostra foi imediatamente infectada com o coquetel de fago de Listeria por 4 horas. O substrato foi adicionado e amostras foram lidas em luminômetro Hygiena. Um sinal de > 10 RLU é considerado positivo. Com este método, aproximadamente 25,000 UFC é requerido para gerar um resultado positivo.

[0085] A Figura 3B mostra as medidas de sinais detectados utilizando luminômetros GloMax 20 / 20 e GloMax (também conhecido como, GloMax 96). Os swabs foram inoculados com células na fase log no nível de UFC indicado. A amostra foi imediatamente infectada com coquetel de fago de Listeria por 4 horas. O substrato foi adicionado e as amostras foram lidas tanto em luminômetros GloMax 20 / 20 (1 mL de amostra) ou GloMax (150 µl de amostra). Uma proporção sinal / fundo de > 3.0 é considerada positivo. Com este método, aproximadamente 5,000 UFC é requerido para gerar um resultado positivo.

[0086] As Figuras 4 - 8 se referem às modalidades que demonstram a detecção de Salmonella. A Figura 4 mostra os resultados da detecção de Salmonella em peru moído que foi inoculado com Salmonella. A Tabela 3 mostra amostra controle não inoculada, e a Tabela 4 mostra amostra de peru inoculada. Os testes foram repetidos com diversos tempos de incubação e de infecção.

[0087] As Figura 5A e Figura 5B são gráficos gerados a partir dos dados na Figura 4. A Figura 6A mostra que amostras de peru inoculadas com Salmonella foram detectadas como positivas com todos os tempos de incubação e de infecção testados. A amostra de peru foi cultivadas por 24 horas a 41 ºC após a inoculação antes do teste com os métodos divulgados no pedido. Para o sinal relativo: incubação de 0HR, infecção de 2HR > incubação de 1HR, infecção de 0.5HR > incubação de 0HR, infecção de 0.5HR. Em adição, a comparação do sinal de RLU mostra que os luminômetros GloMax apresentam um sinal muito mais alto que aquele do luminômetro Hygiena.

[0088] A Figura 5B mostra que a detecção utilizando luminômetros GloMax 20 / 20 e GloMax produziram proporções de sinal / fundo similares para as mesmas amostras. Embora o GloMax 20 / 20 tenha um sinal mais alto (Fig 5A), o fundo foi significativamente mais alto do que aquele com o GloMax. Portanto ao determinar o sinal / fundo, os dois luminômetros performam de forma similar.

[0089] A Figura 6 mostra os dados para a detecção de Salmonella em três amostras de peru (amostras 21, 24, e 26) as quais foram inoculadas com Salmonella antes dos ensaios utilizando o aparelho autônomo. As amostras foram infectadas por diferentes tempo de duração tal como indicado antes da detecção do sinal.

[0090] As Figuras 7A-7C são gráficos gerados a partir dos dados mostrados na Figura 6. As Figuras 7A - 7C mostram resultados dos experimentos nos quais três amostras de peru moído inoculadas foram enriquecidas por 24 horas e amostras de swab foram tomadas e testadas. A amostra 24 (FIG. 7B) e 26 (FIG. 7C) não mostraram sinal em luminômetro portátil Hygiena para as amostras que tinham infecção de fago de 30 min, porém mostraram para a amostra que tinha infecção de 2 horas. O luminômetro GloMax 20 / 20 e GloMax geraram sinais relativamente baixos.

[0091] As Figuras 8A - 8C são gráficos gerados a partir dos dados mostrados na Figura 6. Os gráficos mostram que ambos GloMax 20 / 20 e GloMax foram capazes de detectar a Amostra 21 (Figura 8A) e 26 (Figura 8B) como positivas com infecção de 30 minutos (proporção sinal / fundo de > 3.0 é positiva), no entanto a Amostra 24 (Figura 8C) requereu uma infecção de 2 horas para mostrar um resultado positivo. Os resultados dos luminômetros GloMax 20 / 20 e GloMax foram similares.

[0092] A Figura 9 mostra os dados para a detecção de amostras de esponjas do meio ambiente L. monocytogenes a partir de superfícies inoculadas e enriquecida por 24 horas.

[0093] A Figura 10 mostra a detecção de micro- organismos em amostras de peru inoculadas com Salmonella utilizando o aparelho. Os sinais foram medidos utilizando três diferentes luminômetros: GloMax, 3M, e Hygiena.

[0094] Ensaios com bacteriófago recombinante retém a especificidade ao longo do tempo. Em inúmeras modalidades ao longo de vários anos de desenvolvimento e utilização de ensaios com bacteriófago recombinante para, por exemplo, E. coli, Cronobacter, Salmonella, Listeria e S. aureus, não foram observadas mudanças na especificidade do hospedeiro. Essas modalidades incluem mais de 25 repórter de luciferase recombinante ou bacteriófago indicadores. Além disso, a perda ou inativação do gene do repórter ou indicador (por exemplo, luciferase) não foi detectado em nenhum fago recombinante tal como aqui descrito. Os bacteriófagos recombinantes são armazenados e preservados em múltiplas alíquotas para proteger contra o manuseio incorreto. Embora os bacteriófagos sejam intrinsecamente estáveis, os títulos podem diminuir em grau variável ao longo do armazenamento prolongado, por exemplo, por meses ou anos a 4 oC.

Geralmente, acredita-se que isso seja devido à perda de DNA das partículas; no entanto, o bacteriófago ativo é recuperado por plaqueamento de placas para obter títulos mais elevados. A verificação da especificidade é realizada com cada preparação do bacteriófago recombinante, infectando diferentes cepas de bactérias reconhecidamente positivas e negativas.

[0095] Em algumas modalidades dos métodos para amostras teste, o uso de um grande excesso de bacteriófago recombinante necessita de separação de quaisquer bactérias não ligadas ou outros componentes maiores da amostra a partir do excesso de bacteriófago recombinante não ligado. Isso pode ser alcançado de muitas maneiras diferentes, geralmente conhecidas por um técnico no assunto. As células de micro- organismo podem ser separadas por centrifugação, filtração por tamanho, ou imobilização seletiva. Em algumas modalidades, a filtração por tamanho é alcançada através de poços filtrantes. Em outras modalidades, a separação magnética pode ser usada para imobilização seletiva. Por exemplo, a amostra pode ser filtrada através de uma membrana de 0.45 μm ou 0.22 μm, antes ou depois da incubação com o bacteriófago recombinante, para capturar o micro-organismo alvo (por exemplo, bactéria) em um suporte sólido. O micro- organismo capturado pode, então, ser lavado uma ou mais vezes no suporte sólido para garantir que apenas o bacteriófago recombinante especificamente ligado permaneça ou um mecanismo de ligação específica ou não específica pode ser empregado para capturar o micro-organismo sobre micro grânulos ou outra superfície sólida. Outros formatos para separar componentes de uma amostra são possíveis.

[0096] Uma variedade de suportes sólidos pode ser usada. Em determinadas modalidades, o suporte sólido pode compreender uma placa de múltiplos poços, um filtro, um grânulo, uma faixa de fluxo lateral, uma faixa filtrante, disco de filtro, papel de filtro ou filmes finos projetados para células de cultivo (por exemplo, PetriFilm da 3M). Outros suportes sólidos podem também ser adequados. Por exemplo, em algumas modalidades o micro-organismo da amostra teste pode ser capturado por ligação a um swab, a superfície de uma placa, ou por filtração da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro de rotação de

0.45 μm de tamanho de poro ou filtro de placa). Em uma modalidade, o micro-organismo capturado no filtro ou superfície da placa é incubado com bacteriófago recombinante e subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de bacteriófago recombinante não ligado.

[0097] Alternativamente, em algumas modalidades, a etapa de captura pode ser baseada em outras características do micro-organismo de interesse, tal como tamanho. Em modalidades que utilizam captura com base em tamanho, o suporte sólido pode ser um filtro de coluna de rotação. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma placa de filtro de 96 poços. Ou, o suporte sólido para a captura pode ser um local em uma matriz, ou um suporte móvel, tal como um grânulo.

[0098] Em algumas modalidades, o suporte sólido é revestido com um componente de ligação com a célula que se liga com alta afinidade ao micro-organismo de interesse na amostra. Isto permite que mais bactérias se liguem ao suporte sólido e aumente a sensibilidade e especificidade do ensaio.

[0099] Em uma modalidade, na qual o micro-organismo de interesse é uma bactéria, o bacteriófago recombinante pode se ligar à bactéria por meio de uma domínio de ligação da célula do bacteriófago. Por exemplo, fagos bastantes estudados de E. coli incluem T1, T2, T3, T4, T5, T7, e lambda; outros fagos de E. coli disponíveis na coleção ATCC, por exemplo, incluem phiX174, S13, Ox6, MS2, phiV1, fd,

PR772, e ZIK1. Os fagos de Salmonella incluem SPN1S, 10, epsilon15, SEA1, e P22. Os fagos de Listeria incluem LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, e A511. Os fagos de Staphylococcus incluem P4W, vírus K, Twort, phi11, 187, P68, e phiWMY.

[0100] Em algumas modalidades, a amostra pode ser enriquecida antes de ser testada por incubação em condições que estimulam o crescimento. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou até 8 horas ou mais longo, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0101] Em outras modalidades, a amostra pode ser enriquecida após a captura da bactéria em um suporte sólido. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou até 8 horas ou mais longo, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0102] Portanto, em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende uma porção indicadora detectável, e a ligação a uma única célula patogênica (por exemplo, bactéria) pode ser detectada por um sinal amplificado gerado por meio da a porção indicadora. Portanto o método pode compreender detectar uma porção indicadora do bacteriófago recombinante, em que a detecção do indicador indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0103] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o micro-organismo pode ser detectado sem qualquer isolamento ou purificação dos micro-organismos de uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma amostra contendo um ou mais micro-organismos de interesse pode ser aplicada diretamente a um recipiente de ensaio tal como uma coluna de rotação, um poço de micro titulação, ou um filtro e o ensaio é conduzido naquele recipiente de ensaio. Isto é, os micro- organismos são capturados em uma membrana com tamanho de poro muito pequeno para permitir que os micro-organismos passem. Diversas modalidades dos referidos ensaios são aqui divulgadas.

[0104] As alíquotas de uma amostra teste podem ser distribuídas diretamente em poços de uma placa de múltiplos poços, o bacteriófago recombinante pode ser adicionado, e após um período de tempo suficiente para ligação, as células podem ser capturadas em uma superfície sólida tal como uma placa, grânulo, ou uma substrato de filtro, de tal modo que o excesso de bacteriófago recombinante não ligado pode ser removido em uma ou mais etapas subsequentes de lavagem. Então, um substrato para a porção indicadora (por exemplo, substrato de luciferase para um indicador de luciferase) é adicionado e testado para a detecção do sinal indicador. Algumas modalidades do método podem ser realizadas em placas filtrantes. Algumas modalidades do método podem ser realizadas com ou sem concentração da amostra antes da ligação com o bacteriófago recombinante.

[0105] Por exemplo, em muitas modalidades, placas de múltiplos poços são usadas para conduzir os ensaios. A escolha das placas (ou qualquer outro recipiente no qual a detecção pode ser realizada) pode afetar a etapa de detecção. Por exemplo, algumas placas podem incluir um fundo colorido ou branco, o qual pode afetar a detecção de emissões de luz. Em geral, placas brancas apresentam sensibilidade mais alta mas também produzem um sinal de fundo mais alto. Outras cores de placas podem gerar sinal de fundo menor, mas também possuem sensibilidade um pouco menor. Adicionalmente, o sinal de fundo pode resultar do vazamento de luz de um poço para outro poço adjacente. Algumas placas possuem poços brancos enquanto o resto da placa é preta, portanto, permitindo um sinal alto dentro do poço enquanto evita vazamento de luz de um poço para outro poço. Esta combinação de poços brancos com placas pretas pode diminuir o sinal de fundo. Portanto a escolha da placa ou outro vaso de ensaio pode influenciar na sensibilidade e sinal de fundo do ensaio. Em algumas modalidades, a detecção do micro-organismo de interesse pode ser completada sem a necessidade de cultivo da amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o tempo total requerido para a detecção é menor do que 12.0 horas,

11.0 horas, 10.0 horas, 9.0 horas, 8.0 horas, 7.0 horas, 6.0 horas, 5.0 horas, 4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas, 2.0 horas,

1.5 horas, 1.0 hora, 45 minutos, ou menos do que 30 minutos. Minimizar o tempo de resultado é crítico em testes alimentares e ambientais para patógenos.

[0106] Em contraste aos ensaios conhecidos no estado da técnica, o método da invenção pode detectar micro- organismos individuais. Portanto, em determinadas modalidades, o método pode detectar ≤ 10 células de micro- organismo (isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 micro- organismos) ou ≤ 20, ou ≤ 30, ou ≤ 40, ou ≤ 50, ou ≤ 60, ou ≤ 70, ou ≤ 80, ou ≤ 90, ou ≤ 100, ou ≤ 200, ou ≤ 500, ou ≤ 1000 células de micro-organismo presente em uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante é altamente específico para S. Aureus, Listeria, Salmonella, ou E. coli. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir S. Aureus, Listeria, Salmonella, ou E. coli na presença de mais de 100 outros tipos de bactérias. Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante pode distinguir um sorotipo específico dentro de uma espécie de bactérias (por exemplo, E. coli O157:H7) na presença de mais de 100 outros tipos de bactérias. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante pode ser utilizado para detectar uma única bactéria do tipo específico na amostra. Em determinadas modalidades, o bacteriófago recombinante detecta tão pouco quanto 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 das bactérias específicas na amostra.

[0107] Portanto, aspectos da presente invenção fornecem métodos para a detecção de micro-organismos em uma amostra teste por meio de um repórter ou uma porção indicadora. Em algumas modalidades, quando o micro-organismo de interesse é uma bactéria, a porção indicadora pode estar associada a um bacteriófago recombinante. A porção indicadora pode reagir com um substrato para emitir um sinal detectável ou pode emitir um sinal intrínseco (por exemplo, proteína fluorescente). As proteínas fluorescentes fluorescem naturalmente (fluorescência intrínseca ou autofluorescência) por meio da emissão de energia como um fóton quando a porção fluorescente contendo elétrons absorve um fóton. As proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) pode ser expressas como uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a sensibilidade da detecção pode revelar a presença de tão pouco quanto 100, 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células do micro-organismo de interesse em uma amostra teste. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula do micro-organismo de interesse pode produzir um sinal detectável.

[0108] A seleção de uma porção indicadora particular não é crítica para a presente invenção, porém a porção indicadora será capaz de gerar um sinal detectável tanto por si só, ou ser instrumentalmente detectável, ou ser detectável em conjunto com um ou mais componentes de produção de sinal adicionais, tal como uma sistema de produção de sinal enzima / substrato. Um número de bacteriófagos recombinantes pode ser formado pela variação tanto da porção indicadora ou repórter do bacteriófago recombinante; será apreciado por um técnico no assunto que a escolha envolve a consideração do micro-organismo a ser detectado e os meios desejados de detecção.

[0109] Por exemplo, um ou mais componentes de produção de sinal podem ser reagidos com a porção indicadora para gerar um sinal detectável. Em algumas modalidades, o indicador pode ser um composto bioluminescente. Se a porção indicadora é uma enzima, então a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação da enzima com um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em um sistema de produção de sinal alternativo, o indicador pode ser um composto fluorescente em que nenhuma manipulação enzimática do indicador é necessária para produzir o sinal detectável. Moléculas fluorescentes incluindo, por exemplo, fluoresceína e rodamina e seus derivados e análogos são adequados para uso como indicadores nos referidos sistemas. Ainda em outra modalidade alternativa, a porção indicadora pode ser um cofator, então a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação do cofator com a enzima e um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em algumas modalidades, o sinal detectável é colorimétrico.

[0110] A porção indicadora detectável é uma característica chave do bacteriófago recombinante, a qual pode ser detectada diretamente ou indiretamente. A porção indicadora fornece um sinal detectável pelo qual a reação de ligação é monitorada fornecendo uma medida qualitativa e / ou quantitativa. A quantidade relativa e localização do sinal gerado pelos micro-organismos decorados ou sinalizados pode servir para indicar a presença e / ou quantidade dos micro- organismo. A porção indicadora pode também ser usada para selecionar e isolar micro-organismos decorados ou sinalizados, tal como por classificação de fluxo ou utilizando meio de separação magnética.

[0111] Em algumas modalidades, a porção indicadora do bacteriófago recombinante pode ser detectável diretamente ou após a incubação com um substrato. Muitos diferentes tipos de biomoléculas detectáveis adequadas para uso como porções indicadoras são conhecidas na técnica, e muitas estão comercialmente disponíveis. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende uma enzima, a qual atua como a porção indicadora. Em algumas modalidades, o indicador ou repórter do bacteriófago recombinante codifica para uma enzima detectável. A porção indicadora pode emitir luz e / ou pode ser detectável por uma variação de cor. Várias enzimas apropriadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de raiz forte (HRP), proteína fluorescente verde (GFP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, estas enzimas podem atuar como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis podem também ser porções indicadoras apropriadas.

[0112] Portanto, em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante dos métodos, sistemas ou kits é um bacteriófago do tipo selvagem geneticamente modificado com a sequência de uma proteína indicadora, tal como uma proteína fluorescente ou uma proteína luciferase.

[0113] Os bacteriófagos são capazes de infectar e lisar bactérias específicas.

[0114] A detecção do indicador podem incluir a detecção de emissões de luz. Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser usado para detectar a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com um substrato. A detecção de RLU pode ser alcançada com um luminômetro, ou outras máquinas ou dispositivos podem também ser utilizados. Por exemplo, um espectrofotômetro, câmera CCD, ou câmera CMOS podem detectar variações de cor e outras emissões de luz. A RLU absoluta é importante para a detecção, porém a proporção do sinal para fundo também precisa ser alta (por exemplo, > 2.0, > 2.5, ou > 3.0) a fim de que células únicas ou baixo número de células possam ser detectadas de forma confiável.

[0115] Em algumas modalidades, a reação da porção indicadora (por exemplo, luciferase) com o substrato pode continuar por 30 minutos ou mais, e a detecção em vários pontos no tempo pode ser desejável para otimizar a sensibilidade. Por exemplo, as leituras do luminômetro podem ser tomadas inicialmente em intervalos de 3, ou 5, ou 10, ou

15 minutos até que a reação seja completada.

[0116] Portanto, em algumas modalidades que utilizam o bacteriófago recombinante, a invenção compreende um método para a detecção de um micro-organismo de interesse compreendendo as etapas de captura de pelo menos uma bactéria da amostra; incubação da pelo menos uma bactéria com uma pluralidade de bacteriófago recombinante; permitir tempo para ligação ao micro-organismo alvo na amostra; e detecção da porção indicadora, em que a detecção da porção indicadora demonstra que a bactéria está presente na amostra.

[0117] Por exemplo, em algumas modalidades a bactéria da amostra teste pode ser capturada por ligação à superfície de uma placa, ou por filtração da amostra através de um filtro bacteriológico (por exemplo, filtro de rotação de

0.45 μm de tamanho de poro ou filtro de placa). Em uma modalidade, o bacteriófago recombinante é adicionado em um volume mínimo ou modesto à amostra capturada diretamente no filtro. Em uma modalidade, o micro-organismo capturado no filtro ou superfície da placa é subsequentemente lavado uma ou mais vezes para remover o excesso de bacteriófago recombinante não ligado.

[0118] Em algumas modalidades, as alíquotas de uma amostra teste compreendendo bactérias pode ser aplicada a uma coluna de rotação e após a incubação com um bacteriófago recombinante e lavagem para remover qualquer excesso de bacteriófago, a quantidade de indicador detectada será proporcional à quantidade de bactérias alvo presentes na amostra.

[0119] O indicador (por exemplo, luciferase) ligado às bactérias pode então ser medido e quantificado. Em uma modalidade, a solução é girada através do filtro, e o filtrado é coletado para o ensaio em um novo receptáculo (por exemplo, em um luminômetro) após a adição de um substrato para a enzima indicadora (por exemplo, substrato de luciferase). Alternativamente, o sinal indicador pode ser medido diretamente no filtro.

[0120] Em uma modalidade, o micro-organismo é uma bactéria e o bacteriófago recombinante inclui uma porção indicadora derivada de um bacteriófago. Em uma modalidade, a porção indicadora é a luciferase. Portanto, em uma modalidade alternativa, o substrato indicador (por exemplo, substrato de luciferase) pode ser incubado com a porção da amostra que permanece em um filtro ou ligada a uma superfície da placa. De acordo com isto, em algumas modalidades o suporte sólido é uma placa de filtro de 96 poços (ou placa de 96 poços regular), e a reação do substrato pode ser detectada ao posicionar a placa diretamente no luminômetro.

[0121] Por exemplo, em uma modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de uma bactéria patogênica de interesse compreendendo as etapas de: ligação das células capturadas em uma placa de filtro de 96 poços com uma pluralidade de bacteriófago recombinante; lavagem do excesso de bacteriófago recombinante; e detecção do indicador (por exemplo, luciferase) pela adição de substrato e medição da atividade da enzima diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção da atividade da enzima indica que a bactéria de interesse está presente na amostra.

[0122] Em outra modalidade, a invenção pode compreender um método para a detecção de um micro-organismo de interesse, tal como S. Aureus, compreendendo as etapas de: ligação das células na solução líquida ou suspensão em uma placa de 96 poços com uma pluralidade de bacteriófago recombinante; lavagem do bacteriófago recombinante não ligado das células que apresentam bacteriófago recombinante ligado; e detecção do indicador (por exemplo, luciferase) pela adição de substrato e medida da atividade da enzima diretamente na placa de 96 poços, em que a detecção da atividade da enzima indica que o micro-organismo de interesse, tal como S. Aureus, está presente na amostra. Em algumas modalidades, o micro-organismo de interesse pode ser capturado em um suporte sólido tal como em grânulos ou um filtro. Esta captura pode ocorrer tanto antes ou depois da incubação com o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, nenhuma etapa de captura é necessária.

[0123] Em algumas modalidades, a solução líquida ou suspensão pode ser uma amostra teste consumível, tal como um lavado de vegetais. Em algumas modalidades, a solução líquida ou suspensão pode ser lavado de vegetais fortificado com caldo LB concentrado, caldo tríptico / triptona de soja, água peptonada ou caldo nutriente. Em algumas modalidades, a solução líquida ou suspensão pode ser bactérias diluídas em caldo LB.

[0124] Em algumas modalidades, as células do micro- organismo alvo precisar estar intactas para a detecção adequada. Ou seja, as células não precisam ser viáveis, mas a parede celular deve estar estruturalmente intacta. Portanto, é desejável minimizar a lise da bactéria antes da etapa de detecção.

[0125] Em algumas modalidades, uma etapa de concentração inicial para a amostra é útil. Ou seja,

quaisquer microorganismos ou outras substâncias relativamente grandes em uma amostra são concentrados para remover o excesso de líquido. No entanto, é possível realizar o ensaio sem uma etapa de concentração inicial. Algumas modalidades incluem uma etapa de concentração inicial, e em algumas modalidades esta etapa de concentração permite um tempo de incubação para enriquecimento mais curto. Em outras modalidades, nenhum período de enriquecimento é necessário.

[0126] Algumas modalidades dos métodos de teste podem ainda incluir ensaios confirmatórios. Uma variedade de ensaios são conhecidos na técnica por confirmarem um resultado inicial, geralmente em um momento posterior. Por exemplo, as amostras podem ser cultivadas (por exemplo, ensaio CHROMAGAR® / DYNABEADS®), a PCR pode ser utilizada para confirmar a presença do DNA microbiano, ou outros ensaios de confirmação podem ser usados para confirmar o resultado inicial.

[0127] As modalidades dos ensaios de segurança alimentar incluem etapas de preparação da amostra. Algumas modalidades podem incluir tempo de enriquecimento. Por exemplo, enriquecimento por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 horas pode ser necessários, dependendo do tipo e tamanho da amostra. Após essas etapas de preparação da amostra, a ligação com uma alta concentração de bacteriófago recombinante que compreende um repórter ou indicador pode ser realizada em uma variedade de formatos de ensaio, tal como aquelas mostradas na Figura 1.

[0128] As modalidades de ensaios alimentares pode detectar uma única bactéria patogênica em tamanhos de amostra correspondentes aos padrões da indústria, com uma redução no tempo para os resultados de pelo menos 20 %, ou pelo menos 30 %, ou pelo menos 40 % ou pelo menos 50 % ou pelo menos 60 % dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0129]

[0130] Portanto, algumas modalidades da presente invenção resolvem uma necessidade ao utilizar métodos de bacteriófago recombinante para amplificar um sinal detectável que indica a presença de bactérias. Em determinadas modalidades tão pouco quanto uma única bactéria é detectada. Os princípios aqui aplicados podem ser aplicados à detecção de uma variedade de micro-organismos. Desta forma , as modalidades da presente invenção podem alcançar imensa amplificação de sinal de mesmo uma única célula do micro- organismo de interesse.

[0131] Aspectos da presente invenção utilizam a alta especificidade dos componentes de ligação que podem se ligar a micro-organismos particulares, tal como o reconhecimento e componente de ligação dos agentes infecciosos, como meios para detectar e / ou quantificar o micro-organismo específico em uma amostra. Em algumas modalidades, a presente invenção se beneficia da especificidade dos bacteriófagos.

[0132] Algumas modalidades da invenção divulgadas e aqui descritas utilizam a descoberta de que um único micro- organismo é capaz de gerar grande quantidade de indicador após a infecção com bacteriófago recombinante. Este princípio permite a amplificação do sinal indicador de uma ou algumas células com base no reconhecimento específico do micro-organismo. Por exemplo, ao expor até mesmo uma única célula de uma bactéria a uma pluralidade de bacteriófago recombinante, o sinal indicador é amplificado de tal modo que uma única bactéria é detectável.

[0133] A velocidade e sensibilidade sem precedentes da detecção de um micro-organismo com bacteriófagos recombinantes são resultados inesperados. Em algumas modalidades, os métodos da invenção requerem menos do que 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 horas para a detecção de um micro-organismo de interesse. Estes são prazos mais curtos do que se pensava ser possível. Em algumas modalidades, os métodos podem detectar tão pouco quanto 100, 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 células da bactéria de interesse. Em algumas modalidades, até mesmo uma única célula da bactéria é detectável. Em modalidades adicionais, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas de computador, sistemas automatizados ou kits) compreendendo componentes para a realização dos métodos aqui divulgados, e / ou utilizando os bacteriófagos recombinantes aqui descritos.

[0134] Protocolos existentes para a detecção de bactérias patogênicas em alimentos são complicados, caros, lentos, trabalhosos e propensos a falsos positivos. Além disso, métodos de detecção com base em fagos incluem a complicação adicional e implicações regulatórias de reagentes infecciosos. A detecção com um bacteriófago recombinante específico para um determinado patógeno oferece uma alternativa de teste eficaz, rápida e simples.

[0135] Agentes infecciosos podem ser altamente específicos para um determinado tipo de organismo. Por exemplo, um bacteriófago pode ser específico para um gênero particular de uma bactéria, tal como Listeria. Por exemplo, o bacteriófago A511 é específico para o gênero Listeria. ou um bacteriófago pode ser específico para uma espécie particular de bactéria, tal como E. coli. Para alguns tipos de bactérias, os bacteriófagos podem até reconhecer subtipos particulares desse organismo com alta especificidade. Por exemplo, o bacteriófago CBA120 é altamente específico para E. coli O157:H7 e o bacteriófago φYeO3-12 é altamente específico para o sorotipo O:3 de Y. enterocolitica.

[0136] Em algumas modalidades do bacteriófago recombinante aqui descrito, o bacteriófago recombinante pode ser derivado de T7, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI, AR1, A511, A118, A006, A500, PSA, P35, P40, B025, B054,A97, phiSM101, phi3626, CBA120, SPN1S, 10, epsilon15, P22, LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, A511, P4W, K, Twort, ou SA97. Um bacteriófago recombinante também inclui uma porção indicadora, tal como uma porção fluorescente, uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, ou uma enzima, que permite que o bacteriófago recombinante gere um sinal. Em um bacteriófago recombinante, diversos tipos de repórteres podem ser inseridos no genoma do bacteriófago, para servir como uma porção indicadora. Em algumas modalidades, o bacteriófago recombinante compreende uma enzima, tal como uma luciferase, a qual é apenas detectável quando da adição de um substrato adequado. Por exemplo, luciferase, fosfatase alcalina, e outras enzimas repórter reagem com um substrato adequado para fornecer um sinal detectável. Algumas modalidades de um bacteriófago recombinante compreendem uma luciferase do tipo selvagem ou uma luciferase projetada, tal como NANOLUC®. Outras modalidades incluem uma proteína fluorescente ou outra proteína repórter.

[0137] Em modalidades alternativas, os bacteriófagos, fagos, micobacteriófagos (tal como para TB e paraTB), micófagos (tal como para fungos), fagos de micoplasma, e quaisquer outros vírus que possam invadir bactérias, fungos, micoplasmas, protozoários, leveduras e outros organismos microscópicos vivos podem ser estudados ou copiados para direcionar um micro-organismo de interesse. Por exemplo, fagos bem estudados de E. coli incluem T1, T2, T3, T4, T5, T7, e lambda; outros fagos de E. coli disponíveis na coleção ATCC, por exemplo, incluem phiX174, S13, Ox6, MS2, phiV1, fd, PR772, e ZIK1. Os fagos de Salmonella incluem SPN1S, 10, epsilon15, SEA1, e P22. Os fagos de Listeria incluem LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, e A511. Os fagos de Staphylococcus incluem P4W, vírus K, Twort, phi11, 187, P68, e phiWMY.

[0138] Algumas modalidades da invenção utilizam a especificidade de ligação de um bacteriófago recombinante para um direcionamento rápido e sensível para ligar e facilitar a detecção de uma bactéria de interesse.

[0139] Em algumas modalidades, um bacteriófago recombinante é derivado de um bacteriófago específico para a bactéria alvo de interesse, tal como de T7, T4 ou outro fago similar. Um bacteriófago recombinante também pode ser derivado de tipo T4, tipo T7, ViI, tipo ViI, AR1, A511, A118, A006, A500, PSA, P35, P40, B025, B054, A97, phiSM101, phi3626, CBA120, SPN1S, 10, epsilon15, P22, LipZ5, P40, vB_LmoM_AG20, P70, A511, P4W, K, Twort, ou SA97.

[0140] Em algumas modalidades, um pequeno produto do gene indicador pode ser desejável. As proteínas OpLuc e NANOLUC® têm cerca de apenas 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto FLuc tem cerca de 62 kDa e requer aproximadamente 1700 bp para codificar. Para comparação, o genoma de T7 tem cerca de 40 kbp, enquanto o genoma de T4 tem cerca de 170 kbp.

[0141] Além disso, o indicador deve gerar uma alta proporção de sinal para o fundo e deve ser prontamente detectável em tempo hábil. O NANOLUC® da Promega é uma luciferase de Oplophorus gracilirostris (camarão do fundo do mar) modificada. Em algumas modalidades, NANOLUC® combinado com NANO-GLO® da Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com fundo baixo.

[0142] Em algumas modalidades de bacteriófago recombinante, uma porção indicadora pode ser qualquer uma de uma variedade de biomoléculas. O indicador pode ser um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável ou um cofator para uma enzima que produz um produto detectável. Em algumas modalidades, a porção indicadora de um bacteriófago recombinante é um repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma variação de cor. Várias enzimas apropriadas estão disponíveis comercialmente, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de raiz forte (HRP), ou luciferase (Luc). Por exemplo, em uma modalidade o indicador é uma enzima luciferase. Vários tipos de luciferase pode ser utilizados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em mais detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla, ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, a luciferase é derivada de Oplophorus. Em algumas modalidades, o indicador é uma luciferase geneticamente modificada, tal como

NANOLUC®. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis também podem ser metades indicadores apropriadas. Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como a porção indicadora.

[0143] As composições da invenção podem compreender um ou mais bacteriófagos recombinantes derivados de um ou mais agentes infecciosos do tipo selvagem (por exemplo, bacteriófagos) e uma ou mais porções indicadoras. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes bacteriófagos recombinantes que podem gerar o mesmo ou diferentes sinais indicadores. Ou seja, uma composição para a detecção de um micro-organismo pode incluir os mesmos ou diferentes bacteriófagos recombinantes.

[0144] Os ensaios previamente descritos que utilizam bacteriófago recombinante os quais reconhecem e se ligam a bactérias específicas podem ser empregados. Os ensaios com bacteriófago recombinante podem ser realizados em um ambiente de laboratório tradicional ou em um dispositivo, tal como por exemplo um aparelho tal como aqui descrito mais adiante. Bacteriófago recombinante

[0145] Tal como aqui descrito em mais detalhes, o aparelho, métodos, sistemas e kits da invenção compreendem bacteriófago recombinante para uso na detecção de micro- organismos de interesse. O bacteriófago recombinante está compreendido no primeiro compartimento do aparelho divulgado acima. Em algumas modalidades, a invenção pode incluir uma composição compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um gene indicador incorporado dentro do genoma do bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador está operacionalmente ligado a um promotor que não é um promotor nativo do bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador está operacionalmente ligado a um promotor nativo do bacteriófago. O bacteriófago recombinante compreendendo o indicador ou gene repórter também são referidos como bacteriófago indicador nesta divulgação.

[0146] Um bacteriófago recombinante pode incluir um repórter ou gene indicador. Em determinadas modalidades do bacteriófago, o gene indicador não codifica uma proteína de fusão. Por exemplo, em determinadas modalidades, a expressão do gene indicador durante a replicação da bactéria do fago após a infecção de uma bactéria hospedeira resulta em um produto de proteína indicadora solúvel. Em determinadas modalidades, o gene indicador pode ser inserido dentro de uma região tardia do gene do bacteriófago. Genes tardios são geralmente expressos em níveis mais elevados do que outros genes do fago, uma vez que eles codificam para proteínas estruturais. A região tardia do gene pode ser uma região do gene de classe III e pode incluir um gene para uma proteína do capsídeo principal.

[0147] Algumas modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga a jusante do gene da proteína do capsídeo principal. Outras modalidades incluem projetar (e opcionalmente preparar) uma sequência para a recombinação homóloga a montante do gene da proteína do capsídeo principal. Em algumas modalidades, a sequência compreende um gene repórter otimizado por códon precedido por uma região não traduzida. A região não traduzida pode incluir um promotor de gene tardio do fago e local de entrada ribossomal.

[0148] Em algumas modalidades, um bacteriófago indicador é derivado de A511, P100, fago de Listeria LMTA- 94, LMA4, LMA8, T7, T4 ou outro fago similar. Um bacteriófago indicador também pode ser derivado de P100virus, tipo T4, tipo T7, ViI, tipo ViI, bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Listeria ou Staphylococcus, ou outro bacteriófago apresentando um genoma com pelo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de homologia para T7, tipo T7, T4, tipo T4, P100virus, bacteriófagos específicos para Cronobacter, Salmonella, Listeria ou Staphylococcus, ViI ou tipo ViI (ou ViI tipo vírus, pelo GenBank / NCBI). Em algumas modalidades, o fago indicador é derivado de um bacteriófago que é altamente específico para um determinado micro-organismo patogênico. As modificações genéticas podem evitar deleções de genes do tipo selvagem e portanto o fago modificado pode permanecer mais similar ao bacteriófago do tipo selvagem do que muitos fagos comercialmente disponíveis. O bacteriófago de origem ambiental pode ser mais específico para bactérias encontradas no meio ambiente e, como tal, geneticamente distintas do fago disponível comercialmente.

[0149] Além disso, os genes do fago considerados não essenciais podem apresentar função não reconhecida. Por exemplo, um gene aparentemente não essencial pode apresentar uma função importante na elevação do tamanho da explosão, tal como funções sutis de corte, encaixe ou aparamento na montagem. Sendo assim, deletar genes para inserir um indicador pode ser prejudicial. A maioria dos fagos pode empacotar um DNA alguns por cento maior do que seu genoma natural. Com esta consideração, um indicador de gene menor pode ser uma escolha mais apropriada para modificar um bacteriófago, especialmente um com um genoma menor. As proteínas OpLuc e NANOLUC® têm cerca de apenas 20 kDa (aproximadamente 500 - 600 bp para codificar), enquanto FLuc tem cerca de 62 kDa (aproximadamente 1,700 bp para codificar). Para comparação, o genoma de T7 tem cerca de 40 kbp, enquanto o genoma de T4 tem cerca de 170 kbp, e o genoma do bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, ou Staphylococcus tem cerca de 157 kbp. Além disso, o repórter do gene não deve ser expresso endogenamente pelas bactérias (isto é, não faz parte do genoma da bactéria), deve gerar uma alta proporção de sinal para o fundo, e deve ser prontamente detectável em tempo hábil. O NANOLUC® da Promega é uma luciferase de Oplophorus gracilirostris (camarão do fundo do mar) modificada. Em algumas modalidades, NANOLUC® combinado com NANO-GLO® da Promega, um substrato de imidazopirazinona (furimazina), pode fornecer um sinal robusto com fundo baixo.

[0150] Em algumas modalidades do fago indicador, o gene indicador pode ser inserido em uma região não traduzida para evitar a interrupção de genes funcionais, deixando os genes do fago do tipo selvagem intactos, o que pode levar a uma maior aptidão ao infectar cepas não laboratoriais de bactérias. Além disso, incluir códons de parada em todos os três quadros de leitura pode ajudar a aumentar a expressão ao reduzir a leitura, também conhecida como expressão vazada. Esta estratégia também pode eliminar a possibilidade de uma proteína de fusão ser feita em níveis baixos, o que se manifestaria como um sinal de fundo (por exemplo, luciferase)

que não pode ser separado do fago.

[0151] Um gene indicador pode expressar uma variedade de biomoléculas. O gene indicador é um gene que expressa um produto detectável ou uma enzima que produz um produto detectável. Por exemplo, em uma modalidade o gene indicador codifica para uma enzima luciferase. Vários tipos de luciferase pode ser utilizados. Em modalidades alternativas, e tal como aqui descrito em mais detalhes, a luciferase é uma de luciferase de Oplophorus, luciferase de vagalume, luciferase de Lucia, luciferase de Renilla, ou uma luciferase projetada. Em algumas modalidades, o gene da luciferase é derivado de Oplophorus. Em algumas modalidades, o gene indicador é um gene da luciferase geneticamente modificado, tal como NANOLUC®.

[0152] Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção compreende um bacteriófago geneticamente modificado compreendendo um gene indicador não bacteriófago na região tardia do gene (classe III). Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo está sob o controle de um promotor tardio. O uso de um promotor de gene tardio viral garante que o gene repórter (por exemplo, luciferase) não é apenas expresso em níveis elevados, como as proteínas do capsídeo viral, mas também não se desliga como genes bacterianos endógenas ou mesmo genes precoces virais.

[0153] Em algumas modalidades, o promotor tardio é um P100virus, promotor tipo T4, tipo T7, ou tipo ViI, ou outro promotor de fago similar àquele encontrado no fago do tipo selvagem selecionado, isto é, sem modificação genética. A região do gene tardia pode ser uma região do gene de classe III, e o bacteriófago pode ser derivado de T7, T4, tipo T4,

ViI, tipo ViI, bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Staphylococcus, Listeria ou S. aureus, ou outro bacteriófago natural apresentando um genoma com pelo menos 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 % de homologia para T7, T4, tipo T4, ViI, tipo ViI, ou bacteriófago específico para Cronobacter, Salmonella, Staphylococcus, Listeria ou S. aureus.

[0154] As modificações genéticas para os bacteriófagos podem incluir inserções, deleções ou substituições de um pequeno fragmento de ácido nucleico, uma parte substancial de um gene, ou um gene inteiro. Em algumas modalidades, ácido nucleicos inseridos ou substituídos compreendem sequências não nativas. Um gene indicador não nativo pode ser inserido em um genoma de bacteriófago de tal modo que este esteja sob o controle de um promotor de bacteriófago. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não faz parte de uma proteína de fusão. Ou seja, em algumas modalidades, uma modificação genética pode ser configurada de tal modo que o produto da proteína indicadora não compreende polipeptídeos do bacteriófago do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o produto da proteína indicadora é solúvel. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a detecção de uma bactéria de interesse compreendendo a etapa de incubar uma amostra teste com o referido bacteriófago recombinante.

[0155] Em algumas modalidades, a expressão do gene indicador no bacteriófago da progênie após a infecção das bactérias hospedeiro resulta em um produto de proteína solúvel livre. Em algumas modalidades, o gene indicador não nativo não é contíguo com um gene que codifica para uma proteína de fago estrutural e sendo assim não produz uma proteína de fusão. Sistemas diferentes que empregam uma fusão de uma porção de detecção à proteína do capsídeo (isto é, uma proteína de fusão), algumas modalidades da presente invenção expressam um indicador solúvel ou repórter (por exemplo, luciferase solúvel). Em algumas modalidades, o indicador ou repórter está idealmente livre da estrutura do bacteriófago. Ou seja, o indicador ou repórter não está ligado à estrutura do fago. Dessa forma, o gene para o indicador ou repórter não está fundido com outros genes no genoma do fago recombinante. Isso pode aumentar muito a sensibilidade do ensaio (para uma única bactéria), e simplificar o ensaio, permitindo que o ensaio seja concluído em menos de uma hora para algumas modalidades, ao contrário de várias horas devido a etapas de purificação adicionais necessárias com constructos que produzem proteínas de fusão detectáveis. Além disso, as proteínas de fusão podem ser menos ativas do que as proteínas solúveis devido, por exemplo, a restrições de enovelamento de proteínas que podem alterar a conformação do sítio ativo da enzima ou acesso ao substrato.

[0156] Além disso, as proteínas de fusão, por definição, limitam o número de porções ligadas a subunidades de uma proteína no bacteriófago. Por exemplo, a utilização de um sistema comercialmente disponível projetado para servir de plataforma para a proteína de fusão resultaria em cerca de 415 cópias da porção de fusão, correspondendo a cerca de 415 cópias da proteína do capsídeo do gene 10B em cada partícula do bacteriófago T7. Sem essa restrição, pode- se esperar que bactérias infectadas expressem muito mais cópias de uma porção de detecção (por exemplo, luciferase)

do que cabem no bacteriófago. Além disso, proteínas de fusão grandes, tal como uma fusão capsídeo - luciferase, pode inibir a montagem da partícula do bacteriófago, portanto produzindo menos progênie de bacteriófago. Portanto um produto do gene indicador solúvel não fundido pode ser preferível.

[0157] Em algumas modalidades, o fago indicador codifica para o repórter, tal como uma enzima detectável. O produto do gene indicador pode gerar luz e / ou pode ser detectável por uma variação de cor. Várias enzimas apropriadas estão comercialmente disponíveis, tal como fosfatase alcalina (AP), peroxidase de raiz forte (HRP), ou luciferase (Luc). Em algumas modalidades, essas enzimas podem servir como a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de vagalume é a porção indicadora. Em algumas modalidades, a luciferase de Oplophorus é a porção indicadora. Em algumas modalidades, o NANOLUC® é a porção indicadora. Outras luciferases projetadas ou outras enzimas que geram sinais detectáveis também podem ser porções indicadoras apropriadas.

[0158] Em algumas modalidades, o uso de uma porção de detecção solúvel elimina a necessidade de remover fago parental contaminante do lisado das células da amostra infectada. Com um sistema de proteína de fusão, qualquer bacteriófago usado para infectar as células da amostra teria uma porção de detecção ligada, e seria indistinguível do bacteriófago filho também contendo a porção de detecção. Como a detecção das bactérias da amostra depende da detecção de uma porção de detecção recém criada (sintetizada de novo), o uso dos constructos de fusão requer etapas adicionais para separar as porções antigas (parentais) das porções recém- criadas (bacteriófago filho). Isto pode ser alcançado pela lavagem das células infectadas múltiplas vezes, antes do final do ciclo de vida do bacteriófago, inativando o excesso de fago parental após a infecção por meios físicos ou químicos, e / ou modificando quimicamente o bacteriófago parental com uma porção de ligação (tal como biotina), que podem então ser ligados e separados (tal como por grânulos de sepharose revestidos com estreptavidina). Porém, mesmo com todas essas tentativas de remoção, o fago parental pode permanecer quando uma alta concentração de fago parental é usada para assegurar a infecção de um baixo número de células da amostra, criando um sinal de fundo que pode obscurecer a detecção de sinal de fago da progênie celular infectada.

[0159] Por outro lado, com a porção de detecção solúvel expressa em algumas modalidades da presente invenção, a purificação do fago parental a partir do lisado final é desnecessária, uma vez que o fago parental não tem nenhuma porção de detecção ligada. Portanto qualquer porção de detecção presente após a infecção deve ter sido criada de novo, indicando a presença de uma bactéria ou bactérias infectadas. Para aproveitar esse benefício, a produção e preparação do fago parental podem incluir purificação do fago de qualquer porção de detecção livre produzida durante a produção do bacteriófago parental na cultura bacteriana. Técnicas padrão de purificação do bacteriófago podem ser empregadas para purificar algumas modalidades do fago de acordo com a presente invenção, tal como centrifugação de gradiente de densidade de sacarose, centrifugação de gradiente de densidade isopícnica de cloreto de césio, HPLC,

cromatografia de exclusão de tamanho, e diálise ou tecnologias derivadas (tal como concentradores da marca Amicon – Millipore, Inc.). A ultracentrifugação isopícnica de cloreto de césio pode ser empregada como parte da preparação do fago recombinante da invenção, para separar partículas de fago parental de proteína luciferase contaminante produzida quando da propagação do fago no hospedeiro bacteriano. Neste sentido, o bacteriófago recombinante parental da invenção está substancialmente livre de qualquer luciferase gerada durante a produção nas bactérias. A remoção da luciferase residual presente no estoque de fago pode reduzir substancialmente o sinal de fundo observado quando o bacteriófago recombinante é incubado com uma amostra teste.

[0160] Em algumas modalidades do bacteriófago modificado, o promotor tardio (promotor da classe III, por exemplo, do fago específico para Listeria, T7, T4, ou ViI) apresenta alta afinidade para a RNA polimerase do mesmo bacteriófago que transcreve genes para proteínas estruturais montadas dentro da partícula do bacteriófago. Estas proteínas são as proteínas mais abundantes feitas pelo fago, e cada partícula de bacteriófago compreende dezenas ou centenas de cópias dessas moléculas. O uso de um promotor tardio viral pode garantir um nível ótimo de expressão da porção de detecção da luciferase. O uso de um promotor tardio viral derivado de, específico para, ou ativo sob o fago indicador do bacteriófago do tipo selvagem original é derivado de (por exemplo, um fago específico para Listeria, T4, T7, ou promotor tardio ViI com um sistema com base em T4, T7, ou ViI) pode ainda garantir a expressão ótima de uma porção de detecção. O uso de um promotor bacteriano padrão (não viral / não bacteriófago) pode, em alguns casos, ser prejudicial à expressão, uma vez que esses promotores são frequentemente regulados negativamente durante a infecção do bacteriófago (para que o bacteriófago priorize os recursos da bactéria para a produção da proteína do fago). Portanto, em algumas modalidades, o fago é preferencialmente projetado para codificar e expressar em alto nível uma porção indicadora solúvel (livre), utilizando uma posicionamento no genoma que não limita a expressão ao número de subunidades de um componente estrutural do fago.

[0161] As composições da invenção podem compreender um ou mais bacteriófagos do tipo selvagem ou geneticamente modificados (por exemplo, bacteriófagos) e um ou mais genes indicadores. Em algumas modalidades, as composições podem incluir coquetéis de diferentes fagos indicadores que podem codificar e expressar a mesma ou diferentes proteínas indicadoras. Em algumas modalidades, o coquetel de bacteriófago compreende pelo menos dois diferentes tipos de bacteriófagos recombinantes. Dispositivos ou aparelho para a detecção de micro- organismos

[0162] Modalidades da invenção estão direcionadas para os métodos de detecção de micro-organismos de interesse utilizando um aparelho autônomo. Em algumas modalidades, o aparelho compreende um suporte sólido, o qual pode ser utilizado para a coleta de uma amostra compreendendo os micro-organismos de interesse. Em algumas modalidades, um aparelho de acordo com a invenção compreende um tubo com compartimentos separados, tanto disposto sequencialmente ou em configuração ramificada (por exemplo, “orelhas” em um tubo). O aparelho podem compreender um número de compartimentos os quais podem ser configurados para a mistura variada dos reagentes e tempo das etapas do método. Em algumas modalidades, o aparelho compreende pelo menos dois compartimentos. Em algumas modalidades, o compartimento mais alto ou superior do tubo contém bacteriófago recombinante, e o compartimento do substrato está abaixo do compartimento do bacteriófago. Em algumas modalidades, o tubo contém meio de crescimento.

[0163] Em algumas modalidades, o aparelho compreende pelo menos dois compartimentos, incluindo um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um gene promotor e um repórter (indicador); uma porta de entrada para o primeiro compartimento para a adição de pelo menos uma porção de uma amostra teste para o bacteriófago recombinante; e um segundo compartimento compreendendo um substrato ou desenvolvedor, em que o substrato ou desenvolvedor permite a detecção do gene repórter (indicador).

[0164] Em uma modalidade, um primeiro compartimento contém bacteriófago recombinante, e um segundo compartimento contém substrato ou reagente desenvolvedor. Em algumas das referidas modalidades ambos os reagentes são misturados com uma amostra ao mesmo tempo. Em outras modalidades, uma amostra é inicialmente adicionada ao primeiro compartimento para iniciar a infecção. Após um período de tempo, um conduíte para o segundo compartimento é aberto para permitir a adição e mistura do substrato ou reagente desenvolvedor dentro da amostra infectada.

[0165] Em uma modalidade alternativa, o primeiro compartimento contém agente infeccioso liofilizado (por exemplo, bacteriófago recombinante liofilizado) e um segundo compartimento contém substrato ou reagente desenvolvedor. Em algumas das referidas modalidades ambos os reagentes são misturados com uma amostra (opcionalmente em que os micro- organismos da amostra são capturados em um suporte sólido) ao mesmo tempo. Em outras modalidades, uma amostra é inicialmente adicionada ao primeiro compartimento. Após um período de tempo, um conduíte para o segundo compartimento é aberto para permitir a adição e mistura do substrato ou reagente desenvolvedor dentro da amostra infectada.

[0166] Em algumas modalidades, uma selagem separa compartimentos adjacentes, o usuário rompe a(s) selagem(s), ambos o substrato e o fago encontram o swab ao mesmo tempo. Como a luciferase é produzida e reage com o substrato para produzir um sinal detectável.

[0167] Em algumas modalidades, o compartimento do substrato pode ser posicionado entre um compartimento do meio e um compartimento do bacteriófago recombinante. Em outras modalidades, o dispositivo não compreende um compartimento do meio e o dispositivo está livre de meio. Quando um usuário rompe a selagem para aplicar um reagente a uma amostra que é capturada no suporte sólido, ambos os reagentes podem ser aplicados ao mesmo tempo.

[0168] Em modalidades alternativas, o compartimento do substrato pode estar posicionado entre um compartimento do meio e um compartimento do bacteriófago recombinante. Em outras modalidades, o dispositivo não compreende um compartimento do meio e o dispositivo está livre de meio. Quando o usuário rompe a selagem para aplicar um reagente a uma amostra que é capturada no suporte sólido, ambos os reagentes podem ser aplicados ao mesmo tempo.

[0169] Em algumas modalidades, um suporte sólido é adicionado a um tubo no qual o substrato ou desenvolvedor está no fundo do tubo; o suporte sólido é empurrado para o fundo para iniciar a reação entre a enzima e o substrato ou outro repórter e reagente pareado. O suporte sólido pode estar preso a um eixo para facilitar o manuseio.

[0170] Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende um grânulo revestido com uma molécula que captura especificamente o micro-organismo de interesse (por exemplo, um anticorpo ou uma proteína de ligação à célula). Em outras modalidades, o suporte sólido compreende um swab ou outro mecanismo de captura não específico.

[0171] Alternativamente, em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o dispositivo está livre de meio.

[0172] As Figuras a seguir fornecem exemplos ilustrativos das modalidades da invenção.

[0173] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um sistema independente de aparelho de detecção de micro- organismo. As Figuras 11A, 11B, e 11C mostram uma modalidade de um aparelho 100. O aparelho compreende um suporte sólido 16 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento 10 contém fago, o segundo compartimento 12 contém substrato, e o terceiro compartimento 14 contém meio. Este aparelho permite que o fago e substrato sejam incubados com a amostra ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 11C).

[0174] As Figuras 12A, 12B, e 12C mostram uma segunda modalidade de um aparelho 200. O aparelho compreende um suporte sólido 26 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento 20 contém fago, o segundo compartimento 22 contém meio, e o terceiro compartimento 24 contém substrato. Nas modalidades que utilizam o aparelho mostrado na Figura 12A, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais que utilizam o aparelho mostrado na Figura 12B, o suporte sólido é embebido com meio antes da coleta da amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 12C).

[0175] As Figuras 13A, 13B, e 13C mostram uma terceira modalidade de um aparelho 300. O aparelho compreende um suporte sólido 36 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento 30 contém meio, o segundo compartimento 32 contém fago, e o terceiro compartimento 34 contém substrato. Nas modalidades que utilizam o aparelho mostrado na Figura 13A, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais que utilizam o aparelho mostrado na Figura 13B, o suporte sólido é seco antes da coleta da amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 13C).

[0176] As Figuras 14A, 14B, e 14C mostram uma quarta modalidade de um aparelho 400. O aparelho compreende um suporte sólido 46 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento 40 contém meio, o segundo compartimento 42 contém fago, e o terceiro compartimento 46 contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de bloqueio para a mistura faseada dos reagentes. Nas modalidades que utilizam o aparelho mostrado na Figura 14A, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais que utilizam o aparelho mostrado na Figura 14B, o suporte sólido é embebido com meio antes da coleta da amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 14C).

[0177] As Figuras 15A, 15B, e 15C mostram uma quinta modalidade de um aparelho 500. O aparelho compreende um suporte sólido 56 e um recipiente compreendendo três compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento 50 contém meio, o segundo compartimento 52 contém fago, e o terceiro compartimento 54 contém substrato. O aparelho apresenta um mecanismo de bloqueio para a mistura faseada dos reagentes. Nas modalidades que utilizam o aparelho mostrado na Figura 15A, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato. Em modalidades adicionais que utilizam o aparelho mostrado na Figura 15B, o suporte sólido é seco antes da coleta da amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo está livre de meio (Figura 15C).

[0178] A Figura 16 mostra uma sexta modalidade de um aparelho 600. O aparelho compreende um suporte sólido 64 e um recipiente compreendendo dois compartimentos. Cada um dos compartimentos é separado por uma selagem de ação rápida. O primeiro compartimento 60 contém fago e o segundo compartimento 62 contém substrato. Nas modalidades que utilizam o aparelho mostrado na Figura 16, a amostra é primeiro incubada com o fago, antes da incubação com o substrato.

[0179] A Figura 17 mostra uma modalidade de um método para a detecção de micro-organismos compreendendo (i) enriquecer uma amostra durante a noite, (ii) utilizar um suporte sólido de um aparelho autônomo para coletar a amostra que foi enriquecida durante a noite, (iii) infectar a amostra com fago contido dentro de um compartimento do aparelho autônomo, e (iv) detectar a presença de micro-organismos pela leitura / detecção do sinal produzido pela etapa de infecção.

[0180] Em algumas modalidades, os compartimentos contidos em projeções ou ramificações do tubo central permitem a mistura de reagentes a partir de mais do que 2 direções, por exemplo, na forma de “orelhas”. Por exemplo, dois bulbos de compressão podem ser utilizados para adicionar meio e depois fago sequencialmente ou simultaneamente ao compartimento principal, ou para adicionar outros reagentes. Diversos arranjos de outros compartimentos em relação a um compartimento central permitem a adição e mistura de diferentes reagentes no compartimento adjacente maior. Métodos de utilização o aparelho para a detecção de micro-organismos

[0181] Tal como aqui notado, em determinadas modalidades, a invenção pode incluir métodos da detecção do micro-organismo, o método compreendendo colocar em contato a amostra com um suporte sólido de tal modo que os micro- organismos são capturados no suporte sólido, colocar o bacteriófago recombinante em contato com o primeiro compartimento com os micro-organismos capturados no suporte sólido por, por exemplo, rompimento da selagem de ação rápida do primeiro compartimento. Durante e / ou após a infecção, o bacteriófago expressa o gene indicador para produzir um indicador, o qual pode ser detectado por diversos dispositivos de detecção. Em algumas modalidades, a detecção do indicador pode requerer a adição de um substrato, o qual reage com o indicador para produzir um sinal detectável. A presença dos sinais indica a presença dos micro-organismos na amostra.

[0182] Em uma modalidade alternativa, a invenção pode incluir métodos de detecção de micro-organismo, o método compreendendo colocar em contato a amostra com um suporte sólido de tal modo que os micro-organismos sejam capturados no suporte sólido, colocar em contato o bacteriófago recombinante do primeiro compartimento com os micro- organismos capturados no suporte sólido ao, por exemplo, romper a selagem de ação rápida do primeiro compartimento. A porção indicadora do bacteriófago recombinante pode ser detectada por vários dispositivos de detecção. Em algumas modalidades, a detecção do indicador pode requerer a adição de um substrato, o qual reage com o indicador para produzir um sinal detectável. A presença dos sinais indicam a presença dos micro-organismos na amostra. Amostragem

[0183] Em algumas modalidades, as amostras podem ser usadas diretamente nos métodos de detecção da presente invenção, sem preparação, concentração, ou diluição. Por exemplo, amostras líquidas, incluindo, porém não se limitando a, leite e sucos, podem ser testadas diretamente. Em outras modalidades, as amostras pode ser diluídas ou suspendidas em solução, as quais podem incluir, porém não estão limitadas a, uma solução tamponada ou um meio de cultura bacteriano. Uma amostra que é sólida ou semissólida pode ser suspendida em um líquido picando, misturando ou macerando o sólido no líquido. Em algumas modalidades, uma amostra devem ser mantidos dentro de uma faixa de pH que promova a fixação do fago às células bacterianas hospedeiras. Em algumas modalidades, a faixa de pH preferida pode ser uma adequada para que o bacteriófago se ligue às células bacterianas. Uma amostra também deve conter as concentrações adequadas de cátions divalentes e monovalentes, incluindo, porém não se limitando a Na+, Mg2+, e K+.

[0184] Preferencialmente ao longo dos ensaios de detecção, a amostra é mantida em uma temperatura que mantém a viabilidade de qualquer célula patogênica presente na amostra. Durante as etapas nas quais o bacteriófago se ligam às células bacterianas, é preferível manter a amostra em uma temperatura que facilita a atividade do bacteriófago. As referidas temperaturas são de pelo menos cerca de 25 ºC e não maior do que cerca de 45 ºC. Em algumas modalidades, as amostras são mantidas a cerca de 37 ºC. Em algumas modalidades, as amostras são submetidas à mistura ou agitação suave durante a ligação ou fixação do bacteriófago.

[0185] Ensaios podem incluir diversas amostras controle apropriadas. Por exemplo, as amostras controle, por exemplo, amostras de alimento, sem bactérias podem ser testadas como controles para os níveis de sinal de fundo.

[0186] A amostragem pode ser realizada utilizando uma variedade de formas. Em algumas modalidades, as amostras, por exemplo, amostras de alimentos são primeiro liquefeitas e o suporte sólido, por exemplo, o suporte sólido ou grânulo, é mergulhado na amostra líquida. Em algumas modalidades, o suporte sólido é primeiro embebido no meio de cultura no tubo antes da amostragem. Em algumas modalidades, o suporte sólido é seco antes da amostragem. Em algumas modalidades, a amostra líquida é primeiro cultivada por um período de tempo (“enriquecimento da cultura”), por exemplo, menor do que 24 horas, menor do que 12 horas, menor do que um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

[0187] Em outras modalidades, a amostra pode ser enriquecida após a captura dos micro-organismos no suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido com micro- organismos pode ser incubado em meio de crescimento no terceiro compartimento do aparelho para permitir que o micro- organismo se expanda em número. Esta etapa é referida como enriquecimento de incubação. Nas referidas modalidades, o período de enriquecimento pode ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou até 8 horas ou mais longo, dependendo do tipo e tamanho da amostra.

[0188] Em algumas modalidades dos métodos da invenção, os micro-organismos podem ser detectados sem qualquer isolamento ou purificação dos micro-organismos a partir de uma amostra. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma amostra contendo um ou mais micro-organismos de interesse pode ser aplicada diretamente ao suporte sólido e o ensaio é conduzido no aparelho. Infecção

[0189] Os métodos aqui divulgados compreendem operar o aparelho para fazer com que o bacteriófago recombinante entre em contato com os micro-organismos de interesse. Após colocar em contato os micro-organismos, o bacteriófago replica e expressa o gene indicador ou gene repórter. Vide a seção intitulada “Bacteriófago recombinante”. O tempo de infecção, isto é, um período de tempo entre o ponto no tempo quando a amostra é primeiro colocada em contato com o bacteriófago e o ponto no tempo quando o substrato é adicionado à mistura, pode variar, dependendo do tipo de bacteriófago e concentração do micro-organismos na amostra. Utilizando o aparelho no qual as bactérias são capturadas no suporte sólido pode reduzir significativamente o tempo requerido para a infecção, por exemplo, o tempo de infecção pode ser de uma hora ou menos, enquanto em um ensaio padrão, no qual nenhum suporte sólido é usado para capturar as bactérias, a infecção é tipicamente de pelo menos 4 horas. Em determinadas modalidades, o tempo da infecção para os métodos aqui divulgados é menor do que 6.0 horas, 5.0 horas,

4.0 horas, 3.0 horas, 2.5 horas, 2.0 horas, 1.5 horas, 1.0 hora, 45 minutos, ou menor do que 30 minutos. Em algumas modalidades, o tempo da infecção é de cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, ou cerca de 3 horas. Desenvolvimento do sinal

[0190] O indicador, produzido pela expressão do gene indicador, pode ser detectado utilizando métodos bem conhecido por alguém com habilidades na técnica. Por exemplo, um ou mais componentes de produção de sinal podem ser reagidos com o indicador para gerar um sinal detectável. Em algumas modalidades, o indicador pode ser um composto bioluminescente. Se o indicador é uma enzima, então, a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação do enzima com um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em um sistema de produção de sinal alternativo, o indicador pode ser um composto fluorescente no qual nenhuma manipulação enzimática do indicador é necessária para produzir o sinal detectável. Moléculas fluorescentes incluindo, por exemplo, fluoresceína e rodamina e seus derivados e análogos são adequados para uso como indicadores do referido sistema. Em ainda outra modalidade alternativa, a porção indicadora pode ser um cofator, então a amplificação do sinal detectável é obtida pela reação do cofator com a enzima e um ou mais substratos ou enzimas e substratos adicionais para produzir um produto de reação detectável. Em algumas modalidades, o sinal detectável é colorimétrico. Nota-se que a seleção de um indicador particular não é crítica para a presente invenção, porém o indicador será capaz de gerar um sinal detectável tanto por si só, ou ser instrumentalmente detectável, ou ser detectável em conjunto com um ou mais componentes de produção de sinal adicionais, tal como um sistema de produção de sinal enzima / substrato.

[0191] Em algumas modalidades, a etapa de detecção irá requerer a adição de um substrato para que a enzima indicadora atue. O substrato pode ser adicionado em uma variedade de formas. Em algumas modalidades, o substrato está compreendido no segundo compartimento do aparelho e o rompimento da selagem de ação rápida faz com que o fago (no primeiro compartimento no aparelho) e substrato entre em contato com os micro-organismos (capturados no suporte sólido) concomitantemente. Vide a FIG. 12. Em algumas modalidades, as selagens de ação rápida são rompidas sequencialmente, fazendo com que os micro-organismos entrem em contato com o bacteriófago antes do contato com o substrato. Vide as FIG. 13A e 13B. Em algumas modalidades, o método compreende operar o bloqueio para permitir a mistura em fases de tal modo que os micro-organismos entrem em contato com o bacteriófago antes de entrar em contato com o substrato.

[0192] Em algumas modalidades, a reação do indicador (por exemplo, luciferase) com substrato pode continuar por 30 minutos ou mais, e a detecção nos diversos pontos no tempo pode ser desejável para otimizar a sensibilidade. Em algumas modalidades, as leituras do luminômetro podem ser tomadas inicialmente e em intervalos de 3, ou 5, ou 10, ou 15 minutos até que a reação seja completada. Sinal de detecção

[0193] Detectar o sinal produzido pelo indicador pode incluir detectar a emissão de luz. Em algumas modalidades o compartimento do aparelho no qual o substrato é misturado com a amostra teste é transparente, de tal modo que qualquer sinal que resulte da infecção e incubação subsequente com o substrato é visível. Neste caso, o sinal pode ser detectado através da parede do compartimento. Em algumas modalidades, o aparelho contendo a amostra reagida é inserido em um instrumento para a detecção do sinal resultante. Em outras modalidades, um instrumento de detecção é usado para fazer a varredura do aparelho contendo a amostra reagida.

[0194] Em algumas modalidades, um luminômetro pode ser usado para detectar o indicador (por exemplo, luciferase), por exemplo, GloMax® 20 / 20 e GloMax® da Promega (Madison, WI). Em algumas modalidades, um espectrofotômetro, câmera CCD, ou câmera CMOS pode ser utilizado para detectar variações de cor e outras emissões de luz. RLU absolutos são importantes para a detecção, porém a proporção do sinal para o fundo também precisam ser altos (por exemplo, > 2.0, >

2.5, ou > 3.0) para que uma única célula ou baixo número de células seja detectado de forma confiável. O sinal de fundo pode ser obtido medindo amostra controle que não contém micro-organismo utilizando o mesmo procedimento tal como descrito acima. Em algumas modalidades, a detecção do sinal a partir do repórter ou gene indicador podem incluir, por exemplo, uso de um instrumento que emprega tecnologia de fotodiodo ou PMT (tubo fotomultiplicador). Em algumas modalidades, um luminômetro portátil pode ser empregado para a detecção de sinal. Luminômetros PMT portáteis adequados estão disponíveis em 3M (Maplewood, MN), BioControl (Seattle, WA), e Charm Science (Lawrence, MA). Luminômetros de fotodiodo portáteis adequados estão disponíveis em Hygiena (Camarillo, CA) e Neogen (Lansing, MI). Estes luminômetros portáteis normalmente produzem leituras muito mais baixas em comparação aos luminômetros tradicionais (GloMax ou GloMax 20 / 20) para a mesma amostra. Tal como mostrado nos Exemplos, múltiplos experimentos mostram que os sinais produzidos pelas reações foram suficientes para serem detectados por esses luminômetros portáteis. Os ensaios foram repetidos várias vezes com diferentes tipos de micro- organismos, incluindo L. monocytogenes e Salmonella, e resultados similares foram obtidos cada vez. Isso indica que o método de detecção utilizando o aparelho é suficientemente sensível e robusto. Poder usar esses dispositivos portáteis para detectar o micro-organismo também oferece comodidade e flexibilidade que muitas vezes falta nos métodos de detecção que utilizam dispositivos de detecção tradicionais, não portáteis. Sistemas e Kits da invenção

[0195] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas (por exemplo, sistemas automatizados) ou kits compreendendo componentes para realizar os métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o aparelho está compreendido em sistemas ou kits de acordo com a invenção. Os métodos aqui descritos podem também utilizar os referidos sistemas ou kits. Algumas modalidades aqui descritas são particularmente adequadas para automação e / ou kits, dada a quantidade mínima de reagentes e materiais necessários para realizar os métodos. Em determinadas modalidades, cada um dos componentes de um kit pode compreender uma unidade independente que pode ser entregue de um primeiro local para um segundo local.

[0196] Em algumas modalidades, a invenção compreende sistemas ou kits para a rápida detecção de um micro-organismo de interesse em uma amostra. Os sistemas ou kits podem, em determinadas modalidades, compreender: um aparelho tal como descrito acima, e um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal pode detectar o produto do gene indicador produzido a partir da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um dispositivo portátil. Em algumas modalidades, o componente de detecção de sinal é um luminômetro portátil.

[0197] Então, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema ou kit para a rápida detecção de um micro-organismo de interesse em uma amostra, compreendendo: aparelho que compreende: um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador. O sistema ou kit pode ainda compreender um segundo compartimento que contém substrato, e / ou um terceiro compartimento que contém meio. Um ou mais destes compartimentos são selados e separados da outra porção do aparelho por uma selagem de ação rápida, e o rompimento da selagem de ação rápida faz com que o conteúdo do compartimento deixe o compartimento e se misture com a amostra.

[0198] Em algumas modalidades, o sistema pode compreender um componente para isolar o micro-organismo de interesse dos outros componentes na amostra.

[0199] Em alguns sistemas e / ou kits, o mesmo componente pode ser usado para múltiplas etapas. Em alguns sistemas e / ou kits, as etapas são automatizadas ou controladas pelo usuário por meio da entrada do computador e / ou no qual um robô de manuseio de líquidos realiza pelo menos uma etapa. Em um sistema informatizado, o sistema pode ser totalmente automático, semiautomático, ou dirigido pelo usuário através de um computador (ou alguma combinação dos mesmos).

[0200] Estes sistemas e kits da invenção incluem diversos componentes. Tal como aqui utilizado, o termo “componente” é amplamente definido e inclui qualquer aparelho adequado ou coleção de aparelhos adequados para a execução do método recitado. Os componentes não precisam de estar integralmente ligados ou situados em relação uns aos outros de uma forma particular. A invenção inclui quaisquer arranjos adequados dos componentes em relação uns aos outros. Por exemplo, os componentes não precisam de estar na mesma divisão. Porém, em algumas modalidades, os componentes estão conectados uns aos outros em uma unidade integral. Em algumas modalidades, os mesmos componentes podem desempenhar múltiplas funções. Sistemas de computador e Meio legível por computador

[0201] Em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema. O sistema podem incluir pelo menos algumas das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos alguns dos componentes para a realização do método. Em determinadas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Portanto, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a rápida detecção de um micro-organismo de interesse em uma amostra. O sistema podem incluir pelo menos algumas das composições da invenção. Ainda, o sistema pode compreender pelo menos alguns dos componentes para a realização do método. Em determinadas modalidades, o sistema é formulado como um kit. Portanto, em determinadas modalidades, a invenção pode compreender um sistema para a rápida detecção de um micro-organismo de interesse em uma amostra,

compreendendo um aparelho tal como descrito acima. Por exemplo, o aparelho podem compreender um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; em que o suporte sólido compreende um componente de ligação com a célula. Em algumas modalidades, o sistema também compreende um dispositivo de detecção portátil.

[0202] O sistema, tal como descrito na presente técnica ou qualquer um dos seus componentes, pode ser incorporado na forma de um sistema de computador. Exemplos típicos de um sistema de computador incluem um computador de uso geral, um microprocessador programado, um microcontrolador, um elemento de circuito integrado periférico, e outros dispositivos ou arranjos de dispositivos os quais são capazes de implementar as etapas que constituem o método da presente técnica.

[0203] Um sistema de computador pode compreender um computador, um dispositivo de entrada, uma unidade de exibição, e / ou a Internet. O computador pode ainda compreender um microprocessador. O microprocessador pode estar conectado a um barramento de comunicação. O computador pode também incluir uma memória. A memória pode incluir memória de acesso aleatório (RAM) e memória somente de leitura (ROM). O sistema de computador pode ainda compreender um dispositivo de armazenamento. O dispositivo de armazenamento pode ser uma unidade de disco rígido ou uma unidade de armazenamento removível tal como uma unidade de disquete, unidade de disco óptico, etc. O dispositivo de armazenamento pode também ser outro meio similar para carregar programas de computador ou outras instruções no sistema de computador. O sistema de computador pode também incluir uma unidade de comunicação. A unidade de comunicação permite que o computador se conecte a outras bases de dados e à Internet através de uma interface I / O. A unidade de comunicação permite a transferência, bem como a recepção dos dados de outras bases de dados. A unidade de comunicação pode incluir um modem, uma placa Ethernet, ou qualquer dispositivo similar que permita ao sistema de computador se conectar a bancos de dados e redes como LAN, MAN, WAN e Internet. O sistema de computador portanto pode facilitar as entradas de um usuário através do dispositivo de entrada, acessível ao sistema através da interface I / O.

[0204] Um dispositivo de computador tipicamente incluirá um sistema operacional que fornece instruções de programa executável para a administração e operação geral desse dispositivo de computador, e tipicamente incluirá um meio de armazenamento legível por computador (por exemplo, um disco rígido, memória de acesso aleatório, memória somente de leitura, etc.) armazenando instruções que, quando executadas por um processador do servidor, permitem que o dispositivo de computador execute suas funções pretendidas. As implementações adequadas para o sistema operacional e a funcionalidade geral do dispositivo de computador são conhecidas ou estão comercialmente disponíveis, e são prontamente implementadas por pessoas versadas na técnica, particularmente à luz desta divulgação.

[0205] O sistema de computador executa um conjunto de instruções que são armazenadas em um ou mais elementos de armazenamento, a fim de processar os dados de entrada. Os elementos de armazenamento também podem conter os dados ou outras informações conforme desejado. O elemento de armazenamento pode ser na forma de uma fonte de informação ou um elemento de memória física presente na máquina de processamento.

[0206] O ambiente pode incluir uma variedade de armazenamentos de dados e outra memória e meio de armazenamento, tal como discutido acima. Estes podem residir em uma variedade de locais, como em um meio de armazenamento local para (e / ou residente em) um ou mais dos computadores ou remotos a partir de qualquer ou todos os computadores na rede. Em um determinado conjunto de modalidades, as informações podem residir em uma rede de área de armazenamento (“SAN”) familiar para aqueles versados na técnica. De forma similar, quaisquer arquivos necessários para o desempenho das funções atribuídas aos computadores, servidores, ou outros dispositivos de rede podem ser localmente e / ou remotamente armazenados, tal como adequado. Quando um sistema inclui dispositivos de computador, cada referido dispositivo pode incluir elementos de hardware que podem ser eletricamente acoplado por meio de um barramento, os elementos incluindo, por exemplo, pelo menos uma unidade central de processamento (CPU), pelo menos um dispositivo de entrada (por exemplo, um mouse, teclado, controlador, tela sensível ao toque ou teclado), e pelo menos um dispositivo de saída (por exemplo, um dispositivo de exibição, impressora, ou alto-falante). O referido sistema pode também incluir um ou mais dispositivos de armazenamento, tal como unidades de disco, dispositivos de armazenamento óptico,

dispositivos de armazenamento de estado sólido tal como memória de acesso aleatório (“RAM”) ou memória somente de leitura (“ROM”), bem como dispositivos de meio removíveis, cartões de memória, cartões flash, etc.

[0207] Os referidos dispositivos também podem incluir um leitor de mídia de armazenamento legível por computador, um dispositivo de comunicação (por exemplo, um modem, uma placa de rede (sem fio ou com fio), um dispositivo de comunicação infravermelha, etc.), e uma memória de trabalho tal como descrito acima. O leitor de mídia de armazenamento legível por computador pode ser conectado ou configurado para receber um meio de armazenamento legível por computador, representando dispositivos de armazenamento remoto, local, fixo, e / ou removível bem como o meio de armazenamento para conter, armazenar, transmitir e recuperar informações legíveis por computador de forma temporária ou mais permanente. O sistema e diversos dispositivos também normalmente incluem uma série de aplicativos de software, módulos, serviços, ou outros elementos localizados dentro de pelo menos um dispositivo de memória de trabalho, incluindo um sistema operacional e aplicativos de programas, tal como um aplicativo de cliente ou navegador da Web. Deve-se apreciar que as modalidades alternativas podem apresentar inúmeras variações em relação àquelas descritas acima. Por exemplo, hardware personalizado também pode ser usado e / ou elementos particulares podem ser implementados em hardware, software (incluindo software portátil, tal como applets), ou ambos. Além disso, a conexão com outros dispositivos de computador tal como dispositivos de entrada / saída de rede pode ser empregada.

[0208] O meio de armazenamento não transitório e o meio legível por computador para conter o código, ou porções de código, pode incluir qualquer meio apropriado conhecido ou usado na técnica, incluindo meio de armazenamento e meio de comunicação, tal como, porém não limitado a, meio volátil e não volátil, removível e não removível implementado em qualquer método ou tecnologia para armazenamento e / ou transmissão de informações tal como instruções legíveis por computador, as estruturas de dados, módulos de programa, ou outros dados, incluindo RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM, disco versátil digital (DVD) ou outro armazenamento óptico, cassetes magnéticos, fita magnética, armazenamento em disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou qualquer outro meio que possa ser usado para armazenar as informações desejadas e que possa ser acessado por um dispositivo do sistema. Com base na divulgação e nos ensinamentos aqui fornecidos, uma pessoa de habilidade comum na arte apreciará outras formas e / ou métodos para implementar as várias modalidades.

[0209] Um meio legível por computador pode compreender, porém não está limitado a, um dispositivo eletrônico, óptico, magnético ou outro dispositivo de armazenamento capaz de fornecer um processador com instruções legíveis por computador. Outros exemplos incluem, porém não estão limitados a, um disquete, CD-ROM, DVD, disco magnético, chip de memória, ROM, RAM, SRAM, DRAM, memória endereçável por conteúdo (“CAM”), DDR, memória flash tal como NAND flash ou NOR flash, um ASIC, um processador configurado, armazenamento óptico, fita magnética ou outro armazenamento magnético, ou qualquer outro meio a partir do qual um processador de computador possa ler as instruções. Em uma modalidade, o dispositivo computacional pode compreender um único tipo de meio legível por computador tal como memória de acesso aleatório (RAM). Em outras modalidades, o dispositivo computacional pode compreender dois ou mais tipos de meio legível por computador tal como memória de acesso aleatório (RAM), uma unidade de disco e cache. O dispositivo computacional pode estar em comunicação com um ou mais meio legível por computadores tal como uma unidade de disco rígido externa ou uma unidade externa de DVD ou Blu-Ray.

[0210] Tal como discutido acima, a modalidade compreende um processador o qual está configurado para executar instruções de programa executáveis por computador e / ou para acessar informações armazenadas na memória. As instruções podem compreender instruções específicas do processador geradas por um compilador e / ou um intérprete de código escrito em qualquer linguagem de programação de computador adequada incluindo, por exemplo, C, C++, C#, Visual Basic, Java, Python, Perl, JavaScript, e ActionScript (Adobe Systems, Mountain View, Calif.). Em uma modalidade, o dispositivo computacional compreende um único processador. Em outras modalidades, o dispositivo compreende dois ou mais processadores. Os referidos processadores podem compreender um microprocessador, um processador de sinal digital (DSP), um circuito integrado de aplicação específico (ASIC), matrizes de portas programáveis em campo (FPGAs), e máquinas de estado. Esses processadores podem compreender ainda dispositivos eletrônicos programáveis tal como PLCs,

controladores de interrupção programáveis (PICs), dispositivos lógicos programáveis (PLDs), memórias somente leitura programáveis (PROMs), memórias somente leitura programáveis eletronicamente (EPROMs ou EEPROMs), ou outros dispositivos similares.

[0211] O dispositivo computacional compreende uma interface de rede. Em algumas modalidades, a interface de rede está configurada para se comunicar por meio de links de comunicação com ou sem fio. Por exemplo, uma interface de rede pode permitir a comunicação em redes via Ethernet, IEEE

802.11 (Wi-Fi), 802.16 (Wi-Max), Bluetooth, infravermelho, etc. Como outro exemplo, a interface de rede pode permitir a comunicação em redes como CDMA, GSM, UMTS, ou outras redes de comunicação celular. Em algumas modalidades, a interface de rede pode permitir conexões ponto a ponto com outro dispositivo, tal como via barramento serial universal (em inglês universal serial bus - USB), 1394 FireWire, conexões seriais ou paralelas, ou interfaces similares. Algumas modalidades de dispositivos de computador adequados podem compreender duas ou mais interfaces de rede para comunicação em uma ou mais redes. Em algumas modalidades, o dispositivo computacional pode incluir um os dados armazenados em adição a ou no lugar de uma interface de rede.

[0212] Algumas modalidades de dispositivos de computador adequados podem compreender ou estar em comunicação com uma série de dispositivos externos ou internos, como um mouse, a CD-ROM, DVD, um teclado, uma tela, alto-falantes de áudio, um ou mais microfones, ou quaisquer outros dispositivos de entrada ou saída. Por exemplo, o dispositivo computacional pode estar em comunicação com vários dispositivos de interface de usuário e uma tela. A tela pode utilizar qualquer tecnologia adequada incluindo, porém não limitada a, LCD, LED, CRT e similares.

[0213] O conjunto de instruções de execução pelo sistema de computador pode incluir vários comandos que instruem a máquina de processamento a realizar tarefas específicas tal como as etapas que constituem o método da presente técnica. O conjunto de instruções pode ser na forma de um programa de software. Além disso, o software pode ser na forma de uma coleção de programas separados, um módulo de programa com um programa maior ou uma porção de um módulo de programa, como na técnica atual. O software também pode incluir programação modular na forma de programação orientada a objetos. O processamento de dados de entrada pela máquina de processamento pode ser em resposta a comandos do usuário, resultados de processamento anterior, ou uma solicitação feita por outra máquina de processamento.

[0214] Embora a presente invenção tenha sido divulgada com referências a certas modalidades, inúmeras modificações, alterações e mudanças nas modalidades descritas são possíveis sem se afastar do escopo e do âmbito da presente invenção, conforme definido nas reivindicações anexas. De acordo com isto, pretende-se que a presente invenção não se limite às formas descritas, mas que tenha todo o âmbito definido pela linguagem das reivindicações a seguir, e seus equivalentes.

EXEMPLOS

[0215] Os exemplos a seguir descrevem a detecção de um baixo número de células, até mesmo uma única bactéria, em um tempo reduzido para resultados e são para ilustrar porém não limitar a invenção. Exemplo 1. Detecção de micro-organismo de interesse em cultura bacteriana

[0216] Este exemplo demonstra o desempenho do método de detecção utilizando o aparelho com detecção bem sucedida de bactérias presentes em uma cultura bacteriana. Montagem do aparelho

[0217] 100 µL de coquetel de fago A511/P100 (1.2 x 109 PFU / mL) e 100 µL de meio BHI + 1mM de CaCl2 foram adicionados bulbo superior do aparelho (primeiro compartimento). O fago A511/p100 é um fago que direciona para Listeria moncytogenes. Um prensado de suporte sólido foi usado para pressionar os principais componentes do aparelho juntos. O tubo do aparelho foi preenchido com 900 µL de meio BHI + 1mM de CaCl2. O suporte sólido foi então posicionado no tubo do aparelho para absorber um pouco do meio. O aparelho montado (contendo suporte sólido embebido em meio) foi então mantido durante a noite a 4 ºC. Crescimento da cultura de bactérias

[0218] Listeria moncytogenes foram cultivadas durante a noite em meio BHI (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) em uma incubadora com agitação. A cultura durante a noite foi então subcultivada em meio BHI até a fase log a 37 ºC. As células na fase log foram, então, diluídas para o número apropriado de células (vide a Figura 2). O suporte sólido foi removido do aparelho e as culturas diluídas foram adicionadas ao suporte sólido no nível de UFC indicados. O suporte sólido foi então perfurado com bactérias ou meio isolado (controle) foram colocados de volta no tubo do aparelho e o tubo foi agitado suavemente para misturar o conteúdo. (Figura 2, Tabela 1).

[0219] Em um experimento similar, 2 suportes sólidos foram perfurados, cada, com 10 UFC das bactérias. Uma amostra não inoculada foi usada como um controle. Essas amostras foram incubadas durante a noite a 35 °C para expandir o número de bactérias antes da infecção e exposição do substrato (Figura 2, Tabela 2). Infecção

[0220] A selagem de ação rápida foi, então, rompida ao segurar o suporte sólido firmemente e romper a selagem com o polegar e dedo indicador. O fago (200 µL de 6 x 108 PFU / mL) foi expelido ao apertar o bulbo na parte superior do tubo de suporte sólido. O conteúdo no tubo do suporte sólido foi suavemente misturado por turbilhonamento. O suporte sólido foi então colocado em uma incubadora a 30 °C por 4 horas para infecção do fago das bactérias. O substrato NanoGlo (Promega, Madison, WI) foi diluído 1:4 com 70 % de etanol e 10 µL de substrato diluído foi adicionado no tubo do suporte sólido. O conteúdo do tubo do aparelho foi misturado por vórtice e então deixado descansar por 3 minutos. Detecção

[0221] Três métodos de detecção foram utilizados. O tubo do suporte sólido foi inserido dentro do luminômetro portátil Hygiena. 1 mL da mistura de infecção foi removido e transferido para um tubo de micro centrífuga de 1.5 mL para leitura com luminômetro GloMax 20 / 20 (“GloMax 20 / 20”), e 150 µl da mistura de infecção foi transferida para a placa de 96 poços para ser lida em um luminômetro GloMax (“GloMax”).

[0222] A detecção foi então realizada com suportes sólidos que foram embebidos em meio durante a noite, com um tempo de infecção de 2 horas. Os resultados são mostrados na FIG. 2, Tabelas 1 e 2 e as representações gráficas dos resultados são mostrados na FIG. 3A e 3B. Os resultados mostram que com nenhum enriquecimento de crescimento (nenhum cultivo durante a noite da amostra antes da captura com o suporte sólido), o teste é sensível o suficiente para detectar 25000 UFC em um luminômetro portátil Hygiena (FIG. 3A) – as leituras por amostras inoculadas com bactérias foram todas acima do critério de limite de detecção de 10 unidades de luminescência relativa (RLU) para amostras positivas e detectam aproximadamente 5000 CFU em um GloMax 20 / 20 ou um GloMax (FIG. 3B). Exemplo 2. Detecção de Salmonella amostras de peru Montagem do aparelho

[0223] O aparelho foi montado tal como descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que o bulbo superior estava preenchido com 100 µL de coquetel de fago SEA1/TSP1 (1.2 x 107 PFU / mL) e 100 µL de meio TSB (ThermoFisher Oxoid, Grand Island, NY USA) e o tubo do aparelho foi preenchido com 1 mL de meio TSB. O fago SEA1/TSP1 é um fago que direcionada para Salmonella. Inoculação bacteriana de peru moído

[0224] A cultura de Salmonella foi cultivada durante a noite e diluída para amostras com UFC altos e baixos tal como descrito abaixo.

[0225] 25g de porções teste de peru moído foram divididas em três grupos: grupo não inoculado (5 amostras), grupo altamente inoculado (5 amostras), e grupo pouco inoculado (20 amostras). Cada amostra de 25 g do grupo alto foi inoculado com 2 - 10 UFC de Salmonella, e cada amostra do grupo baixo foi inoculada com 0.2 - 2 UFC de Salmonella. As amostras foram então colocadas em sacos de amostra filtrada e armazenadas a 4 ºC por 48 - 72 horas. Enriquecimento de bactérias no peru moído inoculado

[0226] Meio TSB pré aquecido (41 ºC) foi adicionado a cada amostra em uma proporção de amostra para o meio de 1:3. A amostra foi então misturada em STOMACHER® por 30 segundos em ajuste alto, e então incubada a 41 ºC sem agitação por 24 horas para enriquecer as bactérias na amostra. Amostragem

[0227] A amostra teste foi obtida ao mergulhar o suporte sólido em cada amostra enriquecida e ao girar por 10 segundos para absorver a quantidade máxima de amostra. O suporte sólido foi posicionado no tubo do aparelho preenchido com meio TSB. O tubo foi agitado suavemente para misturar o conteúdo no tubo, e então imediatamente infectado ou colocado a 37 °C por mais uma hora antes da infecção. Infecção

[0228] A selagem de ação rápida do compartimento que contém o bacteriófago foi, então, rompida ao segurar o suporte sólido firmemente e romper a selagem com o polegar e dedo indicador. O fago (200 µL de 6 x 106 PFU / mL) foi expelido para dentro do tubo ao apertar o bulbo na parte superior do tubo do aparelho. O conteúdo no tubo do aparelho foi gentilmente misturado por turbilhonamento. O suporte sólido foi então posicionado em uma incubadora a 37 °C por 30 min ou 2 horas para a infecção do fago das bactérias. O substrato NanoGlo (Promega, Madison, WI) foi diluído 1:4 com

70 % de etanol e 10 µL de substrato diluído foi adicionado no tubo do aparelho. O conteúdo do tubo do aparelho foi misturado por vórtice e então deixado descansar por 3 minutos. Os sinais foram detectados tal como descrito no Exemplo 1. Os resultados das amostras não inoculadas (grupo controle) são mostrados na FIG. 4, Tabela 3 e amostras inoculadas (grupo experimental) são mostrados na Tabela 4. A representação gráfica dos resultados é mostrada na FIG. 5A e FIG. 5B.

[0229] Os resultados mostram que cada um dos três dispositivos de detecção utilizados são capazes de detectar todas as amostras de peru que eram positivas para Salmonella após um enriquecimento da cultura de 24 hora. O sinal de GloMax e GloMax 20 / 20 foram muito mais altos do que do luminômetro Hygiena. O tempo de incubação (isto é, incubação do suporte sólido que capturou as bactérias com o meio antes da infecção) e tempo de infecção são fatores que podem afetar a intensidade do sinal. Dos vários tempos de incubação e tempos de infecção adicionais testados, o tempo de incubação de 0 hora e o tempo de infecção de 2 horas resultou nos RLUs mais altos seguido de amostras que apresentaram tempo de incubação de 1 hora e tempo de infecção de 0.5 hora, e então por amostras que apresentaram tempo de incubação de 0 hora e tempo de infecção de 0.5 hora. Os resultados também mostram que incubação de 0 hora e infecção de 2 horas apresentam sinal de fundo mais baixo. Exemplo 3. Estudos adicionais para o teste do efeito do tempo de infecção na sensibilidade do ensaio

[0230] O experimento foi configurado tal como descrito no Exemplo 2, exceto pelo fato de, após o suporte sólido ter sido mergulhado na amostra bacteriana de peru, o suporte sólido foi posicionado em meio e a infecção é realizada imediatamente, isto é, sem tempo de incubação para que as bactérias no suporte sólido cresçam. O tempo de infecção variou de 30 min a 2 horas. Os sinais foram detectados tal como descrito acima. Os resultados das três amostras são mostrados na FIG. 6 e os dados são plotados nas FIG. 7A - 7C. Os resultados mostram que a infecção de 2 horas pode aumentar o sinal tal como indicado. As amostras 24 e 26 não mostraram sinal em Hygiena na infecção de 30 min porém mostraram em infecção de 2 horas.

[0231] As FIG. 8A - 8C mostram a comparação entre os diferentes dispositivos GloMax e GloMax 20 / 20. O GloMax e GloMax 20 / 20 mostraram resultados similares. Exemplo 4. Teste de L. monocytogenes 19115 em amostras de esponjas do meio ambiente

[0232] L. monocytogenes foram inoculadas sobre as superfícies dos revestimentos cerâmicos e permitidas secar e ficar em temperatura ambiente por 18 – 24 horas. Amostras de esponjas foram usadas para esfregar os revestimentos cerâmicos e as esponjas foram posicionadas em um saco para enriquecimento por 24 horas a 35 °C. O suporte sólido foi então usado para amostrar as amostras enriquecidas tal como descrito no Exemplo 2. 100 µL de fagos de Listeria (em uma concentração de 1.2 x 108 PFU / ml) foram usados para infectar a cultura bacteriana de peru por uma hora a 30 ºC. Os sinais foram detectados utilizando GloMax e Hygiena. Os resultados são mostrados na FIG. 9. Os resultados mostram que Hygiena portátil pode detectar amostra ambiental contaminada com L. monocytogenes.

Exemplo 5. Diferentes dispositivos de detecção

[0233] Experimentos foram configurados tal como descrito no Exemplo 2. O tempo de infecção do fago foi de 1 hora a 37 ºC. Os sinais foram lidos em GloMax, um luminômetro portátil da 3M (“3M”) e Hygiena. Os resultados são mostrados na FIG. 10. Isso mostra que o 3M é mais sensível na detecção dos sinais.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: um primeiro compartimento compreendendo um bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; e um segundo compartimento compreendendo um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal facilita a detecção do produto do gene indicador produzido como um resultado da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o componente de detecção de sinal ser um substrato e o gene indicador codificar uma enzima.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de a enzima ser uma luciferase.

4. Método para a detecção de um ou mais micro- organismos de interesse em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de: colocar em contato a amostra com um reagente infeccioso em um dispositivo, em que o um ou mais micro-organismos de interesse na amostra, se presente, são infectados pelo agente infeccioso, em que o dispositivo compreende: um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; colocar em contato o bacteriófago recombinante a partir do primeiro compartimento com a amostra de tal modo que o bacteriófago recombinante infecta o um ou mais micro- organismos na amostra, assim produzindo o produto do gene indicador, e detectar o produto do gene indicador em um segundo compartimento.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o segundo compartimento compreender um substrato, e em que a detecção do produto do gene indicador é realizada após colocar em contato o produto do gene indicador com um substrato.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o método ainda compreender a ligação dos micro-organismos na amostra a um suporte sólido.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido ser um grânulo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido compreender polietileno (PE), polipropileno (PP), poliestireno (PS), ácido poli láctico (PLA) e cloreto de polivinila (PVC).

9. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho ainda compreender um segundo compartimento contendo um substrato, e em que o método ainda compreende: adicionar a substância do segundo compartimento à amostra, simultaneamente com ou após a adição do bacteriófago recombinante.

10. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o primeiro compartimento compreender uma selagem, e em que colocar em contato o bacteriófago recombinante com a amostra é por rompimento da selagem, em que o rompimento da selagem faz com que o bacteriófago recombinante do primeiro compartimento esteja em contato com a amostra e infecte o um ou mais micro- organismos na amostra, assim produzindo o produto do gene indicador.

11. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago ser liofilizado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho compreender um terceiro compartimento contendo meio de crescimento.

13. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o método compreender incubar o suporte sólido que capturou o um ou mais micro-organismos de interesse no meio de crescimento por um período de tempo antes de adicionar o bacteriófago recombinante.

14. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o aparelho compreende um bloqueio para a mistura faseada do bacteriófago recombinante e o substrato com a amostra.

15. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido ser seco antes de ser colocado em contato a amostra.

16. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido ser embebido em meio antes de ser colocado em contato a amostra.

17. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o suporte sólido que capturou o um ou mais organismos ser incubado com o meio de crescimento em um terceiro compartimento antes de ser colocado em contato com o bacteriófago recombinante.

18. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de a incubação ser de 0 - 2 horas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o bacteriófago ter estado em contato com a amostra por 0.2 - 3 horas antes da detecção do produto do gene indicador.

20. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o produto do gene indicador compreender pelo menos um de um fluoróforo, uma proteína fluorescente, uma partícula, e uma enzima.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de a enzima compreender pelo menos um de uma luciferase, uma fosfatase, uma peroxidase, e uma glicosidase.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de a luciferase ser um gene da luciferase geneticamente projetada.

23. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra de alimentos, amostra ambiental, água, comercial ou clínica.

24. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de o método detectar tão pouco quanto 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou uma única bactéria em uma amostra de um tamanho padrão para a indústria de segurança alimentar.

25. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra compreender carne ou vegetais.

26. Método, de acordo com a reivindicação 4,

CARACTERIZADO pelo fato de a amostra ser uma amostra de alimentos, água, laticínios, amostra ambiental, comercial ou clínica.

27. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de a amostra é primeiro incubada em condições que favorecem o crescimento por um período de enriquecimento de 9 horas ou menos, 8 horas ou menos, 7 horas ou menos, 6 horas ou menos, 5 horas ou menos, 4 horas ou menos, 3 horas ou menos, ou 2 horas ou menos.

28. Sistema para a detecção de micro-organismo de interesse em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de compreender: um aparelho compreendendo: um primeiro compartimento compreendendo o bacteriófago recombinante apresentando um constructo genético inserido em um genoma de bacteriófago, em que o constructo compreende um promotor e um gene indicador; e um componente de detecção de sinal, em que o componente de detecção de sinal pode detectar o produto do gene indicador produzido a partir da infecção da amostra com o bacteriófago recombinante.

29. Sistema, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de o componente de detecção de sinal ser um luminômetro portátil.