CN109642217B - 新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-5及其抑制副溶血弧菌增殖的用途 - Google Patents

新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-5及其抑制副溶血弧菌增殖的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以具备特异性杀灭副溶血弧菌的能力并具有用序列号1标示的基因组为特征的从自然界分离的肌尾噬菌体科噬菌体Vib‑PAP‑5(保藏号KCTC 13029BP)及利用以其为有效成分包含的组合物防止副溶血弧菌感染及治疗副溶血弧菌感染的方法。

Description

新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-5及其抑制副溶血弧菌增殖 的用途
技术领域
本发明涉及一种防止及处置副溶血弧菌感染的方法，该方法利用感染副溶血弧菌后能够将副溶血弧菌杀灭的从自然界分离的噬菌体及以其为有效成分包含在内的组合物。更具体地，涉及一种以具备特异性杀灭副溶血弧菌的能力并具有用序列号1标示的基因组为特征的从自然界分离的肌尾噬菌体科噬菌体Vib-PAP-5(保藏号KCTC 13029BP)及利用以所述噬菌体为有效成分包含的组合物的防止副溶血弧菌感染及感染后处置的方法。
背景技术
属于弧菌属(Genus)的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为革兰氏阴性杆菌，栖息在海水或者海产品等处，其是一种高致病性细菌，人体一旦感染就会引发急性食物中毒及肠炎。副溶血弧菌的血清型(Serotype)有鞭毛抗原(Flagella，H)、菌体抗原(Somatic，O)及荚膜抗原(Capsular，K)3种。其中，鞭毛抗原共同存在于所有的副溶血弧菌中。因此，副溶血弧菌的血清型根据菌体抗原与荚膜抗原的种类进行区分。目前为止，已知的副溶血弧菌的菌体抗原与荚膜抗原的种类分别为13种和75种。
副溶血弧菌会在多种鱼类及贝类等诱发弧菌病(Vibriosis)，从而给水产养殖业带来严重的经济损失。特别是，鱼类因感染副溶血弧菌而患上弧菌病的发病频率高，带来的经济损失也大。因此，迫切需要研发出一种能够用于预防副溶血弧菌感染及进一步处置感染的方案。
目前，为了抑制及治疗副溶血弧菌引发的感染而广泛使用抗生素。最近，随着抗生素耐药菌的增加，其效果在持续下降。由于加强了对抗生素用于养殖鱼类的规制，就需要研发除了抗生素之外的其它有效方法。特别是，针对贴近自然的方法的需求大。
最近，作为应对细菌性疾病的方案，噬菌体(Bacteriophage)的利用受到了极大的关注。特别是，由于人们提倡亲近自然的方式，使得大家对噬菌体的关注比以往任何时候都要高。噬菌体作为一种感染至细菌的非常小的微生物，一般也被简称为噬体(Phage)。当噬菌体感染(Infection)细菌之后，就在细菌细胞内部增殖。增殖后，通过子孙噬菌体来到细菌外时破坏宿主即细菌的细胞壁的方式将细菌杀灭。
噬菌体的细菌感染方式具有非常高的特异性，能够感染特定细菌的噬菌体的种类限定在一部分。即，特定噬菌体只能够感染特定范畴的细菌。因此，特定噬菌体只杀灭特定细菌，而不会对其它的细菌产生影响。由于这种噬菌体的细菌特异性，噬菌体仅对目标细菌提供抗菌效果，不会对环境或者鱼类中的常居菌产生影响。通常情况下，广泛用于细菌处置的现有的抗生素会同时对多种类型的细菌产生影响。因此，导致了环境污染或者动物的体内正常细菌丛搅乱等问题。与此不同，噬菌体只针对特定细菌发挥作用，因此，利用噬菌体不会发生体内正常细菌丛的搅乱。所以，与使用抗生素相比，利用噬菌体是非常安全的，而且相对地，使用噬菌体产生副作用的可能性非常低。
噬菌体是1915年英国的细菌学家Twort在对葡萄球菌(Micrococcus)菌落被某种物质透明溶化的现象进行研究的过程中发现的。另外，1917年，法国的细菌学家d'Herelle在痢疾患者粪便的过滤液中发现了具有使痢疾杆菌(Shigella disenteriae)溶解作用的物质，通过对此进行研究，独立发现了噬菌体。当时，从猎食细菌的意义出发将其命名为噬菌体。此后，相继发现了针对痢疾菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌等多种致病性细菌的噬菌体。
由于具有能够杀灭细菌的特殊能力，因此噬菌体被发现之后，以应对细菌感染的有效方案受到了期待，并开展了相关大量的研究。但是，当Flemi ng发现青霉素之后，抗生素得到了广泛普及，对噬菌体的研究仅限于在一部分国家维持命脉。但是，由于2000年以后抗生素耐药菌的增加，导致现有抗生素表现出了局限性。随着作为现有抗生素替代物质的开发可能性的凸显，噬菌体再次作为抗菌剂得到关注。特别是，随着最近在全世界范围内政府层面对抗生素的使用加强了规制，对噬菌体的关注度进一步提高，将其用于产业方面的事例也在逐渐增加。
如上所述，噬菌体对细菌具有非常高的特异性。正是由于存在这种特异性，即使是属于同一种类(Species)的细菌，噬菌体往往也只对其中一部分株(strain)发挥抗菌效果。另外，随着噬菌体不同，针对相同的细菌株，噬菌体的抗菌力的强度本身也会不一样。正是由于这种原因，如果想要确保针对特定种类的细菌的有效控制方法，就需要确保多种种类的有用噬菌体。为了开发能够应对副溶血弧菌的噬菌体的有效利用方法，当然也需要确保能够针对副溶血弧菌提供抗菌效果的多种多样的有用噬菌体，还需要进一步在所确保的多样的有用噬菌体中筛选抗菌力强度或者抗菌范围层面具有相对优势的噬菌体并加以利用。
发明内容
所要解决的技术问题
因此，本发明人努力尝试着开发出一种利用从自然界分离并能够选择性地杀灭副溶血弧菌的噬菌体而可以用于防止或处置副溶血弧菌感染的组合物，以及一种利用该组合物防止或处置副溶血弧菌感染的方法。其结果是，从自然界分离出了合适的噬菌体，为了能够将所述分离的噬菌体与其它噬菌体进行特定区分而确保了基因组(Genome)的基因序列，之后开发出了以所述噬菌体为有效成分的组合物，然后确认该组合物能够有效用于副溶血弧菌的感染防止及处置，由此完成了本发明。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种以具备特异性杀灭副溶血弧菌的能力并具有以序列号1标示的基因组为特征的从自然界分离的肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体Vib-PAP-5(保藏号KCTC 13029BP)。
本发明的另一个目的在于，提供一种可用于防止副溶血弧菌感染的组合物及利用该组合物防止副溶血弧菌感染的方法，该组合物以感染副溶血弧菌后能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体Vib-PAP-5为有效成分包含。
本发明的又一个目的在于，提供一种可用于处置副溶血弧菌感染的组合物及利用该组合物处置副溶血弧菌感染的方法，该组合物以感染副溶血弧菌后能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体Vib-PAP-5为有效成分包含。
本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的、以副溶血弧菌的感染防止及处置为目的的药浴剂。
本发明的又一个目的在于，提供一种利用所述组合物的、以通过防止及处置副溶血弧菌感染的饲养效果提供为目的的饲料添加剂。
解决技术问题的方法
本发明提供了一种以具备特异性杀灭副溶血弧菌的能力并具有以序列号1表示的基因组为特征的从自然界分离的肌尾噬菌体科噬菌体Vib-PAP-5(保藏号KCTC 13029BP)及利用以其为有效成分包含的组合物的防止及处置副溶血弧菌感染的方法。
噬菌体Vib-PAP-5由本发明人分离后，于2016年5月26日寄托在韩国生命工学研究院生物资源中心(受托编号KCTC 13029BP)。
另外，本发明提供了一种以可用于防止或处置副溶血弧菌感染的噬菌体Vib-PAP-5为有效成分包含的药浴剂及饲料添加剂。
本发明的组合物中包含的噬菌体Vib-PAP-5能够有效杀灭副溶血弧菌，因此对由副溶血弧菌引发疾病的预防(防止感染)或者治疗(感染处置)显示出效果。因此，本发明的组合物可以以预防及治疗由副溶血弧菌引发疾病的目的而使用。
本说明书中使用的“防止”或“预防”等术语意味着：(i)防止副溶血弧菌感染；以及(ii)抑制因感染副溶血弧菌而引起的向疾病的发展。
另外，本说明书中使用的“处置”或“治疗”等术语意味着：(i)抑制由副溶血弧菌引发的疾病；以及(ii)减轻由副溶血弧菌引发疾病的病态的所有行为。
本说明书中提到的“分离”、“分离的”或“被分离的”，是指在自然状态下利用多种实验技法对噬菌体进行分离和确保能够区分于其它噬菌体而特定对象噬菌体的特征的作业。除此之外，还包含通过生物工学技术为了工业利用而增殖对象噬菌体的作业。
本发明的组合物中包含的药剂学上允许使用的载体是生产制剂时通常利用的物质，包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、刺槐胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、及矿物油等，但并非仅限定于此。本发明的组合物中除了上述成分之外，还可进一步包括：润滑剂、润湿剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。
本发明的组合物将噬菌体Vib-PAP-5作为有效成分包含在内。其中所含的噬菌体Vib-PAP-5以1×101pfu/ml至1×1030pfu/ml或1×101pfu/g至1×1030pfu/g包含，优选地，以1×104pfu/ml至1×1015pfu/ml或1×104pfu/g至1×1015pfu/g包含。
本发明的组合物可以按照具有本发明所属技术领域普通知识的技术人员能够容易实施的方法利用药学上允许使用的载体及/或赋形剂实现制剂化，从而既可以按照单位容量形态制造，也可以装入大容量容器内制造。在这种情况下，所述剂型既可以是油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，也可以是萃取剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊形态。除此之外，还可进一步包括：分散剂或稳定剂。
本发明的组合物根据利用方式可以实现为药浴剂及饲料添加剂，但不局限于此。
为了提高上述利用目的方面的效率，能够对其它菌种提供抗菌活性的噬菌体可以追加在本发明的组合物中。另外，本发明的组合物中还可追加对于副溶血弧菌具有抗菌活性的其它种类的噬菌体。即使是对于副溶血弧菌具有抗菌活性的噬菌体，其在抗菌力的强度或者抗菌范围方面相互存在一定的差异，因此将它们适当组合可以最大化其效果。
发明效果
本发明中利用以噬菌体Vib-PAP-5作为有效成分包含在内的组合物对副溶血弧菌的感染进行防止及处置的方法，与现有基于抗生素等化学物质的方式相比，其优点在于对副溶血弧菌的特异性非常高。这意味着，在不会对其它有用的常居菌产生影响的同时，还能够以防止或处置副溶血弧菌的感染的目的使用，而且使用其而产生的副作用非常小。通常情况下，如果使用抗生素等化学物质，同时也会对普通常居菌造成损害，其结果是会导致动物的免疫力下降等，随着使用会显示出多种副作用。此外，本发明是将自然界已经存在的噬菌体分离后用作组合物的有效成分，因此还具有非常亲近自然的优点。另外，即使噬菌体能够发挥抗菌活性的细菌种相同，但就其发挥的抗菌效果而言，在抗菌力的强度或者抗菌范围[即，从属于副溶血弧菌的多种菌株(Strain)的层面来看，噬菌体对个别细菌株发挥抗菌活性的范围。通常情况下，噬菌体可以对属于相同细菌种(Species)的一部分细菌株(Strain)发挥抗菌活性。即，即使属于相同细菌种，噬菌体对个别细菌株的敏感性也会存在差异]方面也存在一定的差异。因此，本发明与对副溶血弧菌具有抗菌力的其它噬菌体相比，可提供差异化的抗菌效果。这一点在用于产业现场时，其效果会有很大的差异。
附图说明
图1是噬菌体Vib-PAP-5的电子显微镜照片。
图2是显示噬菌体Vib-PAP-5对副溶血弧菌杀灭能力的实验结果，透明部分是试验对象细菌经过溶菌后最终形成的溶菌斑。
具体实施方式
下面，将依据实施例对本发明进行更加具体的说明。但是，这些实施例只是本发明的示例，本发明的范围并非限定于这些实施例。
实施例1：能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体的分离
在对能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体进行分离时，利用了从自然环境中获取的样品。另外，用于噬菌体分离的副溶血弧菌株是由本发明人事先分离从而被鉴定(Identification)为副溶血弧菌的。
下面，将对噬菌体分离过程进行详细说明。将收集的样品一并添加到按照1/1,000比例接种有副溶血弧菌的LB(Luria-Bertani)培养基(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L)中，然后在37℃下振荡培养3-4小时。培养之后，在8,000rpm的条件下离心分离20分钟，回收上清液。在回收的上清液中按照1/1,000比例接种副溶血弧菌，然后在37℃下再次振荡培养3-4小时。在样品中包含噬菌体的情况下，为了使噬菌体的数量(滴度；Titer)能够充分增加，总共重复执行了5次上述过程。经过5次重复执行后，将培养液在8,000rpm的条件下离心分离20分钟。经过离心分离后，将回收的上清液利用0.45μm的过滤器进行过滤。通过利用如上获得的滤液的普通的斑点实验(Spot assay)调查是否存在能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体。
所述斑点实验按如下方法实施。将副溶血弧菌以1/1,000比例接种到LB培养基中，然后在37℃下振荡培养一夜。将通过上述过程准备好的副溶血弧菌的培养液3ml(OD600为1.5)涂抹(Spreading)到LA(Luria-Bertani Agar)平板培养基(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L；琼脂，15g/L)上。将涂抹后的平板培养基在净化工作台(Cleanbench)上放置约30分钟左右，使涂抹液干燥。干燥后，将前面准备的滤液10μl滴定到涂抹有副溶血弧菌的平板培养基上，并将其放置30分钟左右进行干燥。干燥后，将经过所述滴定处理的平板培养基在37℃下静置培养一天后，调查在滴有滤液的位置是否生成有透明环(Clear zone)。如果生成有透明环，就可以判断滤液中包含能够杀灭副溶血弧菌的噬菌体。通过上述调查，可以确保包含了对副溶血弧菌具有杀灭能力的噬菌体的滤液。
利用确认了存在对副溶血弧菌具有杀灭能力的噬菌体的滤液实施了纯粹噬菌体的分离。纯粹噬菌体的分离采用了常用的溶菌斑分析(Plaque assay)。下面将对此进行详细说明，将在溶菌斑分析过程中形成的一个溶菌斑利用灭菌的吸头回收之后，将其添加到副溶血弧菌培养液中，并在37℃下一起培养4-5小时。培养之后，在8,000rpm的条件下离心分离20分钟，获取上清液。向获取的上清液中以1/50的体积添加副溶血弧菌培养液，然后再次在37℃下培养4-5小时。为了使噬菌体的数量增加，至少实施5次以上这一过程，最后在8,000rpm的条件下离心分离20分钟，获取上清液。使用获取的上清液再次进行溶菌斑分析。通常情况下，纯粹噬菌体的分离不能仅通过1次的上述过程完成。因此，利用此时形成的溶菌斑再次重复前面的整个步骤。至少重复实施5次以上这种过程，以确保获得包含纯粹噬菌体的溶液。通常情况下，纯粹噬菌体的分离一直重复执行，直到形成的溶菌斑大小及形状全都相似时为止。另外，最后通过电子显微镜分析确认是否有噬菌体的纯粹分离。重复执行前面叙述的过程，直至在电子显微镜分析中确认到纯粹分离。电子显微镜分析是按照常用的方法实施的，下面将对此进行简单说明。将包含纯粹噬菌体的溶液涂到铜载网(Copper grid)上，利用2％乙酸铀酰(Uranyl acetate)进行负染法(Negative staining)和干燥后，通过透射电子显微镜对其形态进行观察。纯粹分离的噬菌体的电子显微镜照片如图1所示，从其形态特征判断，可以确认新获得的噬菌体属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体。
包含通过这种方式确认的纯粹噬菌体的溶液经过了以下提纯过程。按照包含纯粹噬菌体溶液的溶液整体体积1/50的体积标准添加副溶血弧菌培养液后，再次培养4-5小时。培养之后，在8,000rpm的条件下离心分离20分钟，获取上清液。为了获取包含充足数量噬菌体的溶液，将这一过程总共重复执行5次。将最终通过离心分离获得的上清液利用0.45μm的过滤器进行过滤，然后实施了普通的聚乙二醇(Polyethylene Glycol；PEG)沉淀过程。具体地，向滤液100ml中添加PEG和NaCl，使其达到10％PEG 8000/0.5M NaCl。然后在4℃下静置2-3小时，接着在8,000rpm的条件下离心分离30分钟，获得噬菌体沉淀物。利用缓冲液(Buffer；10mM Tris-HCl、10mM MgSO4、0.1％明胶[Gelatin]、pH 8.0)5ml使通过上述过程获得的噬菌体沉淀物悬浮。将其称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。
通过上述过程，可以确保获得经过提纯的纯粹噬菌体，将所述噬菌体命名为噬菌体Vib-PAP-5后，于2016年5月26日托管于韩国生命工学研究院生物资源中心(保藏号KCTC13029BP)。
实施例2：噬菌体Vib-PAP-5的基因组分离及序列分析
将噬菌体Vib-PAP-5的基因组按下述方法实施了分离。基因组的分离利用了按照如实施例1所述的方法获得的噬菌体悬浮液。首先，为了将悬浮液中可能包含的副溶血弧菌的DNA和RNA除去，向噬菌体悬浮液10ml中分别添加200U的DNase I和RNase A，然后在37℃下放置30分钟。放置30分钟之后，为了除去DNase I与RNase A的活性，添加0.5M乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)500μl，然后再次静置10分钟。接着，将其在65℃下再进一步静置10分钟。然后，为了使噬菌体外壁瓦解，添加蛋白酶(proteinase)K(20mg/ml)100μl，然后在37℃下反应20分钟。接着，添加10％十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecyl sulfate；SDS)500μl，然后再次在65℃下反应1小时。反应1小时之后，向该反应液中添加具有25：24：1的构成比的由苯酚(Phenol)：三氯甲烷(Chloroform)：异戊醇(Isoamylalcohol)的混合液10ml，之后混合均匀。接着，将其在13,000rpm条件下离心分离15分钟，从而实现分层后从分离的层中取上层，向其中添加1.5体积比的异丙醇(Isopropylalcohol)后，在13,000rpm的条件下离心分离10分钟，使基因组沉淀。将沉淀物回收后，向沉淀物中添加70％乙醇(Ethanol)，然后再次在13,000rpm的条件下离心分离10分钟，从而对沉淀物进行清洗。将经过清洗的沉淀物回收，并实施真空干燥后，使用100μl的水将沉淀物溶解。重复执行上述过程，确保了大量的噬菌体Vib-PAP-5基因组。
利用由此获得的基因组在Macrogen株式会社使用illumina Mi-Seq仪器执行下一代碱基序列分析(Next generation sequencing analysis)，获得了噬菌体Vib-PAP-5的基因组序列信息。最终分析的噬菌体Vib-PAP-5基因组的大小为58,970bp，整体基因组序列被标记为序列号1。
以获得的噬菌体Vib-PAP-5的基因组序列为基础，利用Web上的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对其与当前已知的噬菌体基因组序列的同源性(Similarity)进行了调查。BLAST调查的结果是，没有确认到具有50％以上的同源性的噬菌体序列。
根据这一事实，可以判断噬菌体Vib-PAP-5是目前尚未报告过的新颖的噬菌体。与这一事实一同地，还依据通常情况下，如果噬菌体的种类不同，则可以提供的抗菌力的强度及抗菌范围不相同的事实，可以判断噬菌体Vib-PAP-5能够提供与目前已报告过的其它噬菌体不同的抗菌效果。
实施例3：噬菌体Vib-PAP-5对副溶血弧菌的杀灭能力调查
对分离的噬菌体Vib-PAP-5对副溶血弧菌的杀灭能力进行了调查。杀灭能力的调查采用通过实施例1中所述的斑点实验，以调查是否生成透明环的方式执行。用于进行杀灭能力调查的副溶血弧菌是由本发明人分离并鉴定为副溶血弧菌的，总共为18株。噬菌体Vib-PAP-5对成为实验对象的18株副溶血弧菌中的总共17株具有杀灭能力。具有代表性的实验结果如图2所示。另外，还通过另行实验对噬菌体Vib-PAP-5杀灭迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、鱼肠弧菌(Vibrioichthyoenteri)、格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、副乳房链球菌(Streptococcusparauberis)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)及杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)的能力也进行了调查，结果表明，噬菌体Vib-PAP-5对这些菌种不具有杀灭能力。
通过以上结果可以确认，噬菌体Vib-PAP-5对副溶血弧菌具有特定杀灭能力，可以对多数副溶血弧菌发挥抗菌效果。这意味着，噬菌体Vib-PAP-5可用作副溶血弧菌感染防止及处置用途的组合物的有效成分。
实施例4：噬菌体Vib-PAP-5预防副溶血弧菌感染的实验例
向装有9mlLB培养基的一个试管内放入1×108pfu/ml标准的噬菌体Vib-PAP-5溶液100μl，向另一个装有9mlLB培养基的试管内仅进一步添加等量的LB培养基。然后，分别向每个试管内放入副溶血弧菌的培养液，并确保600nm的吸光度达到约0.5左右。添加副溶血弧菌后，将试管转移到37℃的培养器中进行振荡培养，并对副溶血弧菌的生长状态进行了观察。如表1所示，在添加了噬菌体Vib-PAP-5溶液的试管中，观察到了副溶血弧菌的生长得到了抑制；相反，在未添加噬菌体溶液的试管中，未观察到副溶血弧菌的生长被抑制。
【表1】
副溶血弧菌的生长抑制
Figure GDA0003485842020000111
从以上结果可以看出，本发明的噬菌体Vib-PAP-5不仅阻碍了副溶血弧菌的生长，而且还具有将其杀灭的能力。由此可以得出结论，噬菌体Vib-PAP-5可用作防止副溶血弧菌感染用途的组合物的有效成分。
实施例5：利用噬菌体Vib-PAP-5预防副溶血弧菌感染的动物实验
利用鲈鱼(Sea bass)对噬菌体Vib-PAP-5预防副溶血弧菌感染的效果进行了调查。将鲈鱼稚鱼(体重：5～7g，体长：8～10cm)60尾作为一组，总共分为两组。然后，将其放入水槽中分开饲养，并持续14天的实验。对水槽周围的环境进行控制，使放置水槽的实验室温度保持恒定。从实验开始日起，在整个实验期间，以1×108pfu/g的标准，采用普通的投喂饲料的方式给实验组(投喂噬菌体组)的鲈鱼投喂包含噬菌体Vib-PAP-5的饲料。相反，按照相同的方式给对照组(未投喂噬菌体组)的鲈鱼投喂不包含噬菌体Vib-PAP-5的相同组成饲料。从实验开始日起的第7天开始，以1×108cfu/g的标准，投喂包含副溶血弧菌的饲料，一天2次并持续投喂2天，诱导副溶血弧菌感染。从实验开始日起的第9天(诱导副溶血弧菌感染后的第2天)开始，每天以所有的试验动物为对象对弧菌病发生状态进行了调查。弧菌病发生状态调查是通过测定体色黑化指数的方式实施的，体色黑化指数测定是通过常用的测定Dark Coloration(DC)score(正常：0，轻微黑化：1，深度黑化：2)的方式实施的，其结果如表2所示。
【表2】
体色黑化指数测定结果(平均值)
Figure GDA0003485842020000121
从以上结果可以看出，本发明的噬菌体Vib-PAP-5对于抑制副溶血弧菌感染非常有效。
实施例6：利用噬菌体Vib-PAP-5治疗副溶血弧菌感染疾病的例子在由副溶血弧菌引发弧菌病的鲈鱼中调查了噬菌体Vib-PAP-5的治疗效果。将鲈鱼稚鱼(体重：5～7g，体长：8～10cm)60尾作为一组，总共分为两组。然后，将其放入水槽中分开饲养，并持续14天的实验。对水槽周围的环境进行控制，使放置水槽的实验室温度保持恒定。从实验开始后的第5天开始，以1×108cfu/g的标准，采用普通的投喂饲料的方式投喂被副溶血弧菌污染的饲料，一天2次并持续投喂3天。从投喂被副溶血弧菌污染饲料的最后一天开始，在两个水槽内均确认到了表现出弧菌病临床症状的个体。从执行完投喂3天被副溶血弧菌污染饲料的第二天(实验开始后的第8天)开始，按照普通的投喂饲料的方式给实验组(投喂噬菌体组)的鲈鱼投喂包含噬菌体V ib-PAP-5(1×108pfu/g)的饲料。相反，按照相同的方式给对照组(未投喂噬菌体组)的鲈鱼投喂不包含噬菌体Vib-PAP-5的相同组成的饲料。从副溶血弧菌强制感染后的第3天(试验开始的第8天)开始，每天以所有的试验动物为对象对弧菌病发生状态进行了调查。对由副溶血弧菌引发的弧菌病发生状态的调查，是通过与实施例5相同的方式，即通过测定体色黑化指数的方式实施的，其结果如表3所示。
【表3】
体色黑化指数测定结果(平均值)
Figure GDA0003485842020000131
从以上结果可以看出，本发明的噬菌体Vib-PAP-5对于由副溶血弧菌导致的感染疾病的治疗也非常有效。
实施例7：饲料添加剂及饲料的制造
利用噬菌体Vib-PAP-5溶液，以每1g饲料添加剂中包含1×108pfu的噬菌体Vib-PAP-5的标准制造饲料添加剂。饲料添加剂的制造方法是向噬菌体溶液中添加麦芽糊精(50％，w/v)后，冷冻干燥从而制造。最后粉碎成细粉形态。所述制造过程中的干燥过程也可以采用减压干燥、加温干燥、常温干燥来代替。为了进行对照实验，制造不包含噬菌体的饲料添加剂采用以下方式，即代替噬菌体溶液使用制造噬菌体溶液时所用的缓冲液(Buffer；10mM Tris-HCl，10mM MgSO4，0.1％Gelatin，pH8.0)。
将通过上述方法制造的2种饲料添加剂分别按重量比与250倍的养鱼用生饲料混合，最终制造出2种饲料。
实施例8：药浴剂的制造
药浴剂按照以下方法制造。利用噬菌体Vib-PAP-5溶液，以每1ml药浴剂中包含1×108pfu的噬菌体Vib-PAP-5的的方式制造药浴剂。药浴剂的制造方法是：以制造噬菌体溶液时使用的每1ml缓冲液中包含1×108pfu噬菌体Vib-PAP-5的标准添加所述噬菌体Vib-PAP-5溶液并进行充分混合的方式制造。为了进行对照实验，不包含噬菌体的药浴剂直接采用了制造噬菌体溶液时使用的缓冲液本身。
将通过上述方法制造的2种药浴剂按体积比用1,000倍的水进行稀释，作为最终的药浴剂使用。
实施例9：鲈鱼饲养过程中的饲养效果确认
对利用实施例7及实施例8中制造的饲料和药浴剂饲养鲈鱼的饲养结果是否获得了改善进行了调查。特别是，本调查是从死亡率观点实施的。将总共800尾鲈鱼的每400尾为一组，总共分为2组(用饲料喂养的组-A；用药浴剂处置的组-B)，实施了4周的试验。将每一组又重新分为由200尾组成的小组，各小组分为适用噬菌体Vib-PAP-5的小组(小组-①)及未适用噬菌体的小组(小组-②)。成为本试验对象的鲈鱼是稚鱼(体重：5～7g，体长：8～10cm)，各试验小组的鲈鱼稚鱼各自饲养在以一定间隔隔离的不同水槽内，各小组按照表4的方式进行区分并命名。
【表4】
鲈鱼饲养试验中的小组区分及标示
Figure GDA0003485842020000141
用饲料喂养的情况下，就采用通常的饲料投喂方式按照表4的区分投喂实施例7中制造的饲料。用药浴剂进行处置的情况下，就将通过实施例8中所述药浴剂制造方式制造的药浴剂按照表4的区分采用通常的药浴剂处置方式进行处置。其结果如表5所示。
【表5】
鲈鱼饲养试验中的死亡率
组 死亡个体数/试验个体数 死亡率(％)
A-① 7/200 3.5
A-② 39/200 19.5
B-① 9/200 4.5
B-② 58/200 29.0
从以上结果可以确认，投喂依据本发明制造的饲料和利用依据本发明的药浴剂进行处置，对饲养鲈鱼的饲养结果改善方面具有效果。由此可以得出以下结论，使用本发明的组合物，对动物的饲养结果改善方面是有效的。
通过以上说明，对本发明的特定部分进行了详细介绍，对于具有本领域普通技术知识的技术人员来说，应当明白，这种具体的技术仅仅是优选的实现例，本发明的范围并非限制于此。因此，本发明的实质性范围应当依据后附权利要求书及其等价物定义。
托管机构名称：KCTC
保藏号：KCTC 13029BP
接管日期：20160526
Figure GDA0003485842020000161
<110> 尹特荣生物科技株式会社
<120> 新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-5及其抑制副溶血弧菌增殖的用途
<130> DFP18KR3504
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 58970
<212> DNA
<213> 噬菌体 Vib-PAP-5(bacteriophage Vib-PAP-5)
<400> 1
gctttttatg gaggccggag atgccgcatc gattatttat ttcctcagat atgtttcacc 60
ctgtatatac atacagtatg accgatgtac agcttatcga tgtgtgtaca gctttgaggg 120
gtatatcata ctcttcggtg tacatagggc gatgacctgg acgtgccgcc gggggcccga 180
tgatcgtcga caatatatgt cggccgagat ggtgacaact ttatccgccg tccaaaaaga 240
tttgaggttt tagaatgttg tctagtaatg tgctgcacac tttgtataat gtacatactt 300
tctgcaacaa cataaggtct acatgatgga aatagctaac gaagaagtgc ttcaatacat 360
tgagtggtat gaagcaacat accctgaata tgatcagtgg acgtgcactg caatcaaaac 420
atggatcctt aacaagtaca acgtgtcgca agagaacctg tctgtgtacg ctgagcaatt 480
caaccgtgtg cgcacactgt ggtcacaaaa gctcaatgag caccgcctta acaaggggtt 540
cccagaatac ttcggcattc acccgttctt ggacatgtct aagaaatact tcggtattga 600
gctactgacg gagcctggag acgaagaaaa ggtttacgca cgtattaaca ttgagcgtaa 660
agagttcatt gattgggtta agaaggagtt gaccacatgt ctgtcgtaat tagcaccgct 720
cccactattg ctgccgctac tgttgcgcta aacaacacgt ctagtgatat accgcctgaa 780
cttggtatac tgcaattctt ggtatttacg ccgcttattt ggttctgcgt gtgggcaatt 840
ggcgcaacgt gcgaccgttg gttctggcgt tggttttggc acgctggcgt tggatcgctg 900
agcttaatcc ttgcaattcc atttttactg gcattggacg tgctaggtgt accgcgggca 960
atgtacctcg cagaacgaat cgttaaaaca ctggaaatac tacataatgc actctttacc 1020
taaagcagct tcaatgtgga agcgtgaaca gtacgaagaa gctactaaag ctgtacagac 1080
aatgtttaac catattaaga agtcttctga ctttacgtat ggttttgaat acgcgtttaa 1140
aggtatgaat gcgcgtattg ttgtgtcgga tacttacttc acattagtgt gcggcgataa 1200
ccgacattcc gttccccgta acaaagacgc gggggttgtt actaccttta cgggacgtta 1260
aacatggcaa tgagtgtttt acaggtgaaa gtatctgtta tggatactga accaatgagc 1320
gagttgatct caattatttg tggttgggat cgtgataagc ttccggttga gtacaaagac 1380
caactggaag gatgggcaga caaattctta gatggagaac cagatgaacc tgcaaagcct 1440
ggaaaagctg aacagcttgt tgaagcagca cgaagcactt ctacagaaga ttaaaaccat 1500
tcgcgacatt gacatcgagt ttggttttat tcgacgtatt gatgggcatg accacataca 1560
cggcaagctt cgcaacgagc caaagctgac agaacatgtg gtcaatttct ggcatgacga 1620
agcttacgaa attgagaagc agttggaagc tttgggcttc gacgttacgt ccttagaggt 1680
gcgttgcagc ccgccaccgc aacctagcgc tgagtaatct agcttttgaa cgttccaagc 1740
ggtatattaa cactataccg cttttattgt atttaaagga gttagtatgt caaaacgaat 1800
tcaacgcgct aagaaagcaa tggacaactt cagcgcacgt ggtagcaaat gcccaatctg 1860
caaagcacag tttagaacgg gttgcaacca ctcggtaaag caagcggaag aacgcttatt 1920
ccagaactac gtaaaagcaa ttgcggaggg taaataaatg aactgtacta aatgcaactc 1980
ggaaaacacc acaacctgtc gtgcaactgg tcacattatt tgcagaaact gtctctacat 2040
taagcgcgac cacttctcac tgtgcgagca ggaagttatg cttgagcttg aaaagcaaga 2100
ggagcaagca atggaggaat tcatccaagc taagcgtgga gaaatgaaac tcgaccgaaa 2160
gaccgagctt gagcaaatgt ggcaaacgca acgtgctgaa agcgaaccaa tgggcgcaac 2220
aacccgagca atgttactca acgggcagtt tggtaagcat ggttcaatcg ataacaagtt 2280
ctacgaagag cttgctgaac gtaacaaaat tgcaattgca cacatcgaag gtagtgcaga 2340
atcagctgcg caagctttcc gctcactagc taccgcaatg gagaagtgcg ggcatgagtt 2400
agctcagttt gcttatgttg tgaccacaga ggctcgcgat aaccttgtgg cgcaaggtta 2460
ctctccagac atgttcattg ttagtgacag cttcccggat attagtgagg tgcttcctcg 2520
cggtggtgaa gttgtgatta tgggtggtcg cggtggtggt aaaagtggtc ttgttgctga 2580
gttactgaag tgttctattt gtccaaccca taaggtgaaa gcgggtcagt taggtggtcg 2640
cacatccaaa ggagaccgtc gtcgcaaacg tcaacaatgg aatcgcccgc gaggtactaa 2700
ctaatgtttg actggttacg agcttggtgg tgtactcact tcgttgagac gcccgcacgc 2760
gagagtgttt ggtattcaaa cagacacaat tctcgcattg ttatagttga ctgtgatggt 2820
tacaacgtat attacaagtt cgtaaccatc gacgggaagt ctgcaactag cggtgacacg 2880
tacagcgtag ctttatggta tatccgcaaa tactataagg aggttcctgg tcttgcaaaa 2940
ggggagctta gagcatgacg tgttctgcag cattgttacg ctaaaccgct ttacatacgc 3000
tgaacttagc tgtattatgg gtgttagttc agcgcgctta aagcgtgcaa ttaagtctct 3060
tagacaaaag ggcgtactta ttcaaacaac tggtggtggc aagggttcca aaatggaaca 3120
ggaacgcttc cttgaatata aaggacatct accacctaaa caaaagagag gattacatgg 3180
caaccctaac tgaacttcgt gtaaagaaac tgcaagataa agttcgcaac gctcgtgttg 3240
aaatgcaagc tgcggaagag tctttgcaat atgcacgcgc aatggaagac ggtcaaacta 3300
ttaatttagg ttccgcaatt ggtagctttg acatgtctaa agaacagcta gttgcagcag 3360
ctgagaaaac gtacaaggaa aagaaaggtc gttacaatgt aatgtgtaac ggtgttgata 3420
gtttcctaac tggtatgggt atagaactat gattcgtgtt tataagcgta attggttcgg 3480
tatgctgaag tgcattgctg agttcagcga cacctattac cgcattgttg ttagcacggg 3540
tggggtgttg acaattcgtg cagcaaacca ccgcgaaaca accattcttg cactagaacc 3600
taaagaatgg tctattgcta aagtggagga taagtaatgg ctaaagtgac cacaattgtg 3660
tgcgacggtt gcggtgaacc tatcaccaaa gaacgtgaca atgacagcca agcgttaatt 3720
cgtttggttt acccaagtaa gaaccatagt ggtttcgaag ctatggaaac aaacgaccta 3780
tgttccgcgt gttactgtaa agcacaaagc gcggtactgg aaatccttaa acctcaagcg 3840
tggacccttc accctgatgc gcgcctcatg ctagacgtgg agtaatgtgg tcatgcactt 3900
tccaattgaa gactttatta aaaatcgtcg caaggaacta gctgacggtg aacgttacgc 3960
tggcaaccaa ggtgttcgca agggtaagaa accaaccaag aagcagattg atgctttgca 4020
agcgggtcat aaagcgttgc gtgagaagcg acttatgcaa catgaagtta agcgaagtaa 4080
gggttaaatt atggcaattg taaacgaaaa gatgaagcgg ggctttgaag agctctaccg 4140
cattggtgca actgcaaacg tattgcagaa cttcatgcgt gaagatgttg actacactta 4200
cagcattgaa gaccttcgtt caatggacga gctcagctta gagtgtcgaa acgggttcaa 4260
ccttatcaaa cttggtatgc aagaaattat ggttaagcag gaagagcaca tcgagtttct 4320
tggtcgtaag ttaactaagg gcgggggagt gcgcttccct aattcggaag cgttgttagt 4380
tcgtttgaac gcgaacaccg accgcgttgt gtgggagttg acacctgaca cttactatcg 4440
tatgaaaagc gagctagagt cgaaaggctt tccatttgcg attatccctt gcggaactgt 4500
agcggataat ggtacaacta ccgttacaca aggagaatca aatgacgctt aaaccgattg 4560
accacattac acagccgtgc ggacgctctt gccaaagtgc ctgcctcgcc atgcttacgg 4620
gtcaacctgt tgaaaagcta attgaacgtc atcacgcgga cttggagact ggtaatcgcc 4680
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acatgatcat tgtagatgca agggacgctg agaatatccg cgtttatgac cccgcgtcca 4860
attggcgtca atccattaac ccgcaggaaa atgaagtgaa actccgtgct tttgttgttc 4920
gttaccgtgt tgttctagct ccacacttgg gggtgctata atggttcatg ttgtgaataa 4980
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cagcaagcta ggtttagaac ctatcaagct gtttcgtaac cagaaccagt cagctctggg 5100
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cagcatcaat acgtggtgga accaagtgct gaaagctacg ggtgaacacc aagtaccgct 5220
attagcgttc cgtcaaaacc gccagaagtg gcgctttatg gtgtggtcac acatccatac 5280
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gttcaaagcc cgacttgctt atgaagcagt tcaggaaggt ggtgtatgat taatgtgtgg 5400
tatctattcg gtactgtagg cgcgttatta gctgtactcg cttatttcct agttgcctca 5460
tccctttgga atgctactgg tgaacgttac aacctttgta acctaatatc cagtattcta 5520
atgggactga gtttggttgg cgctgctgac caacgtgcac tagttgtaag cgtgggttgg 5580
atggtggtga gcttatatat gctctatcgc ttgaagcgtg aaaggggtaa gctttacgtg 5640
tttgattggg taacacgttt gcgcccaaaa tagctaaaat aagtcttgca tagaattgtt 5700
ccttacatta ttataagggt gttgcttcgg taacaccctt tttttattat tctgcaaagg 5760
acatgaacta tgtttaagcc gatgttagct gcaacagcac agctagacgc actaaatgaa 5820
aacttcttcc aatcaattaa gcttgaaggt gtacgcgcac agttcacacc ggatgaaggc 5880
ttagttaccc gccagttgaa accattcaac aacacaatta tttacgagcg ctttgacgcg 5940
gttgagcgtt actgctatga ccacaatatt atgctcgaag gtgaattcta cgttcacggt 6000
tgggacttta agcgtattga tagttgctgt cgtggtgaag gtaatattga cgcacgccaa 6060
atggagttcc acgtgtttga ctgttgggat cccgagcaac cagatctacc gtttgaacaa 6120
cgttacgagc tttataagca acacgttacc gcactgtgcg cgcttgtggg ccacattgtg 6180
cacgctgtaa tgcaataccc ttacgtaagc gaaaacgacg ctatgcacgc ctacgggtgg 6240
gcaatagagc acggttatga gggtctttgc tttaagcgca aggatctagc gtacaaactc 6300
ggacgctcca ctgttaaaca gggttacttc ctacgcatca aaccagaaaa cccatatgac 6360
ggaattgtgt tagggtttat cgaacgacag cacaacctaa tggaaagtga aaccaatgag 6420
cttgggcagc ttttcaaacg tcaaaacaaa gacatgaaac gtgctgcggg tatggttcaa 6480
aatgcgttgg tgtacacacc tgaaattgat aagatccaca aggttgcaat gacacgtgga 6540
cttacagacc ctgaccgtgc aatgctgtgg gatacgcaag atcaatatat tggttgcgga 6600
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aagtggcgac acgacattca accaacgttc ctcgcacacg atagtggtgc attaatggtt 6720
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ttattacact acgtgaaact attcaatttg gacgcttccg tggttgtact ggtgcggaac 7800
ttatgaaatc tagtgatggt acttcctacc ttgtttggat ttacaacaac acagacatcc 7860
aaattgaatc ttcaattgtt aacacactag ctgcgcatgg tttggtgaaa cttgacgctg 7920
ttcgtaaaaa ccagaaagcg ggtggcgttg ttgaacctga gaaacgtaca cctgttgatt 7980
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tgaacgtcag tgaccacaac tactgtcata cctgtgcttg gcgcatccac aaccacttcg 48840
tcaccagctt ccaacttcat gtcttttgga gctttgtacg tgtacgcctg accaacagcg 48900
ttgccgttgt ggtctttgaa acgcacgtta acagttacgc agttagcagc gacaagggtc 48960
attagagcga tagcagcatt gtttttcata aatcctccgg gatttgtttt ggttgaacgc 49020
ttgtttggta tgggtacata atacagtacc accgcaaata agctagatta cttagttaaa 49080
ttcatatagt gcactgagtt aatacactat agggatttaa ctgtgcgcta tggggtacat 49140
aataccgcac atagcacaca ttactagact aaatcgttaa cacttatcgg tccgcgcttc 49200
agctatacct tcaccaccgt tactatagga actttcgcgg agtaggttga tcattaagcg 49260
acactgagcg ttatctttac catcaaagta gaaataacca gtgtggtcac ctgtagcttt 49320
aaactgtaac cccgtttcaa gtaggtcggt aatcaggata tcctgcggac cccacgaatc 49380
agtcttgcgt gcaagcactt cctgtcggtc tagctcgcgt gctttaaaca cagcaatttc 49440
agcagactgt tcagattgcg ttaacgacgc gacacgtgca tgatcactag cgtctaacag 49500
ttttggcata gctgtggcag ctagtacacc aaggatgata ataacaatta ccagttcgat 49560
aagggtaaaa cctttattag atttcatctt tcttctcctt tggaggaaca atatcaagtg 49620
ttggtgactt aggcttagta acaagcgcgt cttccaactt ctcacggtct tccatactaa 49680
ggtctttgaa acccttagca attagtgacg gggtaaactt aacagccttg tcaattacgt 49740
gctcaggtag gtctgggcgt agcaattcga acacagtagg atcgagcttg gtttcttcac 49800
cgcgcacata cttgagcaca taacccgcac ctagttcgtg cttgttagta ccgtttttag 49860
cgtcagggaa catcttctca gcaatttgct tacgctgttc catttccaca gttttaagct 49920
ctttcagcaa agcttggttc aacgaccatg cgtggatcat ttggtcgttt gtcatgtcag 49980
gtgtaaagtg agcaatctta ttgttcatca gggctctccg gtgcttcagg ctcagacata 50040
ggtggaaccc acgtaggcca atctgtttta agggtgcgac gaattacatc cgcgctgtgt 50100
tccatggtaa tcgtatcaaa ccagtcaata ccaccaccag tataaacatc caagtccatt 50160
gcgatttcaa tagcttcaac cgcagaacct ttcatagcca ttgcaccaag tgcaaactga 50220
cccccgctac caatagcggt acgtttttcg tactcgcgtt ccatgtgacc acattggtta 50280
tccggtccgc ggaaacctgt gtaaatcatg tttggaagtc ctggagttac gcgaacagct 50340
aaaacagtga agtcaccgtc aggcactgaa aagcgttgct cagtagcaat ctcacccaca 50400
gcccaatcaa caacttcgat aaagcttggt gcattacccg caacagtcag cactagaccg 50460
tagtcagggt agaagtaaag cttacgcgca aagcggtcgc tcgcatggtt gttggaagtc 50520
acttgcttat ccgtagcaaa caacttaccg tcaaaggctg ctgtggtcat tatagacgct 50580
ccaaagcttt ctcaagcaaa tctaggttct taaaattacc agttacacgc tgaccgttct 50640
tggttgcgta gtaaccgaac ttgctacgtg aaacggagta cgtaaccccg ttcgcagtaa 50700
tatgactagc taacttagcc aaggtcagcc tccttcacaa atgtaccgtc aatccattta 50760
ccaccacgat ctttaatctc atcgtaggca gtctccagag ctaactcagg ggtaacttcc 50820
attgcagcac acatggtaaa cagcaagctg aagaagttaa tgagtggttg tttaatatcg 50880
cgcttacgac caaccgccgc agctagtgca ccatgtgcag caaccaaacg acagaacgtc 50940
aagcccgcat cgtcgtcagg gtcacgtagg tacacgcttt ccatcaattg cacagggtct 51000
aaaccggaca tgtgcgcttg gataatacca acaaccgtct gatcaccaag gtcgtcaagt 51060
acagtaacag cttcaccttc agctagacgt acaaggttag cagcaaactc accctgctct 51120
tcttcacctt ttacttgctg cgaaacaagc gtagcgccac caacaaaacc acgagcgtca 51180
gcccaagcaa caacctttac aattagttcc gcaagttgcg gagtagatac attagacaca 51240
ggaaacccct tttgtgtgtt tgtttattaa gtgtgtatat aataccccgc gaacggggta 51300
tatgctagac tactcgccca aatataaata tgcttcacat cgagcttggt acttgtcacg 51360
catttccttc ttagtgaaag aacgaataac gtccatagct tccaagtgac gtaaagctgc 51420
gttaatgtgg tcttcaacac cgcgaccacc agtatccgcg aacaacttgc ttcgaccaac 51480
actgcgaaca attgcagcac gactcaccaa gccatcgcga tgtaactctt ctttgtatac 51540
ccgcttcaag ctacttgtta gagctgcata aggttgctca acaaacttct gcataacact 51600
agcaataagc tcggcgcgac gttgtgttgt accgtccatt gtaaccttac cactctgaac 51660
agcatcccag acaaggtggt tgtgacgtag cacatagtcc caagcccagt tcatatgctg 51720
ctcgcaaacc ttaggcatgg tagggttatc catcaccgca agcaatgcag atatcttcat 51780
taccttcagg ttagtacgtg tccatgttgc gttccaagca tgggacgtat tttgttggtt 51840
caccatgtcc gtacagtaac gcgacagtgt gcggaacttt tcagaaatgt ccggaggtag 51900
cgcaatcggc ataacgtcca catggtttgg gtcacgcaat gcagagctca tacaaagcac 51960
agcgttagtc atgtggtcaa ttagagcggg actaggtcgc acacccttat caatgttatc 52020
gtatggcact tccccactaa actctgagaa gataaagcgc gatacaaaac cgtcaccaaa 52080
cgcctcttcg tttagacagt cgtagaacgt ttctggtaca cattctccaa ggaagctata 52140
agcaaccgca tggttaatgt taaccgtttt gtccatgtcc gtgtagcgaa caccacctag 52200
cacatcatac gcaccagact tagagtacgt ttcaaccata agatcacgca cagtacgggt 52260
agaaccgtca gggtttacca ttgcacggaa gtgattacca aactctgata aagcgtgcaa 52320
gaaagatgta ttctcttgga acactttcat catagagtta cggtgggtaa aggcttcact 52380
aaccacaaac ttgcttgcat caattacgcc ttgctcacgc tccaacaggc gcataaactc 52440
ttgaggtgct gctgttagct gtgacttacc agtaccggac ggagccaaca ccataaagta 52500
gttattgaga cccgttccgc taatgttgta agcgcgacca aacaaaccag acgcaaggga 52560
tagggcttct gcaatagcaa actccttaat ctgcttcaca cctgtgttgt aaaagtgctt 52620
cgcaagttcc cccatccatc caggcgggta ttgaagcttc ccttggagcg gtggcatctg 52680
gtactttggc tcagcgttac ccgtttgcgc gttggtattg cgcttcgcgt gtaactcttt 52740
tgcgagttta gcaccttcct cagcgtgggc tttgcgtaac tcttcgtctt tcatgttctc 52800
agtcgccgct tgtttaatag ctaagtgtaa cagacggtcg cttccaacat ggttgcgctt 52860
ctcgtgctgc ttcttacggt tgccgggata gcgaagctca agattagcaa gtgcagacat 52920
gcgccacaag cgtttacact gttcaatgtt gcgtgtgtag tacgttacaa ttgtcataaa 52980
cgcactgtca gcacgcgagg catcaaacac atccacgcca tgtgcaccct gctgcttcat 53040
aatctcaagg tacttgtccc aatcacccgt cataaggcat tcaaacttac cactgtggtc 53100
atatgcgtaa acctcagtaa gcaaatcagc atcgctcatc ttctcaggtt catcaatgtc 53160
cgcaatgttg tctaccttac gggaattcga gatatattgg ttaaactgat ctataagtcc 53220
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cttggagtat aactctagtc caccacgttt gtatgaaccc gcaatctcac ctccaaacca 53340
taagtgatag cccccaccgg aacgggaagc ctccgtatag gtttggtaag actgcacagc 53400
attccaccat tgctcagtag cttcaacacc agtatcatcg ccaatatcaa tgtccgctac 53460
tgtgaacccg tcaccctgtg taaggacaaa gccaaacccg cgttcagggt gttgctcaag 53520
caagggtaaa agttcttcat aactaactag cttattgtgg tcactagtta ccgaaatcgg 53580
gacgaactta ccgtccacat aagcaaacgg agccttagcc atcccgccgt caaactctgt 53640
gcctgtaaag caccaacgac gcagcttctt cagctgccaa ggcatatcca tctacttaac 53700
ctcgcatctt aatccaagct tgaataaact ccatcatgtc atcagtacgt ttccagtacc 53760
aagagttgcc aatcttaaat cgaggatact tgcgaagctt gttagtaacg ctaacagggg 53820
taacatcaac catctggcaa atgtcagcaa cggaaatata gagggcgtta aataactcct 53880
ggccatcata cttctcgcgg atgaatgtta gcatgtcttg ttcgctcatg ctcggcattg 53940
ccatgtcaga acccatacca cgctcgaacg gttgttccgt tgtacctact acattattgt 54000
ttacagctac cattgtttgt tcctctttgc gttcaatgta tgcgctttat tatatgcata 54060
cgcctttaat taacaagaca accctatact ttattgtgac cacatacctg tcagctataa 54120
gcaatgcgta gagtaccggc tatgctttat aatacttgtc tttacaatgc acagagtacc 54180
tgcctggcaa gaccatgcgc tttactaata atgtgcagag tattgggact gcgtatacgg 54240
gttgtgcttt atatattatg tgcagagcac tggtactaca agacatagct tattgaaggg 54300
taactgaaag tgtgtattat agctaataag cagagtttat gtttattgcg ttactttctg 54360
ttgggaatat agtttgctgt tcttagctat atatagcgca ctgctagaag gtctactgag 54420
tgtatatagt taatagatac aacttacttc taataaaaaa gtagtgcgca attcaggggt 54480
cgaataccca atcgcatgta cactaacttt gttatgtaaa acagtaactt accccaagtt 54540
accaaagtta ccaaaaaaac gaaggggggg gggatctgtg gatatctcta ggcccctcaa 54600
aactgtgcca gttgcgcact actttctagt ccaactagta gtaaaataaa agcatctaat 54660
agtaaattaa agttccaata aataaaatat ataataataa taataatgtc ttttaattta 54720
actactatat atatatgctt tattaagaac aattcaattg gtattactat ttaagtgttt 54780
taacggactt aatgctagta gtgtgcaaaa aagttgtgcc acttgtgcaa aaatggcttg 54840
actttgggta acaactagta atagcaatat atagtaacct taatttcgga ctcagtttga 54900
cgagttgtct gacaaacgca accaaaaagg tatttgaacg atgaaagtag caacaattga 54960
atataaagac gtagagccgg ggatgaacca atatctgaaa gttgttcgcg aaacgcccat 55020
cggtgaaacg cccacaggcg gaggtgaaac gccctgcaat gattctgtgc aatacggtgt 55080
ctatccgcaa atcaaattcc tgcgctttgc agaacgattt gaaatactag agcacgacat 55140
gggtacggtt ccttatgaac tcattgagca agggaattac tttggcgcag aagttgatat 55200
gtacgttagc ccagagcttt tggatttgct gcacgcttac aaaagagacc atgttgaaca 55260
tctaaaacaa caatgggcaa tggaaataaa caacgttaca gtcgcacaag gcaagttacg 55320
acgcgccaaa gaacaaattg aaacattgaa atggggttgc ataacattgg cagttgttgc 55380
gtcggggacg gttgcggcac ttggctatgt ggtcacacga atttaaaaaa ctggcaaatg 55440
aaaaaactgg cggttcgcta tagccagaag actggcgagc cgttgccttc cctctgatta 55500
cctttcttta gctgttttag attatatttc tttagaagtg tgatgtgcag cgatatcccg 55560
accgcacccc gaaaaggtgt acattgcgaa tagcttggct cgcaagattc cgagtcgctg 55620
tatgcgcgtg tgcgcggctt tgtgcgctga tcaatgcaat ggtattggct agggtgctaa 55680
agtggcccac acgcgatttt agcgtgcttc attcggggta gctgcattta tatatagtgt 55740
gcgtgcgcgg ttacactagg taaagactaa aagcaaggat tatatcaccc gtttagttca 55800
ttaattcatg ataatgcgac attgcgcaca cttttaaacg gattgtgact tttttggtat 55860
ttttcgcaaa aattcgcttt acaggtgagt gaatatttcg cagtatgtac acacagcaac 55920
ggggtacagc aataaagcaa aaccccacta tataaaaggt aatattatgt ctaaactaac 55980
aactacttca gcagttcgtg cacttcgtaa agcagctaaa tcagcaggtg ttcaagttgg 56040
tcgaatcgca atcagtgacc gcaccgaagt cggccttatc gacaacacca ccaaaatgtg 56100
gtcaggtcgc gttcagctgc actggtgcaa gggtagcgtg gaactaatgc agcgttattt 56160
agaaaacact aatttagttc ttaatgctcg accatgcggt gacggtcact tctctgtgtc 56220
tgttaacgta gcgtaacagg gttgttatac agtgcgccct acggggtgca ctaataacca 56280
tcttgttaat aatacctaaa ggggtaattc actatgtcaa ctatcaaaac atacgctaac 56340
aaatctggtc taatcaaagc gcttcgtcgt gcgggtgttg cggacgctga ccacatgcca 56400
cagcaaaacg ctgagggccg ttggttccaa ggaactccga aggtcgtcat tcctaacgtt 56460
gttaactcgg ttgctgtgct gcgtggtgta gcattaccat gcgaagcacc taaaacggtg 56520
aagctatttg gtcgcggtat caagattgag aaaaaccgtg aagagaagaa tggcatcaaa 56580
cgacctagcg taggcggtgc gtgtcgcgct gtgtgggacg aatgtgaccg catctatgct 56640
gaaacgggtc tagtaccaat gccgaagcag cttaaagcgt gggcgcgtga ggtgggtgct 56700
aacgaaaaca acgcagtcat cgagctgtac gtgtggcgca agtttgaggg tcacactaaa 56760
tctaaagctt aatgtgccgc tttctggtgc gcatggttct aatcgctgta ctgtgcgcgc 56820
taatcccaat agcagcttat ttcttcataa tcttattatt tatggttcgt aaaccggagt 56880
cttaattatg tcacgtatca ctaaaaacga cctagaaatt gcaattgata atattaaccg 56940
cttgctcgcg cttaaaaaca gcgacacgcg cttccagcgt ggtgctgaaa acggtatgca 57000
ccacgttaaa gaatttgtca acggtcagta ccgttgtaat cgcagtgtgg gcacagctcg 57060
cgaagtgcat acatggttat gcggtgttca atacggttta acagcttaaa ggggtttatt 57120
atgccaaatg ttattaacgt tgaaaatcgc atcgaggttc gcgattggtt cactgcacaa 57180
cttaaagtgc aaggcatctc ttattgcaga ctgtacagca ataaagctcc caagcatcca 57240
aaagctgtac acgggtatcg tatgaagtat tacgccgtaa agcgtgacaa acacaaaaac 57300
gtaccaattc ttactcgctt ggaatttatc aacgctaaat ctcgcgcggt tggtatacct 57360
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attgtccctg taagcgactg tgcggttgat tgaccttcac cttgctctta gtattgatct 57480
tgcgctaacg tcgcaaatca acttatccac agaagttcaa ggtgcgcgta cagcgaattc 57540
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agtacatacc aaacggggta acacacaaac ttatcggaga tttattatgt cactttcagc 57720
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caacactgat gaatttacaa tcggggtgga ttacgcatgt taacactatt gttctttata 58020
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atgatgagga aaccctactt gatgatgtgt ttaacagtat cgaggtgtgc tgtacgggtg 58260
cgatgaggca ccgcgtgagt gacatggtga ccacgtgggt gctgtgcgac agcttactaa 58320
cactcgagga ccatagtggt ctactgttca tacattacac aacaggtgag gaagtggacc 58380
gacctgcata actatgcact aagcaataac cataccaaca aagcacgctt cggcgtgctt 58440
tttttgtcga tgtcgttagc tattgttctt attgtgaaca acagctttat gctgtgcgta 58500
cagcgatccg ttcattgtgg aagtattcgg tgtacatgcc ccgaaggggt ggggggtgcc 58560
acgatgggcg gctttttatg gaggccggag atgccgcatc gattatttat ttcctcagat 58620
atgtttcacc ctgtatatac atacagtatg accgatgtac agcttatcga tgtgtgtaca 58680
gctttgaggg gtatatcata ctcttcggtg tacatagggc gatgacctgg acgtgccgcc 58740
gggggcccga tgatcgtcga caatatatgt cggccgagat ggtgacaact ttatccgccg 58800
tccaaaaaga tttgaggttt tagaatgttg tctagtaatg tgctgcacac tttgtataat 58860
gtacatactt tctgcaacaa cataaggtct acatgatgga aatagctaac gaagaagtgc 58920
ttcaatacat tgagtggtat gaagcaacat accctgaata tgatcagtgg 58970

Claims (3)

1.一种以保藏号KCTC 13029BP保藏的肌尾噬菌体科噬菌体Vib-PAP-5，其特征在于，
其具备特异性杀灭副溶血弧菌的能力，并具有用序列号1标示的基因组。
2.一种用于防止副溶血弧菌感染及治疗副溶血弧菌感染的组合物，其特征在于，
以权利要求1所述的噬菌体Vib-PAP-5为有效成分包含。
3.根据权利要求2所述的用于防止副溶血弧菌感染及治疗副溶血弧菌感染的组合物，其特征在于，
所述组合物以制造药浴剂或饲料添加剂的用途使用。
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