CN112111464B - 一种大肠杆菌噬菌体dy1及其应用 - Google Patents

一种大肠杆菌噬菌体dy1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大肠杆菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体DY1，其保藏编号为：GDMCC 61175‑B1，所述噬菌体DY1有呈多面体的头部和短尾结构，头部直径约54nm，所述噬菌体DY1杀灭的大肠杆菌为血清型O34大肠杆菌。本发明中的噬菌体DY1在pH 5.0‑11范围和温度20‑50℃条件下具有良好的稳定性，不携带任何毒力或抗生素耐药基因，可以安全地运用于大肠杆菌的防控之中。同时，还具有多个不同的HNH归巢核酸内切酶，为新的分子遗传操作工具的开发提供了来源。

Description

一种大肠杆菌噬菌体DY1及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种针对血清型为O34的大肠杆菌的 噬菌体及其应用。
背景技术
大肠杆菌广泛分布在人与不同动物的肠道中，其中，致病性的大肠杆菌可 引起疾病，导致腹泻等临床症状，严重者可引起死亡。目前，抗生素是治疗大 肠杆菌感染的主要手段，然而依据2018年全国细菌耐药监测报告，大肠杆菌对 第三代头孢菌素耐药在全国平均水平为53％，对喹诺酮类药物耐药平均水平为 50.8％；有超过一半的大肠杆菌对这些常用的抗生素耐药。此外，被称为临床上 防治多重耐药的革兰氏阴性菌最后防线的多粘菌素，也有了耐药细菌的报导。 伴随着新抗生素的发现速度日渐减缓，为了有效防控致病性的大肠杆菌并减少 细菌耐药性的产生和传播，避免对人类健康造成危害，发展新的防控手段已迫 在眉睫。噬菌体作为抗生素的辅助用品甚至替代品，得到越来越多的关注。在 国内，养殖和临床等领域已成功将噬菌体应用于细菌感染的防治。如在我国青 岛正推行的“无抗”养殖，正是利用噬菌体替代抗生素的方式防治养殖中的细 菌感染。而上海噬菌体研究所，则将噬菌体作为临床药物治疗多重耐药性细菌 所引起的细菌感染。因此，噬菌体作为新的手段，有望替代抗生素成为防治细 菌感染的主要手段。噬菌体可高效裂解细菌；同时，由于可以不断的通过宿主 细胞进行复制，相比较抗生素，噬菌体生产更加便捷。因此，运用噬菌体进行 大肠杆菌防控具有很大的发展潜力。
与抗生素相比，噬菌体具有宿主特异性高的特点。利用这一特点，通过混 合不同噬菌体进行治疗，即鸡尾酒疗法，可以实现杀灭特定致病菌的目的。因 此，为了有效防止不同的致病大肠杆菌，我们需要依据不同大肠杆菌进行噬菌 体的分离，以建立一个能够全面防控致病性大肠杆菌的噬菌体库。
目前研究发现，大肠杆菌可以依据表面抗原的不同而分为不同的血清型。 其中，与O抗原相关的典型大肠杆菌致病性血清型O157由于能够引起人出血 性腹泻和肠炎，并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等得到了广 泛关注。但是，实际上致病性大肠杆菌并不局限于这一特定血清型。目前致病 性大肠杆菌可以分为肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产 肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌(包含肠道出血性大肠埃希氏菌) 和肠道集聚性大肠埃希氏菌等，一些较少关注的血清型大肠杆菌如在中国的养 殖猪和牛粪便中所发现的3株血清型为O34的大肠杆菌，采用现有存在的噬菌 体则不能对其有很好的裂解作用。因此，我们需要寻找一种针对血清型为O34 的大肠杆菌有强裂解作用的噬菌体。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明从广州市珠江水中筛选分离获得一种新型烈 性噬菌体，通过对其性能的鉴定发现该噬菌体能针对血清型为O34的大肠杆菌 有强裂解作用。本发明噬菌体宿主为血清型O34大肠杆菌180722，所述噬菌体 保藏编号为：GDMCC 61175-B1，分类名为：Escherichia coli bacteriophage。该 宿主菌株保藏号为GDMCC：1.1917。保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心； 保藏地址：中国广州市先烈中路100号广东省微生物研究所59号楼五楼。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种大肠杆菌噬菌体，所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体DY1，其保藏编号为： GDMCC61175-B1，所述噬菌体DY1有呈多面体的头部和短尾结构，头部直径 约54nm。本发明噬菌体DY1有呈多面体的头部和短尾结构，头部直径约54nm。
进一步地，所述噬菌体DY1杀灭的大肠杆菌为血清型O34大肠杆菌。本发 明噬菌体DY1是特异性地针对血清型O34大肠杆菌具有裂解作用，对其他血清 型大肠杆菌没有裂解作用。
进一步地，本发明通过全基因组分析显示，所述噬菌体DY1的基因组为线 性双链结构，全基因组长39,817bp，Genkbankd登录号为：MT808983.1，预测 有54个开放阅读框。ORF25预测为tRNA，另有34个ORF与已知功能蛋白相 似，不存在细菌的耐药基因和毒力基因。基于RNA聚合酶的系统进化树分析显 示，噬菌体DY1属于Kayfunavirus属噬菌体。
进一步地，所述噬菌体DY1不包含细菌耐药或/和毒力基因。由于本发明的 噬菌体不含有细菌耐药或/和毒力基因，在应用上具有安全性。
进一步地，所述噬菌体DY1在pH值5～11、在20～50℃条件下具有耐性。 本发明通过大量试验研究发现，噬菌体DY1在pH值5～11、在20～50℃条件下 仍保持原有效价。
本发明还提供了一种含有本发明噬菌体DY1的组合物，所述组合物至少含 有本发明的噬菌体DY1。
本发明还提供了一种杀灭血清型O34大肠杆菌的试剂，所述试剂含有本发 明所述的噬菌体DY1。
本发明还提供噬菌体DY1在制备杀灭血清型O34大肠杆菌药物或试剂中的 应用。本发明的噬菌体DY1对血清型O34大肠杆菌具有特定的裂解作用，因此， 将其应用专门针对杀灭血清型O34大肠杆菌的药物或试剂中具有很好的杀灭效 果。
本发明的有益效果为：
(1)本发明中的噬菌体DY1在裂解大肠杆菌180722的实验中表现出快速 高效的裂解作用，在30℃下经过20-30min即可完成对宿主大肠杆菌的裂解， 可用于环境中大肠杆菌爆发性状况的防治及耐药性大肠杆菌的清除；
(2)本发明中的噬菌体DY1在pH 5.0-11范围和温度20-50℃条件下具有 良好的稳定性，噬菌体效价没有发生明显变化，显示了良好的酸碱及温度耐受 性，为不同环境条件下防控大肠杆菌提供了良好的噬菌体来源；
(3)本发明中的噬菌体DY1的基因分析显示其不携带任何毒力或抗生素 耐药基因，可以安全地运用于大肠杆菌的防控之中。
(4)本发明中噬菌体DY1可特异性裂解血清型为O34的宿主菌株，为靶 向特定致病菌的噬菌体治疗提供一个新选择。
(5)本发明中噬菌体DY1具有多个不同的HNH归巢核酸内切酶，为新的 分子遗传操作工具的开发提供了来源。
附图说明
图1为噬菌体DY1的双层平板噬菌斑形态示意图。
图2为噬菌体DY1的透射电镜形态示意图。
图3为噬菌体DY1的RNA聚合酶系统进化树示意图。
图4为噬菌体DY1基因组共线性化比较图。
图5为噬菌体DY1与ST31在尾部纤维蛋白(tail fiber protein)(ORF47) 上差异示意图。
图6为噬菌体DY1的一步生长曲线示意图。
图7为噬菌体DY1的pH稳定性性实验示意图。
图8为噬菌体DY1的温度稳定性实验示意图。
图9为噬菌体DY1裂解O34血清型大肠杆菌阳性结果。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体 实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
本发明试验用噬菌体宿主大肠杆菌180722由本室分离，并保藏于广东省微 生物所菌种保藏中心，保藏号为GDMCC1.1917。
本发明试验用的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB培养基)、琼脂、牛肉膏、 Tween80、0.22μm微孔滤膜(购自环凯公司)；DNase I、RNase A(Takara)； 蛋白酶K(生工)；饱和酚溶液(索莱宝)、氯仿(广州化学试剂厂)。
实施例1、噬菌体的分离纯化
本发明试验用于分离噬菌体的水样为2018年采集于广州市珠江。
将采集的水样经8,000g离心10min后过滤去除杂质；加入固体MgSO4至终浓度50mM。再利用滤膜过滤截留噬菌体颗粒。将滤膜剪成小片后放入50 mL洗脱液中(1％牛肉膏、3％Tween 80)；随后取洗脱液2.5mL与2.5mL TSB 培养基(1mM CaCl2)混合，并加入100μL大肠杆菌180722菌液后37℃震荡 过夜。将过夜后的培养液8,000g离心1min后取上清过滤，该滤液即为拟含噬 菌体的原液。采用双层平板法鉴定滤液中是否有噬菌体，取100μL宿主菌液 加入4mL半固体TSB培养基(0.4％琼脂)中，混匀后倒入TSB固体培养基上， 待其凝固后，取5μL上述拟含噬菌体的原液加至平板上，于超净工作台中将 培养皿开盖静置待液滴晾干后，盖上盖子将培养皿倒扣，随后在37℃培养箱静 置过夜。观察过夜后培养皿上加入原液位置是否有噬菌斑形成，若有噬菌斑， 表明滤液中含有该宿主菌株的噬菌体。
在噬菌体斑形成的平板上，用枪头挑取噬菌斑加入1mL TSB培养基中，混 匀后取0.1mL经适当稀释，与宿主悬液做双层平板进行纯化，次日得到新形成 噬菌斑的平板，挑取单个噬菌斑重复上述纯化操作，约5-6次后，获得形态较一 致的噬菌斑(图1)。
实施例2、噬菌体的形态观察
将噬菌体悬液滴于铜网上，自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸去多余液体， 加一滴2％的磷钨酸于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸吸去染色液，待 样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。透射电镜结果显示(图2)该噬菌体 有多面体的头部和短尾结构，头部直径约54nm。本发明将其命名为噬菌体DY1。 发明人将噬菌体DY1保藏于广东省微生物所菌种保藏中心，其保藏号为： GDMCC 61175-B1。
实施例3、噬菌体基因组分析鉴定
对噬菌体DY1进行全基因组测序及分析：采用Ion torrent S5 platform对样 品DNA进行测序，构建500bp文库，随后利用SPAdes v.3.6.2拼接软件对优化 序列进行拼接。并利用Prokka1.1.3对组装结果进行注释，同时利用NCBI BLASTp对假定蛋白进行再次注释。随后通过NCBI BLASTn确定噬菌体与已报 道噬菌体相似性，依据注释后的蛋白功能，将基因组与已报道相似噬菌体基因 组进行比较，利用Esayfig2.3.3对比较结果进行可视化。
该基因组Genkbankd登录号为：MT808983.1，通过全基因组分析显示， 噬菌体DY1的基因组为线性双链结构，全基因组长39,817bp，预测有54个开 放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)(表1)。ORF25预测为tRNA，另有34 个ORF与已知功能蛋白相似，不存在细菌的耐药基因和毒力基因。基于RNA 聚合酶的系统进化树分析显示(图3)，噬菌体DY1属于Kayfunavirus属噬菌体。
进一步依据基因功能进行基因组可视化显示(图4)，DY1基因组中存在3 个特有的HNH归巢核酸内切酶(HNH homing endonuclease)(ORF20，ORF28， ORF50)。HNH归巢核酸内切酶具有序列特异性，在噬菌体包装病毒颗粒过程中 用于切割DNA链，从而有效促进基因组进入病毒外壳中。同时，具备序列特异 性的HNH核酸内切酶，可进一步开发作为特异性切割DNA序列的分子遗传工 具，如目前已产品化的Kpn I核酸内切酶，可特异性识别并切割具有5’ -GGTACC-3’位点的核酸序列而常用于分子遗传实验中。DY1所特有的HNH 归巢核酸内切酶，为新的分子遗传操作工具开发提供了材料。
此外，本发明噬菌体DY1与ST31(申请号为201710536101.4的专利申请) 在尾部纤维蛋白(tail fiber protein)(ORF47)上具有明显差异(图4，5)。尾部 纤维蛋白是噬菌体识别特定宿主的关键蛋白，具备特异性识别宿主的功能。因 此，通过基因工程表达本发明噬菌体DY1尾部纤维蛋白，作为检测血清型O34 大肠杆菌180722的检测工具。由此可以发展出以特定噬菌体尾部蛋白作为特异 性检测工具，组合多种特定噬菌体尾部蛋白检测多种特定大肠杆菌的检测方法， 比较传统的抗体检测方式，具有更高的特异性，同时，也有效避免细菌抗体制 备过程的成本和伦理问题。
综上基因组分析显示，噬菌体DY1作为一株新的Kayfunavirus属烈性噬菌 体，不包含细菌耐药(如β内酰胺酶bla)或毒力(如志贺毒素stx)基因，应用 上具有安全性。DY1同时具有特异的HNH归巢核酸内切酶和尾部纤维蛋白，为 开发新的分子遗传工具或检测工具提供了材料。
表1噬菌体DY1开放阅读框的注释
Figure BDA0002672462430000071
Figure BDA0002672462430000081
Figure BDA0002672462430000091
实施例4、噬菌体一步生长曲线测定
取对数生长期的大肠杆菌悬液与感染复数为0.1的噬菌体充分混合后， 30℃孵育5min，10,000g离心1min。去除上清并用培养基重悬稀释，加1mL 至49mL TSB培养基(含1mMCaCl2)，30℃震荡培养，每5min取样1mL进 行过滤除菌，共取45min。将过滤除菌后的样品稀释后用双层平板法测定噬菌 体效价，共进行三次平行实验。结果，通过一步生长曲线发现(图6)，噬菌体 DY1在感染宿主后，具有20min的潜伏期，在20-30min内，噬菌体数量急速 增加，在30min后达到顶峰，平均爆发量约30cfu/cell。
实施例5、噬菌体pH稳定性测定
在无菌EP管中加入不同pH值(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的 TSB培养基900μL，再加入100μL噬菌体(108cfu/mL)；混匀后置于37℃ 水浴锅孵育1h。随后采用双层平板法测定噬菌体效价。共进行三次平行实验。 结果显示(图7)，噬菌体DY1在pH 5-11范围内保持原有效价，pH 4时噬菌体 效价下降，在pH 2-3时完全失活。
实施例6、噬菌体温度稳定性测定
在无菌EP管中各加入1mL噬菌体DY1悬液(108cfu/mL)，分别于20℃、 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴1h。随后将处理后的样品稀释后用双层平 板测定效价。每个温度共进行三次平行实验。结果显示(图8)，噬菌体DY1在 温度20-50℃中稳定，60℃处理1h后噬菌体效价下降，70℃完全失活。
实施例7、噬菌体宿主谱测定
将不同血清型大肠杆菌悬液分别取100μL加入4mL半固体TSB培养基 (0.4％琼脂)，混匀后倒入TSB固体培养基上，待凝固后，取2μL噬菌体悬 液加至平板上，于超净工作台中将培养皿开盖静置待液滴晾干后，盖上盖子将 培养皿倒扣，随后在37℃培养箱静置过夜。观察过夜后培养皿上加入噬菌体悬 液位置是否有噬菌斑形成，若有噬菌斑则说明该噬菌体能够裂解对应的大肠杆 菌。结果显示(图9)，噬菌体DY1特异性裂解血清型为O34的宿主菌株，对其 他血清型的23株大肠杆菌无法裂解(表2)，具有高度的宿主特异性。
表2噬菌体DY1宿主谱
Figure BDA0002672462430000101
备注：“+”表示清晰透明噬菌斑，“-”表示无噬菌斑
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。

Claims (3)

1.一种大肠杆菌噬菌体在制备裂解血清型O34大肠杆菌的药物或试剂中的应用，其特征在于，所述噬菌体为大肠杆菌噬菌体DY1，其保藏编号为：GDMCC 61175-B1，所述噬菌体DY1有呈多面体的头部和短尾结构，头部直径约54 nm。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体DY1不含有细菌耐药或/和毒力基因。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体DY1在pH值5~11、在20~50℃条件下具有耐性。
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