CN113490849A - 使用感染因子快速检测李斯特菌属的方法和系统 - Google Patents

使用感染因子快速检测李斯特菌属的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于快速检测样品中的微生物诸如李斯特菌属的某些种的方法和系统。还公开了经遗传修饰的噬菌体，其在晚期基因区中包含指示基因。噬菌体诸如李斯特菌属特异性噬菌体的特异性允许检测特定微生物，诸如李斯特菌属的某些种，并且指示信号可被放大以优化测定灵敏度。

Description

使用感染因子快速检测李斯特菌属的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年1月29日提交的美国临时申请第62/798,248号的优先权。美国申请第13/773,339号、第14/625,481号、第15/263,619号、第15/409,258号的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及使用感染因子检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。
发明背景
人们对提高生物、食品、水和临床样品中细菌、病毒和其它微生物的检测速度和灵敏度有着浓厚的兴趣。微生物病原体会导致人和家畜的大量死亡，以及巨大的经济损失。此外，微生物检测是美国食品和药物管理局(FDA)、疾病控制中心(CDC)以及美国农业部(USDA)的高度优先事项，因为摄入被某些微生物，例如李斯特菌属的某些种(Listeriaspp.)、沙门菌属的某些种(Salmonella spp.)或葡萄球菌属的某些种(Staphylococcus spp.)污染的食物会导致危及生命或致命的疾病爆发。
特别地，已知李斯特菌属的某些种会引起潜在的严重感染，李氏杆菌病。李斯特菌属的某些种，诸如单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)通常通过摄入受污染的食品传播。单核细胞增生李斯特菌是革兰阳性细菌，通常与食品(包括但不限于牛奶、海产品、家禽和肉类)污染有关。食源性疾病，诸如李氏杆菌病，可以通过在消费者购买之前检测受污染的食物来预防。
用于检测细菌的常规微生物测试依赖于非选择性和选择性富集培养物，随后涂铺在选择性培养基上，并进一步测试以确认可疑菌落。此类程序可能需要长达七天的时间。例如，用于检测食品中的李斯特菌属的某些种的传统测试复杂而耗时，需要24-48小时的富集期，随后是额外的冗长测试，总检测时间为5-7天。已经研究了多种快速方法并将其引入实践中以减少时间需求。然而，这些方法都有缺点。例如，聚合酶链式反应(PCR)测试，其也包括扩增步骤、因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；但在经济上仅限于小样品量。对于稀释的细菌悬浮液，大多数小的子样品将没有细胞，因此仍然需要纯化和/或长时间的富集步骤。
常规生物富集所需的时间取决于样品中靶细菌群的生长速率、样品基质的影响以及所需的灵敏度。由于培养需要时间，这些方法可能需要长达8天的时间，这取决于待鉴定的生物体和样品来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水或其它产品可能已经进入牲畜或人体内。另外，抗生素耐药性细菌的增加和生物防御考虑使得快速鉴定水、食品和临床样品中的细菌病原体成为全球范围内的关键优先事项。
因此，需要更快速、简单和灵敏地检测和鉴定微生物，诸如细菌和其它潜在致病微生物。
发明内容
本发明的实施方案包括用于检测微生物诸如李斯特菌属的某些种的组合物、方法、系统和试剂盒。本发明可以以多种方式实施。
在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含插入噬菌体基因组晚期基因区内的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是经遗传修饰的李斯特菌属特异性噬菌体基因组。在某些实施方案中，重组噬菌体包含经遗传修饰的噬菌体基因组，所述基因组来源于特异性识别李斯特菌属的某些种的噬菌体。在一些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性感染一种或多种李斯特菌属的某些种。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在存在其它类型细菌的情况下区分李斯特菌属的某些种。在一些实施方案中，重组噬菌体特异性识别单核细胞增生李斯特菌。
在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因可被密码子优化，并且可以编码产生内在信号的可溶性蛋白产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还在经密码子优化的指示基因上游包含非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，所述指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，诸如刺虾(Oplophorus)萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者其可以是基因工程基因，诸如
Figure BDA0003183463990000031
本文还公开了制备重组指示噬菌体的方法。一些实施方案包括选择特异性感染目标致病细菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化到目标致病细菌中；用选择的野生型噬菌体感染转化的目标致病细菌，从而允许所述质粒/载体与噬菌体基因组之间发生同源重组；以及分离重组噬菌体的特定克隆。在一些实施方案中，所选择的野生型噬菌体是李斯特菌属特异性噬菌体。
在一些实施方案中，制备同源重组质粒/载体包括确定所选噬菌体基因组的晚期区域中的天然核苷酸序列；注释所述基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计用于在所述主要衣壳蛋白基因下游进行同源重组的序列，其中该序列包含经密码子优化的指示基因；以及将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中。设计序列的步骤可包括在经密码子优化的指示基因的上游插入包含非翻译区的遗传构建体，所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，所述噬菌体晚期基因启动子是外源启动子，不同于噬菌体基因组中的任何内源启动子。因此，在一些方法中，同源重组质粒在经密码子优化的指示基因上游包含非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
本发明的一些实施方案是包含本文所述重组指示噬菌体的组合物。例如，组合物可包含一种或多种野生型或经遗传修饰的感染因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可包含至少一种重组噬菌体的混合物，用于检测微生物诸如李斯特菌属的某些种。
在一些实施方案中，本发明包括检测样品中目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：将所述样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含插入噬菌体晚期基因区的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物，并检测所述指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在所述目标微生物。
在制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案中，野生型噬菌体是李斯特菌属某些种的特异性噬菌体，目标致病细菌是李斯特菌属的某些种。在一些实施方案中，分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离显示指示基因表达的克隆的限制稀释测定(limitingdilution assay)。
本发明的其它方面包括检测样品中的细菌诸如李斯特菌属的某些种的方法，该方法包括以下步骤：将所述样品与来源于李斯特氏菌特异性噬菌体的重组噬菌体一起孵育的步骤，以及检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明李斯特菌属的某些种存在于样品中。在一些实施方案中，本发明包括使用来源于靶向李斯特菌属的某些种的噬菌体的重组噬菌体检测李斯特菌属的某些种的方法。样品可以是食物或水样品。在一些实施方案中，样品包括环境样品(例如，用于在工厂和其它加工设施中进行细菌监测的表面或设备的海绵和拭子)。
在用于检测细菌的方法的一些实施方案中，样品首先在有利于生长的条件下孵育24小时或更短、23小时或更短、22小时或更短、21小时或更短、20小时或更短、19小时或更短、18小时或更短、17小时或更短、16小时或更短、15小时或更短、14小时或更短、13小时或更短、12小时或更短、11小时或更短、10小时或更短、or 9小时或更短、8小时或更短、7小时或更短、6小时或更短、5小时或更短、4小时或更短、3小时或更短或者2小时或更短的富集期。在一些实施方案中，在检测前不富集样品。在一些实施方案中，得出结果的总时间短于26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。在一些实施方案中，通过检测指示剂产生的信号背景比为至少2.0或至少2.5或至少3.0。在一些实施方案中，该方法在食品安全行业的标准尺寸的样品中检测少至1个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个特定细菌。
其它实施方案包括用于检测李斯特菌属的某些种的系统和试剂盒，其中所述系统或试剂盒包括来源于李斯特菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。一些实施方案还包括用于与指示剂反应以检测所述重组噬菌体表达的可溶性蛋白产物的底物。这些系统或试剂盒可包括针对本发明的噬菌体、组合物和方法描述的特征。在其它实施方案中，本发明包括与根据本发明的方法或系统一起使用的非瞬态计算机可读介质。
附图说明
通过参考以下非限制性附图，可以更好地理解本发明。
图1描述了根据本发明的一个实施方案的指示噬菌体构建体，其示意了包含萤光素酶基因、噬菌体晚期基因启动子和核糖体结合位点(RBS)的遗传构建体插入噬菌体的晚期(III类)区域。所描绘的启动子是除了内源性晚期基因(诸如主要衣壳蛋白(MCP)的基因)上游的内源性晚期基因启动子之外并与其分开的启动子。
图2显示了噬菌体LMA4的基因组，噬菌体LMA4是从污水中获得的肌病毒(与李斯特菌噬菌体LMTA-94相关)。与假定的前头部蛋白酶p85蛋白同源的假定的基因位于cps的上游，cps是晚期基因区内的主要衣壳基因，由编码病毒体蛋白的结构基因组成。在cps之后，是转录终止子，其后是LMTA-94尾鞘蛋白(tsh)的同源物。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，只要使用晚期基因启动子和/或其它类似的控制元件，插入该区域的任何基因都可以预期具有相似的表达水平。
图3显示了两个携带萤光素酶基因的同源重组质粒构建体设计，所述萤光素酶基因用于构建具有约数百个碱基对的匹配噬菌体序列的重组噬菌体，所述匹配噬菌体序列位于插入位点的上游和下游以促进同源重组。
Figure BDA0003183463990000061
萤光素酶被插入到pCE104革兰氏阳性穿梭载体质粒主链中，其上游非翻译区包含专用噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。pCE104.HR.A511.NanoLuc.v2用于构建了Pecentumviruses A511、LMA4和LMA8的重组体。pCE104.HR.LP-ES1.NanoLuc用于构建人疱疹病毒(Homburvirus)LP-ES1。每个构建体由500bp的同源序列、萤光素酶基因和对于pCE104.HR.A511.NanoLuc.v2为约258bp下游、以及对于pCE104.HR.LP-ES1.NanoLuc为约500bp下游的匹配序列组成，所述同源序列由主要衣壳蛋白基因(cps)的片段和随后的晚期基因启动子组成，所述晚期基因启动子是除了噬菌体基因组中主要衣壳蛋白上游的内源性晚期基因启动子之外添加的。所有重组体都使用了p100病毒晚期基因启动子，而不是T4晚期基因启动子。
图4描述了根据本发明的一个实施方案，使用经修饰的噬菌体检测目标细菌的过滤板测定，其中将细菌和重组噬菌体在过滤板上孵育，并且在产生子代噬菌体后，直接检测指示蛋白，而不去除孵育介质。
图5A和图5B显示了来自李斯特菌属检测测定的实施方案的数据，所述检测测定使用对李斯特菌属特异的重组噬菌体，使用10mL添加的培养基(5A)或90mL添加的培养基(5B)检测加标海绵中的李斯特菌属。
图6显示了来自李斯特菌属检测测定的实施方案的数据，所述检测测定使用对李斯特菌属特异的重组噬菌体来检测环境表面拭子海绵样品中的李斯特菌属。
具体实施方式
本文公开了对检测测试样品(例如，生物、食物、水和环境样品)中的目标微生物诸如李斯特菌属的某些种表现出惊人的灵敏度的组合物、方法和系统。在微生物可能潜在繁殖的最短富集时间内进行的测定中，使用经遗传修饰的感染因子可以在比以前认为可能的更短的时间内完成检测。同样令人惊讶的是，使用潜在的高感染复数(MOI)或高浓度的噬斑形成单位(PFU)与测试样品一起孵育的成功。这种高噬菌体浓度(PFU/mL)以前被认为在细菌检测测定中是有害的，因为它们被认为会导致“自外裂解(lysis from without)”。然而，高浓度的噬菌体可以促进发现、结合和感染少量的靶细胞。
本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可以包含用于检测微生物如李斯特菌属的某些种的感染因子。在某些实施方案中，本发明可以包含含有重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有插入噬菌体的晚期基因区内的指示基因。在某些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生。在某些实施方案中，指示基因可以插入噬菌体的晚期基因(即III类)区域。噬菌体可源自李斯特菌属某些种的特异性噬菌体，或另一种野生型或工程化噬菌体。在一些实施方案中，重组噬菌体由LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A噬菌体中的至少一种构建。
在一些实施方案中，本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可包含至少一种重组噬菌体的混合物，用于检测微生物诸如李斯特菌属的某些种。
在一些方面，本发明包括用于检测目标微生物的方法。该方法可使用感染因子来检测目标微生物，诸如李斯特菌属的某些种。例如，在某些实施方案中，目标微生物是李斯特菌属的某些种，并且感染因子是特异性感染李斯特菌属的某些种的噬菌体。因此，在某些实施方案中，该方法可包括通过将样品与感染目标细菌的重组噬菌体一起孵育来检测样品中的目标细菌。在某些实施方案中，所述重组噬菌体包含指示基因。在某些实施方案中，可将指示基因插入噬菌体的晚期基因区域，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致指示蛋白产物的产生。该方法可包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在一些实施方案中，指示蛋白是可溶的。
在某些实施方式中，本发明可以包括系统。该系统可包含至少一些本发明的组合物。此外，该系统还可包含至少一些用于执行该方法的组件。在某些实施方案中，该系统被配制成试剂盒。因此，在某些实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中的目标微生物诸如李斯特菌属的某些种的系统，其包括：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起温育的部件，其中所述感染因子包含指示剂部分；和用于检测指示剂部分的组分。在其它实施方案中，本发明包括与所述方法或系统一起使用的软件。
因此，本发明的一些实施方案通过使用基于噬菌体的方法来扩增指示细菌存在的可检测信号，从而解决了这一需求。在某些实施例中，检测到少至10个细菌。本文应用的原理可以应用于多种微生物的检测。由于微生物表面上有许多感染因子的结合位点，在感染过程中产生后代的能力，以及编码的指示部分的高水平表达的潜能，感染因子或指示部分比微生物本身更容易被检测到。这样，本发明的实施方案甚至可以从单个感染细胞中获得巨大的信号扩增。
本发明的一些方面利用能够结合特定微生物的结合剂(诸如感染因子的结合组分)的高特异性，作为检测和/或定量样品中所述特定微生物的手段。在一些实施方案中，本发明利用了感染因子诸如噬菌体的高特异性。
在一些实施方案中，通过与目标微生物特异性结合剂缔合的指示部分实现检测。例如，感染因子可包含指示部分，诸如编码可溶性指示剂的基因。在一些实施方案中，所述指示剂可以由感染因子诸如噬菌体编码，并且所述噬菌体被指定为指示噬菌体。
本文公开和描述的本发明的一些实施方案利用了单个微生物能够结合特异性识别剂诸如噬菌体的发现。在噬菌体感染和复制后，可通过噬菌体复制过程中表达的指示剂部分检测后代噬菌体。该原理允许基于微生物表面受体的特异性识别来扩增来自一个或数个细胞的指示信号。例如，通过将少至10个细菌细胞暴露于多个噬菌体，此后允许噬菌体扩增以及复制期间编码的指示基因产物的高水平表达，指示信号被扩增，使得细菌可检测到。
本发明的方法和系统的实施方案可以应用于在多种环境中检测和定量多种微生物(例如，细菌)，包括但不限于检测来自食物、水和商业样品的病原体。本发明的方法快速提供高检测灵敏度和特异度。在一些实施方案中，在噬菌体的单个复制周期内检测是可能的，这是意想不到的。
定义
除非本文中另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交结合使用的命名和技术是本领域熟知和常用的术语。除非另有说明，否则已知的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如在贯穿本说明书讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或本文所述的。本文所述的实验室程序和技术中使用的术语是本领域公知和普遍使用的术语
除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义:
如本文中使用，除非另外特别指出，否则术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”可以指一个/种或多个/种。
除非明确指出仅指替代物或者替代物是互斥的，否则术语“或”的使用用于表示“和/或”，尽管本公开支持仅指替代物以及“和/或”的定义。如本文中所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括设备、用于测定该值的方法的误差的固有变化或样品之间存在的变化。
术语“固体支持物”或“支持物”意指提供生物分子可以结合在其上的基底和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，诸如微量滴定板或多孔板)，或者固体支持物可以是过滤器、阵列或移动支持物，诸如珠粒或膜(例如，过滤板、胶乳颗粒、顺磁性颗粒或侧流条)上的位置。
术语“结合剂”是指能够特异性和选择性结合第二(即，不同的)目标分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，作为氢键合、范德华相互作用或静电或疏水相互作用的结果，或者其可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物结合(即，共价或非共价结合)的结合剂。
如本文中所用，“分析物”是指被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可以与结合剂相互作用。如本文中所述，术语“分析物”可以指目标蛋白质或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可能没有生物效应。分析物可包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报告分子”或“指示剂”或“指示部分”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，指示部分可包含可用于将底物转化为可测量产物的酶。指示剂部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶)。或者，指示部分可以是可定量的放射性同位素。或者，指示部分可以是荧光团。或者，可使用其它可检测的分子。
如本文中所用，“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括一种或多种细菌病毒。在本公开中，术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”包括病毒，诸如分枝杆菌噬菌体(诸如用于TB和paraTB)、真菌噬菌体(诸如用于真菌)、支原体噬菌体，以及任何其它指能够侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微观活生物体并使用它们来复制自身的病毒的术语。这里的“微观”是指最大尺寸为1毫米或更小。噬菌体是自然界中进化的利用细菌作为复制它们自身的手段的病毒。噬菌体通过将其自身附着在细菌上，并将其DNA(或RNA)注入该细菌，诱导其复制噬菌体数百次甚至数千次来实现这一目的。这被称为噬菌体扩增。
如本文中所用，“晚期基因区”是指病毒基因组中在病毒生命周期晚期转录的区域。晚期基因区域通常包括表达最丰富的基因(例如，组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因同义，包括具有结构和组装功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中例如从感染后8分钟转录直至裂解，I类(例如，RNA聚合酶)早在从4-8分钟开始转录，II类从6-15分钟开始转录，因此II类和III类的时间安排重叠。晚期启动子是天然位于这种晚期基因区并在其中具有活性的启动子。
如本文中所用，“用于富集的培养”是指常规培养，诸如在有利于微生物繁殖的培养基中孵育，并且不应该与“富集”一词的其它可能用途相混淆，诸如通过除去样品的液体成分以浓缩其中包含的微生物来富集，或者不包括常规的促进微生物繁殖的其它形式的富集。在本文所述方法的一些实施方案中，可以采用培养富集一段时间。
如本文中所用，“重组”是指通常在实验室中进行的遗传(即，核酸)修饰，以将原本不存在的遗传物质聚集在一起。该术语可与本文中的术语“经修饰的”互换使用。
如本文中所用，“RLU”指的是由光度计(例如
Figure BDA0003183463990000111
96)或类似的检测光的仪器测量的相对光单位。例如，通常以检测到的RLU为单位报告萤光素酶与适当的底物(例如
Figure BDA0003183463990000112
与NANO-
Figure BDA0003183463990000113
)之间的反应的检测。
如本文中所用，“得到结果的时间”是指从样品孵育开始到产生结果的时间总量。得到结果的时间不包括任何验证性测试时间。生成结果后，可随时进行数据收集。
样品
本发明的方法和系统的每个实施方案可以允许快速检测和定量样品中的微生物。例如，可以在缩短的时间周期内进行根据本发明的方法，并得到优异的结果。
本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，作为食物或水传播病原体的细菌细胞。
样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样品可包括环境材料，诸如水样品、来自空气样品中的过滤物或旋风收集器中的气溶胶样品。样品可以是蔬菜、肉、鱼、家禽、花生酱、加工食品、婴儿配方奶粉、奶粉、茶、淀粉、鸡蛋、牛奶、奶酪或其它乳制品。
在一些实施方案中，样品可以直接用于本发明的检测方法，而无需制备、浓缩或稀释。例如，可以直接测定液体样品，包括但不限于牛奶和果汁。样品可被稀释或悬浮在溶液中，所述溶液可包括但不限于缓冲溶液或细菌培养基。可通过在液体中绞碎、混合或浸渍固体而将固体或半固体样品悬浮在液体中。样品应保持在促进噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH范围内。样品还应含有适当浓度的二价和一价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和Ca2+。优选地，在保持样品中包含的任何病原体细胞的活力的温度下保持样品。
在检测测定的一些实施方式中，在保持样品中存在的任何病原体细胞的活力的温度下保持样品。例如，在将噬菌体附着于细菌细胞的步骤中，优选在有利于噬菌体附着的温度下保持样品。在其中噬菌体在受感染的细菌细胞内复制或者裂解这种受感染细胞的步骤中，优选在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度下保持样品。此类温度至少约为25摄氏度(C)，更优选不高于约35摄氏度，最优选约为30摄氏度。
检测可包括各种合适的对照样品。例如，可将不含噬菌体的对照样品或含有噬菌体不含细菌的对照样品作为背景信号水平的对照进行分析。
指示噬菌体
如本文中更详细描述的，本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可包含用于检测病原微生物的感染因子。在某些实施方案中，本发明包含重组指示噬菌体，其中噬菌体基因组被遗传修饰以包含指示或报告基因。在一些实施方案中，本发明可包括含有重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有掺入噬菌体基因组的指示基因。
重组指示噬菌体可包括报告基因或指示基因。在感染因子的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示基因可以插入噬菌体的晚期基因区域。晚期基因的表达水平通常比其它噬菌体基因高，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区域可以是III类基因区域，并且可包括主要衣壳蛋白的基因。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)用于在主要衣壳蛋白基因下游同源重组的序列。其它实施方案包括设计(和任选地制备)用于在主要衣壳蛋白基因上游同源重组的序列。在一些实施方案中，该序列包含经密码子优化的报告基因，在该报告基因之前有非翻译区。非翻译区可包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于李斯特菌属特异性噬菌体。在一些实施方案中，所选择的野生型噬菌体或野生型噬菌体的混合物能够感染至少一种目标李斯特菌属的某些种。李斯特菌属的种在环境中无处不在，经常在水、污水和土壤中被发现。在一些实施方案中，所选择的野生型噬菌体或野生型噬菌体的混合物能够感染一种或多种、两种或更多种、或三种或更多种目标李斯特菌属的某些种。在某些情况下，李斯特菌属的目标种选自单核细胞增生李斯特菌、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)和格氏李斯特菌(L.grayi)。
在一些实施方案中，所选择的野生型噬菌体来自噬菌体的有尾噬菌体目(Caudovirales)。有尾噬菌体目是具有双链DNA(dsDNA)基因组的有尾的噬菌体的一个目。有尾噬菌体目的每个病毒体都有包含病毒基因组的二十面体头部和柔韧的尾部。有尾噬菌体目由以下五个噬菌体科组成：肌病毒科(Myoviridae)(长收缩尾)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)(长的非收缩尾)、短尾噬菌体科(Podoviridae)(短非收缩尾)、Ackermannviridae和Herelleviridae。术语“肌病毒”可用于描述任何具有二十面体头部和长收缩尾巴的噬菌体，涵盖肌病毒科和Herelleviridae科中的噬菌体。在一些实施方案中，所选择的野生型噬菌体是肌病毒科的成员，诸如李斯特菌属噬菌体B054、李斯特菌属噬菌体LipZ5、李斯特菌属噬菌体PSU-VKH-LP041和李斯特菌属噬菌体WIL-2。在其它实施方案中，所选择的野生型噬菌体是Herelleviridae科的成员。属于Herelleviridae科下的Pecentumvirus属包括噬菌体诸如李斯特菌属噬菌体LMSP-25、李斯特菌属噬菌体LMTA-148、李斯特菌属噬菌体LMTA-34、李斯特菌属噬菌体LP-048、李斯特菌属噬菌体LP-064、李斯特菌属噬菌体LP-083-2、李斯特菌属噬菌体LP-125、李斯特菌属病毒P100、李斯特菌属噬菌体List-36、李斯特菌属噬菌体WIL-1、李斯特菌属噬菌体vB_LmoM_AG20和李斯特菌属病毒A511。LMA4和LMA8也可能属于Herelleviridae科下的pecentumvirus属。在其它实施方案中，所选择的野生型噬菌体是LMA4或LMA8。在某些情况下，所选择的野生型噬菌体是LP-ES3A，其来源于A511，但已被改造成能够感染单核细胞增生李斯特菌的血清型3A。在其它实施方案中，所选择的野生型噬菌体是Ackermannviridae科的成员。在其它实施方案中，所选择的野生型噬菌体是长尾噬菌体科的成员，其包括李斯特菌属噬菌体A006、A118、A500、B025、LP-026、LP-030-2、LP-030-3、LP-037、LP-101、LP-110、LP-114、P35、P40、P70、PSA、vB_LmoS_188和vB_Lmos_293。在其它实施方案中，所选择的野生型噬菌体是LP-ES1。LP-ES1也可能属于长尾噬菌体科下的Homburgvirus属。
在一些实施方案中，指示噬菌体来源于李斯特菌属特异性噬菌体。指示噬菌体可以由Pecentumvirus、Tequatravirus、ViI、Kuttervirus、Homburgvirus、LMTA-94、LMA4、LMA8、P70、LP-ES1、LP-ES3A或另一种与李斯特菌属噬菌体LMTA-94、P70、T7、T7样、T4、T4样、李斯特菌属的某些种的特异性噬菌体、ViI或ViI样(库特病毒，根据GenBank/NCBI)噬菌体具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的基因组的噬菌体。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是LP-ES1、LP-ES3A、LMA4或LMA8。在一些实施方案中，指示噬菌体来源于对特定致病微生物高度特异的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失，因此与许多商购可得的噬菌体相比，经修饰的噬菌体可以保持与野生型感染因子更相似。环境来源的噬菌体可能对环境中发现的细菌更具特异性，因此在遗传上不同于商购可得的噬菌体。
在本发明的另一方面，混合组合物包含至少一种类型的重组噬菌体。在一些实施方案中，混合组合物包含至少一种类型的由LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A构建的重组噬菌体。在其它实施方案中，混合组合物包含至少一种类型的由LMA8、LP-ES1和LP-ES3A构建的重组噬菌体。
此外，被认为非必需的噬菌体基因可具有未被识别的功能。例如，表面上非必需的基因可能在提高释放量方面起重要作用，诸如装配中的细微切割、装配或修整功能。因此，删除基因以插入指示剂可能是有害的。大多数噬菌体可包装比其天然基因组大几个百分点的DNA。考虑到这一点，较小的指示基因可能是修饰噬菌体(尤其是基因组较小的噬菌体)的更合适的选择。OpLuc和
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蛋白只有约20kDa(需约500-600bp来编码)，而FLuc约为62kDa(需约约1,700bp来编码)。此外，报告基因不应由细菌内源性表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应产生高的信号背景比，并应易于及时检测。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶。在其它实施方案中，指示基因是萤光素酶的活性亚单位。Promega的
Figure BDA0003183463990000152
是经修饰的细角刺虾(深海虾)的萤光素酶。在一些实施方案中，与Promega的NANO-
Figure BDA0003183463990000153
(一种咪唑并吡嗪酮底物(呋咪嗪(furimazine))结合的
Figure BDA0003183463990000154
可以提供具有低背景的鲁棒信号。
在一些指示噬菌体实施方案中，可以将指示基因插入非翻译区，以避免功能基因的破坏，保持野生型噬菌体基因完整，这可在感染非实验室菌株时导致更大的适应性。另外，在所有三个阅读框中包含终止密码子可能有助于通过减少通读(也称为渗漏表达)来增加表达。这种策略还可消除低水平制备融合蛋白的可能性，这可表现为不能与噬菌体分离的背景信号(例如，萤光素酶)。
指示基因可以表达多种生物分子。指示基因是表达可检测产物或产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可使用各种类型的萤光素酶。在替代实施方案中，并且如本文更详细描述的，萤光素酶是刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、肾素萤光素酶或工程萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶基因来源于刺虾。在一些实施方案中，指示基因是经遗传修饰的萤光素酶基因，诸如
Figure BDA0003183463990000155
因此，在一些实施方案中，本发明包含经遗传修饰的噬菌体，其在晚期(III类)基因区中包含非噬菌体指示基因。在一些实施方案中，所述非天然的指示基因处于晚期启动子控制之下。使用病毒晚期基因启动子确保了报告基因(例如，萤光素酶)不仅像病毒衣壳蛋白一样高水平表达，而且不会像内源性细菌基因或者甚至早期病毒基因一样关闭。
在一些实施方案中，晚期启动子是Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus或Kuttervirus启动子，或类似于在所选野生型噬菌体中发现的噬菌体的另一种噬菌体启动子，即没有遗传修饰。晚期基因区可以是III类基因区，噬菌体可源自李斯特菌噬菌体LMTA-94、P70、A511、LP-ES1、LP-ES3A、LMA4、LMA8、Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus、Kuttervirus、T7、T4、T4样、ViI、李斯特菌属某些种的特异性噬菌体，或具有与LMTA-94、LMA4、LMA8、Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus、Kuttervirus、T7、T4、ViI或李斯特菌属特异性噬菌体具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性的基因组的另一种野生型噬菌体。Pecentumvirus晚期基因启动子不同于T4或Tequatravirus启动子，因为其不仅包含-10区域，而且还包含-35区域。该-35区域不同于在大多数细菌启动子中发现的标准-35区域。
对感染因子的遗传修饰可包括核酸小片段、基因的大部分或整个基因的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，插入或取代的核酸包含非天然序列。可将非天然的指示基因插入噬菌体基因组，使得其处于噬菌体启动子的控制之下。因此，在一些实施方案中，所述非天然的指示基因不是融合蛋白的一部分。也就是说，在一些实施方案中，遗传修饰可被配置成使得指示蛋白产物不包含野生型噬菌体的多肽。在一些实施方案中，指示蛋白产品是可溶的。在一些实施方案中，本发明包括用于检测目标细菌的方法，所述方法包括将测试样品与这种重组噬菌体一起孵育的步骤。
在一些实施方案中，宿主细菌感染后，指示基因在后代噬菌体中的表达产生游离的可溶性蛋白质产物。在一些实施方案中，所述非天然的指示基因不与编码结构噬菌体蛋白的基因邻接，因此不产生融合蛋白。与采用检测部分与衣壳蛋白的融合物(即融合蛋白)的系统不同，本发明的一些实施方案表达可溶性指示剂或报告子(例如，可溶性萤光素酶)。在一些实施方案中，所述指示剂或报告子理想地不含噬菌体结构。也就是说，所述指示剂或报告子没有附着至噬菌体结构上。因此，指示剂或报告子的基因不与重组噬菌体基因组中的其它基因融合。这可大大提高测定的灵敏度(低至单个细菌)，并简化测定，对于一些实施方案，允许测定在两小时或更短时间完成，而不是因产生可检测的融合蛋白的构建体需要额外的纯化步骤所致的数小时内。另外，融合蛋白的活性可能比可溶性蛋白活性低，这是由于例如蛋白质折叠限制而导致，所述蛋白质折叠限制可改变酶活性位点的构象或对底物的接近。例如，如果浓度为1,000个细菌细胞/mL样品，那么不到4小时的感染就足以检测到目标细菌。
此外，根据定义，融合蛋白限制了附着至噬菌体中的蛋白质亚基上的部分的数量。例如，使用设计用作融合蛋白平台的商购可得的系统将产生约415个拷贝的融合部分，对应于每个T7噬菌体颗粒中约415拷贝的基因10B衣壳蛋白。如果没有这种限制，受感染的细菌可以表达比噬菌体能容纳的多得多的检测部分(例如，萤光素酶)拷贝。另外，大的融合蛋白，诸如衣壳-萤光素酶融合蛋白，可以抑制噬菌体颗粒的组装，从而产生较少的噬菌体后代。因此，可溶性的非融合指示基因产物可以是优选的。
在一些实施方案中，指示噬菌体编码报告子，诸如可检测的酶。指示基因产物可以产生光和/或可通过颜色变化检测到。各种合适的酶都是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以作为指示部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，刺虾萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
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是指示部分。产生可检测信号的其它工程化萤光素酶或其它酶也可以是合适的指示部分。
在一些实施方案中，可溶性检测部分的使用消除了对从受感染的样品细胞的裂解物中去除污染性亲代噬菌体的需要。利用融合蛋白系统，任何用于感染样品细胞的噬菌体都将附着有检测部分，并且与也含有检测部分的子噬菌体是无法区分的。由于样品细菌的检测依赖于新产生的(从头合成的)检测部分的检测，因此使用融合构建体需要额外的步骤来将新产生的(子噬菌体)部分与旧的(亲代)部分分离。这可通过在完成噬菌体生命周期之前多次洗涤被感染的细胞，在感染后通过物理或化学手段灭活过量的亲代噬菌体，并且/或者用结合部分(诸如生物素)化学修饰亲代噬菌体，然后结合并分离(诸如通过链霉抗生物素蛋白包被的琼脂糖珠)所述经修饰的亲代噬菌体来实现。然而，即使进行了所有这些去除尝试，当使用高浓度的亲代噬菌体来确保感染少量样品细胞时，亲代噬菌体仍会保留，从而产生背景信号，所述背景信号可能会模糊对来自被感染细胞后代噬菌体的信号的检测。
相比之下，对于在本发明的一些实施方案中表达的可溶性检测部分，从最终裂解物中纯化亲代噬菌体是不必要的，因为亲代噬菌体不具有任何附接的检测部分。因此，感染后出现的任何检测部分必须是重新产生的，表明存在一种或多种被感染的细菌。为了利用这种益处，亲代噬菌体的生产和制备可包括从细菌培养物中亲代噬菌体生产过程中产生的任何游离检测部分中纯化噬菌体。标准噬菌体纯化技术，诸如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱和透析或衍生技术(诸如Amicon brand浓缩器–Millipore,Inc.)可用于纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案。氯化铯等密度超速离心可用作制备本发明的重组噬菌体的一部分，以将亲代噬菌体颗粒与细菌宿主中噬菌体繁殖时产生的污染性萤光素酶蛋白分离。这样，本发明的亲代重组噬菌体基本上不含细菌生产过程中产生的任何萤光素酶。当重组噬菌体与测试样品一起孵育时，去除噬菌体原液中存在的残留萤光素酶可以显著降低观察到的背景信号。
在经修饰的噬菌体的一些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如来自Pecentumvirus、Homburgvirus、T7、T4、ViI或LMA4/8)对同一噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力，所述RNA聚合酶转录组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因。这些蛋白质是噬菌体制造的最丰富的蛋白质，因为每个噬菌体颗粒包含数十或数百个拷贝的这些分子。病毒晚期启动子的使用可以确保萤光素酶检测部分的最佳高水平表达。来源于、特异于所述指示噬菌体所源自的原始野生型噬菌体或在原始野生型噬菌体下具有活性的晚期病毒启动子(例如，具有基于Pecentumvirus、T4、T7、ViI或LMA的系统的Pecentumvirus、Homburgvirus、T4、T7、ViI或LMA4/8晚期启动子)的使用可进一步确保检测部分的最佳表达。标准细菌(非病毒/非噬菌体)启动子的使用在一些情况下可能对表达有害，因为这些启动子在噬菌体感染期间经常被下调(以便噬菌体优先考虑细菌资源用于噬菌体蛋白质生产)。因此，在一些实施方案中，优选使用基因组中不将表达限制于噬菌体结构组分的亚单位的数量的位置工程改造噬菌体以编码可溶性(游离)指示部分并以高水平表达其。
本发明的组合物可包含一种或多种野生型或经遗传修饰的感染因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示噬菌体的混合物，所述指示噬菌体可以编码和表达相同或不同的指示蛋白。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含至少两种不同类型的重组噬菌体。
指示噬菌体的制备方法
制备指示噬菌体的方法的实施方案始于选择野生型噬菌体进行遗传修饰。一些噬菌体对目标细菌具有高度特异性。这为高特异性检测提供了机会。
因此，本发明的方法利用与识别并结合目标特定微生物的感染因子缔合的结合剂的高特异性，作为放大信号的手段，从而检测样品中存在的低水平微生物(例如，单个微生物)。例如，感染因子(例如，噬菌体)特异性识别特定微生物的表面受体，从而特异性感染这些微生物。因此，这些感染因子可以是靶向目标微生物的合适结合剂。
本发明的一些实施方案利用重组噬菌体的结合特异性和高水平遗传表达能力进行快速且灵敏的靶向，以感染和促进目标细菌的检测。在一些实施方案中，李斯特菌属特异性噬菌体被遗传修饰以包含报告基因。在一些实施方案中，噬菌体的晚期基因区被遗传修饰以包括报告基因。在一些实施方案中，报告基因位于主要衣壳基因的下游。在其它实施方案中，报告基因位于主要衣壳基因的上游。在一些实施方案中，插入的遗传构建体还包含其自身的外源性专用启动子来驱动指示基因的表达。外源启动子是噬菌体基因组中任何内源启动子之外的启动子。由于噬菌体产生多顺反子mRNA转录物，因此转录物中第一基因/顺反子上游只需要一个启动子。常规重组构建体仅使用内源性噬菌体启动子来驱动插入的基因。相比之下，在报告基因和核糖体结合位点上游添加额外的启动子可以通过充当转录的第二起始位点来增加基因表达。复杂而紧凑的病毒基因组通常具有不同框架(有时是两个不同的方向)的重叠基因。
制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括选择特异性感染目标致病细菌诸如李斯特菌属的某些种的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化到目标致病菌中；用选择的野生型噬菌体感染转化的目标致病菌，从而允许质粒/载体与噬菌体基因组之间发生同源重组；以及分离重组噬菌体的特定克隆。
设计并制备同源重组质粒的各种方法是已知的。用质粒转化细菌的各种方法是已知的，包括热休克、F菌毛介导的细菌接合(F pilus-mediated bacterial conjugation)、电穿孔和其它方法。同源重组后分离特定克隆的各种方法也是已知的。本文所述的一些方法的实施方案利用特定的策略。
因此，制备指示噬菌体的方法的一些实施方案包括以下步骤：选择特异性感染目标致病细菌的野生型噬菌体；确定所选噬菌体的基因组晚期区域中的天然序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计与主要衣壳蛋白基因相邻的用于同源重组的序列，其中所述序列包含经密码子优化的报告基因；将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中；将质粒/载体转化到目标致病菌中；选择转化的细菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的细菌，从而允许质粒与噬菌体基因组之间发生同源重组；测定所得重组噬菌体裂解物的滴度；以及进行限制性稀释测定以富集和分离重组噬菌体。一些实施方案包括在第一限制性稀释测定后，根据需要进一步重复限制性稀释和滴度测定步骤，直至重组噬菌体代表了混合物的可检测级分。例如，在一些实施方案中，在分离重组噬菌体的特定克隆之前，可以重复限制性稀释和滴定步骤，直至混合物中至少1/30的噬菌体是重组的。在一些实施方案中，1:30的重组型:野生型的比例预期每96个斑块(例如，在96孔板中)产生平均3.2个转导单位(TU)。重组噬菌体与野生型噬菌体的初始比例可以通过进行基于TCID50(组织培养感染剂量的50％)的限制性稀释测定来确定，如先前在美国专利申请第15/409,258号中所述的。根据泊松分布，1:30的比例有96％的的机会在96孔中的某处观察到至少一个TU。
图1描述了本发明的重组指示噬菌体基因组结构的示意图。对于图1所描绘的实施方案，检测部分由插入晚期(III类)基因区域110的萤光素酶基因100编码，所述基因在病毒生命周期的晚期表达。晚期基因的表达水平通常比其它噬菌体基因高，因为它们编码结构蛋白。因此，在图1描绘的重组噬菌体的实施方案中，指示基因(即，萤光素酶)被插入到晚期基因区域，正好在主要衣壳蛋白(cps)120的基因之后，并且是包含萤光素酶基因100的构建体。在一些实施方案中，图1中描绘的构建体可在所有3个阅读框中包含终止密码子，以确保萤光素酶不会通过融合蛋白的产生而掺入cps基因产物中。同样如图1所描绘的，构建体可以包含额外的专用晚期启动子130，以驱动萤光素酶基因的转录和表达。该构建体还包含核糖体结合位点(RBS)140。该构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白的数量。
如本文中所述，在某些实施方案中，可能优选利用已经从环境中分离的感染因子来产生本发明的感染因子。这样，可以产生对天然来源的微生物特异的感染因子。
例如，图2显示了噬菌体LMA4的基因组，LMA4是特异性感染李斯特菌属的某些种的野生型噬菌体。如实施例中所述，主要衣壳蛋白(cps)240和各种其它结构基因位于晚期基因区210内，由编码病毒体蛋白的结构基因组成。编码tRNA 220的基因代表邻近于晚期基因区但在晚期基因区外的基因组序列。与李斯特菌属噬菌体LMTA-94的推定前头部蛋白酶同源的假设基因230位于cps 240的上游，由编码病毒体蛋白的结构基因组成。所描绘的其它晚期基因是李斯特菌属噬菌体LMTA-94的推定的主要衣壳蛋白(cps)的同源物240，随后是转录终止子250，以及李斯特菌属噬菌体LMTA-94尾鞘蛋白(tsh)的同源物260。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，只要使用晚期基因启动子和/或其它类似的控制元件，任何插入该区域的基因都可以预期具有相似的表达水平。
有许多已知的制备质粒的方法和商业产品。例如，PCR、定点诱变、限制性消化、连接、克隆和其它技术可组合用于制备质粒。合成质粒也可以通过商业途径订购(例如，GeneWiz)。还可使用粘粒，或者可使用CRISPR/CAS9系统来选择性编辑噬菌体基因组。制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括设计能够容易地与野生型噬菌体基因组重组以产生重组基因组的质粒。在设计质粒时，一些实施方案包括添加经密码子优化的报告基因，诸如萤光素酶基因。一些实施方案还包括向上游非翻译区添加元件。例如，在设计与李斯特菌属特异性噬菌体基因组重组的质粒时，可以在编码gp23/主要衣壳蛋白的C末端的序列与
Figure BDA0003183463990000221
报告基因的起始密码子之间添加上游非翻译区。非翻译区可包括启动子，诸如T4病毒启动子、Tequatravirus病毒启动子、Homburgvirus病毒启动子、T7病毒启动子、T7样病毒启动子、Pecentumvirus病毒启动子、李斯特菌属特异性噬菌体启动子、ViI或库特病毒启动子。非翻译区也可包括核糖体进入/结合位点(RBS)，对于细菌系统也称为“Shine-Dalgarno序列”。这些元件中的一者或两者，或其它非翻译元件，可以嵌入由随机序列组成的短的上游非翻译区，所述随机序列包含与噬菌体基因组的其余部分大致相同的GC含量。随机区域不应包括ATG序列，因为其将作为起始密码子。
本发明的组合物可包含各种感染因子和/或指示基因。例如，图3显示了用于制造对李斯特菌属的某些种特异的指示噬菌体的同源重组质粒构建体。制备构建体并将其与李斯特菌属某些种的噬菌体LMA4、李斯特菌属某些种的噬菌体LMA8、李斯特菌属某些种的噬菌体LP-ES3A、李斯特菌属某些种的噬菌体LP-ES1或其它李斯特菌属特异性噬菌体组合使用，以产生本发明的重组噬菌体。图3中的构建体显示了用于将
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萤光素酶同源重组插入两个李斯特菌属某些种的Pecentumvirus噬菌体LMA4和LMA8(各自具有500bp的上游和下游同源序列)的重组质粒：同源重组质粒pCE104.HR.ListeriaPhage.NANOLUC.v2.Pecentumvirus.NANOLUC.v2，和用于将
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萤光素酶同源重组插入李斯特菌属的某些种Homburgvirus噬菌体LP-ES1的重组质粒pCE104.HR.LP-ES1.NanoLuc的一般示意图。
在某些实施方案中，质粒被命名为pCE104.HR.Pecentumvirus.NanoLuc.v2。检测/指示部分由
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报告基因300编码。由一系列矩形表示的插入物位于革兰氏阳性穿梭载体pCE104 310中。上游同源重组区由500bp的主要衣壳蛋白C端片段320组成。5’非翻译区330内的Pecentumvirus晚期启动子共有序列及Shine-Dalgarno核糖体进入/结合位点。经密码子优化的
Figure BDA0003183463990000233
报告基因300紧随其后。接下来是内源性转录终止子，以及非翻译区(UTR)和由下游同源重组340组成的假定蛋白质N末端片段位于同源重组区的末端。
主要衣壳蛋白片段是编码病毒体蛋白的结构基因的一部分。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，只要使用晚期基因启动子和/或其它类似的控制元件，任何插入该区域的基因都可以预期具有相似的表达水平。
在一些实施方案中，根据本发明的指示噬菌体包含李斯特菌属特异性噬菌体，其被遗传工程改造成包含报告基因，诸如萤光素酶基因。例如，指示噬菌体可以是李斯特菌属某些种的特异性噬菌体，其中基因组包含
Figure BDA0003183463990000234
基因的序列。重组李斯特菌属特异性NanoLuc噬菌体基因组可进一步包含Pecentumvirus、T4、T7、李斯特菌属特异性、ViI、LMA4或LMA8噬菌体的共有启动子或另一种晚期启动子。在另外的实施方案中，所述启动子是外源启动子。插入外源启动子以驱动指示基因的表达是有利的，因为表达不受其它噬菌体蛋白(例如，主要衣壳蛋白)表达的限制。
因此，在作为重组的结果产生的重组噬菌体的实施方案中，将指示基因(即，
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)插入到晚期基因区域中，正好在编码主要衣壳蛋白的基因的下游，从而产生包含
Figure BDA0003183463990000236
基因的重组噬菌体基因组。该构建体可以另外包含李斯特菌属噬菌体LMTA-94、T4、T7、李斯特菌属特异性噬菌体、ViI的共有启动子，或另一种晚期启动子或另一种合适的启动子，以驱动萤光素酶基因的转录和表达。该构建体还可包含由几个UTR合成的复合非翻译区。该构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白的数量。
通过被设计用于与野生型噬菌体基因组重组的质粒的同源重组产生的重组噬菌体可从包含非常小百分比(例如，0.005％)的总噬菌体基因组的混合物中分离出来。分离后，可进行大规模生产以获得适用于李斯特菌属某些种的检测测定的高滴度重组指示噬菌体原液。此外，氯化铯等密度梯度离心可用于从污染性萤光素酶蛋白中分离噬菌体颗粒，以降低背景。
使用感染因子检测李斯特菌属某些种的方法
如本文中所述，在某些实施方案中，本发明可包括使用感染性颗粒检测微生物的方法。本发明的方法可以以多种方式实现。
在一个实施方案中，本发明可包括用于检测样品中目标细菌的方法，该方法包括以下步骤：将样品与感染目标细菌的噬菌体一起孵育，其中所述噬菌体包含指示基因，使得在目标细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；以及检测所述指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在某些情况下，本发明包括检测样品中李斯特菌属的某些种的方法，该方法包括：将样品与包含至少一种李斯特菌特异性重组噬菌体的混合组合物一起温育；以及检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明李斯特菌属的某些种存在于样品中。
在一些实施方案中，至少一种类型的重组噬菌体由LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A构建。在其它实施方案中，至少一种重组噬菌体由LMA8、LP-ES1和LP-ES3A构建。
在某些实施方案中，可以执行测定以利用可被修改以适应不同的样品类型或尺寸以及测定格式的一般概念。采用本发明重组噬菌体(即指示噬菌体)的实施方案可以允许快速检测特定的细菌菌株，诸如李斯特菌属的某些种，其中总测定时间短于1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、3.5小时、4.0小时、4.5小时、5.0小时、5.5小时、6.0小时、6.5小时、7.0小时、7.5小时、8.0小时、8.5小时、9.0小时、9.5小时、10.0小时、10.5小时、11.0小时、11.5小时、12小时、12.5小时、13.0小时、13.5小时、14.0小时、14.5小时、15.0小时、15.5小时、16.0小时、16.5小时、17.0小时、17.5小时、18.0小时、18.5小时、19.0小时、19.5小时、20.0小时、21.0小时、21.5 22.0小时、22.5小时、23.0小时、23.5小时、24.0小时、24.5 25.0小时、25.5小时或26.0小时，这取决于样品类型、样品尺寸和测定格式。例如，所需的时间量可以稍短或稍长，这取决于噬菌体的株系和测定中待检测的细菌菌株、待测样品的类型和尺寸、靶标活力所需的条件、物理/化学环境的复杂性以及“内源性”非目标细菌污染物的浓度。
噬菌体(例如，T7、T4、P70 P100、A511、LP-ES3A、LP-ES1、LMA4或LMA8噬菌体)可被工程化以在噬菌体复制期间表达可溶性萤光素酶。萤光素酶的表达由病毒衣壳启动子(例如，噬菌体Pecentumvirus或T4晚期启动子)驱动，产生高表达。制备亲代噬菌体，使得它们不含萤光素酶，因此在测定中检测到的萤光素酶必须来自细菌细胞感染期间后代噬菌体的复制。因此，通常不需要将后代噬菌体与亲代噬菌体分离。
图4描绘了根据本发明的一个实施方案使用经修饰的噬菌体检测李斯特菌属的过滤板测定。简言之，可将包括目标细菌418的样品416添加到多孔过滤板404的孔402中，并旋转406以通过从样品中除去液体来浓缩样品。将经遗传修饰的噬菌体420添加到孔中，并与添加的额外培养基一起孵育足够长的时间，足以吸附408，随后感染目标细菌并推进噬菌体生命周期410(例如，约240分钟)。最后，加入萤光素酶底物，并与存在的任何萤光素酶424反应。所得发射在检测萤光素酶活性426的光度计414中测量。
在一些实施方案中，在测试之前不需要富集样品中的细菌。在一些实施方案中，可在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在此类实施方案中，富集期可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或更长，这取决于样品类型和尺寸。
在一些实施方案中，指示噬菌体包含可检测的指示部分，并且单个致病细胞(例如，细菌)的感染可通过经由指示部分产生的扩增信号来检测。因此，该方法可包括检测噬菌体复制过程中产生的指示部分，其中指示剂的检测表明目标细菌存在于样品中。
在一个实施方案中，本发明可包括用于检测样品中目标细菌的方法，该方法包括以下步骤：将样品与感染目标细菌的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包含插入噬菌体晚期基因区的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；以及检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在目标细菌。在一些实施方案中，检测到的指示剂部分的量对应于样品中存在的目标细菌的量。
如本文更详细描述的，本发明的方法和系统可利用一定浓度范围的亲代指示噬菌体来感染样品中存在的细菌。在一些实施方案中，指示剂噬菌体以足以快速发现、结合和感染样品中以非常低的数量(诸如10个细胞)存在的目标细菌的浓度加入到样品中。在一些实施方案中，噬菌体浓度足以在不到一小时内发现、结合和感染目标细菌。在其它实施方案中，在向样品中加入指示噬菌体后，这些事件可以在短于2小时、或短于3小时、或短于4小时内发生。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度高于1x105PFU/mL、高于1x106PFU/mL或高于1x107PFU/mL。
在某些实施方案中，重组感染因子可以被纯化，从而不含任何在感染因子原液生产时可能产生的残留指示蛋白。因此，在某些实施方案中，重组噬菌体可在与样品一起孵育之前使用氯化铯等密度梯度离心法纯化。当感染因子是噬菌体时，这种纯化可具有去除不含DNA的噬菌体(即，空噬菌体或“幽灵”)的额外好处。
在本发明方法的一些实施方案中，可以在不从样品中分离或纯化微生物的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，包含一种或几种目标微生物的样品可以直接施加到测定容器(诸如旋转柱、微量滴定孔或过滤器)中，并且在该测定容器中进行所述测定。本文公开了此类测定的各种实施方案。
测试样品的等分试样可以直接分配到多孔板的孔中，可以添加指示噬菌体，并且在足以感染的一段时间后，可以添加裂解缓冲液以及用于指示部分的底物(例如，用于萤光素酶指示剂的萤光素酶底物)，并测定其指示信号的检测。该方法的一些实施方案可以在过滤板上进行。该方法的一些实施方案可以在用指示噬菌体感染之前在有或无样品浓缩的情况下进行。
例如，在许多实施方案中，多孔板用于进行测定。板(或任何其它可以进行检测的容器)的选择会影响检测步骤。例如，一些板可能包括彩色或白色背景，这可影响光发射的检测。一般来说，白色板具有更高的灵敏度，但也会产生更高的背景信号。其它颜色的板可能会产生较低的背景信号，但也具有稍低的灵敏度。另外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄漏到另一个相邻的孔。有些板具有白色的孔，但板的其余部分是黑色的。这允许孔内的高信号，但防止孔与孔之间的光泄漏，因此可以降低背景。因此，平板或其它测定容器的选择可能会影响测定的灵敏度和背景信号。
本发明的方法可包括增加灵敏度的各种其它步骤。例如，如本文更详细讨论的，该方法可包括在添加噬菌体之后但在孵育之前洗涤捕获和感染的细菌的步骤，以去除污染噬菌体制剂的过量亲代噬菌体和/或萤光素酶或其它报告蛋白。
在一些实施方案中，目标微生物的检测可以在不需要培养样品(作为增加微生物群的方法)的情况下完成。例如，在某些实施例中，检测所需的总时间短于28.0小时、27.0小时、26.0小时、25.0小时、24.0小时、23.0小时、22.0小时、21.0小时、20.0小时、19.0小时、18.0小时、17.0小时、16.0小时、15.0小时、14.0小时、13.0小时、12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时或短于1.0小时。在食品和环境病原体测试中，最大限度地缩短得到结果的时间至关重要。
与本领域已知的测定相反，本发明的方法可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，该方法可以检测样品中存在的少至10个细胞的微生物。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对李斯特菌属的某些种是高度特异的。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在其它类型的细菌存在的情况下区分李斯特菌属的某些种。在某些实施方案中，重组噬菌体可用于检测样品中特定类型的单一细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体检测样品中少至2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个所述特定细菌。
因此，本发明的一些方面提供了通过指示部分检测测试样品中微生物的方法。在一些实施方案中，当目标微生物是细菌时，指示部分可以与感染因子诸如指示噬菌体缔合。指示部分可以与底物反应以发出可检测的信号，或者可以发出内在信号(例如，荧光蛋白)。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示测试样品中少至50个、40个、30个、20个、10个、5个或2个目标微生物细胞的存在。在一些实施方案中，甚至单个细胞的目标微生物也可以产生可检测的信号。在一些实施方案中，噬菌体是Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus或库特病毒噬菌体。在一些实施方案中，重组噬菌体源自李斯特菌属特异性噬菌体。在某些实施方案中，重组李斯特菌特异性噬菌体对李斯特菌属的某些种是高度特异的。
在一些实施方案中，由感染因子编码的指示部分在感染因子复制期间或之后是可检测的。适合用作指示部分的许多不同类型的可检测生物分子在本领域是已知的，并且许多是商购可得的。在一些实施方案中，指示噬菌体包含用作指示部分的酶。在一些实施方案中，指示噬菌体的基因组被修饰以编码可溶性蛋白质。在一些实施方案中，指示噬菌体编码可检测的酶。指示剂可以发光并且/或者可通过添加的基底中的颜色变化来检测。各种合适的酶都是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以作为指示部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，刺虾萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
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是指示部分。产生可检测信号的其它工程萤光素酶或其它酶也可以是合适的指示部分。
因此，在一些实施方案中，所述方法、系统或试剂盒的重组噬菌体是从野生型李斯特菌属特异性噬菌体制备的。在一些实施方案中，指示基因编码发出内在信号的蛋白质，诸如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或其它)。指示剂可以发光并且/或者可以通过颜色变化来检测。在一些实施方案中，指示基因编码与底物相互作用以产生信号的酶(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。在一些实施方案中，萤光素酶基因是刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、External Gaussia萤光素酶、Lucia萤光素酶或工程萤光素酶诸如
Figure BDA0003183463990000292
Rluc8.6-535或Orange Nano-lantern中的一种。
检测指示剂可以包括检测光的发射。在一些实施方案中，光度计可用于检测指示剂(例如，萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可用光度计实现，或者也可以使用其它机器或设备。例如，分光光度计、CCD照相机或CMOS可以检测颜色变化和其它光发射。绝对RLU对于检测很重要，但信号与背景的比率也需要高(例如，>2.0、>2.5或>3.0)，以便可靠地检测单细胞或少量细胞。
在一些实施方案中，指示噬菌体被基因工程改造以包含酶诸如萤光素酶的基因，所述酶仅在噬菌体特异性识别和感染的细菌被感染时产生。在一些实施方案中，指示部分在病毒生命周期的晚期表达。在一些实施方案中，如本文中所述，指示剂是可溶性蛋白(例如，可溶性萤光素酶)，并且不与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
因此，在利用指示噬菌体的一些实施方案中，本发明包括检测目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：捕获至少一种样品细菌；将所述至少一种细菌与多个指示噬菌体一起孵育；给感染和复制留出时间以产生后代噬菌体并表达可溶性指示部分；以及检测后代噬菌体，或优选检测指示剂，其中指示剂的检测表明样品中存在细菌。
例如，在一些实施方案中，测试样品细菌可以通过结合到平板表面，或者通过细菌过滤器(例如，0.45μm孔径的旋转过滤器或平板过滤器)过滤样品而被捕获。在一个实施方案中，将感染因子(例如，指示噬菌体)以最小体积直接添加到过滤器上捕获的样品中。在一个实施方案中，在过滤器或平板表面上捕获的微生物随后被洗涤一次或多次，以除去过量的未结合的感染因子。在一个实施方案中，可以添加培养基(例如，Luria-Bertani(LB)肉汤、缓冲蛋白胨水(Buffered Peptone Water)(BPW)或胰蛋白酶大豆肉汤(Tryptic SoyBroth)或胰蛋白酶大豆肉汤(Tryptone Soy Broth)(TSB)、脑心输注(BHI)缓冲李斯特菌属富集肉汤(BLEB)、University of Vermont(UVM)肉汤或Fraser肉汤)用于持续另外的孵育时间，以允许细菌细胞和噬菌体复制以及编码指示部分的基因高水平表达。然而，测试测定的一些实施方案的一个令人惊讶的方面是，利用指示噬菌体的孵育步骤只需要长至足以进行单个噬菌体的生命周期即可。以前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多的时间，使得噬菌体可以复制几个周期。根据本发明的一些实施方案，指示噬菌体的单个复制周期足以促进灵敏且快速的检测。
在一些实施方案中，包含细菌的测试样品的等分试样可被施加到旋转柱上，并且在用重组噬菌体感染和任选的洗涤以除去任何过量的噬菌体之后，检测到的可溶性指示剂的量将与被感染细菌产生的噬菌体的量成比例。
然后可以测量和定量细菌裂解时释放到周围液体中的可溶性指示剂(例如，萤光素酶)。在一个实施方案中，将溶液旋转通过过滤器，在加入指示酶的底物(例如，萤光素酶底物)后，将滤液收集在新的容器中(例如，在光度计中)用于测定。或者，可以直接在过滤器上测量指示信号。
在各种实施方案中，纯化的亲代指示噬菌体不包含可检测的指示剂本身，因为亲代噬菌体可以在其用于与测试样品孵育之前被纯化。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本发明的一些实施方案中，可以纯化亲代噬菌体以排除任何存在的指示蛋白(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中，指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。因此，在许多实施方案中，没有必要在检测步骤之前将亲本噬菌体与后代噬菌体分离。在一个实施方案中，微生物是细菌，指示噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示部分是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解时释放。
因此，在一个替代实施方案中，指示底物(例如，萤光素酶底物)可以与保留在过滤器上或结合到平板表面的样品部分一起孵育。因此，在一些实施方案中，固体支持物是96孔过滤板(或常规的96孔板)，并且可以通过将板直接放置在光度计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本发明可包括用于检测李斯特菌属的某些种的方法，该方法包括以下步骤：用多个能够在感染时表达萤光素酶的亲代指示噬菌体感染在96孔过滤板上捕获的细胞；洗去过量的噬菌体；加入BHI肉汤，并让噬菌体有时间复制以及裂解特定的李斯特菌属的某些种靶标(例如，60-240分钟)；以及通过添加萤光素酶底物并直接在96孔板中测量萤光素酶活性来检测指示萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表明李斯特菌属的某些种存在于样品中。
在另一个实施方案中，本发明可包括用于检测李斯特菌属的某些种的方法，该方法包括以下步骤：用多个能够在感染时表达萤光素酶的亲代指示噬菌体感染96孔板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；允许噬菌体有时间复制以及裂解特定的李斯特菌属的某些种靶标(例如，60-240分钟)；以及通过添加萤光素酶底物并直接在96孔板中测量萤光素酶活性来检测指示萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表明李斯特菌属的某些种存在于样品中。在这样的实施方案中，不需要捕获步骤。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消费的测试样品，诸如蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩Luria-Bertani(LB)肉汤、缓冲蛋白胨水(BPW)或胰蛋白酶大豆肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、脑心输注(BHI)缓冲李斯特菌属富集肉汤(UVM)University of Vermont(UVM)或Fraser肉汤强化的蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是在BHI肉汤中稀释的细菌。
在一些实施方案中，细菌的裂解可以发生在检测步骤之前、期间或之后。实验表明，在一些实施方案中，加入萤光素酶底物后，可以检测到感染的未裂解的细胞。据推测，萤光素酶可以离开细胞并且/或者萤光素酶底物可以进入细胞而不完全裂解细胞。因此，对于利用旋转过滤系统的实施方案，其中在光度计中仅分析释放到裂解物中的萤光素酶(而不是仍在完整细菌中的萤光素酶)，检测需要裂解。然而，对于其中样品在溶液或悬浮液中的使用过滤板或96孔板的实施方案(其中直接在光度计中测定充满完整和裂解的细胞的原始板)，裂解对于检测不是必需的。
在一些实施方案中，指示部分(例如,萤光素酶)与底物的反应可以持续60分钟或更长时间，并且在不同时间点的检测对于优化灵敏度可能是理想的。例如，在使用96孔过滤板作为固体支持物和萤光素酶作为指示剂的实施方案中，可以在开始时以10分钟或15分钟的间隔获取光度计读数，直至反应完成。
令人惊讶的是，用于感染测试样品的高浓度噬菌体已经成功地在非常短的时间内检测到非常少数量的目标微生物。在一些实施方案中，噬菌体与测试样品的孵育只需足长至足以进行单个噬菌体的生命周期即可。在一些实施方案中，该孵育步骤的噬菌体浓度大于7x106、8x106、9x106、1.0x107、1.1x107、1.2x107、1.3x107、1.4x107、1.5x107、1.6x107、1.7x107、1.8x107、1.9x107、2.0x107、3.0x107、4.0x107、5.0x107、6.0x107、7.0x107、8.0x107、9.0x107或1.0x108PFU/mL。
如此高浓度的噬菌体的成功令人惊讶，因为大量的噬菌体先前与“自外裂解”相关联，所述自外裂解杀死了目标细胞，从而阻止了来自早期噬菌体测定的有用信号的产生。本文所述的对制备的噬菌体原液的清理有可能有助于缓解这一问题(例如，通过氯化铯等密度梯度超速离心进行清理)，因为除了去除与噬菌体相关联的任何污染性萤光素酶之外，这种清理还可以去除鬼影颗粒(已丢失了DNA的颗粒)。鬼影颗粒可以通过“自外裂解”来裂解细菌细胞，过早地杀死细胞，从而阻止指示信号的产生。电子显微镜显示，粗制噬菌体裂解物(即，氯化铯清理之前)可能有超过50％的鬼影。这些鬼颗粒可通过许多噬菌体颗粒刺穿细胞膜的作用导致微生物过早死亡。因此，鬼影颗粒可导致了先前的问题，即据报道高PFU浓度是有害的。此外，非常干净的噬菌体制备允许在没有洗涤步骤的情况下进行测定，这使得在没有初始浓缩步骤的情况下进行测定成为可能。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，该浓缩步骤允许更短的富集孵育时间。
测试方法的一些实施方案可进一步包括确证测定。本领域中已知多种用于通常在稍后的时间点确认初始结果的测定。例如，可以培养样品(例如，选择性显色性铺板板(selective chromogenic plating))，并且可以利用PCR来确认微生物DNA的存在，或者可使用其它确认测定来确认初始结果。
在某些实施方案中，本发明的方法除了用感染因子进行检测之外，还结合使用结合剂(例如，抗体)来从样品纯化并且/或者浓缩目标微生物，诸如李斯特菌属的某些种。例如，在某些实施方案中，本发明包括用于检测样品中目标微生物的方法，该方法包括以下步骤：使用对目标微生物诸如李斯特菌属的某些种特异的捕获抗体在先前的支持物上从样品中捕获微生物；将样品与感染李斯特菌属的某些种的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包含插入噬菌体晚期基因区的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物；以及检测所述指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测表明李斯特菌属的某些种存在于样品中。
在一些实施方案中，合成噬菌体被设计成优化病原体检测测定中使用的所需性状。在一些实施方案中，使用生物信息学和遗传修饰的先前分析来优化期望的性状。例如，在一些实施方案中，编码噬菌体尾部蛋白的基因可以被优化以识别和结合特定种类的细菌。在其它实施方案中，编码噬菌体尾部蛋白的基因可以被优化以识别和结合整个细菌属，或属内的特定组的物种。这样，噬菌体可被优化以检测更宽或更窄的病原体组。在一些实施方案中，合成噬菌体可被设计成提高报告基因的表达。另外地和/或可选地，在一些情况下，合成噬菌体可被设计成增加噬菌体的释放量以提高检测。
在一些实施方案中，可以优化噬菌体的稳定性以延长保存期限。例如，为了增加后续噬菌体的稳定性，可以增加酶制剂的溶解度(enzybiotic solubility)。另外地和/或可选地，可以优化噬菌体的热稳定性。耐热噬菌体在储存过程中更好地保持功能活性，从而延长保存期限。因此，在一些实施方案中，可以优化热稳定性和/或pH耐受性。
在一些实施方案中，经遗传修饰的噬菌体或合成衍生的噬菌体包含可检测的指示剂。在一些实施方案中，指示剂是萤光素酶。在一些实施方案中，噬菌体基因组包含指示基因(例如，萤光素酶基因或编码可检测指示剂的另一种基因)。
本发明的系统和套件
在一些实施方案中，本发明包括系统(例如，自动化系统或套件)，其包含用于执行本文公开的方法的组件。在一些实施方案中，指示噬菌体包含在根据本发明的系统或套件中。本文描述的方法也可利用此类指示噬菌体系统或套件。考虑到实施所述方法所需的试剂和材料的最少量，本文所述的一些实施方案特别适合自动化和/或套件。在某些实施方案中，套件的每个组件可以包括自含式单元，该单元可以从第一位置输送到第二位置。
在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统或套件。在某些实施方案中，所述系统或套件可包括用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组件，其中所述感染因子包括指示部分和用于检测指示剂部分的组件。在本发明的系统和套件的一些实施方案中，感染因子是感染目标细菌的重组噬菌体，并且重组噬菌体包含插入噬菌体晚期基因区的指示基因作为指示部分，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制期间指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。一些系统还包括用于在固体支持物上捕获目标微生物的组件。
在其它实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的方法、系统或套件，其包含对目标微生物特异的感染因子组分，其中感染剂包含指示部分和用于检测指示部分的组分。在一些实施方案中，噬菌体是Tequatravirus、ViI、库特病毒、Homburgvirus、Pecentumvirus或李斯特菌属的某些种特异性噬菌体。在一个实施方案中，重组噬菌体源自李斯特菌属的某些种特异性噬菌体。在某些实施方案中，重组噬菌体对特定细菌高度特异。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对李斯特菌属的某些种高度特异。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在其它类型的细菌存在的情况下区分李斯特菌属的某些种。在某些实施方案中，系统或套件检测样品中少至1个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个特定细菌。
在某些实施方案中，系统和/或套件还可包含用于洗涤捕获的微生物样品的组件。另外地或可选地，系统和/或套件还可包括用于测定指示部分的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。例如，在某些实施方案中，系统或套件可包括光度计或用于测量萤光素酶活性的其它装置。
在一些系统和/或套件中，相同的组件可以用于多个步骤。在一些系统和/或套件中，步骤由用户通过计算机输入自动化或控制，并且/或者其中液体处理机器人执行至少一个步骤。
因此，在某些实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中目标微生物的系统或套件，其包含：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组件，其中所述感染因子包含指示部分；用于在固体支持物上从样品中捕获微生物的组件；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染因子的组件；和用于检测指示部分的组件。在一些实施方案中，相同的组分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤(例如，过滤器组分)。一些实施方案另外包括用于测定样品中目标微生物的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。此类系统可以包括类似于上文针对快速检测微生物的方法所描述的那些的各种实施方案和子实施方案。在实施方案中，微生物是细菌，感染因子是噬菌体。在计算机化系统中，该系统可以是全自动的、半自动的，或者由用户通过计算机(或其某种组合)来指导。
在一些实施方案中，该系统可包括用于将目标微生物与样品中的其它组分分离的组分。
在一个实施方案中，本发明包括含有用于检测目标微生物的组件的系统或套件，其包括：用于将至少一种微生物与样品中的其它组分离的组件；用于用多个亲代感染因子感染至少一个微生物的组件；用于裂解至少一个受感染的微生物以释放微生物中存在的后代感染因子的组件；和用于以更高的灵敏度检测后代感染因子或由感染因子编码和表达的可溶性蛋白的组件，其中感染因子或感染因子的可溶性蛋白产物的检测表明样品中存在微生物。感染因子可包括携带
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指示基因的李斯特菌属特异性
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噬菌体。
该系统或套件可包括多种用于检测后代感染因子的组件。例如，在一个实施方案中，后代感染因子(例如，噬菌体)可包含指示部分。在一个实施方案中，后代感染因子(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制过程中表达的可检测部分，诸如可溶性萤光素酶蛋白。
在其它实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中目标微生物的套件，该系统包含：用于将样品与对目标微生物特异的感染因子一起孵育的组件，其中感染因子包含指示部分；用于在固体支持物上从样品中捕获微生物的组件；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染因子的组件；和用于检测指示部分的组件。在一些实施方案中，相同的组分可以用于捕获并且/或者孵育并且/或者洗涤的步骤。一些实施方案另外包含用于测定样品中目标微生物的量的组分，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。此类套件可包括与上文针对用于快速检测微生物的方法所述的那些类似的各自实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌，感染因子是噬菌体。
在一些实施方案中，套件可包含用于将目标微生物与样品中的其它组分分离的组件。
本发明的这些系统和套件包括各种组件。如本文中所用，术语“组分/组件”被广义地定义，并且包括适于执行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。所述组件不需要以任何特定的方式相互整体连接或定位。本发明包括组件相对于彼此的任何合适的布置。例如，组件不必在同一个房间。但在一些实施方案中，组件在整体单元中彼此连接。在一些实施方案中，相同的组件可以执行多个功能。
计算机系统和计算机可读介质
本技术中描述的系统或任何其组件可以以计算机系统的形式来实现。计算机系统的典型示例包括通用计算机、编程微处理器、微控制器、外围集成电路元件以及能够实现构成本技术的方法的步骤的其它设备或设备布置。
计算机系统可包括计算机、输入设备、显示单元和/或互联网。计算机还可包括微处理器。微处理器可以连接到通信总线。计算机还可以包括存储器。存储器可包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机系统还可包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，诸如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备还可以是用于将计算机程序或其它指令加载到计算机系统中的其它类似装置。计算机系统还可包括通信单元。通信单元允许计算机通过I/O接口连接到其它数据库和互联网。通信单元允许向其它数据库传输数据以及从其它数据库接收数据。通信单元可包括调制解调器、以太网卡或使计算机系统能够连接到数据库和网络诸如LAN、MAN、WAN和互联网的任何类似设备。因此，计算机系统可以方便用户通过输入设备的输入，系统可以通过I/O接口访问该输入设备。
计算设备通常包括为该计算设备的一般管理和操作提供可执行程序指令的操作系统，并且通常包括计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)存储指令，当由服务器的处理器执行时，允许计算设备执行其预期功能。计算设备的操作系统和一般功能的合适实现是已知的或商购获得的，并且容易由本领域普通技术人员实现，特别是根据本文的公开内容。
计算机系统执行存储在一个或多个存储元件中的一组指令，以便处理输入数据。存储元件也可以根据需要保存数据或其它信息。存储元件可呈存在于处理机中的信息源或物理存储元件的形式。
如上所述，该环境可以包括各种数据存储器和其它存储器和存储介质。这些可以驻留在各种位置，诸如在一个或多个计算机本地(和/或驻留在其中)的存储介质上，或者远离网络上的任何或所有计算机。在一组特定的实施方案中，信息可以驻留在本领域技术人员熟悉的存储区域网络(“SAN”)中类似地，用于执行属于计算机、服务器或其它网络设备的功能的任何必要文件在适当的情况下可以本地和/或远程存储。在系统包括计算设备的情况下，每个这样的设备可以包括可以经由总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这种系统还可包括一个或多个存储设备，诸如磁盘驱动器、光存储设备和固态存储设备，诸如随机存取存储器("RAM")或只读存储器("ROM")，以及可移动介质设备、存储卡、闪存卡等。
此类设备还可包括计算机可读存储介质读取器、通信设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通信设备等)，以及如上所述的工作存储器。计算机可读存储介质读取器可以与代表远程、本地、固定和/或可移动存储设备的计算机可读存储介质以及用于临时和/或更永久地包含、存储、传输和检索计算机可读信息的存储介质连接，或者被配置为接收所述计算机可读存储介质。该系统和各种设备通常还将包括位于至少一个工作存储器设备内的多个软件应用程序、模块、服务或其它元件，包括操作系统和应用程序，诸如客户端应用程序或网络浏览器。应当理解，替代实施方案可具有与上述不同的许多变化。例如，也可以使用定制的硬件并且/或者可能在硬件、软件(包括便携式软件，诸如小程序)或两者中实现特定元件。另外，可使用至诸如网络输入/输出设备的其它计算设备的连接。
用于包含代码或代码的部分的非瞬态存储介质和计算机可读介质可包括本领域已知或使用的任何适当的介质，包括存储介质和通信介质，诸如但不限于以任何方法或技术实现的易失性和非易失性、可移动和不可移动介质，用于存储和/或传输信息，诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其它存储技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其它光存储器、盒式磁带、磁带、磁盘存储器或其它磁存储设备，或可用于存储所需信息并可由系统设备访问的任何其它介质。基于本文提供的公开和教导，本领域普通技术人员将理解实现各种实施方案的其它方式和/或方法。
计算机可读介质可包括但不限于能够向处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其它存储设备。其它实例包括但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、诸如NAND闪存或或NOR闪存的闪存、ASIC、配置的处理器、光存储器、磁带或其它磁存储器，或者计算机处理器可以从中读取指令的任何其它介质。在一个实施方案中，计算设备可包括单一类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)。在其它实施方案中，计算设备可包括两种或更多种类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和高速缓存。计算设备可与一个或多个外部计算机可读介质，诸如外部硬盘驱动器或外部DVD或蓝光驱动器通信。
如上所述，该实施方案包括处理器，所述处理器被配置成执行计算机可执行程序指令并且/或者访问存储在存储器中的信息。指令可包括由编译器和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言编写的代码生成的处理器专用指令，所述计算机编程语言包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems,Mountain View,Calif.)。在一个实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其它实施方案中，该设备包括两个或更多个处理器。此类处理器可包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。此类处理器还可包括可编程电子设备，诸如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑器件(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电子可编程只读存储器(EPROM或EEPROM),或其它类似设备。
计算设备包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置成经由有线或无线通信链路进行通信。例如，网络接口可以允许通过以太网、IEEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外等网络进行通信。作为另一个实例，网络接口可以允许通过诸如CDMA、GSM、UMTS或其它蜂窝通信网络的网络进行通信。在一些实施方案中，网络接口可以允许诸如通过通用串行总线(USB)、1394FireWire、串行或并行连接或类似接口与另一设备的点对点连接。合适的计算设备的一些实施方案可包括用于在一个或多个网络上通信的两个或更多个网络接口。在一些实施方案中，除了网络接口之外或代替网络接口，计算设备可以包括数据存储。
合适的计算设备的一些实施方案可以包括诸如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、音频扬声器、一个或多个麦克风或任何其它输入或输出设备等多个外部或内部设备或与其通信。例如，计算设备可以与各种用户接口设备和显示器通信。显示器可以使用任何合适的技术，包括但不限于LCD、LED、CRT等。
由计算机系统执行的指令集可包括指示处理机执行特定任务诸如构成本技术的方法的步骤的各种命令。指令集可以呈软件程序的形式。另外，如在本技术中，软件可呈独立程序的集合、具有较大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式。该软件还可包括面向对象编程形式的模块化编程。处理机对输入数据的处理可以响应用户命令、先前处理的结果或另一处理机的请求。
虽然已经参考某些实施方案公开了本发明，但在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围和精神的情况下，对所描述的实施方案的许多修改、变更和改变是可能的。因此，本发明并不意图局限于所描述的实施方案，而是具有由所附权利要求及其等同物的语言所限定的全部范围。
实施例
以下实施例中描述的结果证明在缩短的得到结果的时间内检测到少量细胞，少至1个李斯特菌属细菌。
实施例1.从李斯特菌属特异性噬菌体产生和分离指示噬菌体的
使用如前所述的程序，通过同源重组产生了指示噬菌体李斯特菌属特异性LMA4.NANOLUC、LMA8.NANOLUC和其它李斯特菌属噬菌体。参见图1至图3，其中描述了来源于LMA4和LMA8的重组李斯特菌属噬菌体。
使用Illumina MiSeq系统，通过全基因组测序和从头序列组装获得这些噬菌体的基因组序列。基于相关噬菌体先前已知和注释的基因组，将晚期基因区和主要衣壳蛋白基因在新的噬菌体基因组上定位。设计和合成质粒来将
Figure BDA0003183463990000411
与适当的晚期基因启动子和核糖体结合位点一起插入，两侧是约200-500bp的匹配噬菌体序列，以促进同源重组。
在适当的抗生素选择下，用同源重组质粒转化目标细菌，并用它们各自的野生型噬菌体感染，以允许与质粒同源重组。在同源重组产生重组噬菌体基因组后，如前所述，将一系列滴度和富集步骤用于分离表达
Figure BDA0003183463990000412
的特异性重组噬菌体。
最后，进行大规模生产以获得适用于李斯特菌属的某些种的检测测定的高滴度原液。氯化铯等密度梯度离心可用于将噬菌体颗粒与污染性萤光素酶蛋白分离，以降低背景。在其它实施方案中，蔗糖等密度梯度离心可用于将噬菌体颗粒与污染性萤光素酶蛋白分离以降低背景。
实施例2.接种的海绵样品-李斯特菌属的海绵测定
EZ Reach聚氨酯海绵取样器用Dey/Engley肉汤预润湿，并搀入<1CFU的单核细胞增生李斯特菌，所述单核细胞增生李斯特菌从过夜培养物或用100CFU攻击细菌(阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii))稀释而来。
将海绵的手柄折断，将海绵放入袋中的培养基中。添加缓冲李斯特菌增菌肉汤(BLEB)(Remel)培养基(10或90mL)以覆盖尽可能多的海绵。然后轻轻按揉海绵，将细菌释放到培养基中，然后在35℃下富集16-18小时或24小时。富集后，轻轻按揉/挤压海绵以去除液体，然后将其移离袋中的培养基。然后轻轻按揉袋子，混合内容物。将150μL等分试样转移到96孔板中。然后将海绵放入培养基中，如有必要，在35℃下进一步富集。
在感染1小时和4小时后，用李斯特菌属噬菌体混合物测试海绵样品。简言之，向样品中加入噬菌体试剂(10μL)，样品在30℃下孵育1小时或4小时。最后，向每个孔中加入65μL萤光素酶预混合试剂，通过上下移液轻轻混合。加入底物3分钟后，在光度计(GloMax96)仪上读取样品(即，检测发光)。将海绵/拭子放回袋/管中，并在35℃下继续富集总共24小时。任选地，可以取等分试样，进一步富集并再次测试。
结果如图5A和图5B所示。大于3的信噪比(S/B)被认为是阳性的。基于先前的噬菌体表征，背景水平被确定为100RLU。这些实验表明，李斯特菌属噬菌体测试可在富集16-18小时和感染1小时后检测到单核细胞增生李斯特菌ATCC 19115的1CFU峰。图5A(10mL培养基)显示海绵样品1和4的李斯特菌属检测呈阴性(即,S/B<3.0)。海绵样品2、3、5和10CFU对照对于所有富集和感染时间都是阳性的。图5B(90mL培养基)显示海绵1对于李斯特菌属的检测呈阴性，而所有其它样品均具有阳性检测。这些数据表明，加入10mL培养基的海绵比加入90mL培养基的样品产生更好的信号，相对S/B更高。
因此，实验证明，对于所有尝试的条件(即，16至18小时富集-1小时感染、16至18小时富集-4小时感染、24小时富集-1小时感染和24小时富集-4小时感染)，从过夜培养物中检测1个CFU峰是可能的。
实施例3.环境表面样品-李斯特菌属的海绵检测法
用培养基中指定数量的细胞接种不锈钢表面。让细胞在表面上干燥，并在室温下保持18-24小时，然后用EZ Reach聚氨酯海绵取样器擦拭，所述取样器用Letheen培养基(World BioProducts)预湿润。单核细胞增生李斯特菌19115用作靶标，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)12600用作攻击菌株。
将海绵的手柄折断，将海绵放回袋中的培养基中。加入缓冲的李斯特菌增菌肉汤(BLEB)(Remel)培养基(20mL)，以覆盖培养基中尽可能多的海绵。轻轻按揉海绵，将细菌释放到培养基中，然后在35℃富集20小时。富集后，轻轻按揉海绵，挤压去除液体，然后远离袋中的培养基。轻轻按揉袋子，混合内容物。将150μL等分试样转移到96孔板中。如果需要进一步富集，将海绵放入培养基中并在35℃下孵育。
在感染1小时和4小时后，用李斯特菌属噬菌体混合物测试海绵样品。简言之，将噬菌体试剂(10μL)加入样品中，并在30℃下孵育4小时。最后，向每个孔中加入65μL萤光素酶预混合试剂，通过上下移液轻轻混合。加入底物3分钟后，在GloMax96仪上读取样品(即，检测发光)。
向样品中加入噬菌体试剂(10μL)，并在30℃下孵育4小时。最后，向每个孔中加入65μL萤光素酶预混合试剂，通过上下移液轻轻混合。加入底物3分钟(180秒)后在GloMax96仪上读取样品(即，检测发光)。
图6显示了从不锈钢表面拭子产生的RLU。产生RLU>300的样品被认为是阳性的。这些数据表明，李斯特菌属噬菌体测定可以通过20小时富集和4小时感染，在有非李斯特菌属细菌以10倍于目标李斯特菌属细菌的CFU水平存在的情况下检测单核细胞增生李斯特菌的100CFU表面接种。样品2和阴性对照对于单核细胞增生李斯特菌的检测呈阴性。所有其它样品，包括阳性对照，都是阳性的。与加标海绵实验相比，不锈钢的拭子需要更长的富集期和更高的CFU水平才能进行阳性检测。这可归因于几个变量，包括与来自过夜培养的细胞相比，对表面接种的细胞的损伤增加。表面接种的细胞通常会显著丧失活力。此外，利用海绵从表面回收细胞也是变化很大的。

Claims (25)

1.一种重组噬菌体，其中包含插入所述噬菌体基因组的晚期基因区的指示基因，其中所述重组噬菌体特异性感染李斯特菌属的某些种。
2.如权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体由LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A噬菌体之一构建。
3.如权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述指示基因被密码子优化，并且编码产生内在信号的可溶性蛋白质产物或与底物反应时产生信号的可溶性酶。
4.如权利要求1所述的重组噬菌体，其还在所述经密码子优化的指示基因上游包含非翻译区，其中所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
5.一种混合组合物，其包含至少一种根据权利要求1的重组噬菌体。
6.如权利要求5所述的混合组合物，其中至少一种重组噬菌体由LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A之一构建。
7.如权利要求5所述的混合组合物，其包含由LMA8、LP-ES1和LP-ES3A中的两种构建的至少两种重组噬菌体。
8.一种制备重组指示噬菌体的方法，其包括：
选择特异性感染目标致病菌的野生型噬菌体；
制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；
将所述同源重组质粒/载体转化到目标致病菌中；
用选择的野生型噬菌体感染所述转化的目标致病菌，从而允许所述质粒/载体与所述噬菌体基因组之间发生同源重组；以及
分离重组噬菌体的特定克隆。
9.如权利要求8所述的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括：
确定所述选择的噬菌体基因组的所述晚期区域中的天然核苷酸序列；
注释所述基因组并鉴定所述选择的噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计用于在所述主要衣壳蛋白基因下游同源重组的序列，其中所述序列包含经密码子优化的指示基因；以及
将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中。
10.如权利要求9所述的方法，其中设计序列还包括在所述经密码子优化的指示基因的上游插入包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点的非翻译区。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述同源重组质粒在所述经密码子优化的指示基因上游包含非翻译区，所述非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述野生型噬菌体是李斯特菌属特异性噬菌体，并且所述目标致病菌是单核细胞增生李斯特菌或其它李斯特菌属的某些种。
13.如权利要求8所述的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离显示所述指示基因表达的克隆的限制性稀释测定。
14.一种用于检测样品中的李斯特菌属的某些种的方法，所述方法包括：
将所述样品与混合组合物一起孵育，所述混合组合物包含至少一种根据权利要求1所述的李斯特菌属特异性重组噬菌体；以及
检测由所述重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测表明李斯特菌属的某些种存在于所述样品中。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种重组噬菌体由LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A之一构建。
16.如权利要求14所述的方法，其包括由LMA8、LP-ES1和LP-ES3A中的至少两种构建的至少两种重组噬菌体。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述样品是食品、环境、水或商业样品。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述方法在食品安全行业的标准尺寸的样品中检测少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述食品样品包括肉、鱼、蔬菜、蛋、乳制品、干食品或婴儿配方奶粉。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述样品首先在有利于生长的条件下孵育短于24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时的富集期。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述得出结果的总时间短于28小时、27小时、26小时、25小时、24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时。
22.如权利要求14所述的方法，其中通过检测所述指示剂产生的所述信号背景比为至少2.0或至少2.5或至少3.0。
23.一种检测李斯特菌属的某些种的套件，其包含源自李斯特菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
24.如权利要求23所述的套件，其还包括用于与指示剂反应以检测由所述重组噬菌体表达的所述可溶性蛋白产物的底物。
25.一种用于检测李斯特菌属的某些种的系统。其包含源自李斯特菌属特异性噬菌体的重组噬菌体。
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