CN111088233A - 一株痢疾志贺氏菌噬菌体sse1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1及其应用，属于生物技术领域。本发明公开的一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1，保藏编号为CGMCC No.18853，其为病原菌的防控提供一种可选择的基础材料，丰富噬菌体种库；通过对噬菌体SSE1的分离鉴定和全基因组测序，进一步深入挖掘其功能基因和蛋白，为噬菌体治疗和生物防治提供一种或多种对病原菌具有裂解作用的酶类等，以此扩大宿主谱，提高噬菌体应用的广泛性和有效性；噬菌体SSE1可快速高效裂解痢疾杆菌，可用于污水处理系统中痢疾杆菌的污染防治以及耐药性痢疾杆菌的去除。

Description

一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1及其应用。
背景技术
痢疾志贺氏菌为病原菌，主要通过水和食物传播；据统计，每年在全世界范围内感染8000万至1.65亿人，并造成60万人死亡。通常情况下，痢疾杆菌感染可通过抗生素进行治疗。但近年来，随着抗生素的滥用，其已被公认为新兴的环境污染物，严重威胁环境和人类健康。除此之外，抗药性耐药菌株大量涌现。在美国每年约有27000例抗药痢疾杆菌感染事件发生。尤其是超级细菌的出现，使得抗生素的使用更是大大受到限制。超级细菌感染快，并对大多数抗生素有强大的抵抗作用，对人类健康造成了极大的危害。因此，开发研究抗生素替代药物至关重要。
噬菌体因具有较高特异性，对环境无污染等优势，逐渐受到大家的重视。与抗生素相比，噬菌体治疗副作用少，特异性高，特别是多种噬菌体的联用，可有效减少细菌产生抗性的发生率。现阶段已有多例噬菌体治疗食物中痢疾杆菌感染的案例。虽然噬菌体已在畜禽养殖、水产养殖和食品工业等方面去除病原菌取得了较好的成果，但是噬菌体的种类和数量是限制噬菌体治疗进一步发展的一个重要因素，需要进一步分离和鉴定噬菌体来丰富噬菌体种库。
因此，提供一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1，保藏编号为CGMCC No.18853，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年10月31日，分类命名为痢疾志贺氏菌肌尾噬菌体。
进一步，痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1在裂解痢疾杆菌中的应用。
进一步，痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1在污水处理系统中防治和去除痢疾杆菌中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1及其应用，为病原菌的防控提供一种可选择的基础材料，丰富噬菌体种库；通过对噬菌体SSE1的分离鉴定和全基因组测序，进一步深入挖掘其功能基因和蛋白，为噬菌体治疗和生物防治提供一种或多种对病原菌具有裂解作用的酶类等，以此扩大宿主谱，提高噬菌体应用的广泛性和有效性；噬菌体SSE1可快速高效裂解痢疾杆菌，可用于污水处理系统中痢疾杆菌的污染防治以及耐药性痢疾杆菌的去除。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明噬菌体SSE1的双层平板噬菌斑形态；
图2附图为本发明噬菌体SSE1透射电镜形态；比例尺为100nm；
图3附图为本发明噬菌体SSE1基因组圈图；
图4附图为本发明噬菌体SSE1基因组系统进化树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
噬菌体宿主菌痢疾志贺氏菌1.1869由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，并由本实验室保存。
NB培养液、培养基和PEG8000购自Amresco公司；DNase、RNaseA购自Sigma公司；蛋白酶K购自Amresco公司；0.22μm微孔滤膜购自上海市新亚净化器件厂；氯仿、平衡饱和酚购自北京鼎国生物技术有限公司。
实施例1噬菌体的分离纯化
本发明试验用污水样品为2018年9月采集于北京市某城市污水处理厂曝气池中，以此作为分离噬菌体的水样。
污水样本离心15min，取用0.22μm微孔滤膜过滤除菌的污水25mL；加入CaCl2母液至终浓度为1mmol/L，静置；加入20mL NB液体培养基，再加入对数期宿主菌悬液2.0mL于50ml离心管中，混匀；静置15min后，37℃振荡过夜(10h)。次日，加2mL氯仿，4℃，8000g离心30min；取上清15mL，加入20mL NB培养液及对数期宿主菌悬液1.0mL，摇匀，室温放置30min；37℃振荡120r·min-1培养3-6h，取出；4℃，8000g离心30min，上清即为含有此宿主菌噬菌体的原液。采用spot-test方法鉴定原液中是否含有噬菌体，取适量上述原液点滴到涂布了宿主菌的NB固体培养基上，37℃培养6-8h，观察有无噬菌斑长出。若平板上出现清晰透亮的噬菌斑，则说明原液中存在噬菌体，反之，则表明未分离出噬菌体，需重新采样分离。
分离出的噬菌体未必为单一噬菌体，本发明采用双层平板法进一步纯化。挑取平板上的噬菌斑，浸置于含有1mL SM液的无菌管中，室温放置1h后，取0.1mL上述溶液经梯度稀释。取0.1mL稀释后的溶液与0.1mL宿主菌悬液加入5mL管内，紧接着加入4mL NB半固体培养基，而后迅速倒入NB固体培养基中，使之涂布于整个双层平板。37℃培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。而后挑取单一噬菌斑，重复此步骤5-6次，直至双层平板中各噬菌斑的大小和形态基本一致，见图1。
实施例2噬菌体的形态观察
取噬菌体悬液20μL滴于铜网上，待其自然沉淀10min后，用干燥滤纸从侧面吸干，晾置约1min后在铜网上加1滴1％醋酸双氧铀，染色2min，然后小心使用干燥滤纸从侧面将多余染剂吸干，避光自然晾置30min后，用透射电子显微镜(JEM-1400)观察。
透射电镜结果见图2，结果显示，噬菌体SSE1有二十面体的头部和可收缩的尾部，头部长约123.5nm，头部直径约82nm，长尾长约130nm，尾部直径约25nm，根据国际病毒分类学组织(ICTV)病毒分类第八次报告，可初步将该株噬菌体SSE1归类为肌尾噬菌体科。
实施例3噬菌体基因组分析鉴定
噬菌体全基因组测序及分析：采用Illumina NextSeq500进行PE2×150对样品的DNA进行测序。随后利用spades v.3.11.1拼接软件对优化序列进行拼接，得到最优的组装结果。利用生物软件PHASTER对基因组的开放阅读框进行预测分析，并使用NCBI Blastp完成功能基因的初步注释，使用tRNAscan-SE(http://lowelab.ucsc.edu//tRNAscan-SE/)在线预测tRNA，利用CGView Server软件(http://cgview.ca/)完成全基因组圈图的绘制(见图3)，基于全基因组数据利用MEGA X软件构建系统进化树。
全基因组分析显示，噬菌体SSE1的基因组为环状双链结构，全长为169744bp，G+C％含量为37.51％，预测有2个tRNA，开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)预测有270个，其中123个有相似的蛋白功能，并进行了功能基因注释。经同源性比对和基因组系统进化树分析(见图4)显示，噬菌体SSE1与噬菌体ST0和HX01的亲缘关系最近，但经过宿主谱的实验测定(见表1)，其不可裂解ST0的宿主菌ST100，因此说明噬菌体SSE1为新型噬菌体。另外，结果发现SSE1只可侵染部分志贺氏菌株，对其他种属的菌株均无裂解能力，说明噬菌体SSE1特异性较强，符合烈性噬菌体特征。
表1噬菌体SSE1的宿主谱测定
Figure BDA0002360009960000041
Figure BDA0002360009960000051
感染噬菌体后，“+”表示有噬菌斑，“-”表示没有噬菌斑；
CDC＝Chinese Center for Disease Control and Prevention；
CGMCC＝China General Microbiological Culture Collection Center。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.18853。
2.根据权利要求1所述的一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1在裂解痢疾杆菌中的应用。
3.根据权利要求1所述的一株痢疾志贺氏菌噬菌体SSE1在污水处理系统中防治和去除痢疾杆菌中的应用。
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