CN115029323A - 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用 - Google Patents

一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115029323A
CN115029323A CN202210602032.3A CN202210602032A CN115029323A CN 115029323 A CN115029323 A CN 115029323A CN 202210602032 A CN202210602032 A CN 202210602032A CN 115029323 A CN115029323 A CN 115029323A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
staphylococcus aureus
drug
resistant staphylococcus
tail
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210602032.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115029323B (zh
Inventor
张亮
张雪丽
朱曼玲
杨美
于浩淼
解晓莉
杨宏军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Original Assignee
Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS filed Critical Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority to CN202210602032.3A priority Critical patent/CN115029323B/zh
Publication of CN115029323A publication Critical patent/CN115029323A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115029323B publication Critical patent/CN115029323B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10331—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

本发明涉及一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160及其在制备抑菌剂中的应用。本发明从污水样品中分离上述噬菌体，是一种裂解多重耐药金黄色葡萄球菌的噬菌体，效价达1.75×1011PFU/mL，命名为SP160。电镜下观察，噬菌体具有长不收缩尾巴，属尾状噬菌体目、长尾噬菌体科。噬菌体SP160裂解谱窄，最佳感染复数为1000，裂解动力学结果表明可抑制细菌生长，在‑20℃到54℃范围活性稳定，在pH值3～11之间活性稳定，对紫外线敏感。SP160对其宿主菌生物膜具有清除作用。该噬菌体是一株窄谱对环境有一定耐受性的长尾新型噬菌体，对其研究可为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究提供理论材料。

Description

一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160及其在制备抑菌剂中 的应用
技术领域
本发明属于抑菌微生物技术领域，具体涉及一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160及其在制备抑菌剂中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中常见的多发性疾病，严重影响奶牛产奶量和奶品质，是导致成乳牛淘汰的主要因素之一。奶牛乳腺炎通常是由一种或多种病原微生物感染所致，其中金黄色葡萄球菌是最主要的病原菌之一。通常金黄色葡萄球菌的治疗主要依靠抗生素，但临床治疗中发现，长期抗生素治疗易导致耐药菌株，后续治疗药物效果不理想，难以控制和根除。抗生素治疗期间，奶牛所产牛奶因抗生素超标不能出售，进一步加大了养殖场的经济损失。在国家提倡“减抗替抗”的政策引导下，需要有新的制剂用于奶牛乳腺炎的防治。
噬菌体作为一种细菌病毒，具有很高的感染效率，能够快速高效地杀死耐药细菌。噬菌体具有极高的宿主特异性，通过自身的配体识别并结合细菌表面的受体，只对其宿主菌有裂解作用，对其他细菌则不能裂解。不仅不会破坏机体的正常菌群，而且不会导致细菌产生耐药性。噬菌体还具有清除细菌生物膜的能力，通过清除环境或生物体内的细菌生物膜，从而降低细菌耐药性的能力。噬菌体作为生物抑菌剂还具有高效安全的优点，在防治金黄色葡萄球菌导致的乳腺炎中有较高的应用价值。
发明内容
本发明以临床奶牛乳腺炎的乳汁中分离的致病性金黄色葡萄球菌为宿主进行噬菌体的分离筛选，对筛选的噬菌体进行基因组分析及生物学特性分析，探究对细菌生物膜的清除效果。基于上述筛选，本发明提供了一株对耐药型金黄葡萄球菌具有良好裂解效果的噬菌体，并提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureusphage)SP160，所述噬菌体已于2021年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 20211544。
上述第一方面提供的噬菌体SP160分离自奶牛场挤奶池污水及粪污水样品，具有环状DNA基因组，全长为42,790kb。在电镜下观察，上述噬菌体具有不收缩的长尾，尾端有明显纤突结构，头部呈多面体结构，判定为属尾状噬菌体目，长尾噬菌体科。所述噬菌体SP160的头部长度为55～60nm，宽度为98～102nm，尾部的长度为290～295nm，尾部纤突的宽度为38～42nm，长度为17～19nm。
上述噬菌体SP160具有裂解金黄色葡萄球菌的作用，能够在宿主菌的双层平板上形成直径为2～3mm的噬菌斑，并且噬菌斑边缘整齐无晕环，形态均一呈清晰透亮的圆形。
另外，本发明提供的上述噬菌体裂解谱较窄，仅对氨苄西林和/或红霉素耐药耐药型金黄色葡萄球菌具有特异性的抑制效果，效价达1.75×1011PFU/mL。上述菌株可导致奶牛乳腺炎，将不同浓度噬菌体与宿主菌共培养动态监控噬菌体的裂解作用，分析其裂解动力学曲线，发现该噬菌体可以在一定程度上杀灭细菌，还可以在一定程度上抑制和减少细菌的生长速度和数量。生物膜是细菌为了抵御体内外环境中物理、化学和生物因素的伤害，而生成的被自体细胞外基质包裹的多细菌聚集群体。形成生物膜的细菌对环境应激物的耐受性更强，也会影响抗生素的治疗效果。抗生素可以杀死生物膜表面的浮游细菌，但对生物膜内的细菌不能根除，残留的细菌也可能导致进一步的感染。金黄色葡萄球菌是严重威胁奶牛乳腺的致病菌之一，多数金黄色葡萄球菌都能产生生物膜。金黄色葡萄球菌形成生物膜后，一方面可以在奶牛乳腺组织中内定植来逃避机体的免疫系统，限制抗生素对细菌的治疗作用。另一方面可以附着在环境中吸奶器的橡胶内衬上，使消毒剂难以到达膜的内部破坏细菌，在环境中长期存活。因此，如何有效去除生物膜在疾病防控和治疗过程中具有重要的实践意义。经本发明验证，噬菌体SP160对生物膜的清除率可达80％，说明具有较强的清除其宿主菌生物膜的能力，预示该噬菌体在预防和治疗生物被膜相关的疾病中具有潜力。
在自然环境中，噬菌体对环境压力的耐受性决定噬菌体侵染宿主的能力，良好的环境压力耐受性是噬菌体作为新型生物抑菌制剂的前提。经验证，上述噬菌体不仅能够有效抑制该类型细菌的生长，对环境也具有较强的耐受性，在温度范围-20℃到54℃、pH值3～11之间均能够保持活性稳定。
本发明第二方面，提供一种用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物，所述组合物中包括第一方面所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160，或包含耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160的生物试剂。
上述第二方面所述的组合物中，可包括上述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160、所述噬菌体的分泌物、代谢物或培养物；所述包含耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160的生物试剂优选为培养试剂培养的噬菌体SP160，或噬菌体SP160与其他具有抑菌活性成分的组合。
进一步的，所述培养试剂为包括但不限于宿主细胞的培养基；具体实例如，肉汤培养基。
本发明第三方面，提供第一方面所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160、第二方面所述组合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂领域的应用。
优选的，所述金黄色葡萄球菌抑制剂包括但不限于以下几种类型：
(1)用于预防、治疗金黄色葡萄球菌引发疾病的药物；
(2)用于畜禽养殖环境杀菌的清洁剂、消毒剂或杀菌剂；
(3)用于预防、治疗金黄色葡萄球菌引发疾病的饲料或饲料添加剂。
本发明第四方面中，提供一种奶牛乳腺炎防治药物，所述防治药物中包括耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160，和/或抑制第二方面所述用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物。
上述第四方面所述的奶牛乳腺炎主要为金黄色葡萄球菌引发的乳腺炎，包括对灵敏型和/或耐药型型金黄色葡萄球菌；进一步的，为耐药型金黄色葡萄球菌。
优选的，所述奶牛乳腺炎防治药物为注射剂。奶牛的体温正常范围在37.5～39.5℃。因此噬菌体如果被开发为乳腺注剂，在应用过程中噬菌体可保持良好的活性。若乳汁中残留有噬菌体，也可在牛奶加工过程中经巴氏消毒和紫外线消毒清除掉，不会在食品中残留，对人类健康和公共卫生具有良好意义。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为双层平板上噬菌体SP160形成的噬菌斑；
图2为噬菌体SP160电镜下照片形态；
图3为噬菌体SP160基因组圈图；
图4为GC含量图；
图5为噬菌体SP160最佳感染复数结果；
图6为SP160噬菌体的裂解动力学测定结果；
图7为温度对噬菌体SP160效价的影响；
图8为紫外线对噬菌体SP160效价的影响；
图9为pH对噬菌体SP160效价的影响；
图10为噬菌体对生物膜的清除能力结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
1.1实验材料
1.1.1实验菌株
实验菌种均由本实验室分离保藏，主要分离于临床乳房炎患奶牛乳液样品，部分大肠杆菌分离于环境样品。160菌株对氨苄西林和红霉素耐药。采用鉴别培养结合16r RNA测序对细菌进行鉴定。
1.1.2污水来源
济南周边规模化奶牛场挤奶池污水及粪污水混样。
1.1.3主要试剂和仪器
H2SO4、NaOH，国药集团化学试剂有限公司；醋酸铀，上海吉至生化科技有限公司。
生物安全柜，青岛海尔生物医疗股份有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；冷冻高速离心机、动态酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；JEM-2100Plus透射电子显微镜(electronmicroscope,EM)，日本电子株式会社；0.22μm滤器，Merck Millipore公司。
1.1.4培养基缓冲液配制
配制LB肉汤、LB半固体培养基、LB固体培养基和SM缓存液，SM缓存液略有调整，不加入明胶。
1.2实验方法
1.2.1噬菌体的富集
将采自济南某规模化牛场的污水混样，12,000r离心15min除杂，收集上清液，重复2～3次。再经0.22μm滤器过滤除菌，4℃备用。将活化好处于生长对数期的宿主菌(金黄色葡萄球菌160，临床分离菌株)、过滤好的污水与无菌LB肉汤按1:5:10比例充分混匀。将混合液37℃，180r/min培养24h后，重复离心过滤，得到噬菌体富集液备用。参照采用双层平板法分离噬菌斑。
1.2.2噬菌体的纯化
用无菌针头挑取噬菌斑，包含所在的上层培养基，加入到1mL无菌SM缓存液，4℃过夜。次日经0.22μm滤器过滤，滤液10倍梯度连续稀释至10-10。制备双层平板，37℃培养过夜。再次挑取噬菌斑，加入SM缓存液中4℃过夜。重复3～5次上述操作，即可得到纯化的噬菌体。
1.2.3噬菌体效价测定
将纯化好的噬菌体连续10倍梯度稀释，每个梯度浓度取100μL，用双层平板法得到噬菌斑，选择20～300噬菌斑平板计数。每个浓度梯度做三组重复，最终取平均值计算噬菌体效价。噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑平均数×稀释倍数×10
1.2.4噬菌体的电镜观察
取100μL纯化后的噬菌体(106PFU/mL)滴加到干净的膜上，将铜网放入噬菌体液中静置20min取出，自然吸收20s吸去多余液体。用醋酸铀染液染色，2min后取出并吸去残留的染液，洗涤干燥。接着放入另1滴醋酸铀染液中复染，2min后取出，吸去残留染液，干燥后透射电镜观察噬菌体形态。
1.2.5噬菌体的基因组学分析
1.2.5.1基因组的提取
向600μL噬菌体浓缩液中分别加入Dnase I与Rnase A至终浓度为1μg/mL，37℃过夜消化，80℃灭活15min。分别加入24μL 0.5％EDTA、1.5μL 20ng/ml蛋白酶K、30μL 10％SDS，置于56℃水浴1h。加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，温和振荡1min，12,000rpm离心10min，将上层水相转移至新的EP管中。再次加入等体积平衡酚溶液同上。加入与上述反应液等体积的氯仿，充分混匀后10,000rpm离心5min，转移上层水相至新的离心管中。加入400μL异戊醇，-20℃放置30min。4℃，13,000rpm离心20min，缓慢倒掉上清；加入1ml 75％的乙醇(-20℃预冷)，静置1min，12,000rpm离心10min。缓慢倒掉乙醇，室温放置10min，以使乙醇完全挥发掉。加入10～30μL的ddH2O溶解沉淀，-20℃保存。所得DNA浓度用荧光定量测定。
1.2.5.2基因组分析
参照HHMI SEA-PHAGES噬菌体基因组学指南对噬菌体SP160的基因组进行建库、测序、组装和基因注释(https://seaphagesbioinformatics.helpdo csonline.com/home)。采用Illumina TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit方法构建文库。使用ABySS(http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss)拼接软件对优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的组装结果。把reads比对到组装好的基因组序列上，统计组装序列的GC含量和reads覆盖深度。运用GapCloser(https://sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/GapCloser/)软件对组装结果进行局部内洞填充和碱基校正。使用GeneMarkS软件可以对测序的基因组进行编码基因预测。采用R circlize包进行基因组圈图的绘制。通过BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)与NCBI中已有的33株金黄葡萄球菌噬菌体进行比较基因组分析。
1.3噬菌体的生物学特性分析
1.3.1噬菌体的最佳感染复数
参照Niu Y D等的方法略有调整。调整培养至对数生长期的宿主细菌浓度至1×106CFU/mL。将噬菌体浓缩液(1×109PFU/mL)连续10倍稀释。每个稀释浓度与宿主菌各100μL共同接种到96微孔板中，37℃空气环境中培养6～10h。目视检查微孔的浑浊度，并在OD600测其吸光值，记录使细菌完全溶解的最高稀释值。
噬菌体-宿主试验的MOI计算方法：每孔噬菌体数/每孔细菌数。
1.3.2噬菌体裂解动力学
参照Niu Y D等的方法绘制细菌生长抑制曲线。将初始浓度为109PFU/mL的噬菌体浓缩液连续10倍稀释，并吸取100μL加入96孔微板中，每孔同时加入100μL已稀释好的宿主菌悬浮液(106CFU/mL)。同时设立未处理的对照组，只含有细菌的对照孔以及仅包含LB肉汤的空白对照孔。37℃孵育，并使用自动酶标仪每1小时动态读取OD600吸光值，进行三组重复实验。
1.3.3噬菌体的裂解谱测定
将除宿主菌外的15株大肠杆菌和39株金黄色葡萄球菌活化，培养至对数生长期，各取100μL菌液制双层平板，使用点板的方法，取噬菌体液5～10μL滴加到平板表面。37℃过夜培养，次日观察噬菌斑的形成情况。
1.4噬菌体的抗逆性分析
1.4.1噬菌体的热稳定性
将初始浓度为109PFU/mL的噬菌体储存液，分装到2mL的EP管中，分别置于-20℃、4℃、25℃、37℃、46℃、54℃、60℃、70℃、90℃温度中处理1h。处理后的噬菌体液通过双层平板法测定效价。检测噬菌体滴度变化，评价噬菌体热稳定性。每个处理组设三组重复。
1.4.2噬菌体的紫外线稳定性
将初始浓度为109PFU/mL的噬菌体储存液，分装到2mL的EP管中。分别在紫外线环境中处理10min、20min、30min，双层平板法测定处理后噬菌体的效价，评价噬菌体紫外线稳定性。每个处理组设三组重复。
1.4.3噬菌体的pH稳定性
用H2SO4和NaOH调节SM缓冲液至pH为3、5、6、7、8、11、13。将噬菌体储存液(109PFU/mL)与不同pH缓冲液等体积混合，37℃静置孵育1h，双层平板法测定处理后噬菌体的效价，评价噬菌体酸碱稳定性、每个处理组设三组重复。
1.5噬菌体清除细菌被膜的能力
参照S Purkait等方法略有调整，在96孔板中接种细菌悬浮液(5×105CFU/mL)，37℃孵育24h，细菌被膜生长成熟后使用无菌PBS洗去未附着的游离细菌，自然干燥。每孔加入108PFU/mL噬菌体200μL，设置SM液对照组，37℃条件下孵育。分别在1h、2h、3h、4h、5h除去上清液，无菌PBS清洗三次，干燥后每孔加入1％结晶紫溶液100μL，室温下染色10min。用无菌PBS洗涤平板三次，除去多余的染料，并风干。最后向每个孔中加入200μL 95％乙醇，在室温下孵育15min，620nm测量吸光度。
二、结果与分析
2.1噬菌斑的观察结果
通过双层平板法从牛场污水混样中分离出一株金黄色葡萄球菌噬菌体，命名为SP160，挑取清晰透亮的斑块进行下一步研究。可见在含有宿主菌的双层平板上形成较大斑块，平均直径大小2.5mm。形成噬菌斑边缘整齐无晕环，形态均一呈圆形，斑块清晰透亮。如图1所示。
2.4噬菌体效价测定
将纯化后的噬菌体连续10倍稀释，通过双层平板法计算各浓度梯度噬菌斑个数。经多次平行试验后，得出SP160噬菌体效价为1.75×1011PFU/mL。
2.2噬菌体电镜观察结果
噬菌体负染后在电镜下的形态。SP160噬菌体有长尾，且不具备收缩功能，尾端有明显纤突结构，头部呈多面体结构。属尾状噬菌体目，长尾噬菌体科。头部的长度和宽度分别为58.56nm和99.83nm。尾巴的长度为294.53nm，爪子的宽度为40.61nm，长度为18.38nm。如图2所示。
2.3噬菌体基因组测序结果
为了解噬菌体的基因组特征，测定了SP160噬菌体的全基因组序列。Illumina测序有效数据量为949.6Mb。测序深度为17.7×。组装后结果显示，噬菌体基因组为环状DNA，全基因组长度为42,790kb。GC总含量为34.1％。如图3、4所示。
GeneMarkS软件预测SP160基因组含70个基因。在预测的70个ORFs中，有23个(32.86％)具有特定功能，已知功能的ORFs注释如表1所示。可将它们分为以下几个模块：1、与噬菌体结构组成的蛋白：头尾适配蛋白(008)、头尾适配蛋白(009)、尾部装配蛋白(014)、小尾蛋白(017)、结构蛋白(018)、小尾蛋白(019)。2、与复制和代谢相关蛋白：rho终止因子(007)、LexA抑制因子(032)、假定转录调节因子(033)、ssDNA结合蛋白(044)、复制蛋白(046)、DNA复制蛋白DnaC(047)、RusA-like游离酶/核酸内切酶(050)、转录激活因子(069)。3、与噬菌体包装相关蛋白：末端酶小亚单位(001)、门户蛋白(003)。4、与杀菌抑菌相关蛋白：裂解酶(023)、SGNH/GDSL水解酶家族蛋白(024)、穿孔素(025)、细胞内溶素(026)。5、特定功能蛋白：DUF3168结构域蛋白(011)、抗阻遏物激活因子(036)、毒力相关蛋白(045)。根据基因组的注释和分类，这表明噬菌体均具有自我复制、组装和宿主裂解所需的所有核心基因。
表1已知功能的SP160的ORF功能注释
Figure BDA0003670070240000091
Figure BDA0003670070240000101
Figure BDA0003670070240000111
值得注意的是，噬菌体大多采用穿孔素-裂解酶(holin-lysin)系统来裂解细菌。穿孔素是一种由噬菌体编码的疏水性小蛋白质，它插入细胞质膜并在膜上形成小孔以供细菌内溶素通过。而细菌内溶素(或裂解酶)是噬菌体编码的酶，在噬菌体繁殖周期的最后阶段降解细菌细胞壁的肽聚糖。这些酶破坏细菌细胞壁的抵抗力，从而通过细菌内部细胞质的渗透压力使细菌溶解，同时释放子代噬菌体。在噬菌体SP160基因组中包含裂解酶(023)、穿孔素(025)和细胞内溶素(026)，还包含一个用于细胞壁水解的SGNH/GDSL水解酶家族蛋白(024)，这4个基因相邻。噬菌体SP160在金黄色葡萄球菌噬菌体中具有两段裂解酶序列，这与已发现的多数金黄色噬菌体不同，这也启示了上述噬菌体可能在结构上与现有物种存在明显的差异。
2.5噬菌体的生物学特性分析结果
2.5.1最佳感染复数测定结果
将不同浓度的噬菌体液与细菌共同培育，通过微孔法测得噬菌体的最佳感染复数。通过对微孔浊度的观察，发现不同浓度的噬菌体SP160与宿主菌共培育后，在感染复数为1000时，微孔浊度降低变得清亮。同时在600nm波长下测定其OD值，发现在MOI为1000时，与细菌组比较差异显著。结合两结果可认为SP160最佳感染复数为1000。如图5。
2.5.2噬菌体裂解动力学结果
将不同浓度噬菌体与宿主菌在96孔微板中共同培养，利用动态酶标仪每隔1小时记录微孔在OD600的吸光值，绘制噬菌体的裂解动力学曲线。如图6所示，根据曲线显示，SP160噬菌体可以一定程度抑制和减少细菌的生长速度和数量，但不能完全裂解杀死细菌。
2.5.3噬菌体的裂解谱测定结果
通过双层平板法测定噬菌体对52株临床分离细菌的裂解作用，得到噬菌体裂解谱结果。如表2。结果显示，噬菌体SP160仅能裂解其宿主菌，裂解范围窄，具有较强宿主特异性。另外对大肠杆菌无裂解作用。
表2噬菌体SP160对52株临床分离细菌的裂解情况
Figure BDA0003670070240000121
Figure BDA0003670070240000131
2.6噬菌体的抗逆性结果分析
2.6.1温度稳定性结果
噬菌体的热稳定性试验结果，将在不同温度孵育过的噬菌体通过双层平板法测定效价，结果显示：噬菌体在-20℃至46℃时，噬菌体活性受到影响较小，效价变化不大。54℃时，噬菌体开始急剧失活，效价急剧下降，60℃时完全失活。表明噬菌体对低温有一定的耐受性(小于37℃)，对高温耐受性弱，超过54℃噬菌体开始逐渐失去活性。如图5所示。
2.6.2噬菌体的紫外线稳定性
噬菌体的紫外线稳定性试验结果，将在不同时间紫外线照射的噬菌体通过双层平板法测定效价，结果显示：对紫外线的耐受力较弱。SP160噬菌体在紫外线照射10min条件下，效价下降40％左右，20min时即完全失活。如图8所示。
2.6.3噬菌体的pH稳定性
噬菌体的pH稳定性试验结果，将在不同pH缓冲液孵育的噬菌体通过双层平板法测定效价，结果显示：噬菌体对酸碱耐受范围较大，对酸碱均有一定的耐受力，但对强碱的耐受程度不如强酸。pH为7.4时，噬菌体活性最强。当pH在3、5、6、8.5、11时，对噬菌体的活性影响不大，效价降低约20％。当pH为13时，噬菌体效价显著降低。如图9所示。
2.7噬菌体对宿主菌生物膜的清除能力结果分析
根据最佳感染复数结果，选取了108PFU/mL浓度噬菌体SP160，检测对宿主菌生物膜的影响。按2.5.2方法测定OD620吸光度，并计算抑制百分比。结果如图10所示，清除率在70％左右，组间差异显著(P<0.01)；在2h～5h时间范围内，生物膜清除率为75％～80％，组间差异不显著(P>0.05)。说明噬菌体SP160在2h内可完成对宿主细菌生物被膜的清除作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage)SP160，所述噬菌体已于2021年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO:M 20211544。
2.如权利要求1所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160，其特征在于，所述噬菌体SP160具有不收缩的长尾，尾端有明显纤突结构，头部呈多面体结构，为属尾状噬菌体目，长尾噬菌体科；所述噬菌体SP160的头部长度为55～60nm，宽度为98～102nm，尾部的长度为290～295nm，尾部纤突的宽度为38～42nm，长度为17～19nm。
3.如权利要求1所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160，其特征在于，所述噬菌体SP160的宿主菌为耐药型金黄色葡萄球菌；所述耐药型金黄色葡萄球菌为对氨苄西林和/或红霉素耐药型金黄色葡萄球菌。
4.一种用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物，其特征在于，所述组合物中包括权利要求1-3任一项所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160，或包含耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160的生物试剂。
5.如权利要求4所述用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物，其特征在于，所述组合物中，包括所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160、所述噬菌体的分泌物、代谢物或培养物。
6.如权利要求4所述用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物，其特征在于，所述包含耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160的生物试剂为培养试剂培养的噬菌体SP160，或噬菌体SP160与其他具有抑菌活性成分的组合。
7.权利要求1-3任一项所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160、权利要求4-6任一项所述组合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂领域的应用。
8.权利要求7所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160、组合物在制备金黄色葡萄球菌抑制剂领域的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌抑制剂包括但不限于以下几种类型：
(1)用于预防、治疗金黄色葡萄球菌引发疾病的药物；
(2)用于畜禽养殖环境杀菌的清洁剂、消毒剂或杀菌剂；
(3)用于预防、治疗金黄色葡萄球菌引发疾病的饲料或饲料添加剂。
9.一种奶牛乳腺炎防治药物，其特征在于，所述防治药物中包括权利要求1-3任一项所述耐药型金黄葡萄球菌噬菌体SP160，和/或抑制权利要求4-6任一项所述用于抑制金黄色葡萄球菌的组合物。
10.如权利要求9所述奶牛乳腺炎防治药物，其特征在于，所述奶牛乳腺炎防治药物为注射剂。
CN202210602032.3A 2022-05-30 2022-05-30 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用 Active CN115029323B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210602032.3A CN115029323B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210602032.3A CN115029323B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115029323A true CN115029323A (zh) 2022-09-09
CN115029323B CN115029323B (zh) 2023-08-15

Family

ID=83120985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210602032.3A Active CN115029323B (zh) 2022-05-30 2022-05-30 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115029323B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116410969A (zh) * 2023-04-24 2023-07-11 深圳北辰生物科技有限公司 一种噬菌体、噬菌体裂解酶及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101643235B1 (ko) * 2015-06-03 2016-07-27 서울대학교산학협력단 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 sap4 및 이를 함유하는 조성물
CN107779439A (zh) * 2016-08-24 2018-03-09 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新的葡萄球菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
CN109082414A (zh) * 2018-06-29 2018-12-25 浙江工业大学 一种金黄色葡萄球菌噬菌体及应用
CN112143747A (zh) * 2020-09-09 2020-12-29 昆明理工大学 一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用
CN113621584A (zh) * 2021-08-23 2021-11-09 山东农业大学 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101643235B1 (ko) * 2015-06-03 2016-07-27 서울대학교산학협력단 황색포도상구균에 대해 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 시포비리데 패밀리 sap4 및 이를 함유하는 조성물
CN107779439A (zh) * 2016-08-24 2018-03-09 菲吉乐科(南京)生物科技有限公司 新的葡萄球菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用
CN109082414A (zh) * 2018-06-29 2018-12-25 浙江工业大学 一种金黄色葡萄球菌噬菌体及应用
CN112143747A (zh) * 2020-09-09 2020-12-29 昆明理工大学 一种噬菌体裂解酶及其基因、基因重组表达载体与应用
CN113621584A (zh) * 2021-08-23 2021-11-09 山东农业大学 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116410969A (zh) * 2023-04-24 2023-07-11 深圳北辰生物科技有限公司 一种噬菌体、噬菌体裂解酶及其用途
CN116410969B (zh) * 2023-04-24 2024-05-07 深圳北辰生物科技有限公司 一种噬菌体、噬菌体裂解酶及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN115029323B (zh) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113621584B (zh) 一株金黄色葡萄球菌噬菌体及其抑菌应用
CN111172119B (zh) 具有宽裂解谱的新副溶血弧菌噬菌体、其特异性引物及其应用
CN112725287B (zh) 一株强裂解性金黄色葡萄球菌噬菌体rdp-sr-20001及其应用
CN113583971B (zh) 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用
van Charante et al. Isolation of bacteriophages
CN113430176B (zh) 一株稳定高效的烈性沙门氏菌噬菌体rdp-sa-21004及其应用
CN113337480B (zh) 一株广谱的大肠杆菌噬菌体及其应用
KR101756088B1 (ko) 신규한 비브리오 파라헤몰리티쿠스 박테리오파지 Ｖｉｂ-ＰＡＰ-2 및 이의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 균 증식 억제 용도
Ribeiro et al. Bacteriophage isolated from sewage eliminates and prevents the establishment of Escherichia coli biofilm
CN115948348A (zh) 一种宽谱禽源沙门菌噬菌体及其应用和组合物
CN113583966B (zh) 一株烈性沙门氏菌噬菌体及其应用
CN115029323B (zh) 一种耐药型金黄葡萄球菌噬菌体sp160及其在制备抑菌剂中的应用
CN113583973B (zh) 一株高裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体rdp-kp-20007及其应用
CN113913391A (zh) 一株可跨种裂解的大肠埃希氏菌噬菌体rdp-ec-20128及其应用
CN110964700B (zh) 一株马流产沙门氏菌噬菌体及其应用
CN116410935A (zh) 一株可跨科侵染的多价副溶血性弧菌噬菌体vB_VpaP_G1及其应用
CN116083374A (zh) 一株耐高温鸡白痢沙门氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN113755368B (zh) 一株福建鸡滑液囊支原体及其培养基
CN113337474B (zh) 一株副溶血性弧菌裂解性噬菌体vB_VpP_DE17及其应用
CN114164183A (zh) 一株南非诺卡氏菌噬菌体p69及其应用
CN112646785B (zh) 一株耐高温烈性变形杆菌噬菌体rdp-sa-20018及其应用
CN114574450B (zh) 一种宽裂解谱耐紫外的奇异变形杆菌噬菌体和其组合物、试剂盒及其应用
Fathy et al. Investigation of Antibacterial Efficiency of Various Lytic Bacteriophages Isolated from Chickens Against Characterized Multidrug-resistant Pathogenic Bacterial Strains
CN115873808B (zh) 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体及其用途
CN113528470B (zh) 一种T4SS靶向型噬菌体vB_EcoM_X4及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant