CN110904054A - 一种沙门氏菌噬菌体see-1及其应用 - Google Patents

一种沙门氏菌噬菌体see-1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌噬菌体SEE‑1及其应用。本发明涉及沙门氏菌的防控，属于生物工程领域。从污水处理系统中分离出一株新型噬菌体SEE‑1，保藏号:CGMCC NO.1834D；并对其进行基因组基本性质分析，尤其是其功能基因和蛋白的预测分析。本发明分离的沙门氏菌噬菌体SEE‑1在裂解肠炎沙门氏菌的实验中表现出快速高效的裂解效用，可用于污水处理系统中防治肠炎沙门氏菌或耐药性肠炎沙门氏菌。

Description

一种沙门氏菌噬菌体SEE-1及其应用
技术领域
本发明涉及沙门氏菌的防控，属于生物工程领域，更具体的说是涉及一 种沙门氏菌噬菌体SEE-1及其应用。
背景技术
沙门氏菌是一种严重的食源性病原菌，因其高发病率已经引起了全世界 的关注。据估计每年有超过13亿人感染沙门氏菌，造成300万人死亡。而肠炎 沙门氏菌是引起沙门氏菌病的常见菌株。治疗细菌感染疾病通常应用抗生素， 但是近年来抗生素抗性问题愈发严重。在欧美等地，每年有25万人死于抗生 素抗性。因此，需要严格把控抗生素的使用以及研发新的替代或辅助抗生素 治疗药物。
与抗生素治疗相比，噬菌体治疗具有特异性高，副作用小，及增殖能力 强等优点。噬菌体治疗形式有多种，如单一噬菌体治疗，多种噬菌体共同作 用，及噬菌体与抗生素联合应用。在利用单一噬菌体裂解宿主菌的过程中， 仍会有抗性菌株的出现。而多种噬菌体共同作用则可有效缓解或阻止此种情 况的出现。
因此，提供一种沙门氏菌噬菌体SEE-1及其应用，扩充噬菌体库是本领域 技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种沙门氏菌噬菌体SEE-1及其应用
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种沙门氏菌噬菌体SEE-1，保藏编号为CGMCC NO.1834D(保藏单位全 称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位代码：CGMCC，
进一步的：一种沙门氏菌噬菌体SEE-1在裂解肠炎沙门氏菌中的应用。
进一步的：一种沙门氏菌噬菌体SEE-1在污水处理系统中防治肠炎沙门 氏菌中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种沙 门氏菌噬菌体SEE-1及其应用，取得的技术效果：为病原菌的防控提供一种 新的方法或辅助手段，丰富噬菌体库；通过对噬菌体SEE-1的形态鉴定和全 基因组测序，挖掘功能蛋白，为噬菌体治疗和生物防治提供一种或多种对病 原菌具有裂解作用的酶类，以此扩大宿主谱，有利于噬菌体应用的广泛性和 有效性；本发明分离的沙门氏菌噬菌体SEE-1在裂解肠炎沙门氏菌的实验中 表现出快速高效的裂解效用，可用于污水处理系统中防治肠炎沙门氏菌或耐 药性肠炎沙门氏菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的噬菌体SEE-1的双层平板噬菌斑形态。
图2附图为本发明提供的噬菌体SEE-1透射电镜形态。
图3附图为本发明提供的噬菌体SEE-1基因组圈图。
图4附图为本发明提供的噬菌体SEE-1基因组系统进化树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种沙门氏菌噬菌体SEE-1及其应用
其中，未强调的单一药品及原料均通过市售渠道获得，例如本发明试验 用噬菌体宿主菌肠炎沙门氏菌1.10754购于中国普通微生物菌种保藏中心，为 本实验室保存。本发明试验用LB培养液、培养基和PEG8000(购自Amresco 公司)；DNase、RNaseA(Sigma公司)；蛋白酶K(Amresco公司)；0.22μm微 孔滤膜(上海市新亚净化器件厂)；氯仿、平衡饱和酚(北京鼎国生物技术 有限公司)等不再一一赘述。未强调的实验方法为本领域常规技术。
实施例1
噬菌体的分离纯化
本发明试验用污水样品为2018年4月采集于北京市某城市污水处理厂曝 气池中作为分离噬菌体的水样。
取200mL水样，经4,000g离心20min，去除大的杂质，再通过0.22μm滤 膜过滤上清,以去除细菌得滤液A。取100mL滤液A、100mL 2×LB培养基与 10mL肠炎沙门氏菌菌液混合，于37℃，160rpm震荡培养10h后，4℃，6000g 离心10min，离心后取上清液，再次离心，得到滤液B。滤液B为拟含有相应 宿主菌的噬菌体，利用双层平板法检测滤液B中是否存有噬菌体，取滤液B 经适当稀释后0.1mL加入肠炎沙门氏菌菌液0.1mL混匀，37℃静置15min后 加入4mL冷却至47℃的0.7％LB半固体培养基，混匀后立即倒入LB固体培 养基上，待其凝固后，37℃培养6-8h，观察有无噬菌斑长出。若有噬菌斑， 则表明滤液中含有相应的噬菌体，反之，则表明未分离出相应噬菌体，需重 新采样分离。
初次分离的噬菌体在双层平板上的噬菌斑，形态、大小常不一致，有待 进一步纯化。在有噬菌斑的双层平板上挑取透明清晰的噬单一菌斑，浸置于 含有1mL SM液的无菌管中，室温放置1h后，取0.1mL上述溶液经适当稀释 后，与沙门氏菌液做双层平板。重复此步骤5-6次，直至双层平板中各噬菌斑 的大小和形态基本一致(参见图1)。
实施例2
噬菌体的形态观察
取噬菌体悬液20μL滴于铜网上，待其自然沉淀10min后，用干燥滤纸从 侧面吸干，晾置约1min后在铜网上加1滴1％醋酸双氧铀，染色2min，然后 小心使用干燥滤纸从侧面将多余染剂吸干，避光自然晾置30min后，用透射 电子显微镜(JEM-1400)观察。
透射电镜结果显示(参见图2)，噬菌体SEE-1有二十面体的头部和长尾， 头部直径约57.5nm，尾部长约113.5nm,根据国际病毒分类学组织(ICTV)病毒 分类第九次报告，可初步将该株噬菌体SEE-1归类为长尾噬菌体科。
实施例3
噬菌体基因组分析鉴定
噬菌体全基因组测序及分析：采用Ill uminaNextSeq500测序技术对样品 的DNA进行测序。随后利用spades 3.0拼接软件对优化序列进行拼接，得到 最优的组装结果。利用生物软件PHASTER对基因组的开放阅读框进行预测 分析，并使用NCBI Blastp完成功能基因的初步注释，使用tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu//tRNAscan-SE/)在线预测tRNA，利用CGView Server 软件(http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/index.html)完成全基因组 圈图的绘制，基于全基因组数据利用MEGA X软件构件系统进化树。
全基因组分析显示，噬菌体SEE-1基因组为环状双链结构，全长为40987 bp，开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)预测有63个(如表1所示)， 其中有22个有相似的蛋白功能，并进行了功能基因注释(参见图3)。经同 源性比对和基因组系统进化树分析(参见图4)显示，噬菌体SEE-1与噬菌体 St161,St162,FSL SP-031andVSip的亲缘关系最近。
表1噬菌体SEE-1开放阅读框的注释
Figure BDA0002221717580000041
Figure BDA0002221717580000051
Figure BDA0002221717580000061
Figure BDA0002221717580000071
a:predictedproteinssize；b:alignedproteinssize
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都 是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种沙门氏菌噬菌体SEE-1，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.1834D。
2.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体SEE-1在裂解肠炎沙门氏菌中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌噬菌体SEE-1在污水处理系统中防治肠炎沙门氏菌中的应用。
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