JP2022512167A - 微生物の検出のための自己完結型装置およびシステム - Google Patents

Abstract

組換えバクテリオファージを使用する微生物の迅速な検出のためのデバイス、方法、およびシステムを本明細書中に開示する。組換えバクテリオファージの微生物結合の特異性により、目的の微生物を標的にした特異性の高い検出を可能にする。上記デバイスは、個別の区画を含み得、このデバイスの個別の区画は、使用者が検出方法の種々の段階で異なる区画由来の内容物を組み合わせることが可能であるように構成され得る。例えば、試験すべき試料を、１つの区画内でバクテリオファージと組み合わせ、この内容物をデバイスの別の区画の内容物（基質など）に添加する前にいくらかの期間にわたってインキュベートし得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年１２月１０日出願の米国仮出願第６２／７７７，４７３号および２０１９年１月３０日出願の同第６２／７９８，９８０号に基づく優先権を主張する。米国特許出願第１３／７７３，３３９号、同第１４／６２５，４８１号、同第１５／２６３，６１９号、同第１５／４０９，２５８号、同第１６／２９８，６９５号、ならびに米国仮出願第６２／６１６，９５６号、同第６２／６２８，６１６号、同第６２／６６１，７３９号、同第６２／６４０，７９３号、および同第６２／７９８，９８０号の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。

発明の分野
本発明は、組換えバクテリオファージを使用して目的の微生物を検出するための方法、装置、デバイス、およびシステムに関する。

背景
生物試料、食品試料、水試料、および臨床試料中の細菌、ウイルス、および他の微生物の検出速度および検出感度の改善に高い関心が寄せられている。微生物病原体はヒトおよび家畜の多くを罹患させることができ、大きな経済的損失ももたらし得る。ある特定の微生物（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、大腸菌、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）で汚染された食品の摂取に原因する生命を脅かす疾病または致死的な疾病の激増を考慮すると、微生物の検出は、食品医薬品局（ＦＤＡ）および疾病管理予防センター（ＣＤＣ）における優先度が高い。

細菌検出のための伝統的な微生物学的試験は、非選択的および選択的な増菌培養後の選択培地上のプレーティングおよび疑われるコロニーを確認するためのさらなる試験に依存する。かかる手順には、数日間を要し得る。種々の迅速な方法が調査されており、所要時間を削減させるために導入されている。しかしながら、これまでの所要時間の削減方法には欠点がある。例えば、直接的な免疫アッセイおよび遺伝子プローブに関与する技術には、一般に、適切な感度を得るための一晩の富化工程が必要であり、したがって、当日に結果を得られない。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験は、増幅工程を含み、したがって、非常に高い感度および選択性の両方を実現することができる；しかしながら、ＰＣＲ試験に経済的に供することができるサンプルサイズは制限される。ＰＣＲに供することができる希釈細菌懸濁液はおそらく細胞を含まず、したがって、精製および／または時間のかかる富化工程は依然として必要である。

伝統的な生物学的富化の所要時間は、試料の標的細菌集団の増殖速度、試料マトリックスの影響、および必要な感度によって決定づけられる。実際に、最も感度の高い方法は、一晩のインキュベーションを使用し、全体として約２４時間を要する。培養の所要時間に起因して、これらの方法は、識別すべき生物および試料の供給源に応じて最大で３日間かかり得る。この時間の遅延は、かかる遅延が食物または水または他の製品を汚染し、これらが家畜またはヒトに取り込まれるので、一般に不適である。さらに、抗生物質耐性菌の増加および生物兵器防衛上の懸念から、水試料、食品試料、および臨床試料中の細菌性病原体を迅速に識別することは世界的に重大な優先事項となっている。

したがって、細菌および他の潜在的に病原性を示す微生物などの微生物のより迅速、簡潔、および感度の高い検出および識別が必要である。

要旨
本発明の実施形態は、微生物の検出のためのデバイス、組成物、方法、装置、システム、およびキットを含む。本発明を、種々の方法で具体化することができる。

本発明の態様は、簡単で簡潔な微生物検出を容易にするためのデバイスを含む。組換えバクテリオファージを使用して試験試料中の微生物を検出するためのアッセイの実施のための装置またはデバイスを本明細書中に記載する。

１つの態様では、本発明は、微生物に結合して低レベルの微生物を検出することができるバクテリオファージの特異性の高さを利用する。いくつかの実施形態では、本方法は、食品安全性業界の標準サイズに対して試料中の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または単一ほどの少数の細菌を検出する。他の実施形態では、試料を、９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化期間で好ましい増殖条件にて最初にインキュベートする。いくつかの実施形態では、試料は、組換えバクテリオファージとのインキュベーション前に富化されない。

いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージを、以前に記載のようにレポーター遺伝子を含むように遺伝子改変する。さらなる実施形態では、組換えバクテリオファージは、検出すべき微生物に特異的なバクテリオファージに由来する。例えば、組換えバクテリオファージは、以下のバクテリオファージのうちのいずれかに由来し得る：ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージε１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、または大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０。

いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージを、安定化または保存してよい。例えば、組換えバクテリオファージを凍結乾燥してよい。

ある特定の実施形態では、レポーターは、指標部分を生成する。ある特定の実施形態では、指標部分は、内因性シグナルを生成することができる。他の実施形態では、指標部分は、基質との反応の際にシグナルを生成する酵素を含む。さらに他の実施形態では、指標部分は、１またはそれを超えるさらなるシグナル産生成分との反応の際にシグナルを生成する補因子を含む。例えば、指標部分は、フルオロフォア、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１つを含む。酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１つを含み得る。ルシフェラーゼ遺伝子は、天然に存在する遺伝子（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ルシアルシフェラーゼ、またはウミイシイタケルシフェラーゼなど）であり得るか、遺伝子操作された遺伝子であり得る。

本発明のいくつかの実施形態は、検出方法を実施するためのデバイスまたは装置を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、個別の区画を含み得る。いくつかの実施形態では、デバイスの個別の区画は、使用者が検出方法の種々の段階で異なる区画由来の内容物を組み合わせることが可能であるように構成され得る。例えば、試験すべき試料を、１つの区画内でバクテリオファージと組み合わせ、この内容物をデバイスの別の区画の内容物（基質など）に添加する前にいくらかの期間にわたってインキュベートしてよい。かかる実施形態では、基質は、組換えバクテリオファージによる感染（例えば、標的微生物が試料中に存在する場合）の結果として産生された任意のレポーター（または指標部分）と反応し得る。

いくつかの実施形態は、デバイスであって、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前述の構築物が、プロモーターおよび指標遺伝子を含む、第１の区画；およびシグナル検出構成要素を含む第２の区画であって、前述のシグナル検出構成要素が、前述の試料への前述の組換えバクテリオファージの感染の結果として産生された前述の指標遺伝子産物の検出を容易にする、第２の区画を含む、デバイスを含む。いくつかの実施形態では、シグナル検出構成要素は基質であり、指標遺伝子は酵素をコードする。いくつかの実施形態では、酵素はルシフェラーゼである。

いくつかの実施形態では、装置は、組換えバクテリオファージ、試験試料の一部を組換えバクテリオファージに添加するための入口／入り口(inlet/portal)を含む第１の区画、および基質または他の対の試薬を含む第２の区画を含み、本方法は、組換えバクテリオファージの添加と同時またはその後に、第２の区画由来の基質を試料に添加する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、装置は、第３の区画を含む。第３の区画は、例えば、試料を富化するための増殖培地を含むことができる。他の実施形態では、装置は培地を含まない。

いくつかの実施形態では、装置はさらに、基質を含む第２の区画を含み、ここで、指標遺伝子産物を検出する工程は、指標遺伝子産物を基質と接触させることによる。いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、試料との接触前に乾燥している。いくつかの実施形態では、固体支持体は、試料との接触前に培地に浸漬している。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える生物を捕捉している固体支持体を、組換えバクテリオファージとの接触前に、第３の区画内の増殖培地と共にインキュベートする。

いくつかの実施形態では、固体支持体は、試料中の目的の微生物に高親和性で結合する細胞結合成分でコーティングされている。これにより、固体支持体により多くの細菌を結合させ、アッセイの感度および特異性を高めることが可能である。他の実施形態では、固体支持体は、目的の微生物に結合することができる抗体でコーティングされている。

いくつかの実施形態では、第１の区画はシールを含み、ここで、組換えバクテリオファージの試料との接触は、シールを破壊することにより、シールが破壊されると、第１の区画由来の組換えバクテリオファージが試料と接触して試料中の１またはそれを超える微生物に感染し、それにより、指標遺伝子産物（指標タンパク質）が産生される。さらなる実施形態では、装置は、培地、組換えバクテリオファージ、および基質の試料との段階的混合のためのストップ・ロックを含む。

いくつかの実施形態では、指標遺伝子産物は、フルオロフォア、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、遺伝子操作されたルシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、試料は、食品試料、環境試料、水試料、商業的試料、または臨床試料である。

別の態様では、試料中の１またはそれを超える目的の微生物を検出する方法は、前述の試料を装置の固体支持体と接触させる工程であって、前述の固体支持体は、前述の試料中の前述の１またはそれを超える微生物を、存在する場合に、捕捉する、接触させる工程、ここで、前述の装置が、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前述の構築物が、プロモーターおよび指標遺伝子を含む、第１の区画を含み、前述の第１の区画由来の前述の組換えバクテリオファージを、前述の組換えバクテリオファージが前述の試料中の１またはそれを超える微生物に感染するように前述の試料と接触させ、それにより、指標遺伝子産物を産生する、接触させる工程、および前述の指標遺伝子産物を検出する工程を含む。

いくつかの実施形態では、本方法は、組換えバクテリオファージを添加する前に、増殖培地中の１またはそれを超える目的の微生物を捕捉している固体支持体をある期間にわたってインキュベートする工程を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは０～２時間である。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、指標遺伝子産物の検出前に、試料と０．５～３時間接触されている。

いくつかの実施形態では、本方法は、食品安全性業界の標準サイズに対して試料中の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または単一ほどの少数の細菌を検出する。いくつかの実施形態では、試料は、食用肉または野菜を含む。いくつかの実施形態では、試料は、食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、または臨床試料である。

いくつかの実施形態では、試料を、９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化期間で好ましい増殖条件にて最初にインキュベートする。

さらなる実施形態は、組換えバクテリオファージを含む、微生物（Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、または大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７など）の検出のためのシステムおよびキットを含む。いくつかの実施形態は、組換えバクテリオファージの指標部分との反応のための基質をさらに含む。これらのシステムまたはキットは、本発明のバクテリオファージ、組成物、および方法について記載の特徴を含むことができる。さらなる他の実施形態では、本発明は、本発明にしたがって方法またはシステムと共に使用するための非一過性のコンピュータ可読媒体を含む。

別の態様では、本開示は、試料中の目的の微生物を検出するためのシステムであって、装置であって、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前述の構築物がプロモーターおよび指標遺伝子を含む、第１の区画；およびシグナル検出構成要素であって、前述のシグナル検出構成要素が、試料への組換えバクテリオファージの感染から産生された指標遺伝子産物を検出することができる、シグナル検出構成要素を含む装置を含む、システムを提供する。いくつかの実施形態では、シグナル検出構成要素はハンドヘルド照度計である。

本発明を、以下の非限定的な図面を参照することによって、より深く理解することができる。

図１は、組換えバクテリオファージを使用した目的の細菌の検出方法の１つの実施形態である。

図２は、固体支持体としてのスワブを有する自己完結型装置の１つの実施形態を使用したＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ培養物の検出結果を示す。細菌の存在に対応するシグナルを、Ｈｙｇｉｅｎａ照度計、ＧｌｏＭａｘ照度計、およびＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計によって検出した。表１は対数期培養物の結果を示し、表２は一晩培養物の結果を示す。

図３Ａおよび３Ｂは、表１に示したデータから作成したプロットである。図３Ａは、Ｈｙｇｉｅｎａを使用して検出されたシグナルの測定値を示す。スワブに、対数期の細胞を表示のＣＦＵレベルで播種した。試料に、直ちにＬｉｓｔｅｒｉａファージカクテルを４時間感染させた。基質を添加し、試料を、Ｈｙｇｉｅｎａ照度計で読み取った。１０ＲＬＵを超えるシグナルを、陽性と見なした。この方法を使用した場合、陽性の結果を得るにはおよそ２５，０００ＣＦＵが必要である。

図３Ｂは、ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ（ＧｌｏＭａｘ９６としても知られる）照度計を使用して検出されたシグナルの測定値を示す。スワブに、対数期の細胞を表示のＣＦＵレベルで播種した。試料に、直ちにＬｉｓｔｅｒｉａファージカクテルを４時間感染させた。基質を添加し、試料を、ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計（１ｍＬの試料）またはＧｌｏＭａｘ（１５０μｌの試料）照度計のいずれかで読み取った。シグナル／バックグラウンド比３．０超を陽性と見なす。この方法を使用した場合、陽性の結果を得るにはおよそ５，０００ＣＦＵが必要である。

図４は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが播種されているシチメンチョウ挽肉中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出結果を示す。表３は非播種対照試料を示し、表４は非接種シチメンチョウ試料を示す。試験を、種々の接種および感染時間を用いて繰り返した。

図５Ａおよび５Ｂは、図４中のデータから作成したプロットである。図６Ａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを播種したシチメンチョウ試料が、試験したあらゆるインキュベーションおよび感染時間で陽性として検出されたことを示す。シチメンチョウ試料を接種後に４１℃で２４時間増殖させ、その後に本出願に開示の方法を用いた試験を行った。相対シグナルについて：０時間インキュベーション、２時間感染＞１時間インキュベーション、０．５時間感染＞０時間インキュベーション、０．５時間感染。さらに、ＲＬＵシグナルを比較すると、ＧｌｏＭａｘ照度計がＨｙｇｉｅｎａ照度計よりもかなり高いシグナルを示すことを示す。

図５Ｂは、ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ照度計を使用した検出において、同一試料については類似のシグナル／バックグラウンド比を示すことを示す。ＧｌｏＭａｘ２０／２０はより大きなシグナルを示していたが（図５Ａ）、バックグラウンドがＧｌｏＭａｘよりも有意に高かった。したがって、シグナル／バックグラウンドを判定する場合、２つの照度計は同様に動作する。

図６は、自己完結型装置を使用したアッセイの前にＳａｌｍｏｎｅｌｌａを播種している３つのシチメンチョウ試料（試料２１、２４、および２６）におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出についてのデータを示す。試料を、シグナルの検出前に、表示の異なる時間にわたって感染させた。

図７Ａ～７Ｃは、図６に示したデータから作成したプロットである。図７Ａ～７Ｃは、３つの播種済みのシチメンチョウ挽肉試料を２４時間富化し、スワブ試料を取り、アッセイした実験の結果を示す。試料２４（図７Ｂ）および２６（図７Ｃ）は、Ｈｙｇｉｅｎａハンドヘルド照度計によって、３０分間ファージ感染させた試料についてはシグナルを示さなかったが、２時間感染させた試料についてはシグナルを示した。ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ照度計は、シグナルが相対的に低かった。

図８Ａ～８Ｃは、図６に示したデータから作成したプロットである。プロットは、ＧｌｏＭａｘ２０／２０およびＧｌｏＭａｘの両方が３０分間の感染で陽性として（シグナル／バックグラウンド比３．０超が陽性である）試料２１（図８Ａ）および２６（図８Ｂ）を検出することができたが、しかしながら、試料２４（図８Ｃ）は陽性の結果を示すために２時間の感染を要したことを示す。ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ照度計の結果は類似していた。

図９は、表面に播種し、２４時間富化したＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ環境スポンジ試料の検出についてのデータを示す。

図１０は、装置を使用したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ播種済みのシチメンチョウ試料中の微生物の検出を示す。シグナルを、以下の３つの異なる照度計を使用して測定した：ＧｌｏＭａｘ、３Ｍ、およびＨｙｇｉｅｎａ。

図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、３つの区画を含む容器に挿入されたスワブ（図１１Ａ）またはビーズ（図１１Ｂ）を有する、微生物を検出するための自己完結型装置システムの１つの実施形態の図を示す。各区画は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画はファージを含み、第２の区画は基質を含み、第３の区画は培地を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体はスワブである。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１１Ｃ）。

図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、３つの区画を含む容器に挿入されたスワブ（図１２Ａ）またはビーズ（図１２Ｂ）を有する、微生物を検出するための自己完結型装置システムの１つの実施形態の図を示す。各区画は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画はファージを含み、第２の区画は培地を含み、第３の区画は基質を含む。ファージおよび培地とのインキュベーション後、第２の区画および第３の区画を分離しているシールが破壊され得る。いくつかの実施形態では、固体支持体はスワブである。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１２Ｃ）。

図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、３つの区画を含む容器に挿入されたスワブ（図１３Ａ）またはビーズ（図１３Ｂ）を有する、微生物を検出するための自己完結型装置システムの１つの実施形態の図を示す。各区画は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画は培地を含み、第２の区画はファージを含み、第３の区画は基質を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体はスワブである。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１３Ｃ）。

図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、３つの区画を含む容器に挿入されたスワブ（図１４Ａ）またはビーズ（図１４Ｂ）を有する、微生物を検出するための自己完結型装置システムの１つの実施形態の図を示す。各区画は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画は培地を含み、第２の区画はファージを含み、第３の区画は基質を含む。装置は、試薬の段階的混合のためのストップ・ロック機構を有する。いくつかの実施形態では、固体支持体はスワブである。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１４Ｃ）。

図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、３つの区画を含む容器に挿入されたスワブ（図１５Ａ）またはビーズ（図１５Ｂ）を有する、微生物を検出するための自己完結型装置システムの１つの実施形態の図を示す。各区画は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画は培地を含み、第２の区画はファージを含み、第３の区画は基質を含む。装置は、試薬の段階的混合のためのストップ・ロック機構を有する。いくつかの実施形態では、固体支持体はスワブである。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１５Ｃ）。

図１６は、２つの区画を含む容器に挿入されたスワブを有する、微生物を検出するためのシステムのための自己完結型装置システムの１つの実施形態の図を示す。各区画は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画はファージを含み、第２の区画は基質を含む。いくつかの実施形態では、固体支持体はスワブである。

図１７は、微生物の検出のための自己完結型装置システムを利用した実施形態の流れ図を示す。

発明の詳細な説明
定義
本明細書中に別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で別段の必要性が無い限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書中に記載の細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質化学および核酸化学ならびにハイブリッド形成に関連して使用される命名法およびその技術は、当該分野で周知であり、一般的に使用されるものである。別段の指示がない限り、公知の方法および技術は、一般に、当該分野で周知であり、かつ本明細書全体で考察される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。酵素反応および精製技術は、当該分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載の実験の手順および技術に関連して使用される命名法は、当該分野で周知であり、一般的に使用されているものである。

以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解するものとする。

本明細書中で使用される場合、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の具体的記載が無い限り、１または複数を指し得る。

用語「または」の使用は、代替物のみを指すように明記されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持している。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第２またはそれを超えること意味し得る。

本出願全体を通して、用語「約」は、値がデバイスの誤差の固有の変動、値を決定するために使用される方法、または試料間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

用語「固体支持体」または「支持体」は、生体分子が結合され得る基板および／または表面を提供する構造を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレートなど）であり得るか、固体支持体は、フィルター、アレイ、またはビーズもしくはメンブレン（例えば、濾板または側方流動ストリップ）などの可動支持体上の位置であり得る。

用語「標識」または「指標部分」または「検出可能な部分」または「検出可能な生体分子」または「レポーター」または「標識」は、定性アッセイまたは定量アッセイで測定することができるシグナルを提供する分子を指す。例えば、指標部分は、基質を測定可能な生成物に変換するために使用することができる酵素を含み得る。指標部分は、生物発光を生じる反応を触媒する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ、またはＡＰ）であり得る。あるいは、指標部分は、定量することができる放射性同位体であり得る。あるいは、指標部分はフルオロフォアであり得る。あるいは、他の検出可能な分子が使用され得る。

本明細書中で使用される場合、「バクテリオファージ」または「ファージ」には、複数の細菌ウイルスのうちの１または複数が含まれる。本開示では、用語「バクテリオファージ」および「ファージ」には、マイコバクテリオファージ（ＴＢおよびｐａｒａＴＢなどを対象とする）、マイコファージ（真菌などを対象とする）、マイコプラズマファージなどのウイルス、ならびに生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の微視的生命体に侵入することができ、これらを利用して自身を複製するウイルスを指す任意の他の用語が含まれる。ここで、「微視的」とは、最大寸法が１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、自己複製手段として細菌を使用するように自然に進化したウイルスである。

本明細書中で使用される場合、「富化培養」、「富化のために培養すること」、「富化のために培養した」、または「富化のための培養」は、微生物の増殖に好ましい培地中でのインキュベーションなどの伝統的な培養を指し、用語「富化」の他の考えられる使用（液体に含まれる微生物を濃縮するために試料の液体成分を除去することによる富化、または微生物増殖の伝統的な促進を含まない他の富化形態など）と混同すべきではない。本明細書中に記載の方法のいくつかの実施形態において、短期間の富化のための培養を使用することができるが、培養を使用する場合、富化のための伝統的な培養期間を必要とせず、伝統的な培養期間より遥かに短い期間である。

本明細書中で使用される場合、「組換え」は、本来は見出されない遺伝子材料を結合させるために実験室で通常行われる遺伝子（すなわち、核酸）改変を指す。この用語は、本明細書中で「改変された」という用語と互換的に使用される。

本明細書中で使用される場合、「ＲＬＵ」は、照度計（例えば、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６）または光を検出する類似の装置によって測定される相対的な光の単位を指す。例えば、ルシフェラーゼと適切な基質との間の反応（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）のＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）との反応）の検出は、検出されたＲＬＵで報告されることが多い。
概要

本発明は、特定の微生物に高親和性で結合して試料中の特異的微生物の存在および／または量を検出することができる組換えバクテリオファージの特異性の高さを利用する。

富化のための培養を使用しないか、いくつかの実施形態では、微生物が潜在的に増殖することができるインキュベーション期間が最短の実施されるアッセイを使用して、試験試料（例えば、食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、臨床試料、または他の生物試料）中の目的の微生物の検出が驚異的な感度および速度であることが実証される組成物、方法、キット、およびシステムを本明細書中に開示する。これらの組成物、方法、キット、およびシステムは、以前に可能であると考えられていた時間枠よりも短い時間枠で微生物の検出が可能である。

本発明の組成物、方法、キット、およびシステムの実施形態を、種々の環境中の種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出（食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、臨床試料、または他の生物試料由来の病原体の検出が含まれるが、これらに限定されない）に適用することができる。本明細書中に開示の組換えバクテリオファージベースの検出実施形態は、検出を意図しない微生物を認識しない特異的バクテリオファージを利用可能な目的の任意の細菌または他の微生物（例えば、病原性微生物）に適応し得る。本発明の方法は、迅速かつ伝統的な生物学的富化（例えば、培養）を必要とせずに、高い検出感度および特異性を提供する。したがって、本発明の方法を使用して種々の微生物が検出され得る。

本発明の方法およびシステムの実施形態を、種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出および定量（食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、臨床試料、または他の生物試料由来の病原体の検出が含まれるが、これらに限定されない）に適用することができる。本発明の方法は、伝統的な生物学的富化（例えば、培養）を必要とせずに高い検出感度および特異性を迅速に提供することができ、所望の感度および特異性を有する全ての利用可能な方法が培養を必要とするので、これは驚くべき態様である。

試験試料（例えば、食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、臨床試料、または他の生物試料）中の微生物を検出するための装置を使用するシステムおよび方法も本明細書中に開示する。本方法は、試料を回収するために使用することができる固体支持体を含む自己完結型装置を使用する。前述の装置は、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有するバクテリオファージを含む第１の区画をさらに含み、ここで、前述の構築物は、プロモーターおよび指標遺伝子を含む。本方法は、第１の区画由来の組換えバクテリオファージを、前述の組換えバクテリオファージが試料中の１またはそれを超える微生物を感染させ、それにより指標遺伝子産物（「指標」）が産生されるように、試料と接触させる工程、および前述の指標を検出する工程を含む。いくつかの態様では、装置は、指標の検出に特異的な基質を含む第２の区画をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、バクテリオファージが感染している試料を基質と接触させ、それにより、指標が検出される、接触させる工程をさらに含む。これらの実施形態では、各区画は、スナップ動作シールによって直接隣接した区画と分離しており、このシールが破壊された際に、区画の内容物が区画から抜け出し、試料または他の区画由来の内容物と混合される。例えば、使用者は、第１の区画由来の組換えバクテリオファージが固体支持体上の試料と接触するようにスナップ動作シールを破壊し、それにより、固体支持体上に結合している微生物に感染させることができる。微生物の感染の際に、指標遺伝子が発現して指標タンパク質が産生され、この指標タンパク質を種々の検出デバイスによって検出することができる。シグナルの存在は、試料中に微生物が存在することを示す。

本発明の装置、組成物、方法、キット、およびシステムの実施形態を、種々の環境中の種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出（食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、臨床試料、または他の生物試料由来の病原体の検出が含まれるが、これらに限定されない）に適用することができる。本明細書中に開示の検出実施形態は、意図しない他の微生物を認識しない特異的組換えバクテリオファージを利用可能な目的の任意の細菌または他の微生物（例えば、病原性微生物）に適応し得る。本発明の方法は、迅速かつ伝統的な生物学的富化（例えば、培養）を必要とせずに、高い検出感度および特異性を提供する。所望の感度および特異性を有する全ての利用可能な方法が培養を必要とするので、これは驚くべき態様である。微生物検出に必要な試薬を検出時まで個別の区画内に収容している自己完結型装置を使用した試料中の微生物の検出は、便利かつ効率的である。装置は、使用が容易であり、広範囲の訓練は必要ない。
試料

本発明の組成物、方法、キット、およびシステムの実施形態の各々により、試料中の微小生物を迅速に検出および／または定量することが可能である。例えば、本発明の方法を、短期間で実施し、より優れた結果を得ることができる。

ある特定の実施形態では、組換えバクテリオファージを、目的の微生物を検出するために使用する。本発明の組成物、方法、キット、およびシステムによって検出することができる微生物には、商業的、医学的、または獣医学的に懸念される病原体が含まれる。特定の微小生物に特異的な組換えバクテリオファージが識別されている任意の微生物を、本発明の方法によって検出することができる。当業者は、必要な組換えバクテリオファージ／微生物の対の利用可能性以外に本方法の適用に制限がないことを理解するであろう。

本発明によって検出可能な細菌細胞には、食品または水媒介性の病原体である細菌細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって検出可能な細菌細胞には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの全ての種、大腸菌の全ての種（大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（および他の志賀毒素－および大腸菌のエンテロトキシン産生株）が含まれるが、これらに限定されない）、Ｌｉｓｔｅｒｉａの全ての種（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが含まれるが、これらに限定されない）、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの全ての種が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって検出可能な細菌細胞には、医学的または獣医学的に重要な病原体である細菌細胞が含まれるが、これらに限定されない。かかる病原体には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．が含まれるが、これらに限定されない。

試料は、環境試料、食品試料、または水試料であり得る。試料は、医学的試料または獣医学的試料であり得る。試料は、液体、固体、または半固体であり得る。試料は、固体表面のスワブであり得る。試料には、水試料などの環境材料、または空気試料由来のフィルター、またはサイクロン集塵機由来のエアロゾル試料が含まれ得る。試料は、牛肉、家禽類、加工食品、ミルク、チーズ、または他の乳製品の試料であり得る。医学的または獣医学的試料には、血液、痰、脳脊髄液、および糞便の試料が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、試料は、様々なタイプのスワブであり得る。

いくつかの実施形態では、試料を、調製、濃縮、または希釈することなく、本発明の検出方法で直接使用することができる。例えば、液体試料（ミルクおよび果汁が含まれるが、これらに限定されない）を、直接アッセイすることができる。他の実施形態では、試料を、溶液（緩衝液または細菌培養培地が含まれ得るが、これらに限定されない）に希釈または懸濁することができる。固体または半固体である試料を、液体中で固体を細かく刻むか、混合するか、浸軟することによって液体に懸濁することができる。いくつかの実施形態では、試料を、宿主細菌細胞への組換えバクテリオファージの付着を促進するｐＨ範囲内で維持すべきである。いくつかの実施形態では、好ましいｐＨ範囲は、細菌細胞に付着したバクテリオファージに適切なｐＨ範囲であり得る。試料はまた、適切な濃度の二価および一価のカチオン（Ｎａ^＋、Ｍｇ^２＋、およびＫ^＋が含まれるが、これらに限定されない）を含むべきである。

いくつかの実施形態では、試料は、試料中に存在する任意の病原体細胞の生存率を維持する温度に維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着している工程中、試料は、バクテリオファージの活動が容易になる温度に維持され得る。かかる温度は少なくとも約２５℃かつ約４５℃以下である。いくつかの実施形態では、試料は約３７℃に維持される。いくつかの実施形態では、試料は、組換えバクテリオファージの結合または感染中に、穏やかな混合または振盪に供される。
微生物検出のための組換えバクテリオファージの使用方法

目的の微生物を検出するための組換えバクテリオファージの使用方法は、以前に記載されている。アッセイは、種々の適切な対照試料を含み得る。例えば、組換えバクテリオファージを含まない対照試料および／または組換えバクテリオファージを含むが細菌を含まない対照試料は、バックグラウンドシグナルレベルの対照としてアッセイされ得る。

本明細書中に述べたように、ある特定の実施形態では、本発明は、微生物を検出するための組換えバクテリオファージの使用方法を含み得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。

いくつかの態様では、本発明は、目的の微生物を検出する方法を含む。本方法は、目的の微生物の検出のために組換えバクテリオファージを使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、目的の微生物は細菌であり、組換えバクテリオファージは、目的の細菌を特異的に認識するバクテリオファージに由来する。ある特定の実施形態では、本方法は、目的の細菌に結合することができる複数の組換えバクテリオファージと試料をインキュベートすることによる試料中の目的の細菌の検出を含み得る。単一の微生物に結合する複数の組換えバクテリオファージは、１を超える任意の数であるが、好ましくは、少なくとも５×１０^４個、または少なくとも１×１０^５個、または少なくとも１×１０^６個、または少なくとも１×１０^８個、または少なくとも１×１０^９個、または少なくとも１×１０^１０個の組換えバクテリオファージである。

ある特定の実施形態では、組換えバクテリオファージは指標部分を含む。本方法は、組換えバクテリオファージの指標部分を検出することを含み得、ここで、指標部分の陽性の検出は目的の細菌が試料中に存在することを示す。

いくつかの実施形態では、本発明は、試料中のわずか１つの目的の微生物でさえも検出する方法を含み得、本方法は、以下の工程を含む：試料を目的の微生物に結合する複数の組換えバクテリオファージとインキュベートする工程であって、ここで、組換えバクテリオファージが指標部分を含み、複数の組換えバクテリオファージが目的の細菌に結合するような条件下で、試験すべき試料と接触される、インキュベートする工程；細胞に結合した組換えバクテリオファージから非結合組換えバクテリオファージを分離する工程；および細菌感染に起因する指標部分を検出する工程であって、ここで、指標部分の陽性の検出が、試料中に目的の微生物が存在することを示す、検出する工程。実施形態は、試料を、少なくとも５×１０^８個、または少なくとも５×１０^９個、または少なくとも５×１０^１０個、または少なくとも５×１０^１１個、または少なくとも５×１０^１２個、または少なくとも５×１０^１３個の組換えバクテリオファージとインキュベートする工程を含み得る。

いくつかの実施形態では、検出工程には、指標酵素と作用させるための基質の添加が必要であろう。特定の指標の選択は本発明に重要ではないが、指標は、それ自体、または装置によって検出可能であるか、１またはそれを超えるさらなるシグナル生成構成要素と併せて（酵素／基質シグナル生成システムなど）検出可能なシグナルを生成することができるであろう。

ある特定の実施形態では、特異的な微生物の存在を識別するための組換えバクテリオファージを利用してアッセイを行ってもよい。異なる試料のタイプまたはサイズおよびアッセイ形式に適応するようにアッセイを修正することができる。本発明の組換えバクテリオファージを使用する実施形態は、特異的細菌株を、試料のタイプ、試料サイズ、およびアッセイ形式に応じて、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、または１２時間未満の総アッセイ時間で迅速に検出することが可能であり得る。例えば、必要とされる時間は、組換えバクテリオファージの親和性ならびに／またはアッセイで検出すべき細菌のタイプ、試験すべき試料のタイプおよびサイズ、物理的／化学的環境の複雑さ、および内因性の非標的細菌夾雑物の濃度に応じて、いくらか短いか長い場合がある。

図１は、本発明の実施形態にしたがって組換えバクテリオファージを使用した目的の細菌を検出するためのアッセイの実施形態を示す。多種多様な配置および試薬の組み合わせ工程が可能である。ここに示した実施形態では、指標ファージ（または凍結乾燥した指標ファージ）のアリコートは、デバイスの第１の区画に含まれている。細菌を含むスワブを第１の区画に導入し、ファージが複製して可溶性の指標（例えば、ルシフェラーゼ）が生成されるのに十分な期間（例えば、３７℃で４５分間）インキュベートする。次いで、可溶性指標およびファージを含む第１の区画と第２の区画との間のシールを破壊すると、可溶性指標タンパク質が第２の区画内に含まれる基質と接触するようになり得る。指標（例えば、ルシフェラーゼ）の基質との反応を検出するために照度計が使用され得る。この方法を利用した実験を、本明細書中に記載する。いくつかの実施形態では、感染後、デバイスの内容物を、感染した細菌を基質と混合するために第１の区画に引き戻すことができる。さらなる実施形態では、次いで、指標シグナルを照度計で読み取ることができるように、内容物を第２の区画に押し戻すことができる。

いくつかの実施形態では、増殖を促進する条件でのインキュベーションによって、試験前に試料が富化され得る。かかる実施形態では、富化期間は、試料のタイプおよびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７時間、または最大８時間までまたはそれを超える期間であり得る。

したがって、いくつかの実施形態では、指標バクテリオファージは検出可能な指標部分を含み、単一の病原性細胞（例えば、細菌）の感染を、指標部分を介して生成される増幅シグナルによって検出することができる。したがって、本方法は、ファージの複製中に産生される指標部分を検出する工程を含んでよく、ここで、指標の検出は、目的の細菌が試料中に存在することを示す。

いくつかの実施形態では、指標バクテリオファージは検出可能な指標部分を含み、単一の病原性細胞（例えば、細菌）の感染を、指標部分を介して生成される増幅シグナルによって検出することができる。したがって、本方法は、ファージの複製中に産生される指標部分を検出する工程を含んでよく、ここで、指標の検出は、目的の細菌が試料中に存在することを示す。

本明細書中により詳細に記載されるように、本発明の方法およびシステムは、試料中に存在する細菌に感染する濃度範囲の親指標バクテリオファージを利用し得る。いくつかの実施形態では、指標バクテリオファージを、試料中の非常に少数で存在する標的細菌（単一細胞など）を迅速に発見し、結合し、感染するのに十分な濃度で試料に添加する。いくつかの実施形態では、ファージ濃度は、１時間未満に標的細菌を発見し、結合し、感染するのに十分であり得る。他の実施形態では、これらの事象は、試料への指標ファージの添加後、２時間未満または３時間未満に起こり得る。例えば、ある特定の実施形態では、インキュベーション工程のためのバクテリオファージ濃度は、１×１０^５ＰＦＵ／ｍＬ超、１×１０^６ＰＦＵ／ｍＬ超、または１×１０^７ＰＦＵ／ｍＬ超である。

本発明の方法は、感度を上げるための種々の他の工程を含み得る。例えば、本明細書中により詳細に考察されるように、本方法は、過剰な組換えバクテリオファージを除去し、シグナル対ノイズ比を増大させるために細菌を捕捉し、捕捉および結合した細菌を洗浄する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、指標部分の陽性検出には、指標部分の検出によって生じたシグナル対バックグラウンド比が少なくとも２．０または少なくとも２．５であることが必要である。

図２～１０は、組換えバクテリオファージアッセイの例示的な実施形態由来のデータおよびデータおよびプロットを実証する。

図２、３Ａ、および３Ｂは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの検出に関する。図２は、固体支持体としてのスワブを有する自己完結型装置の１つの実施形態を使用したＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ培養物の検出由来のデータを示す。細菌の存在に対応するシグナルを、Ｈｙｇｉｅｎａ照度計、ＧｌｏＭａｘ照度計、およびＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計によって検出した。表１は対数期培養物の結果を示し、表２は一晩培養物の結果を示す。

図３Ａおよび３Ｂは、表１に示したデータから作成したプロットである。図３Ａは、Ｈｙｇｉｅｎａを使用して検出されたシグナルの測定値を示す。スワブに、対数期の細胞を表示のＣＦＵレベルで播種した。試料に、直ちにＬｉｓｔｅｒｉａファージカクテルを４時間感染させた。基質を添加し、試料を、Ｈｙｇｉｅｎａ照度計で読み取った。１０ＲＬＵを超えるシグナルを、陽性と見なした。この方法を使用した場合、陽性の結果を得るにはおよそ２５，０００ＣＦＵが必要である。

図３Ｂは、ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ（ＧｌｏＭａｘ９６としても知られる）照度計を使用して検出されたシグナルの測定値を示す。スワブに、対数期の細胞を表示のＣＦＵレベルで播種した。試料に、直ちにＬｉｓｔｅｒｉａファージカクテルを４時間感染させた。基質を添加し、試料を、ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計（１ｍＬの試料）またはＧｌｏＭａｘ（１５０μｌの試料）照度計のいずれかで読み取った。シグナル／バックグラウンド比３．０超を陽性と見なす。この方法を使用した場合、陽性の結果を得るにはおよそ５，０００ＣＦＵが必要である。

図４～８は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの検出を実証している実施形態に関する。図４は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａが播種されているシチメンチョウ挽肉中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出結果を示す。表３は非播種対照試料を示し、表４は非接種シチメンチョウ試料を示す。試験を、種々の接種および感染時間を用いて繰り返した。

図５Ａおよび５Ｂは、図４中のデータから作成したプロットである。図６Ａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを播種したシチメンチョウ試料が、試験したあらゆるインキュベーションおよび感染時間で陽性として検出されたことを示す。シチメンチョウ試料を接種後に４１℃で２４時間増殖させ、その後に本出願に開示の方法を用いた試験を行った。相対シグナルについて：０時間インキュベーション、２時間感染＞１時間インキュベーション、０．５時間感染＞０時間インキュベーション、０．５時間感染。さらに、ＲＬＵシグナルを比較すると、ＧｌｏＭａｘ照度計がＨｙｇｉｅｎａ照度計よりもかなり高いシグナルを示すことを示す。

図５Ｂは、ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ照度計を使用した検出において、同一試料については類似のシグナル／バックグラウンド比を示すことを示す。ＧｌｏＭａｘ２０／２０はより大きなシグナルを示していたが（図５Ａ）、バックグラウンドがＧｌｏＭａｘよりも有意に高かった。したがって、シグナル／バックグラウンドを判定する場合、２つの照度計は同様に動作する。

図６は、自己完結型装置を使用したアッセイの前にＳａｌｍｏｎｅｌｌａを播種している３つのシチメンチョウ試料（試料２１、２４、および２６）におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出についてのデータを示す。試料を、シグナルの検出前に、表示の異なる時間にわたって感染させた。

図７Ａ～７Ｃは、図６に示したデータから作成したプロットである。図７Ａ～７Ｃは、３つの播種済みのシチメンチョウ挽肉試料を２４時間富化し、スワブ試料を取り、アッセイした実験の結果を示す。試料２４（図７Ｂ）および２６（図７Ｃ）は、Ｈｙｇｉｅｎａハンドヘルド照度計によって、３０分間ファージ感染させた試料についてはシグナルを示さなかったが、２時間感染させた試料についてはシグナルを示した。ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ照度計は、シグナルが相対的に低かった。

図８Ａ～８Ｃは、図６に示したデータから作成したプロットである。プロットは、ＧｌｏＭａｘ２０／２０およびＧｌｏＭａｘの両方が３０分間の感染で陽性として（シグナル／バックグラウンド比３．０超が陽性である）試料２１（図８Ａ）および２６（図８Ｂ）を検出することができたが、しかしながら、試料２４（図８Ｃ）は陽性の結果を示すために２時間の感染を要したことを示す。ＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計およびＧｌｏＭａｘ照度計の結果は類似していた。

図９は、表面に播種し、２４時間富化したＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ環境スポンジ試料の検出についてのデータを示す。

図１０は、装置を使用したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ播種済みのシチメンチョウ試料中の微生物の検出を示す。シグナルを、以下の３つの異なる照度計を使用して測定した：ＧｌｏＭａｘ、３Ｍ、およびＨｙｇｉｅｎａ。

組換えバクテリオファージアッセイは、経時的に特異性を保持する。例えば、大腸菌、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、およびＳ．ａｕｒｅｕｓのための複数年の組換えバクテリオファージアッセイの開発および利用についての多数の実施形態では、宿主特異性の変化は認められなかった。これらの実施形態は、２５種を超える組換えルシフェラーゼレポーターまたは指標バクテリオファージを含む。さらに、レポーター遺伝子または指標遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の喪失または不活化は、本明細書中に記載の任意の組換えファージで検出されていない。取り扱いの誤りを防止するために、組換えバクテリオファージを複数のアリコートで貯蔵および保存する。バクテリオファージは本質的に安定であるが、長期間（例えば、４℃で数カ月間または数年間）にわたって保存すると、力価は種々の程度まで減少し得る。これは、一般に、粒子由来のＤＮＡの喪失に起因すると考えられ；しかしながら、活性なバクテリオファージは、より高い力価を得るためにプラークをプレートすることによって回収される。陽性および陰性であることが公知の異なる細菌株の感染による各組換えバクテリオファージ調製物を使用して、特異性を検証する。

試料を試験する方法のいくつかの実施形態では、大過剰の組換えバクテリオファージを使用するには、過剰量の非結合組換えバクテリオファージから試料の任意の非結合細菌または他のより大きな構成要素を分離する必要がある。これは、当業者に一般的に知られている多数の異なる方法で行われ得る。微生物細胞を、遠心分離、サイズによる濾過、または選択的固定によって分離することができる。いくつかの実施形態では、サイズによる濾過は、フィルターウェルによって行われる。他の実施形態では、磁気分離を、選択的固定化のために使用することができる。例えば、試料を、組換えバクテリオファージとのインキュベーションの前または後に０．４５μｍまたは０．２２μｍの膜で濾過して、固体支持体上に標的微生物（例えば、細菌）を補足し得る。次いで、捕捉された微生物を、特異的に結合した組換えバクテリオファージのみが確実に残存するように固体支持体上で１またはそれを超える回数で洗浄し得る。あるいは、特異的結合または非特異的結合の機序を使用して、マイクロビーズまたは別の固体表面上に微生物を捕捉することができる。試料の成分を分離するための他の形式も可能である。

種々の固体支持体を使用することができる。ある特定の実施形態では、固体支持体は、マルチウェルプレート、フィルター、ビーズ、側方流動ストリップ、フィルターストリップ、フィルターディスク、濾紙、または細胞を培養するために設計された薄膜（例えば、３ＭのＰｅｔｒｉＦｉｌｍ）を含み得る。他の固体支持体も適切であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、試験試料微生物を、スワブ、プレートの表面に結合することにより、または細菌学的フィルター（例えば、孔径０．４５μｍのスピンフィルターまたはプレートフィルター）を通して試料を濾過することにより捕捉することができる。１つの実施形態では、フィルターまたはプレートの表面上に捕捉された微生物を、組換えバクテリオファージとインキュベートし、引き続いて１回または複数回洗浄して過剰な未結合の組換えバクテリオファージを除去する。

あるいは、いくつかの実施形態では、捕捉工程は、サイズなどの目的の微生物の他の特徴に基づき得る。サイズベースの捕捉を利用する実施形態では、固体支持体はスピンカラムフィルターであり得る。いくつかの態様において、固体支持体は、９６ウェルフィルタープレートを含む。または、捕捉用の固体支持体は、アレイ上の場所またはビーズなどの可動支持体上の位置であり得る。

いくつかの実施形態では、固体支持体は、試料中の目的の微生物に高親和性で結合する細胞結合成分でコーティングされている。これにより、固体支持体により多くの細菌を結合させ、アッセイの感度および特異性を高めることが可能である。

１つの実施形態では、目的の微生物が細菌である場合、組換えバクテリオファージは、バクテリオファージ由来の細胞結合ドメインを介して細菌に結合し得る。例えば、大腸菌の十分に研究されたファージには、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、λが含まれ；ＡＴＣＣコレクションで利用可能な他の大腸菌ファージには、例えば、ｐｈｉＸ１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２、およびＺＩＫ１が含まれる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージには、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ε１５、ＳＥＡ１、およびＰ２２が含まれる。Ｌｉｓｔｅｒｉａファージには、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、およびＡ５１１が含まれる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージには、Ｐ４Ｗ、ウイルスＫ、Ｔｗｏｒｔ、φ１１、１８７、Ｐ６８、およびφＷＭＹが含まれる。

いくつかの実施形態では、増殖を促進する条件でのインキュベーションによって、試験前に試料が富化され得る。かかる実施形態では、富化期間は、試料のタイプおよびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７時間、または最大８時間までまたはそれを超える期間であり得る。

他の実施形態では、試料は、固体支持体上への細菌の捕捉後に富化され得る。かかる実施形態では、富化期間は、試料のタイプおよびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７時間、または最大８時間までまたはそれを超える期間であり得る。

したがって、いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージは検出可能な指標部分を含み、単一の病原性細胞（例えば、細菌）への結合を、指標部分によって生成された増幅シグナルによって検出することができる。したがって、本方法は、組換えバクテリオファージの指標部分を検出する工程を含んでよく、ここで、指標の検出は、目的の細菌が試料中に存在することを示す。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、微生物を、試料からの微生物のいかなる単離または精製もなく検出することができる。例えば、ある特定の実施形態では、１またはそれを超える目的の微生物を含む試料を、スピンカラム、マイクロタイターウェル、またはフィルターなどのアッセイ容器に直接適用することができ、前述のアッセイ容器でアッセイする。すなわち、微生物は、微生物が通過するには小さすぎる孔径を有する膜上に捕捉される。かかるアッセイの種々の実施形態が本明細書に開示されている。

試験試料のアリコートを、マルチウェルプレートのウェル内に直接分注してよく、組換えバクテリオファージを添加してよく、結合に十分な結合時間後、１またはそれを超える回数のその後の洗浄工程で過剰な非結合組換えバクテリオファージを除去することができるように、プレート、ビーズ、またはフィルター基質などの固体表面上に細胞を捕捉してよい。次いで、指標部分の基質（例えば、ルシフェラーゼ指標のルシフェラーゼ基質）を添加し、指標シグナルの検出のためにアッセイする。方法のいくつかの実施形態を、フィルタープレート上で行うことができる。方法のいくつかの実施形態を、組換えバクテリオファージとの結合前に試料の濃縮物を使用するか使用せずに行うことができる。

例えば、多くの実施形態では、マルチウェルプレートを使用してアッセイを実施する。プレート（または検出を実行できる任意の他の容器）の選択は、検出工程に影響を及ぼし得る。例えば、プレートによっては、有色または白色のバックグラウンドが含まれている場合があり、これが発光の検出に影響を及ぼし得る。一般に、白色プレートは高感度であるが、バックグラウンドシグナルも高くなる。他の色のプレートは、バックグラウンドシグナルがより低くなり得るが、感度もわずかに低い。さらに、バックグラウンドシグナルは、あるウェルから別の隣接するウェルへの光の漏れに起因し得る。いくつかのプレートは白色ウェルを有し、残りのプレートは黒色であり、したがって、ウェル内側のシグナルは高く、一方で、ウェル同士の光の漏れが防止される。この白色ウェルの黒色プレートとの組み合わせは、バックグラウンドシグナルが軽減され得る。したがって、プレートまたは他のアッセイ容器の選択は、アッセイの感度およびバックグラウンドシグナルに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、目的の微生物の検出は、試料の培養を必要とせずに完了され得る。例えば、ある特定の実施形態では、必要な総検出時間は、１２．０時間未満、１１．０時間未満、１０．０時間未満、９．０時間未満、８．０時間未満、７．０時間未満、６．０時間未満、５．０時間未満、４．０時間未満、３．０時間未満、２．５時間未満、２．０時間未満、１．５時間未満、１．０時間未満、４５分未満、または３０分未満である。病原体についての食品および環境の試験には、結果を得るための時間を最短にすることが重要である。

当該分野で公知のアッセイと対照的に、本発明の方法は、個別の微生物を検出することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本方法は、試料中に存在する１０個以下の微生物の細胞（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の微生物）または２０個以下、または３０個以下、または４０個以下、または５０個以下、または６０個以下、または７０個以下、または８０個以下、または９０個以下、または１００個以下、または２００個以下、または５００個以下、または１０００個以下の微生物の細胞を検出し得る。例えば、ある特定の実施形態では、組換えバクテリオファージは、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、または大腸菌に対する特異性が高い。１つの実施形態では、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下でＳ．Ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、または大腸菌を識別することができる。１つの実施形態では、組換えバクテリオファージは、１００を超える他のタイプの細菌の存在下である種の細菌内の特異的な血清型（例えば、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７）を識別することができる。ある特定の実施形態では、組換えバクテリオファージを使用して、試料中の特異的なタイプの単一の細菌を検出することができる。ある特定の実施形態では、組換えバクテリオファージは、試料中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個ほどの少数の特異的な細菌を検出する。

したがって、本発明の態様は、レポーター部分または指標部分を介して試験試料中の微生物を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、目的の微生物が細菌である場合、指標部分は、組換えバクテリオファージと関連し得る。指標部分は、基質と反応して検出可能なシグナルを発生し得るか、内因性シグナル（例えば、蛍光タンパク質）を発生し得る。蛍光タンパク質は、電子を含む蛍光部分が光子を吸収するときに光子としてエネルギーを放出することによって天然に蛍光を発する（内部蛍光または自己蛍光）。蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を、融合タンパク質として発現することができる。いくつかの実施形態では、検出感度によっては、試験試料中の１００、５０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個ほどの少数の目的の微生物の細胞の存在を明らかにすることができる。いくつかの実施形態では、目的の微生物の単一の細胞でさえ、検出可能なシグナルが得られる場合がある。

特定の指標部分の選択は本発明に重要ではないが、指標部分は、それ自体、または装置によって検出可能であるか、１またはそれを超えるさらなるシグナル生成構成要素と併せて（酵素／基質シグナル生成システムなど）検出可能なシグナルを生成することができるであろう。いくつかの組換えバクテリオファージを、組換えバクテリオファージの指標部分またはレポーターのいずれかを変動させることによって形成することができ；選択は検出すべき微生物および所望の検出手段の考慮を含むことが当業者に認識されるであろう。

例えば、１またはそれを超えるシグナル産生成分を、指標性部分と反応して検出可能なシグナルを生成することができる。いくつかの実施形態では、指標は、生物発光化合物であり得る。指標部分が酵素である場合、酵素を１またはそれを超える基質またはさらなる酵素および基質と反応させて検出可能な反応生成物を産生することによって、検出可能なシグナルを増幅する。代替的なシグナル産生システムでは、指標は、検出可能なシグナルを産生させるために指標の酵素による操作を必要としない蛍光化合物であり得る。蛍光分子（例えば、フルオレセインおよびローダミンならびにこれらの誘導体およびアナログが含まれる）は、かかるシステムにおける指標として使用するのに適している。さらに別の実施形態では、指標部分は補因子であり得、次いで、補因子を酵素および１またはそれを超える基質またはさらなる酵素および基質と反応させて検出可能な反応生成物を産生することによって、検出可能なシグナルを増幅する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは比色法に関する。

検出可能な指標部分は、組換えバクテリオファージの重要な特徴であり、直接または間接的に検出することができる。指標部分は、検出可能なシグナルを提供し、この検出可能なシグナルによって結合反応をモニタリングして定性的および／または定量的尺度が得られる。修飾されたかシグナルを発する微生物によって生成されたシグナルの相対的な量および位置は、微生物の存在および／または量を示すのに役立ち得る。また、指標部分を使用して、流動選別または磁気分離培地の使用などによって修飾されたかシグナルを発する微生物を選択および単離することができる。

いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージの指標部分は、直接または基質とのインキュベーション後に検出可能であり得る。指標部分としての使用に適切な多数の異なるタイプの検出可能な生体分子が当該分野で公知であり、多数市販されている。いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージは、指標部分としての機能を果たす酵素を含む。いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージの指標またはレポーターは、検出可能な酵素をコードする。指標部分は発光してもよく、そして／または変色によって検出可能であってもよい。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）などの種々の適切な酵素が市販されている。いくつかの実施形態では、これらの酵素は指標部分としての役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、ホタルルシフェラーゼが指標部分である。いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが指標部分である。いくつかの実施形態では、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）が指標部分である。検出可能なシグナルを生成する他の操作されたルシフェラーゼまたは他の酵素も、適切な指標部分であり得る。

したがって、いくつかの実施形態では、方法、システム、またはキットの組換えバクテリオファージは、指標タンパク質（蛍光タンパク質またはルシフェラーゼタンパク質など）の配列で遺伝子改変された野生型バクテリオファージである。

バクテリオファージは、特異的な細菌に感染し、溶解することができる。

指標の検出は、発光の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、指標（例えば、ルシフェラーゼ）の基質との反応を検出するために照度計が使用され得る。照度計を用いてＲＬＵを検出することができるか、他の機械またはデバイスも使用することができる。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラは、変色および他の発光を検出することができる。絶対ＲＬＵは検出に重要であるが、単一の細胞または少数の細胞を確実に検出するためには、シグナル対バックグラウンド比が高いことも必要である（例えば、２．０超、２．５超、または３．０超）。

いくつかの実施形態では、指標部分（例えば、ルシフェラーゼ）の基質との反応は、３０分間またはそれを超えて継続させてよく、種々の時点での検出は、感度を最適にするのに望ましい場合がある。例えば、照度計を最初に読み取り、反応が完了するまで３分間隔、または５分間隔、または１０分間隔、または１５分間隔で読み取ることができる。

したがって、組換えバクテリオファージを利用するいくつかの実施形態では、本発明は、目的の微生物を検出する方法であって、少なくとも１つの試料細菌を捕捉する工程；少なくとも１つの細菌を複数の組換えバクテリオファージとインキュベートする工程；試料中の標的微生物への結合時間を与える工程；および指標部分を検出する工程であって、指標部分の検出が、試料中に細菌が存在することを実証している、検出する工程を含む、方法を含む。

例えば、いくつかの実施形態では、試験試料細菌を、プレートの表面に結合することにより、または細菌学的フィルター（例えば、孔径０．４５μｍのスピンフィルターまたはプレートフィルター）を通して試料を濾過することにより捕捉することができる。１つの実施形態では、組換えバクテリオファージを、最少容量または中程度の容量でフィルター上に直接捕捉された試料に添加する。１つの実施形態では、フィルターまたはプレートの表面上に捕捉された微生物を、引き続いて１回または複数回洗浄して過剰な未結合の組換えバクテリオファージを除去する。

いくつかの実施形態では、細菌を含む試験試料のアリコートを、スピンカラムに適用し、組換えバクテリオファージとのインキュベーション後に洗浄して任意の過剰なバクテリオファージを除去することができ、指標の検出量は、試料中の標的細菌の存在量に比例するであろう。

次いで、細菌に結合した指標（例えば、ルシフェラーゼ）を、測定および定量することができる。１つの実施形態では、溶液をスピンしてフィルターに通し、濾液をアッセイのために新規の容器中（例えば、照度計中に）に、指標酵素の基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）の添加後に回収した。あるいは、指標シグナルは、フィルター上で直接測定され得る。

１つの実施形態では、微生物は細菌であり、組換えバクテリオファージはバクテリオファージ由来の指標部分を含む。１つの実施形態では、指標部分はルシフェラーゼである。したがって、別の実施形態では、指標基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）を、フィルター上に保持されているか、プレート表面に結合している試料の一部とインキュベートしてよい。したがって、いくつかの実施形態では、固体支持体は９６ウェルフィルタープレート（または通常の９６ウェルプレート）であり、基質反応は照度計内にプレートを直接配置することによって検出され得る。

例えば、１つの実施形態では、本発明は、目的の病原性細菌を検出する方法であって、９６ウェルフィルタープレート上に捕捉された細胞を複数の組換えバクテリオファージと結合させる工程；過剰な組換えバクテリオファージを洗い流す工程；および基質を添加し、酵素活性を９６ウェルプレート中で直接測定することによって指標（例えば、ルシフェラーゼ）を検出する工程であって、酵素活性の検出は、目的の細菌が試料中に存在することを示す、検出する工程を含む、方法を含み得る。

別の実施形態では、本発明は、目的の微生物（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓなど）を検出する方法であって、９６ウェルプレート中の溶液または懸濁液中の細胞を複数の組換えバクテリオファージと結合させる工程；非結合組換えバクテリオファージを、結合組換えバクテリオファージを有する細胞から洗い流す工程；および基質を添加し、酵素活性を９６ウェルプレート中で直接測定することによって指標（例えば、ルシフェラーゼ）を検出する工程であって、酵素活性の検出は、目的の細菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓなど）が試料中に存在することを示す、検出する工程を含む、方法を含み得る。いくつかの実施形態では、目的の微生物は、ビーズまたはフィルターなどの固体支持体上に捕捉され得る。組換えバクテリオファージとのインキュベーションの前または後にこの捕捉を行うことができる。いくつかの実施形態では、捕捉工程は必要ない。

いくつかの実施形態では、溶液または懸濁液は、消耗試験試料（野菜洗浄液など）であり得る。いくつかの実施形態では、溶液または懸濁液は、濃縮ＬＢブロス、トリプシン／トリプトンダイズブロス、ペプトン水、またはニュートリエントブロスで栄養価を高めた野菜洗浄液であり得る。いくつかの実施形態では、溶液または懸濁液は、ＬＢブロスで希釈された細菌であり得る。

いくつかの実施形態では、標的微生物細胞は、適切な検出のためにインタクトである必要がある。すなわち、細胞は生きている必要はないが、細胞壁は構造的にインタクトでなければならない。したがって、検出工程前に溶菌を最小にすることが望ましい。

いくつかの実施形態では、試料の初期濃縮工程は有用である。すなわち、試料中の任意の微生物または他の相対的に巨大な物質を濃縮して過剰な液体を除去する。しかしながら、初期濃縮工程を行わずにアッセイを実施することが可能である。いくつかの実施形態は、初期濃縮工程を含み、いくつかの実施形態では、この濃縮工程によって富化インキュベーション時間を短縮することが可能である。他の実施形態では、富化期間は必要ない。

試験方法のいくつかの実施形態は、確認アッセイをさらに含み得る。通常は後に行われる最初の結果を確認するための種々のアッセイが当該分野で公知である。例えば、試料を培養することができ（例えば、ＣＨＲＯＭＡＧＡＲ（登録商標）／ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）アッセイ）、ＰＣＲを利用して微生物ＤＮＡの存在を確認することができるか、他の確認アッセイを使用して最初の結果を確認することができる。

食品安全性アッセイの実施形態は、試料調製工程を含む。いくつかの実施形態は、富化時間を含むことができる。例えば、試料のタイプおよびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７、または８時間の富化時間が必要な場合がある。これらの試料調製工程後、種々のアッセイ形式（図１に示す形式など）でレポーターまたは指標を含む高濃度の組換えバクテリオファージに結合させることができる。

食品アッセイの実施形態は、工業規格に応じたサイズの試料中の単一の病原性細菌を検出することができ、試料のタイプおよびサイズに応じて、結果を得るための時間が、少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％削減される。

したがって、本発明のいくつかの実施形態は、組換えバクテリオファージ法を使用することによって細菌の存在を示す検出可能なシグナルを増幅するというニーズを満たす。ある特定の実施形態では、単一の細菌ですら検出される。本明細書中で適用された原理を、種々の微生物の検出に適用することができる。このような方法で、本発明の実施形態は、単一の目的の微生物細胞からでさえもシグナルを非常に増幅することができる。

本発明の態様は、特定の微生物に結合することができる結合成分の高い特異性（感染性因子の結合成分の認識など）を、試料中の特異的微生物を検出および／または定量するための手段として利用する。いくつかの実施形態では、本発明は、バクテリオファージの特異性を活用する。

本明細書中に開示および記載の本発明のいくつかの実施形態は、単一の微生物が組換えバクテリオファージの感染後に大量の指標を生成することができるという発見を利用している。この原理により、微生物の特異的認識に基づいて、１つまたは少数の細胞由来の指標シグナルを増幅可能である。例えば、単一の細菌細胞でさえも複数の組換えバクテリオファージに暴露することによって、単一の細菌が検出可能なように指標シグナルが増幅される。

組換えバクテリオファージを使用した微生物の検出が、前例の無い速度および感度であることは予想外の結果である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、目的の微生物の検出に１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２時間未満を要する。これらは、以前に可能であると考えられていた時間枠よりもよりも短い。いくつかの実施形態では、本方法は、１００、５０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個ほどの少数の目的の細菌の細胞を検出することができる。いくつかの実施形態では、単一の細菌細胞でさえも検出可能である。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の方法を実施するための、および／または本明細書中に記載の組換えバクテリオファージを使用するための構成要素を含むシステム（例えば、コンピュータシステム、自動システム、またはキット）を含む。

食品中の病原性細菌を検出するための既存のプロトコールは複雑であり、高価であり、遅く、重労働で、偽陽性を示す傾向がある。さらに、ファージベースの検出方法には、感染性試薬のさらなる複雑さおよび規制関係が加わる。所与の病原体に特異的な組換えバクテリオファージを用いた検出は、有効、迅速、かつ簡潔な代替試験法を提供する。

感染性因子は、特定のタイプの生物に高い特異性を示すことができる。例えば、バクテリオファージは、特定の細菌属（Ｌｉｓｔｅｒｉａなど）に特異的であり得る。例えば、Ａ５１１バクテリオファージは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に特異的である。あるいは、バクテリオファージは、特定の細菌種（大腸菌など）に特異的であり得る。いくつかの細菌タイプについて、バクテリオファージは、生物の特定のサブタイプでさえも高い特異性で認識し得る。例えば、ＣＢＡ１２０バクテリオファージは大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に高い特異性を示し、φＹｅＯ３－１２バクテリオファージはＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ血清型Ｏ：３に高い特異性を示す。

本明細書中に記載の組換えバクテリオファージのいくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、ＡＲ１、Ａ５１１、Ａ１１８、Ａ００６、Ａ５００、ＰＳＡ、Ｐ３５、Ｐ４０、Ｂ０２５、Ｂ０５４、Ａ９７、φＳＭ１０１、φ３６２６、ＣＢＡ１２０、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ε１５、Ｐ２２、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、Ａ５１１、Ｐ４Ｗ、Ｋ、Ｔｗｏｒｔ、またはＳＡ９７に由来することができる。また、組換えバクテリオファージは、組換えバクテリオファージがシグナルを生成することが可能な指標部分（蛍光部分、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、または酵素など）を含む。組換えバクテリオファージでは、指標部分としての機能を果たすために、種々のタイプのレポーターをバクテリオファージゲノムに挿入することができる。いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージは、適切な基質の添加の際にのみ検出可能な酵素（ルシフェラーゼなど）を含む。例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、および他のレポーター酵素は、適切な基質と反応して検出可能なシグナルを提供する。組換えバクテリオファージのいくつかの実施形態は、野生型ルシフェラーゼまたは操作されたルシフェラーゼ（ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）など）を含む。他の実施形態は、蛍光タンパク質または別のレポータータンパク質を含む。

別の実施形態では、バクテリオファージ、ファージ、マイコバクテリオファージ（ＴＢおよびｐａｒａＴＢなどを対象とする）、マイコファージ（真菌などを対象とする）、マイコプラズマファージ、ならびに生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の微視的生命体に侵入することができる任意の他のウイルスを、目的の微生物を標的にするように研究するか、コピーすることができる。例えば、大腸菌の十分に研究されたファージには、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、λが含まれ；ＡＴＣＣコレクションで利用可能な他の大腸菌ファージには、例えば、ｐｈｉＸ１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２、およびＺＩＫ１が含まれる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージには、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ε１５、ＳＥＡ１、およびＰ２２が含まれる。Ｌｉｓｔｅｒｉａファージには、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、およびＡ５１１が含まれる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージには、Ｐ４Ｗ、ウイルスＫ、Ｔｗｏｒｔ、φ１１、１８７、Ｐ６８、およびφＷＭＹが含まれる。

本発明のいくつかの実施形態は、目的の細菌に結合して検出を容易にするために、迅速かつ感度の高いターゲティングのための組換えバクテリオファージの結合特異性を利用する。

いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージは、目的の標的細菌に特異的なバクテリオファージ（Ｔ７、Ｔ４、または別の類似のファージなど）に由来する。また、組換えバクテリオファージは、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、ＡＲ１、Ａ５１１、Ａ１１８、Ａ００６、Ａ５００、ＰＳＡ、Ｐ３５、Ｐ４０、Ｂ０２５、Ｂ０５４、Ａ９７、φＳＭ１０１、φ３６２６、ＣＢＡ１２０、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ε１５、Ｐ２２、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、Ａ５１１、Ｐ４Ｗ、Ｋ、Ｔｗｏｒｔ、またはＳＡ９７に由来し得る。

いくつかの実施形態では、小さな指標遺伝子産物が望ましい場合がある。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コード領域はおよそ５００～６００ｂｐ）である一方で、ＦＬｕｃは約６２ｋＤａであり、およそ１，７００ｂｐのコード領域が必要である。比較のために、Ｔ７のゲノムはおよそ約４０ｋｂｐである一方で、Ｔ４ゲノムは約１７０ｋｂｐである。

さらに、指標は、高いシグナル対バックグラウンド比を生成すべきであり、適時に容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン）と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）により、低バックグラウンドで頑強なシグナルを生成することができる。

いくつかの組換えバクテリオファージ実施形態では、指標部分は、種々の生体分子のうちのいずれかであり得る。指標は、検出可能な生成物または検出可能な生成物を産生する酵素または検出可能な生成物を産生する酵素の補因子であり得る。いくつかの実施形態では、組換えバクテリオファージの指標部分は、検出可能な酵素などのレポーターである。指標遺伝子産物は、光を生成してもよく、そして／または変色によって検出可能であってもよい。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）などの種々の適切な酵素が市販されている。例えば、１つの実施形態では、指標はルシフェラーゼ酵素である。種々のタイプのルシフェラーゼを使用することができる。別の実施形態では、本明細書でより詳細に記載するように、ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ルシアルシフェラーゼ、ウミイシイタケルシフェラーゼ、または操作されたルシフェラーゼのうちの１つである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼはＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態では、指標は、遺伝子改変されたルシフェラーゼ（ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）など）である。検出可能なシグナルを生成する他の操作されたルシフェラーゼまたは他の酵素も、適切な指標部分であり得る。いくつかの実施形態では、これらの酵素は指標部分としての役割を果たし得る。

本発明の組成物は、１またはそれを超える野生型感染性因子（例えば、バクテリオファージ）に由来する１またはそれを超える組換えバクテリオファージおよび１またはそれを超える指標部分を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、同一または異なる指標シグナルを生成し得る異なる組換えバクテリオファージのカクテルを含むことができる。すなわち、微生物を検出するための組成物は、全ての同一または異なる組換えバクテリオファージを含むことができる。

以前に記載のアッセイは、使用することができる特異的細菌を認識して結合する組換えバクテリオファージを利用する。組換えバクテリオファージアッセイを、伝統的な実験設定またはデバイス（例えば、本明細書中にさらに記載の装置など）で行うことができる。
組換えバクテリオファージ

本明細書により詳細に記載されるように、本発明の装置、方法、システム、およびキットは、目的の微生物の検出で用いる組換えバクテリオファージを含む。組換えバクテリオファージは、上記開示の装置の第１の区画に含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、バクテリオファージのゲノムに組み込まれた指標遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、指標遺伝子は、バクテリオファージのネイティブプロモーターではないプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、指標遺伝子は、バクテリオファージのネイティブプロモーターに作動可能に連結されている。また、指標遺伝子またはレポーター遺伝子を含む組換えバクテリオファージは、本開示において指標バクテリオファージと称される。

組換えバクテリオファージは、レポーター遺伝子または指標遺伝子を含むことができる。バクテリオファージのある特定の実施形態では、指標遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、一定の実施形態では、宿主細胞の感染後のバクテリオファージ複製中の指標遺伝子の発現により、可溶性指標タンパク質産物が得られる。一定の実施形態では、指標遺伝子を、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入することができる。後期遺伝子は、構造タンパク質をコードするので、一般に他のファージ遺伝子より高いレベルで発現される。後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であってよく、主要キャプシドタンパク質の遺伝子を含み得る。

いくつかの実施形態は、主要キャプシドタンパク質遺伝子下流の相同組換えのための配列のデザイン（および必要に応じた調製）を含む。他の実施形態は、主要キャプシドタンパク質遺伝子上流の相同組換えのための配列のデザイン（および必要に応じた調製）を含む。いくつかの実施形態では、配列は、非翻訳領域続くコドン最適化レポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボゾーム侵入部位を含み得る。

いくつかの実施形態では、指標バクテリオファージは、Ａ５１１、Ｐ１００、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬＭＴＡ－９４、ＬＭＡ４、ＬＭＡ８、Ｔ７、Ｔ４、または別の類似のファージに由来する。また、指標バクテリオファージは、Ｐ１００ウイルス、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なバクテリオファージ、もしくはＴ７、Ｔ７様、Ｔ４、Ｔ４様、Ｐ１００ウイルス、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なバクテリオファージ、ＶｉＩ、もしくはＶｉＩ様（もしくはＶｉ１ウイルス様、ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによる）バクテリオファージと少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％相同なゲノムを有する別のバクテリオファージに由来し得る。いくつかの実施形態では、指標ファージは、特定の病原性微生物に高い特異性を示すバクテリオファージに由来する。遺伝子改変は、野生型遺伝子の欠失を回避することができ、したがって、改変ファージは、多数の市販のファージより野生型バクテリオファージとの類似性をさらに保持し得る。環境由来のバクテリオファージは、環境中に見出される細菌に対してより特異的であり得、そのため、市販のファージと遺伝的に異なり得る。

さらに、非必須と考えられるファージ遺伝子は、認識されていない機能を有し得る。例えば、見かけ上非必須の遺伝子は、アセンブリのわずかな切断、適合、またはトリミング機能などの放出数を増加させる重要な機能を有し得る。したがって、指標を挿入するために遺伝子を欠失させることは有害であり得る。ほとんどのファージは、その天然のゲノムよりも数パーセント大きいＤＮＡをパッケージングすることができる。このことを考慮すると、バクテリオファージ、特により小さなゲノムを有するバクテリオファージを改変するには、より小さな指標遺伝子がより適切な選択であり得る。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コード領域は約５００～６００ｂｐ）である一方で、ＦＬｕｃは約６２ｋＤａ（コード領域は約１，７００ｂｐ）である。比較のために、Ｔ７のゲノムはおよそ４０ｋｂｐであり、一方で、Ｔ４ゲノムは約１７０ｋｂｐであり、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに特異的なバクテリオファージのゲノムは約１５７ｋｂｐである。さらに、レポーター遺伝子は細菌によって内因性に発現されるべきではなく（細菌ゲノムの一部ではない）、高いシグナル対バックグラウンド比を生成すべきであり、適時に容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン）と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）により、低バックグラウンドで頑強なシグナルを生成することができる。

いくつかの指標ファージの実施形態では、指標遺伝子を非翻訳領域に挿入して機能性遺伝子の破壊を回避することができ、それにより、野生型ファージ遺伝子をインタクトなまま残し、非実験室菌株の細菌に感染するときの適合性が高められ得る。さらに、３つすべての読み枠に終止コドンを含めることは、リーキー発現としても公知のリードスルーを減らすことにより発現を増大させるのに役立ち得る。このストラテジーはまた、ファージから分離することができないバックグラウンドシグナル（例えば、ルシフェラーゼ）として出現するかもしれない融合タンパク質が低レベルで作製される可能性を排除することができる。

指標遺伝子は、種々の生体分子を発現し得る。指標遺伝子は、検出可能な産物または検出可能な産物を産生する酵素を発現する遺伝子である。例えば、１つの実施形態では、指標遺伝子はルシフェラーゼ酵素をコードする。種々のタイプのルシフェラーゼを使用することができる。別の実施形態では、本明細書でより詳細に記載するように、ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ルシアルシフェラーゼ、ウミイシイタケルシフェラーゼ、または操作されたルシフェラーゼのうちの１つである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼ遺伝子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態では、指標遺伝子は、遺伝子改変されたルシフェラーゼ遺伝子（ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）など）である。

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域内に非バクテリオファージ指標遺伝子を含む遺伝子改変バクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、変性指標遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用すると、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がウイルスキャプシドタンパク質のように高レベルで発現されるだけでなく、内因性の細菌遺伝子やさらに初期のウイルス遺伝子のようにシャットダウンされないことを保証する。

いくつかの実施形態では、後期プロモーターは、Ｐ１００ウイルス、Ｔ４－、Ｔ７－、もしくはＶｉＩ様のプロモーター、または選択された野生型ファージ（すなわち、遺伝子改変されていない）に見いだされるプロモーターに類似の別のファージプロモーターである。後期遺伝子領域はクラスＩＩＩ遺伝子領域であってよく、バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、もしくはＳ．ａｕｒｅｕｓに特異的なバクテリオファージ、またはＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、もしくはＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、もしくはＳ．ａｕｒｅｕｓに特異的なバクテリオファージと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９５％相同なゲノムを有する別の天然のバクテリオファージに由来し得る。

バクテリオファージに対する遺伝子改変には、核酸の小さな断片、遺伝子の実質的な部分、または遺伝子全体の挿入、欠失、または置換が含まれ得る。いくつかの実施形態では、挿入または置換された核酸は、変性配列を含む。変性指標遺伝子を、バクテリオファージプロモーターの制御下にあるようにバクテリオファージゲノムに挿入することができる。いくつかの実施形態では、変性指標遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、いくつかの実施形態では、指標タンパク質産物が野生型バクテリオファージのポリペプチドを含まないように遺伝子改変を構成することができる。いくつかの実施形態では、指標タンパク質産物は可溶性である。いくつかの実施形態では、本発明は、試験試料をかかる組換えバクテリオファージとインキュベートする工程を含む、目的の細菌を検出する方法を含む。

いくつかの実施形態では、宿主細菌の感染後の子孫バクテリオファージにおける指標遺伝子の発現により、遊離の可溶性タンパク質産物が得られる。いくつかの実施形態では、変性指標遺伝子は、構造ファージタンパク質をコードする遺伝子と隣接しておらず、したがって、融合タンパク質を産生しない。キャプシドタンパク質への検出部分の融合（すなわち、融合タンパク質）を使用するシステムとは異なり、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性指標またはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態では、指標またはレポーターは、理想的には、バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、指標またはレポーターは、ファージ構造に付着していない。そのため、指標またはレポーターの遺伝子は、組換えファージゲノム内の他の遺伝子と融合しない。これにより、アッセイ感度を大幅に（単一の細菌に至るまで）向上させることができ、アッセイが簡素化され、それにより、いくつかの実施形態については、検出可能な融合タンパク質を産生する構築物のさらなる精製工程に数時間が必要であることと対照的に、１時間未満でアッセイを完了させることが可能である。さらに、融合タンパク質は、例えば、酵素活性部位の高次構造または基質へのアクセスを変化させ得るタンパク質折りたたみの制約により、可溶性タンパク質よりも活性が低い場合がある。

さらに、融合タンパク質は、定義により、バクテリオファージ中のタンパク質のサブユニットに付着する部分の数を制限する。例えば、融合タンパク質のプラットフォームとしての機能を果たすようにデザインされた市販のシステムを使用すると、約４１５コピーの融合部分が得られると考えられ、これは、各Ｔ７バクテリオファージ粒子中の遺伝子１０Ｂキャプシドタンパク質の約４１５コピーに相当する。この制限がなければ、感染された細菌は、バクテリオファージ上に取り付けることができる数よりもより遥かに多くの検出部分（例えば、ルシフェラーゼ）のコピーを発現すると予想することができる。さらに、巨大な融合タンパク質（キャプシド－ルシフェラーゼ融合物など）は、バクテリオファージ粒子のアセンブリを阻害し得るため、バクテリオファージの子孫の生成はより少なくなる。したがって、可溶性の非融合指標遺伝子産物が好ましい場合がある。

いくつかの実施形態では、指標ファージは、検出可能な酵素などのレポーターをコードする。指標遺伝子産物は、光を生成してもよく、そして／または変色によって検出可能であってもよい。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）などの種々の適切な酵素が市販されている。いくつかの実施形態では、これらの酵素は指標部分としての役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、ホタルルシフェラーゼが指標部分である。いくつかの実施形態では、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが指標部分である。いくつかの実施形態では、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）が指標部分である。検出可能なシグナルを生成する他の操作されたルシフェラーゼまたは他の酵素も、適切な指標部分であり得る。

いくつかの実施形態では、可溶性検出部分を使用すると、感染した試料細胞の溶解物から夾雑親ファージを除去する必要がなくなる。融合タンパク質システムを使用すると、試料細胞に感染させるために使用される任意のバクテリオファージに検出部分が付着しており、検出部分も含む娘バクテリオファージと識別できないであろう。試料細菌の検出は、新規に作出された（ｄｅ ｎｏｖｏ合成された）検出部分の検出に依存しているので、融合構築物を使用するには、新規に作出された（娘バクテリオファージ）部分から古い（親）部分を分離する追加の工程が必要である。これは、バクテリオファージ生活環の完了前に感染細胞を複数回洗浄し、物理的または化学的手段による感染後に過剰な親ファージを不活性化し、そして／または結合部分（ビオチンなど）を使用して親バクテリオファージを化学修飾することにより達成することができ、前述の結合部分は、その後に結合および分離することができる（ストレプトアビジンでコーティングしたセファロースビーズなどによる）。しかし、これらすべての除去を試みたとしても、少数の試料細胞の感染を確実にするために高濃度の親ファージが使用される場合、親ファージが残存することができ、バックグラウンドシグナルが生成されて感染細胞の子孫ファージからのシグナルの検出を不明瞭にする可能性がある。

対照的に、本発明のいくつかの実施形態で発現される可溶性検出部分は、親ファージがいかなる検出部分にも付着しないので、最終溶解物からの親ファージの精製は不要である。したがって、感染後に存在する任意の検出部分は、ｄｅ ｎｏｖｏで作製されていたに違いなく、感染した細菌の存在を示す。この利点を活用するために、親ファージの産生および調製には、細菌培養での親バクテリオファージの産生中に産生される任意の遊離検出部分からのファージの精製が含まれ得る。スクロース密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、および透析、または派生テクノロジー（Ａｍｉｃｏｎブランドの濃縮器－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｎｃ．など）などの標準的なバクテリオファージ精製技術を使用して、本発明のファージのいくつかの実施形態を精製することができる。塩化セシウム等密度超遠心分離を、細菌宿主中のファージの増殖の際に産生される夾雑ルシフェラーゼタンパク質から親ファージ粒子を分離するために、本発明の組換えファージの調製の一部として使用することができる。このようにして、本発明の親組換えバクテリオファージは、細菌での産生中に生成されるいかなるルシフェラーゼも実質的に含まない。ファージストックに存在する残存ルシフェラーゼを除去すると、組換えバクテリオファージを試験試料とインキュベートしたときに認められるバックグラウンドシグナルを実質的に低下させることができる。

改変バクテリオファージのいくつかの実施形態では、後期プロモーター（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的ファージ、Ｔ７、Ｔ４、またはＶｉＩ由来のクラスＩＩＩプロモーター）は、バクテリオファージ粒子にアセンブリされる構造タンパク質の遺伝子を転写する同一のバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有する。これらのタンパク質は、各バクテリオファージ粒子がこれらの分子の数十または数百のコピーを含むので、ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用により、ルシフェラーゼ検出部分の最適な高レベルの発現を確実にすることができる。指標ファージが由来する元の野生型バクテリオファージ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的ファージ）に由来するか、特異的であるか、または活性を示す後期ウイルスプロモーター、Ｔ４、Ｔ７、もしくはＶｉＩに基づくシステムを用いたＴ４、Ｔ７、もしくはＶｉＩ後期プロモーターの使用により、検出部分の最適な発現をさらに確実にすることができる。標準的な細菌（非ウイルス／非バクテリオファージ）プロモーターの使用は、これらのプロモーターがバクテリオファージ感染中に下方制御されることが多いので（バクテリオファージが細菌からの供給源をファージタンパク質産生に優先させるため）、場合によっては、発現に有害であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ファージは、発現をファージ構造成分のサブユニット数に限定しないゲノム内の配置を使用して、可溶性（遊離）指標部分を高レベルでコードおよび発現するように操作されることが好ましい。

本発明の組成物は、１またはそれを超える野生型または遺伝子改変されたバクテリオファージ（例えば、バクテリオファージ）および１またはそれを超える指標遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、同一または異なる指標タンパク質をコードして発現することができる異なる指標ファージのカクテルを含み得る。いくつかの実施形態では、バクテリオファージのカクテルは、少なくとも２つの異なるタイプの組換えバクテリオファージを含む。
微生物を検出するためのデバイスまたは装置

本発明の実施形態は、自己完結型装置を使用して目的の微生物を検出する方法に関する。いくつかの実施形態では、装置は、目的の微生物を含む試料を回収するために使用することができる固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の装置は、連続的または分岐した配置（例えば、管上の「耳」）の個別の区画を有する管を含む。装置は、いくつかの区画を含んでよく、これらの区画は、方法工程の様々な試薬の混合およびタイミングのために構成することができる。いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも２つの区画を含む。いくつかの実施形態では、管の最上部または上部の区画は組換えバクテリオファージを含み、基質区画はバクテリオファージ区画の下に存在する。いくつかの実施形態では、管は増殖培地を含む。

いくつかの実施形態では、装置は、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前述の構築物が、プロモーターおよびレポーター（指標）遺伝子を含む、第１の区画；試験試料の少なくとも一部を組換えバクテリオファージに添加するための第１の区画中の入口孔；および基質または顕色剤を含む第２の区画であって、基質または顕色剤によってレポーター（指標）遺伝子が検出可能である、第２の区画を含む少なくとも２つの区画を含む。いくつかの実施形態では、

１つの実施形態では、第１の区画は組換えバクテリオファージを含み、第２の区画は基質または顕色試薬を含む。いくつかのかかる実施形態では、両方の試薬を、試料と同時に混合する。他の実施形態では、試料を第１の区画に最初に添加して、感染を開始させる。一定時間後、第２の区画に通じる導管を開いて、基質または顕色試薬を感染した試料に添加し、混合する。

別の実施形態では、第１の区画は凍結乾燥した感染性因子（例えば、凍結乾燥した組換えバクテリオファージ）を含み、第２の区画は基質または顕色試薬を含む。いくつかのかかる実施形態では、両方の試薬を、同時に試料と混合する（必要に応じて、試料由来の微生物を固体支持体上に捕捉する）。他の実施形態では、試料を第１の区画に最初に添加する。一定時間後、第２の区画に通じる導管を開いて、基質または顕色試薬を感染した試料に添加し、混合する。

いくつかの実施形態では、シールは隣接する区画を分離し、使用者がシール（複数可）を破壊し、基質およびファージの両方が同時にスワブに遭遇する。ルシフェラーゼが産生され、基質と反応し、それにより検出可能なシグナルが産生される。

いくつかの実施形態では、基質区画は、培地区画と組換えバクテリオファージ区画との間に配置され得る。他の実施形態では、デバイスは培地区画を含まず、デバイスは培地を含まない。使用者がシールを破壊して試薬が固体支持体上に捕捉された試料に適用された場合、両方の試薬を同時に適用することができる。

別の実施形態では、基質区画は、培地区画と組換えバクテリオファージ区画との間に配置され得る。他の実施形態では、デバイスは培地区画を含まず、デバイスは培地を含まない。使用者がシールを破壊して試薬が固体支持体上に捕捉された試料に適用された場合、両方の試薬を同時に適用することができる。

いくつかの実施形態では、固体支持体を管に添加し、ここで、基質または顕色剤は管の下部に存在し；固体支持体を押下することによって酵素と基質との間または他のレポーターと対合試薬との間の反応を開始させる。取り扱いを容易にするために、固体支持体を軸に付着させることができる。

いくつかの実施形態では、固体支持体は、目的の微生物を特異的に捕捉する分子（例えば、抗体または細胞結合タンパク質）でコーティングしたビーズを含む。他の実施形態では、固体支持体は、スワブまたは別の非特異的捕捉機構を含む。

あるいは、本明細書中に記載の実施形態のうちのいずれかでは、デバイスは培地を含まない。

以下の図は、本発明の実施形態の実例を提供する。

１つの実施形態では、本開示は、自己完結型の微生物検出装置システムを提供する。図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、装置１００の実施形態を示す。装置は、固体支持体１６および３つの区画を含む容器を含む。区画の各々は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画１０はファージを含み、第２の区画１２は基質を含み、第３の区画１４は培地を含む。この装置は、ファージおよび基質を試料と同時にインキュベートすることが可能である。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１１Ｃ）。

図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、装置２００の第２の実施形態を示す。装置は、固体支持体２６および３つの区画を含む容器を含む。区画の各々は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画２０はファージを含み、第２の区画２２は培地を含み、第３の区画２４は基質を含む。実施形態では、図１２Ａに示した装置を使用して、基質とのインキュベーション前に、試料をファージと最初にインキュベートする。図１２Ｂに示した装置を使用したさらなる実施形態では、試料の回収前に固体支持体を培地に浸漬させる。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１２Ｃ）。

図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、装置３００の第３の実施形態を示す。装置は、固体支持体３６および３つの区画を含む容器を含む。区画の各々は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画３０は培地を含み、第２の区画３２はファージを含み、第３の区画３４は基質を含む。実施形態では、図１３Ａに示した装置を使用して、基質とのインキュベーション前に、試料をファージと最初にインキュベートする。図１３Ｂに示した装置を使用したさらなる実施形態では、固体支持体は、試料の回収前に乾燥している。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１３Ｃ）。

図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃは、装置４００の第４の実施形態を示す。装置は、固体支持体４６および３つの区画を含む容器を含む。区画の各々は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画４０は培地を含み、第２の区画４２はファージを含み、第３の区画４６は基質を含む。装置は、試薬の段階的混合のためのストップ・ロック機構を有する。実施形態では、図１４Ａに示した装置を使用して、基質とのインキュベーション前に、試料をファージと最初にインキュベートする。図１４Ｂに示した装置を使用したさらなる実施形態では、試料の回収前に固体支持体を培地に浸漬させる。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１４Ｃ）。

図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、装置５００の第５の実施形態を示す。装置は、固体支持体５６および３つの区画を含む容器を含む。区画の各々は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画５０は培地を含み、第２の区画５２はファージを含み、第３の区画５４は基質を含む。装置は、試薬の段階的混合のためのストップ・ロック機構を有する。実施形態では、図１５Ａに示した装置を使用して、基質とのインキュベーション前に、試料をファージと最初にインキュベートする。図１５Ｂに示した装置を使用したさらなる実施形態では、固体支持体は、試料の回収前に乾燥している。いくつかの実施形態では、デバイスは培地を含まない（図１５Ｃ）。

図１６は、装置６００の第６の実施形態を示す。装置は、固体支持体６４および２つの区画を含む容器を含む。区画の各々は、スナップ動作シールによって分離されている。第１の区画６０はファージを含み、第２の区画６２は基質を含む。実施形態では、図１６に示した装置を使用して、基質とのインキュベーション前に、試料をファージと最初にインキュベートする。

図１７は、微生物を検出する方法の実施形態であって、（ｉ）試料を一晩富化する工程、（ｉｉ）一晩富化した試料を回収するために自己完結型装置由来の固体支持体を使用する工程、（ｉｉｉ）試料に、自己完結型装置の区画内に含まれるファージを感染させる工程、および（ｉｖ）感染工程によって産生されたシグナルの読み取り／検出によって微生物の存在を検出する工程を含む、微生物を検出する方法の実施形態を示す。

いくつかの実施形態では、中央の管からの突起部または分岐部に含まれる区画により、例えば、「耳」の形態で２つを超える方向から試薬を混合することが可能である。例えば、２つのスクイーズバルブを使用して、培地およびファージを連続的にまたは同時に主区画に添加するか、他の試薬を添加することができる。中央の区画に対して他の区画を様々に配置することにより、より大きな隣接区画に異なる試薬を添加および混合することが可能である。
微生物の検出のための装置を使用する方法

本明細書中に述べたように、ある特定の実施形態では、本発明は、微生物を検出する方法であって、微生物が固体支持体上に捕捉されるように、試料を固体支持体と接触させる工程、例えば、第１の区画のスナップ動作シールを破壊することによって、第１の区画由来の組換えバクテリオファージを固体支持体上に捕捉された微生物と接触させる工程を含む、方法を含み得る。感染中および／または感染後に、バクテリオファージが指標遺伝子を発現して指標を産生し、この指標を種々の検出デバイスによって検出することができる。いくつかの実施形態では、指標の検出には、指標と反応して検出可能なシグナルを産生する基質を添加することが必要であり得る。シグナルの存在は、試料中の微生物の存在を示す。

別の実施形態では、本発明は、微生物を検出する方法であって、微生物が固体支持体上に捕捉されるように、試料を固体支持体と接触させる工程、例えば、第１の区画のスナップ動作シールを破壊することによって、第１の区画由来の組換えバクテリオファージを固体支持体上に捕捉された微生物と接触させる工程を含む、方法を含み得る。組換えバクテリオファージの指標部分を、種々の検出デバイスによって検出することができる。いくつかの実施形態では、指標の検出には、指標と反応して検出可能なシグナルを産生する基質を添加することが必要であり得る。シグナルの存在は、試料中の微生物の存在を示す。
試料採取

いくつかの実施形態では、試料を、調製、濃縮、または希釈することなく、本発明の検出方法で直接使用することができる。例えば、液体試料（ミルクおよび果汁が含まれるが、これらに限定されない）を、直接アッセイすることができる。他の実施形態では、試料を、溶液（緩衝液または細菌培養培地が含まれ得るが、これらに限定されない）に希釈または懸濁することができる。固体または半固体である試料を、液体中で固体を細かく刻むか、混合するか、浸軟することによって液体に懸濁することができる。いくつかの実施形態では、試料を、宿主細菌細胞へのファージの付着を促進するｐＨ範囲内で維持すべきである。いくつかの実施形態では、好ましいｐＨ範囲は、細菌細胞に付着したバクテリオファージに適切なｐＨ範囲であり得る。試料はまた、適切な濃度の二価および一価のカチオン（Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、およびＫ＋が含まれるが、これらに限定されない）を含むべきである。

好ましくは、検出アッセイを通して、試料は、試料中に存在する任意の病原体細胞の生存率を維持する温度に維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着している工程中、バクテリオファージの活動が容易になる温度に試料を維持することが好ましい。かかる温度は少なくとも約２５℃かつ約４５℃以下である。いくつかの実施形態では、試料を約３７℃に維持する。いくつかの実施形態では、試料は、バクテリオファージの結合または付着中に、穏やかな混合または振盪に供される。

アッセイは、種々の適切な対照試料を含み得る。例えば、細菌を含まない対照試料（例えば、食品試料）は、バックグラウンドシグナルレベルの対照としてアッセイされ得る。

試料採取を、種々の方法を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、試料（例えば、食品試料）を最初に液化し、固体支持体（例えば、固体支持体またはビーズ）を、液体試料に液浸させる。いくつかの実施形態では、固体支持体を、試料採取前に最初に管内の培養培地に浸漬する。いくつかの実施形態では、固体支持体は試料採取前に乾燥している。いくつかの実施形態では、液体試料を、一定期間（「培養富化」）（例えば、２４時間未満、１２時間未満、９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化期間未満）最初に培養する。

他の実施形態では、試料を、固体支持体上への微生物の捕捉後に富化してよい。いくつかの実施形態では、微生物を有する固体支持体を、装置の第３の区画中の増殖培地中でインキュベートして、微生物数を拡大することができる。この工程を、インキュベーション富化と称する。かかる実施形態では、富化期間は、試料のタイプおよびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７時間、または最大８時間までまたはそれを超える期間であり得る。

本発明の方法のいくつかの実施形態では、微生物を、試料からの微生物のいかなる単離または精製もなく検出することができる。例えば、ある特定の実施形態では、１またはそれを超える目的の微生物を含む試料を、固体支持体に直接適用してよく、アッセイを装置内で行う。
感染

本明細書中に開示の方法は、組換えバクテリオファージが目的の微生物と接触するように装置を操作する工程を含む。微生物の接触の際に、バクテリオファージは、指標遺伝子またはレポーター遺伝子を複製および発現する。「組換えバクテリオファージ」の部を参照のこと。感染時間（すなわち、試料を最初にバクテリオファージと接触させた時点と基質を混合物に添加した時点との間の時間）は、バクテリオファージのタイプおよび試料中の微生物の濃度に応じて変動し得る。細菌を固体支持体上に捕捉する装置を使用すると、感染に必要な時間をかなり削減することができ、例えば、感染時間が１時間またはそれ未満であり得る一方で、標準的なアッセイでは、細菌を捕捉するために固体支持体を使用しない場合、感染は、典型的には、少なくとも４時間であり、ある特定の実施形態では、本明細書中に開示の感染時間は、６．０時間未満、５．０時間未満、４．０時間未満、３．０時間未満、２．５時間未満、２．０時間未満、１．５時間未満、１．０時間未満、４５分未満、または３０分未満である。いくつかの実施形態では、感染時間は、約１時間、約２時間、または約３時間である。
シグナルの発生

指標遺伝子の発現によって産生される指標を、当業者に周知の方法を使用して検出することができる。例えば、１またはそれを超えるシグナル産生成分を指標と反応させて検出可能なシグナルを生成することができる。いくつかの実施形態では、指標は、生物発光化合物であり得る。指標が酵素である場合、酵素を１またはそれを超える基質またはさらなる酵素および基質と反応させて検出可能な反応生成物を産生することによって、検出可能なシグナルを増幅する。代替的なシグナル産生システムでは、指標は、検出可能なシグナルを産生させるために指標の酵素による操作を必要としない蛍光化合物であり得る。蛍光分子（例えば、フルオレセインおよびローダミンならびにこれらの誘導体およびアナログが含まれる）は、かかるシステムにおける指標として使用するのに適している。さらに別の実施形態では、指標部分は補因子であり得、次いで、補因子を酵素および１またはそれを超える基質またはさらなる酵素および基質と反応させて検出可能な反応生成物を産生することによって、検出可能なシグナルを増幅する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは比色法に関する。特定の指標の選択は本発明に重要ではないが、指標は、それ自体、または装置によって検出可能であるか、１またはそれを超えるさらなるシグナル生成成分と併せて（酵素／基質シグナル生成システムなど）検出可能なシグナルを生成することができることに留意すべきである。

いくつかの実施形態では、検出工程には、指標酵素と作用させるための基質の添加が必要であろう。基質を種々の方法で添加することができる。いくつかの実施形態では、基質は、装置の第２の区画中に含まれ、スナップ動作シールを破壊すると、ファージ（装置の第１の区画中）および基質が（固体支持体に捕捉された）微生物と同時に接触する。図１２を参照のこと。いくつかの実施形態では、スナップ動作シールが連続的に破壊されて、微生物が基質との接触前にバクテリオファージと接触する。図１３Ａおよび１３Ｂを参照のこと。いくつかの実施形態では、本方法は、微生物が基質との接触前にバクテリオファージと接触するように段階的に混合できるようにストップ・ロックを操作する工程を含む。

いくつかの実施形態では、指標（例えば、ルシフェラーゼ）の基質との反応は、３０分間またはそれを超えて継続してよく、感度を最適にするために種々の時点で検出することが好ましい場合がある。いくつかの実施形態では、照度計を、最初に読み取り、反応が完了するまで３分間隔、または５分間隔、または１０分間隔、または１５分間隔で読み取ってよい。
シグナルの検出

指標によって産生されたシグナルの検出は、発光の検出を含み得る。いくつかの実施形態では、感染およびその後の基質とのインキュベーションに起因する任意のシグナルを目視できるように、基質が試験試料と混合される装置の区画は透明である。この場合、シグナルを、区画の壁を介して検出することができる。いくつかの実施形態では、反応済み試料を含む装置を、得られたシグナルを検出するために機器に挿入する。他の実施形態では、検出機器を使用して、反応済み試料を含む装置をスキャンする。

いくつかの実施形態では、指標（例えば、ルシフェラーゼ）を検出するために照度計（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧｌｏＭａｘ（登録商標）２０／２０およびＧｌｏＭａｘ（登録商標））が使用され得る。いくつかの実施形態では、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラは、変色および他の発光を検出するために使用することができる。絶対ＲＬＵは検出に重要であるが、単一の細胞または少数の細胞を確実に検出するためには、シグナル対バックグラウンド比が高いことも必要である（例えば、２．０超、２．５超、または３．０超）。バックグラウンドシグナルを、上記と同一の手順を使用して微生物を含まない対照試料を測定することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子または指標遺伝子由来のシグナルの検出は、例えば、光ダイオードまたはＰＭＴ（光電子増倍管）テクノロジーを使用する機器の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、ハンドヘルド照度計を、シグナル検出のために使用してよい。適切なＰＭＴハンドヘルド照度計は、３Ｍ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ，ＭＮ）、ＢｉｏＣｏｎｔｒｏｌ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、およびＣｈａｒｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）から入手可能である。適切な光ダイオードハンドヘルド照度計は、Ｈｙｇｉｅｎａ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＮｅｏｇｅｎ（Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）から入手可能である。これらのハンドヘルド照度計は、典型的には、同一試料について伝統的な照度計（ＧｌｏＭａｘまたはＧｌｏＭａｘ２０／２０）と比較して読み取り値が遥かに低い。実施例に示すように、複数の実験から、反応によって産生されたシグナルがこれらのハンドヘルド照度計によって検出されるのに十分であったことを示す。異なるタイプの微生物（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａが含まれる）を使用してアッセイを複数回繰り返し、毎回類似の結果が得られた。これは、前述の装置を使用した検出方法の感度が十分であり、頑強であることを示す。また、これらのハンドヘルドデバイスが微生物を検出するために使用できることは、伝統的な非ハンドヘルド検出デバイスを使用した検出方法を使用したときに欠くことが多い利便性および順応性を提供する。
本発明のシステムおよびキット

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に開示の方法を実施するための構成要素を含むシステム（例えば、自動システム）またはキットを含む。いくつかの実施形態では、装置は、本発明のシステムまたはキット中に含まれる。また、本明細書中に記載の方法は、かかるシステムまたはキットを利用し得る。本明細書中に記載のいくつかの実施形態は、本方法を実行するのに必要な試薬および材料が最小量であることを考慮すると、自動化および／またはキットに特に適している。一定の実施形態では、キットの構成要素の各々は、第１の場所から第２の場所に送達可能な自立型ユニットを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットを含む。システムまたはキットは、ある特定の実施形態では、上記の装置およびシグナル検出構成要素を含んでよく、ここで、前述のシグナル検出構成要素は、試料の組換えバクテリオファージ感染から産生された指標遺伝子産物を検出することができる。いくつかの実施形態では、シグナル検出構成要素はハンドヘルドデバイスである。いくつかの実施形態では、シグナル検出構成要素はハンドヘルド照度計である。

したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、試料中の目的の微生物を迅速に検出するためのシステムまたはキットであって、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画を含む装置であって、前述の構築物がプロモーターおよび指標遺伝子を含む装置、を含むシステムまたはキットを含み得る。システムまたはキットは、基質を含む第２の区画および／または培地を含む第３の区画をさらに含み得る。これらの区画のうちの１つまたは複数はシールされており、スナップ動作シールによって装置の他の部分から分離されており、スナップ動作シールが破壊されると、区画由来の内容物が区画から遊離して試料と混合する。

いくつかの実施形態では、システムは、試料中の他の構成要素から目的の微生物を単離するための構成要素を含み得る。

いくつかのシステムおよび／またはキットでは、同一の構成要素を複数の工程のために使用することができる。いくつかのシステムおよび／またはキットでは、工程は、自動化されているか、コンピュータ入力を介して使用者によって制御され、そして／または液体処理ロボットが少なくとも１つの工程を実行する。コンピュータ化システムにおいて、システムは、完全に自動化され得るか、半自動化され得るか、コンピュータを介して使用者によって指示され得る（またはこれらのいくつかの組み合わせ）。

本発明のこれらのシステムおよびキットは、種々の構成要素を含む。本明細書中で使用される場合、用語「構成要素」は、広く定義され、列挙された方法を実施するのに適した任意の適切な装置または装置の集合物を含む。構成要素は、任意の特定の方法で一体化するように相互に接続または配置する必要はない。本発明は、相互の構成要素の任意の適切な配置を含む。例えば、構成要素は同一の空間にある必要はない。しかし、いくつかの実施形態では、構成要素は、一体型ユニット中で相互に接続されている。いくつかの実施形態では、同一の構成要素が複数の機能を実行することができる。
コンピュータシステムおよびコンピュータ可読媒体

一定の実施形態では、本発明は、システムを含み得る。システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、システムは、方法を実施するための構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。一定の実施形態では、システムを、キットとして製剤化する。したがってある特定の実施形態では、本発明は、試料中の目的の微生物の迅速な検出のためのシステムを含み得る。システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、システムは、方法を実施するための構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。一定の実施形態では、システムを、キットとして製剤化する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、上記の装置を含む、試料中の目的の微生物の迅速な検出のためのシステムを含み得る。例えば、装置は、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画を含んでよく、前述の構築物がプロモーターおよび指標遺伝子を含み；前述の固体支持体は結合成分を含む。いくつかの実施形態では、システムは、ハンドヘルド検出デバイスも含む。

本発明の技術またはその構成要素のいずれかに記載のシステムは、コンピュータシステムの形態で具現化され得る。コンピュータシステムの典型的な例には、汎用コンピュータ、プログラミングされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、周辺集積回路素子、および本発明の技術の方法を構成する工程を実装することができる他のデバイスまたはデバイスの配置が含まれる。

コンピュータシステムは、コンピュータ、入力デバイス、ディスプレイユニット、および／またはインターネットを含み得る。コンピュータは、マイクロプロセッサをさらに含み得る。マイクロプロセッサは、コミュニケーションバスに接続され得る。また、コンピュータは、メモリを含み得る。メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含み得る。コンピュータシステムは、記憶装置をさらに含み得る。記憶装置は、ハードディスクドライブまたはリムーバブル記憶ドライブ（フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光ディスクドライブなど）であり得る。また、記憶装置は、コンピュータプログラムのローディングまたはコンピュータシステムへの他の命令のための他の類似の手段であり得る。また、コンピュータシステムは、通信ユニットを含み得る。通信ユニットは、Ｉ／Ｏインターフェースを介してコンピュータを他のデータベースおよびインターネットに接続する。通信ユニットは、データを他のデータベースに転送し、他のデータベースから受信もする。通信ユニットは、モデム、イーサネット（登録商標）カード、またはコンピュータシステムがデータベースおよびネットワーク（ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮ、およびインターネットなど）に接続することができる任意の類似のデバイスを含み得る。したがって、コンピュータシステムは、Ｉ／Ｏインターフェースを介してシステムにアクセスできる入力デバイスを介して使用者からの入力を容易にし得る。

コンピューティングデバイスは、典型的には、コンピューティングデバイスの一般的な管理および演算についての実行可能プログラム命令を提供するオペレーティングシステムを含み、典型的には、サーバのプロセッサによって実行されたときにコンピューティングデバイスがその意図する機能を果たす命令を記憶しているコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリなど）を含むであろう。コンピューティングデバイスのオペレーティングシステムおよび一般的機能に適切な実装は、公知であるか市販されており、特に本開示を考慮して、当業者によって容易に実装される。

入力データを処理するために、コンピュータシステムは、１またはそれを超える記憶素子に記憶された一連の命令を実行する。また、記憶素子は、必要に応じてデータまたは他の情報を保持し得る。記憶素子は、処理装置内に存在する情報源または物理記憶素子の形態であり得る。

環境は、上記で考察した種々のデータ格納および他のメモリおよび記憶媒体を含むことができる。これらは、コンピュータのうちの１つまたは複数に対してローカルであるか（そして／または常駐するか）、ネットワークを介して任意のまたは全てのコンピュータからリモートの記憶媒体上などの種々の位置に存在することができる。特定の一連の実施形態では、情報は、当業者によく知られたストレージエリアネットワーク（「ＳＡＮ」）に存在し得る。同様に、コンピュータ、サーバ、または他のネットワークデバイスに起因する機能を果たすための任意の必要なファイルは、必要に応じて、ローカルおよび／またはリモートで記憶され得る。システムがコンピューティングデバイスを含む場合、各々のかかるデバイスは、バスによって電気的に結合され得るハードウェア要素（例えば、少なくとも１つの中央処理装置（ＣＰＵ）、少なくとも１つの入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラ、タッチスクリーン、またはキーパッド）、および少なくとも１つの出力デバイス（例えば、ディスプレイデバイス、プリンタ、またはスピーカー）が含まれる要素）を含むことができる。また、かかるシステムは、１またはそれを超える記憶装置（ディスクドライブ、光学式記憶装置、および固体記憶装置（ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）またはリードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」）など）、ならびに可換型媒体装置、メモリカード、フラッシュカードなど）など）を含み得る。

また、かかるデバイスは、上記のコンピュータ可読記憶媒体リーダ、通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークカード（無線または有線）、赤外線通信デバイスなど）、およびワーキングメモリを含むことができる。コンピュータ可読記憶媒体リーダを、リモート型、ローカル型、固定型、および／または可換型の記憶装置を意味するコンピュータ可読記憶媒体、ならびにコンピュータ可読情報を一過性におよび／またはより持続的に含み、記憶し、転送し、検索するための記憶媒体に接続するか、受信するように構成することができる。また、システムおよび種々のデバイスは、典型的には、少なくとも１つのワーキングメモリデバイス（オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラム（クライアントアプリケーションまたはウェブブラウザなど）が含まれる）内に配置されたいくつかのソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービス、または他の要素を含むであろう。代替の実施形態が上記に由来する変形形態を多数有し得ると認識すべきである。例えば、また、カスタマイズしたハードウェアを使用してよく、そして／または特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（アプレットなどの高移植性ソフトウェアが含まれる）、またはその両方に実装され得る。さらに、ネットワーク入力／出力デバイスなどの他のコンピューティングデバイスに接続され得る。

コードまたはコードの一部を含めるための非一過性記憶媒体およびコンピュータ可読媒体には、当該分野で公知であるか、使用されている任意の適切な媒体（記憶媒体および通信媒体（コンピュータ可読指示、データ構造、プログラムモジュール、または他のデータなどの情報を記憶および／または伝送するための任意の方法またはテクノロジーで実装された揮発性および不揮発性の、可換型および非可換型の媒体（ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、もしくは他の記憶テクノロジー、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、もしくは他の光記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置、もしくは他の磁気記憶装置、または所望の情報を記憶させるために使用することができ、かつシステムデバイスによってアクセスすることができる任意の他の媒体が含まれる）などであるが、これらに限定されない）が含まれる）を挙げることができる。本明細書中に提供した開示および教示に基づいて、当業者は、種々の実施形態を実装するための他の手段および／または方法を認識するであろう。

コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読指示をプロセッサに提供することができる電子記憶装置、光学記憶装置、磁気記憶装置、または他の記憶装置を含み得るが、これらに限定されない。他の例には、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリーチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、連想メモリ（「ＣＡＭ」）、ＤＤＲ、フラッシュメモリ（ＮＡＮＤフラッシュまたはＮＯＲフラッシュなど）、ＡＳＩＣ、設定済みプロセッサ、光記憶装置、磁気テープ、もしくは他の磁気記憶装置、またはコンピュータプロセッサが指示を読み出すことができる任意の他の媒体が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、コンピューティングデバイスは、単一のタイプのコンピュータ可読媒体（ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）など）を含み得る。他の実施形態では、コンピューティングデバイスは、２またはそれを超えるタイプのコンピュータ可読媒体（ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブ、およびキャッシュなど）を含み得る。コンピューティングデバイスは、１またはそれを超える外付けコンピュータ可読媒体（外付けハードディスクドライブまたは外付けＤＶＤドライブもしくはブルーレイドライブなど）と通信し得る。

上記で考察されるように、実施形態は、コンピュータ実行可能プログラム命令を実行し、そして／またはメモリ内に記憶された情報にアクセスするように構成されたプロセッサを含む。命令は、コンパイラおよび／またはインタープリタによって任意の適切なコンピュータ－プログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる）で書かれたコードから生成されたプロセッサ特異的命令を含み得る。１つの実施形態では、コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサを含む。他の実施形態では、デバイスは、２つまたはそれを超えるプロセッサを含む。かかるプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および状態機械を含み得る。かかるプロセッサは、プログラマブル電子デバイス（ＰＬＣなど）、プログラマブル割り込み制御回路（ＰＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電子的にプログラマブルなリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭまたはＥＥＰＲＯＭ）、または他の類似のデバイスをさらに含み得る。

コンピューティングデバイスは、ネットワーク・インターフェースを含む。いくつかの実施形態では、ネットワーク・インターフェースは、有線または無線の通信リンクを介した通信のために構成される。例えば、ネットワーク・インターフェースは、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、ＩＥＥＥ ８０２．１１（Ｗｉ－Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ－Ｍａｘ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、赤外線などを介してネットワーク上で通信することが可能であり得る。別の例として、ネットワーク・インターフェースは、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳ、または他のセルラー通信ネットワークなどのネットワーク上で通信することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、ネットワーク・インターフェースは、ユニバーサル・シルアル・バス（ＵＳＢ）、１３９４ ＦｉｒｅＷｉｒｅ、直列接続もしくは並列接続、または類似のインターフェースなどを介した別のデバイスとの二地点間接続が可能であり得る。適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、１またはそれを超えるネットワーク上の通信のための２またはそれを超えるネットワーク・インターフェースを含み得る。いくつかの実施形態では、コンピューティングデバイスは、ネットワーク・インターフェースに加えて、またはこれの代わりのデータストアを含み得る。

適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、いくつかの外部または内部デバイス（マウス、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディオスピーカー、１またはそれを超えるマイクロフォン、または任意の他の入力デバイスもしくは出力デバイスなど）を含み得るか、これらと通信し得る。例えば、コンピューティングデバイスは、種々のユーザーインターフェースデバイスおよびディスプレイと通信し得る。ディスプレイは、任意の適切なテクノロジー（ＬＣＤ、ＬＥＤ、およびＣＲＴなどが含まれるが、これらに限定されない）を使用し得る。

コンピュータシステムによる実行のための一連の命令は、本技術の方法を構成する工程などの特異的タスクを実施するように処理機に命令する種々のコマンドを含み得る。一連の命令は、ソフトウェアプログラムの形態であり得る。さらに、ソフトウェアは、本技術などのような個別のプログラム、より大きなプログラムを有するプログラムモジュールまたはプログラムモジュールの一部の集合体の形態であり得る。また、ソフトウェアは、オブジェクト指向プログラミングの形態のモジュラ・プログラミングを含み得る。入力データは、処理機によって、ユーザーコマンド、前の処理の結果、または別の処理機によって作製されたリクエストに応答して処理され得る。

一定の実施形態を参照して本発明を開示してきたが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲および意図から逸脱することなく、記載の実施形態の多くの修正、変更、および変化が可能である。したがって、本発明は、記載の実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有することが意図される。

以下の実施例は、結果が出るまでの時間が短縮された、少数の細胞（単一の細菌でさえも）の検出を記載し、これらの実施例は、例示であり、本発明を制限しない。
実施例１．細菌培養物中の目的の微生物の検出

この実施例は、細菌培養物中に存在する細菌を首尾よく検出する装置を使用した検出方法の性能を実証する。
装置の組み立て

１００μＬ Ａ５１１／Ｐ１００ファージカクテル（１．２×１０^９Ｐｆｕ／ｍＬ）および１００μＬ ＢＨＩ培地＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２を、装置の上部バルブ（第１の区画）に添加した。Ａ５１１／ｐ１００ファージは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓを標的にするファージである。固体支持体のプレスを使用して、装置の上部区画と共にプレスした。装置の管を９００μＬ ＢＨＩ培地＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で満たした。次いで、固体支持体を装置の管に入れていくらかの培地を吸収させた。次いで、組み立てられた装置（培地に浸漬された固体支持体を含む）を、４℃で一晩保持した。
細菌培養物の増殖

Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓを、振盪インキュベーター中にてＢＨＩ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で一晩増殖させた。次いで、一晩の培養物を、ＢＨＩ培地中で対数期まで３７℃で継代した。次いで、対数期の細胞を、適切な細胞数に希釈した（図２を参照のこと）。固体支持体を装置から取り出し、希釈した培養物を、固体支持体上に表示のＣＦＵレベルでスパイクした。細菌または培地のみ（対照）をスパイクした固体支持体を、装置の管に戻し、管を穏やかに振盪して内容物を混合した（図２、表１）。

類似の実験において、２つの固体支持体に、１０ＣＦＵの各細菌をスパイクした。非播種試料を対照として使用した。これらの試料を感染および基質曝露を行った後３５℃で一晩インキュベートして細菌数を拡大させた（図２、表２）。
感染

次いで、スナップバルブを、固体支持体をしっかりと保持して親指および人差し指でバルブを破壊することによって破壊した。ファージ（２００μＬの６×１０^８Ｐｆｕ／ｍＬ）を、固体支持体の管の上部のバルブを強く押すことによって下方に排出した。固体支持体の管内の内容物を、旋回することによって穏やかに混合した。次いで、固体支持体を、細菌にファージを感染させるために３０℃のインキュベーター中に４時間入れた。ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を７０％エタノールで１：４に希釈し、１０μＬの希釈した基質を固体支持体の管に入れた。装置の管の内容物をボルテックスによって混合し、次いで、３分間静置した。
検出

３つの検出方法を使用した。固体支持体の管を、Ｈｙｇｉｅｎａハンドヘルド照度計に挿入した。１ｍＬの感染混合物を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に移してＧｌｏＭａｘ２０／２０照度計（「ＧｌｏＭａｘ２０／２０」）で読み取り、１５０μｌの感染混合物を９６ウェルプレートに移してＧｌｏＭａｘ照度計（「ＧｌｏＭａｘ」）で読み取った。

次いで、一晩培地に浸漬させた固体支持体を用いて、感染時間２時間で検出した。結果を図２、表１、および表２に示し、結果のグラフ図を図３Ａおよび３Ｂに示す。結果は、増殖富化を行わない場合（捕捉前の固体支持体を用いた試料の一晩培養を行わない）、試験はＨｙｇｉｅｎａハンドヘルド照度計で２５，０００ＣＦＵを検出し（図３Ａ）（細菌播種試料の読み取り値は全て陽性試料についての１０相対発光単位（ＲＬＵ）の基準の検出閾値を超えていた）、そしてＧｌｏＭａｘ２０／２０またはＧｌｏＭａｘでおよそ５，０００ＣＦＵを検出する（図３Ｂ）のに十分な感度であることを示す。
実施例２．シチメンチョウ試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出
装置の組み立て

上部バルブに１００μＬ ＳＥＡ１／ＴＳＰ１ファージカクテル（１．２×１０^７Ｐｆｕ／ｍＬ）および１００μＬ ＴＳＢ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｏｘｏｉｄ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ ＵＳＡ）を充填し、装置の管に１ｍＬ ＴＳＢ培地を充填することを除いて、装置を実施例１に記載のように組み立てた。ＳＥＡ１／ＴＳＰ１ファージは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを標的にするファージである。
シチメンチョウ挽肉の細菌接種

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ培養物を一晩増殖させ、下記のように高ＣＦＵ試料および低ＣＦＵ試料について希釈した。

２５ｇのシチメンチョウ挽肉の試験部分を、以下の３群に分割した：非播種群（５試料）、高播種群（５試料）、および低播種群（２０試料）。各２５ｇの高播種群の試料に２～１０ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａを播種し、低播種群の各試料に０．２～２ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａを播種した。次いで、試料を、フィルターを通した試料バッグに入れ、４℃で４８～７２時間保管した。
播種したシチメンチョウ挽肉中の細菌の富化

予め加温したＴＳＢ培地（４１℃）を、試料：培地比１：３で各試料に添加した。次いで、試料をＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（登録商標）のハイで３０秒間ブレンドし、次いで、振盪せずに４１℃で２４時間インキュベートして試料中の細菌を富化した。
試料採取

試験試料を、各々の富化試料中に固体支持体を液浸し、１０秒間旋回して最大量の試料を吸収させることによって得た。固体支持体を、ＴＳＢ培地で満たした装置の管に入れた。管を穏やかに振盪して管内の内容物を混合し、次いで、その直後に感染させるか、感染前に３７℃でさらに１時間おいた。
感染

次いで、バクテリオファージを収容した区画のスナップバルブを、固体支持体しっかりと保持して親指および人差し指でバルブを破壊することによって破壊した。ファージ（２００μＬの６×１０^６Ｐｆｕ／ｍＬ）を、装置の管の上部のバルブを強く押すことによって管の下方に排出した。装置の管内の内容物を、旋回することによって穏やかに混合した。次いで、固体支持体を、細菌にファージを感染させるために３７℃のインキュベーター中に３０分間または２時間入れた。ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を７０％エタノールで１：４に希釈し、１０μＬの希釈した基質を装置の管に入れた。装置の管の内容物をボルテックスによって混合し、次いで、３分間静置した。シグナルを実施例１に記載のように検出した。非播種試料（対照群）由来の結果を図４、表３に示し、播種試料（実験群）由来の結果を表４に示す。結果のグラフ図を、図５Ａおよび図５Ｂに示す。

結果は、使用した３つの検出デバイスの各々が、全てのシチメンチョウ試料が２４時間の培養物の富化後にＳａｌｍｏｎｅｌｌａに対して陽性であることを検出できたことを示す。ＧｌｏＭａｘおよびＧｌｏＭａｘ２０／２０由来のシグナルは、Ｈｙｇｉｅｎａ照度計よりもはるかに高かった。インキュベーション時間（すなわち、感染前の細菌を捕捉した固体支持体の培地とのインキュベーション）および感染時間は、シグナル強度に影響を及ぼし得る要因である。試験した種々のさらなるインキュベーション時間および感染時間のうちで、０時間のインキュベーション時間および２時間の感染時間の試料のＲＬＵが最も高く、１時間のインキュベーション時間および０．５時間の感染時間の試料が続き、０時間のインキュベーション時間および０．５時間の感染時間の試料が続いた。また、結果は、０時間のインキュベーションおよび２時間の感染のバックグラウンドシグナルが最も低いことを示す。
実施例３．アッセイの感度に及ぼす感染時間の影響を試験するためのさらなる研究

固体支持体を細菌シチメンチョウ試料に液浸した後に、固体支持体を培地に入れ、その直後に感染させた（すなわち、固体支持体上で細菌を増殖させるためのインキュベーション時間がない）ことを除いて、実験を実施例２に記載のように設定した。感染時間は、３０分間から２時間まで変動した。シグナルを上記のように検出した。３つの試料の結果を図６に示し、図７Ａ～７Ｃにデータをプロットしている。結果は、試料２４および２６に示すように、２時間の感染でシグナルを増加させることができたが、Ｈｙｇｉｅｎａにおいては３０分間の感染でシグナルを示さなかったが、２時間の感染でシグナルを示したことを示す。

図８Ａ～８Ｃは、ＧｌｏＭａｘとＧｌｏＭａｘ２０／２０との異なるデバイスの間の比較を示す。ＧｌｏＭａｘおよびＧｌｏＭａｘ２０／２０は、類似の結果を示した。
実施例４．Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１９１１５環境スポンジ試料の試験

Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓをセラミックタイル表面に播種し、乾燥させ、室温で１８～２４時間おいた。試料スポンジを使用してセラミックタイルを拭き取り、スポンジをバッグに入れて３５℃で２４時間富化させた。次いで、実施例２に記載のように、固体支持体を使用して富化試料を採取した。１００μＬ Ｌｉｓｔｅｒｉａファージ（濃度１．２×１０^８ＰＦＵ／ｍｌ）を使用して、細菌シチメンチョウ培養物に３０℃で１時間感染させた。ＧｌｏＭａｘおよびＨｙｇｉｅｎａを使用してシグナルを検出した。結果を図９に示す。結果は、ＨｙｇｉｅｎａハンドヘルドがＬ．ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓ汚染環境試料を検出することができることを示す。
実施例５．異なる検出デバイス

実験を実施例２に記載のように設定した。ファージ感染時間は、３７℃で１時間であった。シグナルを、ＧｌｏＭａｘ、３Ｍハンドヘルド照度計（「３Ｍ」）、およびＨｙｇｉｅｎａで読み取り、結果を図１０に示す。３Ｍがシグナル検出においてより感度が高いことを示す。

Claims (29)

1. デバイスであって、
   バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前記構築物が、プロモーターおよび指標遺伝子を含む、第１の区画、および
   シグナル検出構成要素を含む第２の区画であって、前記シグナル検出構成要素が、前記試料への前記組換えバクテリオファージの感染の結果として産生された前記指標遺伝子産物の検出を容易にする、第２の区画
   を含む、デバイス。
2. 前記シグナル検出構成要素が基質であり、前記指標遺伝子が酵素をコードする、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記酵素がルシフェラーゼである、請求項２に記載のデバイス。
4. 試料中の１またはそれを超える目的の微生物を検出する方法であって、
   前記試料をデバイス内の感染性試薬と接触させる工程であって、前記試料中の前記１またはそれを超える目的の微生物が、存在する場合、前記感染性因子によって感染される、接触させる工程であって、
   前記デバイスが、
   バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前記構築物が、プロモーターおよび指標遺伝子を含む、第１の区画を含み、
   前記第１の区画由来の前記組換えバクテリオファージを、前記組換えバクテリオファージが前記試料中の１またはそれを超える微生物に感染するように前記試料と接触させ、それにより、指標遺伝子産物を産生する、接触させる工程、および
   第２の区画中の前記指標遺伝子産物を検出する工程
   を含む、方法。
5. 前記第２の区画が基質を含み、ここで、前記指標遺伝子産物を検出する工程を、前記指標遺伝子産物を基質と接触させた後に行う、請求項４に記載の方法。
6. 前記方法が、前記試料中の微生物を固体支持体に結合させる工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
7. 前記固体支持体がビーズである、請求項６に記載の方法。
8. 前記固体支持体が、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）を含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記装置が基質を含む第２の区画をさらに含み、ここで、前記方法が、前記組換えバクテリオファージの添加と同時または添加後に、前記第２の区画由来の基質を前記試料に添加する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
10. 前記第１の区画がシールを含み、ここで、前記組換えバクテリオファージを前記試料と接触させる工程は、前記シールを破壊することによって実施され、ここで、前記シールが破壊されると、前記第１の区画由来の前記組換えバクテリオファージが前記試料と接触して前記試料中の前記１またはそれを超える微生物に感染し、それにより、指標遺伝子産物が産生される、請求項４に記載の方法。
11. 前記バクテリオファージが凍結乾燥されている、請求項４に記載の方法。
12. 前記装置が、増殖培地を含む第３の区画を含む、請求項４に記載の方法。
13. 前記方法が、前記組換えバクテリオファージを添加する前に、前記増殖培地中の前記１またはそれを超える目的の微生物を捕捉している固体支持体を一定期間インキュベートする工程を含む、請求項４に記載の方法。
14. 前記装置が、前記組換えバクテリオファージおよび前記基質の前記試料との段階的混合のためのストップ・ロックを含む、請求項４に記載の方法。
15. 前記固体支持体が、前記試料との接触前に乾燥している、請求項４に記載の方法。
16. 前記固体支持体が、前記試料との接触前に培地に浸漬されている、請求項４に記載の方法。
17. 前記１またはそれを超える生物を捕捉している前記固体支持体を、前記組換えバクテリオファージとの接触前に、第３の区画中の増殖培地とインキュベートする、請求項４に記載の方法。
18. 前記インキュベーションが０～２時間である、請求項４に記載の方法。
19. 前記バクテリオファージが、前記指標遺伝子産物の検出前に、前記試料と０．２～３時間接触されている、請求項４に記載の方法。
20. 前記指標遺伝子産物が、フルオロフォア、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１つを含む、請求項４に記載の方法。
21. 前記酵素が、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ルシフェラーゼが遺伝子操作されたルシフェラーゼである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記試料が、食品試料、環境試料、水試料、商業的試料、または臨床試料である、請求項４に記載の方法。
24. 前記方法が、食品安全性業界の標準サイズの試料中の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または単一ほどの少数の細菌を検出する、請求項４に記載の方法。
25. 前記試料が、食用肉または野菜を含む、請求項４に記載の方法。
26. 前記試料が、食品試料、水試料、乳製品試料、環境試料、商業的試料、または臨床試料である、請求項４に記載の方法。
27. 前記試料を、９時間もしくはそれ未満、８時間もしくはそれ未満、７時間もしくはそれ未満、６時間もしくはそれ未満、５時間もしくはそれ未満、４時間もしくはそれ未満、３時間もしくはそれ未満、または２時間もしくはそれ未満の富化期間で好ましい増殖条件にて最初にインキュベートする、請求項４に記載の方法。
28. 試料中の目的の微生物を検出するためのシステムであって、
    バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、前記構築物が、プロモーターおよび指標遺伝子を含む、第１の区画、および
    シグナル検出構成要素であって、前記シグナル検出構成要素が、前記試料への前記組換えバクテリオファージの感染から産生された指標遺伝子産物を検出することができる、シグナル検出構成要素
    を含む、装置を含むシステム。
29. 前記シグナル検出構成要素がハンドヘルド照度計である、請求項２８に記載のシステム。
    
    

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