KR20170052950A

KR20170052950A - 이질균에 대한 광범위 항균 활성을 갖는 박테리오파지 Shi-DYP-1, 이를 활용한 이질균에 의해 유발되는 질환 방지용 및 처치용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20170052950A
Application number: KR1020150155105A
Authority: KR
Inventors: 박상진; 강상현; 전수연; 손지수; 김병국
Original assignee: 국방과학연구소
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2017-05-15

Abstract

본 발명은 이질균에 대한 광범위 항균 활성을 갖는 자연으로부터 분리된 박테리오파지 Shi-DYP-1(수탁번호 KCTC 12857BP)에 관한 것으로, 더욱 상세하게 이질균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고, 전체 크기가 약 100 kb인 DNA 유전체를 가지며, 또한 약 53.7 kDa, 69.9 kDa, 86.6 kDa, 및 95.6 kDa 크기의 주요 구조 단백질을 가지며, 형태학적으로 미오비리대(Myoviridae)에 속하는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 Shi-DYP-1을 유효성분으로 포함하는 이질균의 감염 방지 및 감염 후 처치 목적으로 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 이질균의 감염 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다.

Description

이질균에 대한 광범위 항균 활성을 갖는 박테리오파지를 활용한 이질균 감염 방지 및 처치용 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR PREVENTION AND TREATMENT OF SHIGELLA INFECTIONS USING A BACTERIOPHAGE WITH BROAD ANTIBACTERIAL SPECTRUM AGAINST SHIGELLA}

본 발명은 이질균(Shigella)에 대한 광범위 항균 활성을 갖는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함한 이질균의 감염을 방지 및 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 이질균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다.

이질균은 운동성이 없고 협막과 포자를 형성하지는 않는 그람음성 간균으로 일본 세균학자 Kiyoshi Shiga에 의해 처음으로 분리되어 시겔라(Shigella)로 명명되었다. 이질균은 표면항원인 O-항원에 따라 4가지 혈청그룹으로 분류되며 이는 또 다시 49종의 혈청형으로 세분된다. 예를 들면, 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae, S. dysenteriae)는 혈청그룹 A에 속하는 이질균이고, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri, S. flexneri)는 혈청그룹 B에 속하는 이질균이고, 시겔라 보이디이(Shigella boydii, S. boydii)는 혈청그룹 C에 속하는 이질균이고, 시겔라 소네이(Shigella sonnei, S. sonnei)는 혈청그룹 D에 속하는 이질균이다.

이와 같은 이질균은 주로 인간에 감염하여 발열, 복통, 구토 및 설사를 유발하며, 이질균에 감염된 상태를 세균성이질(Shigellosis)이라고 지칭하는데 이는 제1군 법정 전염병으로 분류되고 있다.

또한, 이질균은 다른 장내 병원균들과 비교할 때 비교적 적은 양(10~100개)으로도 감염을 유발할 수 있으며, 신경독소(neurotoxin), 장내독소(enterotoxin), 세포독소(cytotoxin)와 같은 체외독소를 생성하고 항생제에 대한 내성도 높다고 보고되고 있다. 시겔라 소네이(S. sonnei)와 시겔라 보이디이(S. boydii)는 비교적 가벼운 증상을 유발하는 이질균이라 할 수 있고 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)는 이에 비교하여 좀 더 심한 형태의 설사를 일으키는 이질균이다. 선진국에서는 시겔라 소네이(S. sonnei)가 이질의 주요 원인균이지만 위생환경이나 공중보건시설이 열악한 개발도상국에서는 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)와 시겔라 플렉스네리(S. flexneri)가 주된 원인균으로 알려져 있다.

식중독 등 이질균 감염에 의한 폐해는 상당히 크기 때문에 이질균 감염을 효과적으로 방지할 수 있고 또한 이들의 감염을 효과적으로 처치할 수 있는 방법의 개발이 절실하다 할 수 있다. 이질균의 감염 방지나 처치 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 항생제 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 효과적 방안의 확보가 시급한 실정이다.

최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히, 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(phage)라고 줄여서 부르기도 한다.

박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질균 감염 환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다. 특정 세균에 대한 박테리오파지는 그 종류가 다르면 항균력이나 항균범위 측면에서 차이를 제공한다. 따라서 박테리오파지의 종류가 다르면 그 산업적 활용성에서도 차이가 난다. 이러한 이유로 다양한 박테리오파지의 확보가 필요하다.

박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 박테리아 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.

특히 최근 항생제 사용에 대한 정부 차원의 규제가 전 세계적으로 강화됨에 따라 박테리오파지에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.

한국등록특허 제10-1101377호

이에 상기와 같은 점을 감안한 본 발명은 다양한 이질균에 대하여 광범위한 항균 활성을 갖는 자연으로부터 신규 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 이질균의 감염을 방지 및 처치하는 데에 활용 가능한 조성물의 제공에 목적이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 이질균의 감염 방지 및 감염 처치의 목적의 소독제 및 약학적 조성물을 제공하고, 또한 이 조성물을 이용한 이질균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 다양한 이질균에 대해 특이적 사멸 능력을 가지고 수탁번호가 KCTC 12857BP인 자연으로부터 분리된 박테리오파지 Shi-DYP-1을 제공한다.

본 명세서에서의 "분리" 또는 "분리된"은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징들을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

상기 이질균으로는 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae, S. dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri, S. flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii, S. boydii) 및 시겔라 소네이(Shigella sonnei, S. sonnei)를 포함하며, 이에 국한되지 않는다.

상기 박테리오파지 Shi-DYP-1은 전체 유전체 크기가 약 100 kb인 DNA 유전체를 가지며, 53.7 kDa, 69.9 kDa, 86.6 kDa 및 95.6 kDa 크기의 단백질을 주요 구조 단백질로 가지며, 형태학적으로 미오비리대(Myoviridae)에 속한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 Shi-DYP-1을 유효성분으로 포함하며 이질균의 감염을 방지 및 처치하는데 활용할 수 있는 이질균 감염 방지 및 처치용 조성물을 제공한다.

본 발명의 이질균 감염 방지 및 처치용 조성물에 포함되는 박테리오파지 Shi-DYP-1은 다양한 이질균에 대해 광범위한 향균 활성을 가지므로 다양한 이질균에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방과 치료에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 이질균에 의해 유발되는 질환에 대한 방지 및 처치 목적으로 활용되는 소독제 또는 약학적 조성물의 용도로 사용될 수 있으나 이에 국한된 것은 아니며, 본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라 다양한 용도로 사용될 수 있다.

여기서 이질균에 의해 유발되는 질환이란 이질균 감염에 의한 발열, 복통, 구토 및 설사 등을 수반하는 증상을 총칭한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "방지" 또는 "예방"이라는 용어는 상기 박테리오파지 Shi-DYP-1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하여 이질균에 의해 유발된 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 명세서에서 사용된 "처치" 또는 "치료"라는 용어는 이질균에 의해 유발된 질환의 억제 및 이질균에 의해 유발된 질환의 병적 상태를 경감하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Shi-DYP-1이 유효성분으로 포함된다. 이때, 포함되는 박테리오파지 Shi-DYP-1의 양은 1×10¹ PFU/ml 내지 1×10³⁰ PFU/ml 또는 1×10¹ PFU/g 내지 1×10³⁰ PFU/g로 포함되며, 바람직하게는 1×10⁴ PFU/ml 내지 1×10¹⁵ PFU/ml 또는 1×10⁴ PFU/g 내지 1×10¹⁵ PFU/g로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및 또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

상기 조성물이 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 글루코스, 말토덱스트린, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

여기서 상기 "약학적으로 허용되는 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 유효성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본원 발명의 이질균 감염의 방지 및 처치용 조성물을 이용한 이질균 감염의 예방 및 치료 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 본원 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 경구투여, 비경구투여 또는 비강 분무 등을 통해 투여될 수 있으며, 환경에 분무하는 방식에 의해서도 사용될 수 있다.

본 발명의 신규 분리된 박테리오파지 Shi-DYP-1을 활용한 조성물 및 이 조성물을 이용한 이질균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 이질균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 이질균의 감염 예방 및 감염 치료 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이러한 이질균에 대한 특이성으로 인하여 사용에 따른 부작용이 매우 적다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래하여 다양한 부작용이 나타난다.

한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점 또한 제공할 수 있다.

도 1은 박테리오파지 Shi-DYP-1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Shi-DYP-1의 주요 구조 단백질을 일차원 전기영동법으로 분석한 결과이다.
도 3은 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체 크기를 펄스장젤전기영동법(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE)으로 분석한 결과이다.
도 4는 박테리오파지 Shi-DYP-1의 이질균에 대한 사멸 능력을 확인한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야한다. 또한 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명의 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계 들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1은 이질균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에 관한 것으로, 이 분리에서는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하며, 여기서 박테리오파지 분리에 사용되는 이질균은 미리 분리되어 이질균으로 동정(identification)된 것이다.

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 수집된 시료를 1/1000 비율로 이질균을 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 췌장효소 소화물(Pancreatic Digest of casein) 17 g/L, 파파인 소화물(Papaic Digest of Soybean) 3 g/L, 덱스트로스(Dextrose) 2.5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, 디포타슘 포스페이트(Dipotassium Phosphate) 2.5 g/L)에 함께 첨가한 다음 37℃에서 3 내지 4시간동안 진탕배양 한다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 회수한다. 회수한 상등액에 이질균을 1/1000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3 내지 4시간동안 또 다시 진탕배양한다.

여기서, 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우 박테리오파지의 수(titer)가 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복한다. 5회 반복 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 회수한 상등액을 0.45 ㎛의 필터로 여과를 해 준다. 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(spot assay)을 통하여 이질균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사한다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB(Tryptic Soy Broth)배지에 이질균을 1/1000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 한다. 이렇게 하여 준비된 이질균의 배양액 2 ml(OD₆₀₀값은 2.0 임)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 췌장효소 소화물(Pancreatic Digest of casein) 17 g/L, 파파인 소화물(Papaic Digest of Soybean) 3 g/L, 염화나트륨 5 g/L, 아가(Agar) 15 g/L)에 도말한다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 한다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 ㎕를 이질균이 도말된 평판 배지 위에 점적하고, 이를 다시 30분 정도 방치하여 건조시킨다. 건조 후 점적한 평판 배지를 37℃에서 하루 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(clear zone)의 생성을 조사한다. 이때, 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 이질균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 이질균에 대한 사멸 능력을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있다.

이질균에 대한 사멸 능력을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하며, 이와 같은 순수한 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(plaque assay)을 이용한다.

이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 이질균 배양액에 첨가해 주어 37℃에서 4 내지 5 시간 동안 함께 진탕 배양한다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 얻고, 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 이질균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4 내지 5 시간 진탕 배양한다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위해서 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 얻는다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시한다.

통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회로 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞에 기술한 단계를 전체적으로 다시 반복한다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시함으로써 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보한다. 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하며, 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복하는 것이 바람직하다.

그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인한다. 전자현미경 조사에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 과정을 반복하고, 본 발명에서는 통상의 전자현미경 분석 방법에 따라 전자현미경 분석을 실시하였다.

이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(copper grid)에 묻히고 2% 유라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 확인하며, 이와 같이 하여 본 발명의 실시예 1에 따라 분리된 박테리오파지를 분석한 결과가 도 1에 제시되어 있다.

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따라 분리된 박테리오파지는 형태학적 특징으로 판단할 때 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지임을 확인할 수 있다.

상기 기술된 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제과정을 거쳐 얻을 수 있다. 먼저, 순수 박테리오파지를 포함한 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 이질균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 37℃에서 4 내지 5 시간 진탕 배양한다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻으며, 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복한다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol, 이하 PEG) 침전 과정을 실시한다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전과정은 구체적으로, 여과액 100 ml에 10% PEG 8000, 0.5 M 염화나트륨(NaCl)이 되게 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 염화나트륨(NaCl)을 첨가한 다음 4℃에서 2 내지 3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 박테리오파지 침전물을 얻는다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% 젤라틴(Gelatin), pH 8.0) 5 ml로 부유하고, 이하에서 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

이렇게 하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Shi-DYP-1로 명명한 뒤, 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(수탁번호 KCTC 12857BP)에 기탁하였다.

실시예 2는 상기 실시예 1에서 얻어진 박테리오파지 Shi-DYP-1의 주요 구조 단백질 분석에 관한 것으로, 박테리오파지 Shi-DYP-1의 겉 외곽을 구성하는 단백질을 획득하기 위해 상기 실시예 1에서 얻어진 박테리오파지 Shi-DYP-1 부유액 200 ㎕와 아세톤 800 ㎕를 섞어 격렬히 혼합한 후 10분간 -20℃에 정치시키고, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리를 실시한 후 상층액을 제거한 후, 자연 건조(air dry)한다. 이를 5배로 농축된 전기영동용 시료 완충액을 50 ㎕ 가하여 부유시킨 다음 5분 정도 끓여 시료를 준비한다. 이렇게 준비된 시료를 일차원 전기영동을 통하여 박테리오파지 Shi-DYP-1의 주요 구조 단백질을 분석해보았다.

그 결과, 도 2에서 알 수 있듯이 약 53.7 kDa, 69.9 kDa, 86.6 kDa, 및 95.6 kDa 크기의 주요 구조 단백질들이 확인되었다. 도 2에서 레인 M은 단백질 크기 마커이고, 레인 1은 박테리오파지 Shi-DYP-1의 단백질 시료이며, 주요 구조 단백질 밴드는 "*"로 표시한 것이다.

실시예 3은 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체의 분리 및 특성 분석에 관한 것으로, 상기 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 Shi-DYP-1 부유액을 이용한다.

먼저, 박테리오파지 부유액에 포함되어 있을 수 있는 이질균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNA 분해효소로 DNase I과 RNA 분해효소로 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하고, 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 500 ㎕를 첨가한 다음 다시 10분간 정치한다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 20 ㎎/ml 농도의 proteinase K 100 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시킨다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate, SDS) 500 ㎕를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응한 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml를 첨가해 준 후 잘 섞고, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5배 부피비의 이소프로판 알코올(isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 유전체를 침전시킨다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물을 세척한 후, 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 ㎕의 물에 녹인다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체를 다량 확보한다.

이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 펄스장젤전기영동법(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE)을 통해 박테리오파지 Shi-DYP-1의 전체 유전체 크기를 분석하였다. 본 발명의 펄스장젤전기영동법(Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE)에서는 Bio-Rad사의 CHEF-DR Ⅲ variable angle system을 사용하였다. 펄스장젤전기영동법(PFGE)은 장비제조사의 지침을 따라 실시하였으며, 그 결과, 도 3과 같이 분리한 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체의 전체 크기가 약 100 kb 정도임을 확인할 수 있었다.

도 3에서 레인 M은 DNA 크기 마커이며, 레인 1은 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체 시료이다. 참고로 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체 크기는 DNA 크기 마커를 근거로 하여 박테리오파지 Shi-DYP-1의 유전체의 젤(gel) 상에서의 상대적 위치로부터 계산된 것이다.

실시예 4는 상기 실시예 1에서 분리된 박테리오파지 Shi-DYP-1의 이질균에 대한 사멸 능력에 관한 것으로, 이러한 박테리오파지 사멸 능력 조사에는 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 점적 실험(spot assay)을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 확인한다.

실시예 4에서 사멸 능력 조사에 사용된 이질균들은 본 발명자들에 분리되어 이질균으로 동정된 것들로 혈청형 A 2주, 혈청형 B 2주, 혈청형 C 2주, 혈청형 D 2주씩 총 8종이었다. 박테리오파지 Shi-DYP-1은 실험에 대상이 된 이질균 모두에 대하여 사멸능을 발휘하였으며 대표적 실험 결과가 도 4에 제시되어 있다.

도 4에 도시된 바와 같이 박테리오파지 Shi-DYP-1 처리로 배양 접시 위에 자란 이질균이 용균되어 투명한 원의 용균반들이 형성되는 것으로 보아 박테리오파지 Shi-DYP-1은 이질균에 대하여 사멸 능력을 발휘함을 알 수 있다.

한편, 박테리오파지 Shi-DYP-1의 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Shi-DYP-1은 이들 균종들에 대해서는 사멸 능력을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 Shi-DYP-1은 이질균에 대하여 광범위한 항균 활성 범위를 가진다는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 사실로 박테리오파지 Shi-DYP-1은 이질균의 감염 방지 및 감염 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 5는 본 발명의 박테리오파지 Shi-DYP-1의 이질균의 감염 예방 및 감염 처치에 대한 효능을 보여주는 것으로, 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.

9 ml의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1×10⁹ PFU/ml 수준의 박테리오파지 액 100 ㎕를 넣어주고, 다른 하나의 9 ml의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 첨가한다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 실시예 1에서 사용했던 이질균과 동일한 종류의 이질균의 배양액을 첨가한 후 각각의 튜브들을 37℃의 진탕배양장치에 옮겨 배양하면서 이질균의 성장 상태를 관찰하였다.

그 결과 하기 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 액을 첨가해 준 튜브에서는 이질균의 성장 억제 및 저감이 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 이질균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

구분	OD₆₀₀ 흡광도 값
구분	배양 0분	배양 후 30분	배양 후 60분
박테리오파지 액 미첨가	0.5	0.8	1.3
박테리오파지 액 첨가	0.5	0.4	0.1

상기와 동일한 방법으로 상기 실시예 4에서 사용했던 나머지 이질균들을 대상으로 하여 이질균에 대한 성장 억제를 조사해 보았으며, 유사한 결과를 확인할 수 있었다.

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Shi-DYP-1이 이질균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Shi-DYP-1이 이질균의 감염을 방지하는 목적의 조성물 및 감염을 처치하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6은 박테리오파지 Shi-DYP-1의 이질균에 의한 질환이 유발된 돼지에서의 처치 효과를 조사하였다.

생후 25일령의 이유자돈 4마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 실험사육 돈방(1.1 m×1.0 m)에서 분리 사육하면서 11일간 실험을 실시한다. 보온시설 하에 주위환경을 통제하고, 돈방의 온도와 습도는 일정하게 유지시키며 돈방 바닥의 청소를 매일 실시한다.

실험 개시일로부터 7일째 되는 날에 모든 돼지들에게 이질균 액을 경구 주입관을 사용하여 경구투여한다. 이때, 경구투여 한 이질균 액은 다음과 같이 준비한 것이다. 이질균을 TSB 배지를 이용하여 37℃에서 18시간 배양한 후 균체만을 회수하여 이를 생리식염수(pH 7.2)로 1×10¹⁰ CFU/ml가 되게끔 부유하여 준비한다. 이질균 투여 다음날부터 박테리오파지 액을 투여할 군인 실험군의 돼지들에게는 매일 2회씩 1×10⁹ PFU/ml의 박테리오파지 Shi-DYP-1을 이질균 액 투여와 같은 방식으로 경구투여 하고, 박테리오파지 액의 미 투여군인 대조군의 돼지들은 어떠한 처치도 하지 않았다. 사료와 음수는 대조군과 실험군 모두 동일하게 급이 한다.

이질균 투여 후부터 매일 모든 시험동물들을 대상으로 분변 시료를 채취하여 분변 내 이질균의 생균수를 조사한다. 분변 내 이질균의 생균수 조사는 분변 1 g을 생리식염수(pH 7.2) 9 ml로 잘 풀어준 후, 10진법 희석을 하여 XLD(Xylose Lysine Deoxycholate) 아가 배지 상에 도말 후 37℃에서 한밤 배양하여 자란 콜로니를 계수하는 방식으로 실시한다.

이질균 투여 후 경과 일	0일	1일	2일	3일	4일
대조군(박테리오파지 액 미 투여, 단위 CFU/g)	2×10⁷	3×10⁷	2×10⁷	1×10⁷	8×10⁸
실험군(박테리오파지 액 투여, 단위 CFU/g)	3×10⁷	2×10⁶	2×10⁴	2×10³	1×10³

상기 표 2는 분변 내 이질균의 생균수 조사를 실시한 결과로, 이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Shi-DYP-1이 이질균을 원인으로 하는 감염 질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12857BP

20150623

Claims

이질균에 대해 특이적 사멸 능력을 가지고 수탁번호가 KCTC 12857BP인 박테리오파지 Shi-DYP-1.
제1항에 있어서, 상기 이질균은 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae, S. dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri, S. flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii, S. boydii) 및 시겔라 소네이(Shigella sonnei, S. sonnei)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 Shi-DYP-1.
제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 Shi-DYP-1은 전체 크기가 100 kb인 DNA 유전체를 가지며, 53.7 kDa, 69.9 kDa, 86.6 kDa 및 95.6 kDa 크기의 단백질을 주요 구조 단백질로 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 Shi-DYP-1.
제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 Shi-DYP-1은 형태학적으로 미오비리대(Myoviridae)에 속하는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 Shi-DYP-1.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 박테리오파지 Shi-DYP-1을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 이질균 감염 방지 및 처치용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae, S. dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri, S. flexneri), 시겔라 보이디이(Shigella boydii, S. boydii) 및 시겔라 소네이(Shigella sonnei, S. sonnei)으로 이루어진 군으로부터 어느 하나 이상 선택되는 이질균을 사멸시키는 것을 특징으로 하는 이질균 감염 방지 및 처치용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물이 소독제 또는 약학적 조성물 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 이질균 감염 방지 및 처치용 조성물.
제5항의 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물에게 투여하거나 환경에 분사하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 이질균 감염 방지 및 처치하는 방법.