KR20160013243A

KR20160013243A - 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염을 방지 및 처치하는 방법

Info

Publication number: KR20160013243A
Application number: KR1020160009818A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 전수연; 백형록; 손지수; 강상현
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2016-01-27
Filing date: 2016-01-27
Publication date: 2016-02-03

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지인 박테리오파지 CPP-5를 유효성분으로 포함한 조성물, 및 본 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 박테리오파지 CPP-5는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고, 전체 크기가 약 50 kb인 DNA이며 제한효소 Nde I, EcoR I, Xho I, Kpn I, Sma I, Fok I, 및 Sal I으로 처리할 때 특징적으로 유리되는 단편이 없는 유전체를 가지며, 또한 약 37 kDa, 40 kDa, 44 kDa, 및 127 kDa 크기의 주요 구조 단백질을 가지며 형태학적으로 시포비리대 박테리오파지의 특징을 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

클로스트리디움 퍼프린젠스 감염을 방지 및 처치하는 방법{Method for prevention and treatment of Clostridium perfringens}

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지하거나 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고, 전체 크기가 약 50 kb인 DNA이며 제한효소 Nde I, EcoR I, Xho I, Kpn I, Sma I, Fok I, 및 Sal I으로 처리할 때 특징적으로 유리되는 단편이 없는 유전체를 가지며, 또한 약 37 kDa, 40 kDa, 44 kDa, 및 127 kDa 크기의 주요 구조 단백질을 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대 박테리오파지, 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 목적으로 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.

클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)는 편성 혐기성균(산소의 존재 하에서는 거의 생육할 수 없는 세균)이며, 사람 혹은 소, 돼지, 염소 등의 여러 동물들에서 심각한 질병을 유발할 수 있는 원인균으로, 특히 괴사성 장염 및 식중독이 주요 질환이다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균이 생산하는 장독소(enterotoxin)는 보통 용혈독과 괴사독이며, 주요 독소로는 α, β, ε, i의 4가지가 존재한다. 이 독소들의 유무에 따라 A-F형의 6가지 독소형(toxigenic type)으로 분류된다. 이 중 A형균이 대표적인 식중독 원인균이며, C형균은 괴사성 장염의 원인균이다.

최근 양계 산업에 있어 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염 발생이 증가하고 있으며, 이로 인한 농가 피해가 심각한 상황이다. 이는 큰 규모의 계군에 유행될 수 있을 뿐 아니라 오랜 시간 동안 증상발현 없이 잠복이 가능한 질병이기 때문이다. 특히 육계군에서 전 세계적으로 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염이 빈번하게 발생하고 있는 추세여서 최근에 더욱 주요 감염원으로 인식되고 있다. 따라서 이 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염에 효과적으로 대처할 방안의 마련이 시급한 상황이다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지나 처치 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 항생제 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다.

최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.

박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 박테리아 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.

특히 최근 항생제 사용에 대한 정부 차원의 규제가 전 세계적으로 강화됨에 따라 박테리오파지에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.

이에, 본 발명자들은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(genome)의 특징 등을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가진 신규 분리된 박테리오파지를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염 방지 및 처치 목적의 소독제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염 방지 및 처치 목적의 음수첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 감염 방지 및 처치를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 감염하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물의 유효성분으로 포함되는 분리 박테리오파지는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고, 전체 크기가 약 50 kb인 DNA이며 제한효소 Nde I, EcoR I, Xho I, Kpn I, Sma I, Fok I, 및 Sal I으로 처리할 때 특징적으로 유리되는 단편이 없는 유전체를 가지며, 또한 약 37 kDa, 40 kDa, 44 kDa, 및 127 kDa 크기의 주요 구조 단백질을 갖는 것을 특징으로 하는 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지 CPP-5이다. 박테리오파지 CPP-5는 본 발명자들에 의해 분리된 후 2012년 12월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다 (기탁번호 KCTC 12334BP).

또한, 본 발명은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 소독제, 음수첨가제, 및 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 CPP-5는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 효과적 사멸시키므로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ⅱ) 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.

본 명세서의 “분리” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징들을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

본 발명의 박테리오파지는 박테리오파지 CPP-5와 이의 변형체들(variants)을 포함한다. 본 명세서의 “변형체”란 유전체 서열(genomic sequence)이나 유전정보가 코딩(coding)하고 있는 폴리펩타이드(polypeptide)에서의 작은 변이(minor variation)가 있지만 전체적 유전자형(genotypic) 및 표현형(phenotypic) 특징이 박테리오파지 CPP-5와 같은 박테리오파지들을 의미한다. 상기 변형체에는 다변형성 변형체(polymorphic variants)도 당연히 포함된다. 이러한 변형체들은 박테리오파지 CPP-5와 같은(same) 또는 동등한(equivalent) 생물학적 기능(biological function)을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 박테리오파지 CPP-5 또는 이의 변형체들이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 CPP-5 또는 이의 변형체들은 1× 10¹ pfu/㎖ 내지 1× 10³⁰ pfu/㎖ 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1 × 10³⁰ pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10⁴ pfu/㎖ 내지 1× 10¹⁵ pfu/㎖ 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 소독제, 음수첨가제, 및 사료첨가제로 구현될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 이 조성물을 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래하여 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점 또한 제공할 수 있다.

도 1은 박테리오파지 CPP-5의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 CPP-5의 주요 구조 단백질을 일차원 전기영동법으로 분석한 결과이다. 레인 M은 단백질 크기 마커이며, 레인 1은 박테리오파지 CPP-5의 단백질 시료이다. 주요 구조 단백질을 □□*□□로 표시하였다.
도 3은 박테리오파지 CPP-5의 유전체 크기를 PFGE로 분석한 결과이다. 레인 M은 DNA 크기 마커이며(CHEF DNA size standards-8-48 kb; Bio-Rad), 레인 1/10, 레인 1, 레인 2, 레인 3, 및 레인 6은 모두 박테리오파지 CPP-5의 유전체이며 레인에 적용한 유전체의 양만 다르다.
도 4는 박테리오파지 CPP-5 유전체의 제한 효소에 의한 절단 양상을 보여주는 결과로서, 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 1은 Nde I에 의한 절단 양상, 레인 2는 EcoR I에 의한 절단 양상, 레인 3은 Xho I에 의한 절단 양상, 레인 4는 Kpn I에 의한 절단 양상, 레인 5는 Sma I에 의한 절단 양상, 레인 6은 Fok I에 의한 절단 양상, 및 레인 7은 Sal I에 의한 절단 양상을 보여준다. 레인 8은 제한효소 처리를 하지 않은 박테리오파지 CPP-5의 유전체이다.
도 5는 박테리오파지 CPP-5의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 맑게 생긴 투명한 원은 배양 접시 위에 자란 박테리아가 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지 의 분리

클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 클로스트리디움 퍼프린젠스 균은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 동정(identification)된 것이다.

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 수집된 시료를 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 1/1000 비율로 접종한 BHI(Brain Heart Infusion) 배지 (Brain Heart Infusion from solid, 6 g/L; Peptic Digest of Animal Tissue, 6 g/L; Sodium Chloride, 5 g/L; Dextrose, 3 g/L; Pancreatic Digest of Gelatin, 14.5 g/L; Disodium Phosphate, 2.5 g/L)에 함께 첨가한 다음 혐기 조건의 37℃에서 12시간동안 배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 혐기 조건의 37℃에서 12시간 동안 또 다시 배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우 박테리오파지의 수(titer)가 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 5회 반복 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(spot assay)을 통하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. BHI 배지에 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 혐기 조건의 37℃에서 한밤동안 배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액 3 ml (OD600이 2.0)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 혐기배양장치 내에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 클로스트리디움 퍼프린젠스 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 혐기 조건의 37℃에서 하루 정치 배양한 다음에 여과액이 떨어진 위치에 투명환(clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 배양액에 첨가해 주어 12 시간 동안 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 12 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회로 달성되지 않기 때문에 이 때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 조사에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 과정을 반복하였다. 전자현미경 조사는 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(copper grid)에 묻히고 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다. 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지라고 확인하였다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 12 시간 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ml에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ml로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

이렇게 하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 CPP-5로 명명한 뒤, 2012년 12월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 12334BP)에 기탁하였다.

실시예 2: 분리 박테리오파지의 주요 구조 단백질 분석

얻어진 박테리오파지의 주요 구조 단백질을 일차원 전기영동을 통하여 확인해 보았다. 이를 위해 박테리오파지의 겉 외곽을 구성하는 단백질을 획득하기 위해 실시예 1에서 얻어진 박테리오파지 부유액 200 μl와 아세톤 800 μl를 섞어 격렬히 혼합한 후 10분간 -20℃에 정치시켰다. 그 다음 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리를 실시한 후 상층액을 제거한 다음, 자연 건조(Air dry)시켰다. 이를 5배로 농축된 전기영동용 시료 완충액(5× 샘플 버퍼)을 50 μl 가하여 부유시킨 다음 5분 정도 끓여 주었다. 이렇게 준비된 시료를 일차원 전기영동을 통하여 분석해보았다. 그 결과, 도 2에서 알 수 있듯이 약 37 kDa, 40 kDa, 44 kDa, 및 127 kDa 크기의 주요 구조 단백질들이 확인되었다.

실시예 3: 박테리오파지 CPP -5의 유전체 분리 및 특성 분석

박테리오파지 CPP-5의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K (20 ㎎/ml) 100 μl를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로판 알코올(isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 CPP-5의 유전체를 다량 확보하였다.

이렇게 얻어진 유전체를 PFGE(Pulse-field gel electrophoresis)를 이용하여 전체 크기를 분석하였다. PFGE에서는 Bio-Rad사의 CHEF-DR　 Ⅲ variable angle system을 사용하였다. PFGE는 장비제조사의 지침을 따라 실시하였으며 그 결과는 도 3과 같다. 이 결과로부터 분리한 박테리오파지 CPP-5의 유전체의 전체 크기가 약 50 kb 정도임을 확인할 수 있었다. 참고로 박테리오파지 CPP-5의 유전체 크기는 DNA 크기 마커를 근거로 하여 박테리오파지 CPP-5의 유전체의 젤(gel) 상에서의 상대적 위치로부터 계산되어졌다.

또한, 얻은 박테리오파지 CPP-5 유전체를 다양한 제한효소(restriction enzyme)로 처리하여 제한효소 처리에 따른 절단 양상을 파악하였다. 사용한 제한효소는 Nde I, EcoR I, Xho I, Kpn I, Sma I, Fok I, 및 Sal I(New England Lab)이며 제한효소 처리는 제조사의 사용설명에 따라 실시하였다.

그 결과는 도 4에 제시되어 있으며, 박테리오파지 CPP-5로부터 분리된 유전체는 제한효소 Nde I, EcoR I, Xho I, Kpn I, Sma I, Fok I, 및 Sal I으로 처리할 때 절단되지 않았다.

실시예 4: 박테리오파지 CPP -5의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸 능 조사

분리된 박테리오파지 CPP-5의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 클로스트리디움 퍼프린젠스 균들은 본 발명자들에 분리되어 클로스트리디움 퍼프린젠스 균으로 동정된 것들로 총 10종이었다. 박테리오파지 CPP-5는 실험에 대상이 된 모든 클로스트리디움 퍼프린젠스 균들에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 5에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 CPP-5의 보데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis), 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella Typhimurium) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 CPP-5는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 CPP-5는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 박테리오파지 CPP -5의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 예방 에 대한 실험예

9 ml의 BHI 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 10⁹ pfu/ml 수준의 박테리오파지 CPP-5 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ml의 BHI 배지를 담은 튜브에는 동량의 BHI 배지만을 첨가하였다. 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 배양액을 넣어 주었다. 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 혐기배양장치에 옮겨 배양 하면서 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 CPP-5 액을 첨가해 준 튜브에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 CPP-5가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 CPP-5가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 6: 박테리오파지 CPP -5를 이용한 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감 염 질환 처치예

박테리오파지 CPP-5의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의한 질환이 유발된 동물에서의 처치 효과를 조사하였다. 40 마리의 2일령 병아리에게 1× 107 cfu의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 먹여 인위적으로 감염상태를 만들었다. 이들을 무작위로 두 그룹으로 나누어 한 그룹에는 박테리오파지 CPP-5를 사료 1 g당 1× 109 pfu가 되도록 섞어서 급이하였고, 다른 한 그룹은 대조군으로 박테리오파지를 배제 시킨 동일한 조성의 사료만을 급이하였다. 급이 2일 후 분변 및 맹장 내용물에서의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균수를 측정하였다. 본 실시예의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균수 측정에서는 타 오염 세균에 의한 간섭을 막기 위해 클로스트리디움 퍼프린젠스 균 선택배지(TSC agar plate; OXOID)를 사용하였다. 실험 결과, 박테리오파지를 사료와 함께 급이한 경우, 분변에서는 대조군 대비 500배 이상의 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감소가 확인되었으며, 맹장 내용물에 있어서도 300배 이상 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 오염이 줄어듦을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 CPP-5가 클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 원인으로 하는 감염 질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 사료첨가제 및 사료의 제조

박테리오파지 CPP-5 액을 이용하여 사료 첨가제 1 g당 1× 109 pfu의 박테리오파지 CPP-5가 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트란을 첨가하고 여기에 전체 5%가 되게 트리할로오즈를 첨가한 다음에 동결건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루 형태로 분쇄하였다. 상기 제조 과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.

이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 1,000배의 양계용 사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.

실시예 8: 음수첨가제 및 소독제의 제조

음수첨가제나 소독제는 그 활용에서만 차이가 나고 제형은 동일하므로 같은 방식으로 제조하였다. 박테리오파지 CPP-5 액을 이용하여 음수첨가제 (또는 소독제) 1 ml당 1× 10⁹ pfu의 박테리오파지 CPP-5가 포함되도록 음수첨가제 (또는 소독제)를 제조하였다. 음수첨가제 (또는 소독제)의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ml당 1× 10⁹pfu의 박테리오파지 CPP-5가 포함되도록 상기 박테리오파지 CPP-5 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 음수첨가제 (또는 소독제)로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.

이렇게 제조된 2종의 음수첨가제 (또는 소독제)는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 음수 또는 소독제로 사용하였다.

실시예 9: 닭 사육에서의 사양 효과 확인

실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 음수 및 소독제를 이용하여 닭 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 60 마리의 2일령 병아리를 한 군당 20 마리씩으로 총 3개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 음수로 공급한 그룹-B; 소독 처리한 그룹-C)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 10마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 CPP-5가 적용된 소그룹 (소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹 (소그룹 ②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 병아리들은 각 시험 소그룹 별로 분리되어 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 2와 같이 구분되고 지칭되었다.

사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 2의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이하였으며, 음수 급이의 경우에는 실시예 8에서 제조한 음수를 표 2의 구분에 따라 통상적인 음수 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 3에 제시되어 있다.

그룹	폐사율(%)
A-①	0
A-②	30
B-①	0
B-②	20
C-①	0
C-②	30

이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료 및 음수의 급이와 본 발명에 따른 소독 처리가 동물 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 동물의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

KCTC

KCTC12334BP

20121207

Claims

클로스트리디움 퍼프린젠스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 시포비리대 박테리오파지 CPP-5 (수탁번호 KCTC 12334BP).
제1항의 박테리오파지 CPP-5를 유효성분으로 포함하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
제2항 또는 제3항에 의한 박테리오파지 CPP-5를 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의한 감염을 방지 또는 처치하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 용도로 사람을 제외한 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 퍼프린젠스 균에 의한 감염을 방지 또는 처치하는 방법.