CN114375330A - 产生用于检测李斯特菌属的突变噬菌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了用于产生具有改变的宿主范围的突变噬菌体的方法。此外，本申请公开了用于快速检测样品中的微生物(诸如李斯特菌属的多个种)的方法和系统。本申请还公开了一种遗传修饰的噬菌体，其包含在晚期基因区域中的指示基因。噬菌体(诸如李斯特菌属特异性的噬菌体)的特异性允许检测特定微生物，诸如李斯特菌属的多个种，并且可以放大指示信号以优化测定灵敏度。

Description

产生用于检测李斯特菌属的突变噬菌体的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月21日提交的美国临时专利申请号62/864,894的优先权。美国申请号62/864,894和16/776,417的公开内容特此通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于产生噬菌体的方法和得到的噬菌体。
背景技术
人们对提高生物、食品、水和临床样品中的细菌、病毒和其它微生物的检测灵敏度有着浓厚的兴趣。微生物病原体可以造成人类和家养动物的大量发病，以及巨大的经济损失。此外，鉴于由某些微生物(例如，李斯特菌属的多个种(Listeria spp.)、沙门氏菌属的多个种(Salmonella spp.)或葡萄球菌属的多个种(Staphylococcus spp.))污染的食品的摄入引起的危及生命的或致死的疾病的爆发，微生物的检测是美国食品和药物管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)以及美国农业部(USDA)的高度优先事项。
用于检测细菌的传统微生物学检验依赖于非选择性的和选择性的富集培养，然后在选择性培养基上铺板并进一步检验以确认可疑菌落。此类程序可能需要几天。已经研究了多种快速方法并将其引入实践以减少时间要求。但是，这些方法具有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链式反应(PCR)检验还包括一个扩增步骤，且因此具有非常高的灵敏度和选择性；但是，可以经济地进行PCR检验的样品大小是有限的。对于稀释的细菌悬浮液，大多数小的子样品将不含细胞，并因此仍需要纯化和/或冗长的富集步骤。
传统的生物富集所需的时间取决于样品的靶细菌群体的生长速率、样品基质的影响以及所需的灵敏度。在实践中，大多数高灵敏度方法都采用过夜孵育，并总共需要大约24小时。由于培养需要时间，这些方法可能需要长达三天，取决于要鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食品、水或其它产品可能已经进入牲畜或人类体内。此外，抗生素抗性细菌的增加和生物防御考虑使得水、食品和临床样品中的细菌病原体的快速鉴定成为全球范围内的重要优先事项。
由于噬菌体(bacteriophage，phage)的狭窄的宿主特异性范围，其可以用于检测食品、环境和临床样品中的致病菌。噬菌体的狭窄宿主范围可以用于检测潜在的病原细菌，同时排除无害细菌的检测。但是，噬菌体的特异性太强，无法检测在样品中存在的潜在有害细菌的每种血清型或物种。样品中感兴趣的细菌的检测可能需要使用噬菌体混合物。因此，扩大对特定宿主具有特异性的噬菌体的宿主范围以包括感兴趣的新靶宿主可能是有利的。
因此，需要产生具有扩大的宿主范围的噬菌体的方法和具有扩大的宿主范围的噬菌体。
发明内容
本公开内容的实施方案包括产生具有扩大的宿主范围的突变噬菌体(bacteriophage，phage)的方法和得到的噬菌体。本公开内容可以以多种方式实施。
在一个方面，本公开内容涉及一种产生具有扩大的宿主范围的突变噬菌体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)制备一系列以不同比例包含宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株的第一共培养混合物；(ii)将噬菌体菌株加入第一共培养混合物中的每一个中；(iii)在细菌培养条件下孵育第一共培养混合物和噬菌体菌株；(iv)从多个第一共培养物中的每一个收集噬菌体裂解物；(v)合并来自所述多个第一共培养物中的每一个的噬菌体裂解物；(vi)测定噬菌体裂解物以确定细菌宿主范围是否已经扩大；和(vii)分离具有扩大的宿主范围的突变噬菌体。
在另一个方面，本公开内容涉及得到的具有扩大的宿主范围的突变噬菌体，其中所述突变噬菌体能够感染宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株。
在其它情况下，利用具有狭窄宿主范围的噬菌体是有利的。因此，在另一个方面，本公开内容涉及一种产生具有减小的宿主范围的突变噬菌体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)突变编码噬菌体的尾部刺突蛋白的基因；(ii)从突变的噬菌体产生后代噬菌体裂解物；(iii)测定噬菌体裂解物以确定细菌宿主范围是否已经减小；和(iv)分离具有减小的宿主范围的突变噬菌体。
在另一个方面，本公开内容涉及一种重组噬菌体，其包含插入在具有扩大的宿主范围的突变噬菌体基因组的晚期基因区域中的指示基因。在某些实施方案中，所述重组噬菌体是遗传修饰的李斯特菌属特异性的噬菌体基因组。在某些实施方案中，所述重组噬菌体包含遗传修饰的噬菌体基因组，其衍生自特异性地识别李斯特菌属的多个种的噬菌体。在某些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性地感染一种或多种李斯特菌属的种。在一个实施方案中，所述重组噬菌体可以在有其它类型的细菌存在下区分宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株。
本文中还公开了用于制备重组指示剂噬菌体的方法。一些实施方案包括：选择特异性地感染靶病原细菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化进靶病原细菌中；用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原细菌，从而允许在质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；和分离重组噬菌体的特定克隆。在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体是李斯特菌属特异性的噬菌体。在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体是肌尾噬菌体，诸如T4、T4样病毒、李斯特菌属噬菌体LMTA-94、P100病毒或Vil-样。在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体感染李斯特菌属的多个种。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是短尾病毒，诸如T7-样病毒或Sp6-样病毒。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是LMA4和LMA8。LMA4和LMA8是肌尾噬菌体，可能属于P100病毒属。
在某些实施方案中，本发明包括一种用于检测样品中的感兴趣微生物的方法，所述方法包括下述步骤：将样品与感染感兴趣微生物的重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含插入在噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在感染宿主细菌后在噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物，和检测所述指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示感兴趣微生物存在于所述样品中。
具体实施方式
本文公开了产生具有扩大的宿主范围的噬菌体的方法和得到的突变噬菌体，其可用于检测检验样品(例如，生物、食品、水和环境样品)中的感兴趣微生物，诸如李斯特菌属的多个种。在没有富集培养的情况下进行的测定中，使用遗传修饰的传染物，可以在比先前认为可能的更短的时间范围内实现检测，或在某些实施方案中，用最小的孵育时间，在此期间微生物可能潜在繁殖。
在某些方面，本公开内容涉及一种用于检测感兴趣微生物的方法。所述方法可以使用传染物来检测感兴趣微生物，诸如李斯特菌属的多个种。例如，在某些实施方案中，感兴趣微生物是李斯特菌属的多个种，且传染物是特异性地感染李斯特菌属的多个种的噬菌体。在某些实施方案中，噬菌体已经突变以具有扩大的宿主范围并且能够感染单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多种血清型。因而，在某些实施方案中，所述方法可以包括通过将样品与感染感兴趣细菌的重组突变噬菌体一起孵育来检测样品中的感兴趣细菌。在某些实施方案中，所述重组突变噬菌体包含指示基因。在某些实施方案中，可以将指示基因插入噬菌体的晚期基因区域，使得在感染宿主细菌后在噬菌体复制过程中指示基因的表达导致指示蛋白产物的产生。所述方法可以包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示样品中存在感兴趣细菌。在某些实施方案中，指示蛋白是可溶性的。
本发明的方法和系统的实施方案可以应用于在多种情况下对多种微生物(例如，细菌)的检测和定量，包括、但不限于从食品、水和商业样品中检测病原体。本发明的方法迅速提供高检测灵敏度和特异性。在某些实施方案中，检测在噬菌体的单个复制周期内是可能的，这是出乎意料的。
定义
除非在本文中另外定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学及杂交相关使用的命名及其技术是本领域众所周知和常用的那些。已知的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如贯穿本说明书讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述，除非另外指出。如本领域中通常所完成的或如本文所述的，根据制造商的说明书，进行酶反应和纯化技术。结合本文描述的实验室规程和技术使用的命名法是本领域众所周知和常用的那些。
除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义：
本文中使用的术语“一个”、“一种”和“所述”可以表示一个或多个或者一种或多种，除非另外特别指出。
除非明确指出仅表示替代物，或者替代物是相互排斥的，否则术语“或”的应用用于指“和/或”，尽管本公开内容支持仅表示替代物和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可以是指至少第二或更多。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括用于确定该值的装置、方法的固有误差变化，或在样品之间存在的变化。
术语“固体支持物”或“支持物”是指提供在其上面可结合生物分子的基底和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，诸如微孔滴定板或多孔板)，或者固体支持物可以是在过滤器、阵列或移动支持物诸如珠或膜(例如，滤板、胶乳颗粒、顺磁颗粒或侧向流条)上的位置。
术语“结合剂”表示可以特异性地和选择性地结合第二种(即不同的)感兴趣分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，由于氢键合、范德华相互作用或静电或疏水相互作用，或者相互作用可以是共价的。术语“可溶性结合剂”表示不与固体支持物缔合(即，共价地或非共价地结合)的结合剂。
本文中使用的“分析物”表示被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，感兴趣的分析物可以与结合剂相互作用。如本文所述，术语“分析物”可以表示感兴趣的蛋白或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可能不具有生物学效应。分析物可能包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测的生物分子”或“报道物”或“指示剂”或“指示剂部分”表示可在定量测定中测量的分子。例如，指示剂部分可以包含可用于将底物转化为可测量的产物的酶。指示剂部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶)。或者，指示剂部分可以是可以定量的放射性同位素。或者，指示剂部分可以是荧光团。或者，可以使用其它可检测的分子。
本文中使用的“噬菌体”(“bacteriophage”或“phage”)包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开内容中，术语“噬菌体”(“bacteriophage”和“phage”)包括病毒诸如分枝杆菌噬菌体(诸如对于TB和paraTB)、真菌噬菌体(诸如对于真菌)、支原体噬菌体，以及表示这样的病毒的任何其它术语：所述病毒可以侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微观活生物体并利用它们进行自我复制。这里，“微观”是指最大尺寸为一毫米或更小。噬菌体是在自然界中进化出来的病毒，其使用细菌作为自我复制的手段。噬菌体如下实现这一点：将自身附着至细菌并将其DNA(或RNA)注射进该细菌中，并诱导该细菌复制噬菌体数百甚至数千次。这被称作噬菌体扩增。
本文中使用的“晚期基因区域”表示在病毒生命周期的晚期转录的病毒基因组区域。晚期基因区域通常包括最丰富表达的基因(例如，组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因同义，并包括具有结构和组装功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中转录，例如从感染后8分钟到裂解，I类(例如，RNA聚合酶)早至4-8分钟，且II类为6-15分钟，因此II和III的时间存在重叠。晚期启动子是在这样的晚期基因区域中天然存在并具有活性的启动子。
本文中使用的“富集培养”表示传统培养，诸如在有利于微生物繁殖的培养基中孵育，且不应与词语“富集”的其它可能用法混淆，诸如通过除去样品的液体组分以浓缩其中所含的微生物的富集，或不包括微生物繁殖的传统促进的其它富集形式。在本文描述的方法的一些实施方案中，可以采用一段时间的富集培养。
本文中使用的“宿主范围”表示病原体使用的宿主物种的数量。宿主范围描述了噬菌体能够感染的生物体的宽度，对宿主范围的限制源于噬菌体、宿主或环境特征。
本文中使用的“重组的”表示通常在实验室中进行的遗传(即，核酸)修饰，以将原本不会被发现的遗传物质聚集在一起。该术语在本文中与术语“修饰的”互换使用。
本文中使用的“RLU”表示由光度计(例如，
Figure BDA0003419843990000061
96)或检测光的类似仪器测量的相对光单位。例如，萤光素酶与适当底物(例如，
Figure BDA0003419843990000062
与
Figure BDA0003419843990000063
)之间的反应的检测通常在检测到的RLU中报告。
本文中使用的“达到结果的时间”表示从样品孵育开始到产生结果的总时间量。达到结果的时间不包括任何确认性检验时间。在已经产生结果后的任何时间可以进行数据收集。
突变噬菌体的产生
产生具有扩大的宿主范围的突变噬菌体的方法的实施方案开始于选择用于遗传修饰的噬菌体。一些噬菌体对靶细菌具有高特异性。这为高特异性检测提供了机会。在某些情况下，有利的是，扩大高特异性噬菌体的宿主范围以允许在单个测定中检测多种潜在有害细菌菌株。
噬菌体的宿主范围被认为是噬菌体能够有效感染的细菌的宽度(即属、种或菌株)。一些噬菌体的宿主范围是相当狭窄的，仅具有感染同一物种内的少数菌株的能力。其它噬菌体可以感染多个细菌种，有时跨不同属。但是，大多数噬菌体被认为具有相对狭窄的宿主范围。这可能部分地由于噬菌体的宿主结合蛋白的特异性、在感染期间的生化相互作用、相关原噬菌体或特定质粒的存在、以及噬菌体抗性机制。
在某些情况下，利用具有非常广宿主范围的噬菌体是有利的。因此，在一个方面，本公开内容涉及一种产生具有扩大的宿主范围的突变噬菌体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)制备一系列以不同比例包含宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株的第一共培养混合物；(ii)将噬菌体菌株加入第一共培养混合物中的每一个中；(iii)在细菌培养条件下孵育第一共培养混合物和噬菌体菌株；(iv)从所述多个第一共培养物中的每一个收集噬菌体裂解物；(v)合并来自所述多个第一共培养物中的每一个的噬菌体裂解物；(vi)测定噬菌体裂解物以确定细菌宿主范围是否已经扩大；和(vii)分离具有扩大的宿主范围的突变噬菌体。
在其它情况下，利用具有狭窄宿主范围的噬菌体是有利的。因而，在另一个方面，本公开内容涉及一种产生具有减小的宿主范围的突变噬菌体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)突变编码噬菌体的尾部刺突蛋白的基因；(ii)从突变的噬菌体产生后代噬菌体裂解物；(iii)测定噬菌体裂解物以确定细菌宿主范围是否已经减小；和(iv)分离具有减小的宿主范围的突变噬菌体。
在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体是李斯特菌属特异性的噬菌体。在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体来自噬菌体的有尾噬菌体目(Caudovirales)。有尾噬菌体目是具有双链DNA(dsDNA)基因组的有尾噬菌体目。有尾噬菌体目的每个病毒体具有含有病毒基因组的二十面体头部和柔性的尾部。有尾噬菌体目包含5个噬菌体科：肌尾噬菌体科(Myoviridae)(长收缩性尾部)、长尾病毒科(Siphoviridae)(长非收缩性尾部)、短尾病毒科(Podoviridae)(短非收缩性尾部)、Ackermannviridae和Herelleviridae。术语肌尾噬菌体可以用于描述具有二十面体头部和长收缩性尾部的任何噬菌体，其涵盖在肌尾噬菌体科和Herelleviridae科内的噬菌体。在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体是肌尾噬菌体科的成员，诸如，李斯特菌属噬菌体B054、李斯特菌属噬菌体LipZ5、李斯特菌属噬菌体PSU-VKH-LP041和李斯特菌属噬菌体WIL-2。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是Herelleviridae科的成员。在Herelleviridae科下的Pecentumvirus属包括噬菌体诸如李斯特菌属噬菌体LMSP-25、李斯特菌属噬菌体LMTA-148、李斯特菌属噬菌体LMTA-34、李斯特菌属噬菌体LP-048、李斯特菌属噬菌体LP-064、李斯特菌属噬菌体LP-083-2、李斯特菌属噬菌体LP-125、李斯特菌属病毒P100、李斯特菌属噬菌体List-36、李斯特菌属噬菌体WIL-1、李斯特菌属噬菌体vB_LmoM_AG20和李斯特菌属病毒A511。LMA4和LMA8同样也属于Herelleviridae科下的pecentumvirus属。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是LMA4或LMA8。在某些情况下，选择的野生型噬菌体是LP-ES3A，其衍生自A511，但是已经被改造成能够感染单核细胞增生李斯特菌的血清型3A。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是Ackermannviridae科的成员。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是长尾病毒科的成员，该科包括李斯特菌属噬菌体A006、A118、A500、B025、LP-026、LP-030-2、LP-030-3、LP-037、LP-101、LP-110、LP-114、P35、P40、P70、PSA、vB_LmoS_188和vB_Lmos_293。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是LP-ES1。LP-ES1同样也属于长尾病毒科下的Homburgvirus属。
在某些实施方案中，产生具有扩大的宿主范围的突变噬菌体的方法包括鉴定和选择对感兴趣细菌特异性的噬菌体。在某些实施方案中，所述感兴趣细菌是潜在有害细菌。在其它实施方案中，选择的噬菌体能够感染宿主细菌菌株，但是不能感染靶宿主细菌菌株。宿主细菌菌株是选择的噬菌体能够感染的任何细菌菌株。靶宿主细菌菌株是选择的噬菌体不能感染的任何细菌菌株。在某些实施方案中，选择的噬菌体被突变以能够感染靶宿主细菌菌株。
在其它实施方案中，产生具有减小的宿主范围的突变噬菌体的方法包括鉴定和选择对感兴趣细菌特异性的噬菌体。在某些实施方案中，所述感兴趣细菌是潜在有害细菌。在其它实施方案中，选择的噬菌体能够感染宿主细菌菌株，但是也能够感染非靶宿主细菌菌株。宿主细菌菌株是选择的噬菌体能够感染的任何细菌菌株。非靶宿主细菌菌株是对于期望用途而言不利的、选择的噬菌体能够感染的任何细菌菌株。在某些实施方案中，选择的噬菌体被突变以不能感染非靶宿主细菌菌株。
李斯特菌属含有七个种(单核细胞增生李斯特菌、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)、Listeria martii和格氏李斯特菌(Listeriagrayi))。已知只有两个种具有致病性：单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌(以前的单核细胞增生李斯特菌血清型5)。但是，伊氏李斯特菌主要感染动物，很少引起人类疾病。血清分型在物种水平以下区分李斯特菌属的分离株。根据菌体抗原(O)和鞭毛抗原(H)的变异对单核细胞增生李斯特菌菌株进行血清分型。细菌的表面覆盖着脂多糖(LPS)，LPS的最外部分被称为O抗原。菌体抗原存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中。鞭毛是辅助细菌行进的尾状结构。鞭毛的细长线状部分被称作H抗原。
单核细胞增生李斯特菌具有高的遗传多样性和克隆群体结构。识别出了单核细胞增生李斯特菌的12种血清型(1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c、4d、4e和7)。已经描述了在单核细胞增生李斯特菌内的两个主要种系发生分支。第一分支由血清型1/2b、3b、4b、4d和4e组成，且第二分支由血清型1/2a、1/2c、3a和3c组成。此外，还已经描述了不太常见的血清型4a和4c，并构成第三分支。三种血清型(1/2a、1/2b和4b)是导致大多数临床病例的原因。从食品和环境中分离出的单核细胞增生李斯特菌中的超过50％是血清型1/2(尤其是1/2a和1/2b)。但是，血清型4b菌株是食源性人李斯特菌病爆发的最普遍原因。
一些噬菌体具有狭窄宿主范围，能够感染单核细胞增生李斯特菌的某些血清型，但不能感染其它血清型。例如，一些噬菌体对单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)具有特异性，但无法检测单核细胞增生李斯特菌的其它血清型，例如，单核细胞增生李斯特菌51782(血清型3a)。在某些实施方案中，选择的噬菌体对单核细胞增生李斯特菌的一种血清型具有特异性，但不能感染单核细胞增生李斯特菌的另一种血清型。在某些情况下，选择的噬菌体对单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)具有特异性，但不能感染单核细胞增生李斯特菌51782(血清型3a)。
已知一些噬菌体具有广泛的宿主范围，能够感染多个属的细菌种。例如，噬菌体Mu能够感染大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和肠杆菌属(Enterobacter)的种。类似地，已知一些噬菌体在特定细菌属内具有广泛的宿主范围。例如，多种李斯特菌属特异性的噬菌体，包括A511和P100，能够感染单核细胞增生李斯特菌的几种血清型，以及李斯特菌属的其它多个种。
对于某些应用，使用具有广泛宿主范围的李斯特菌属特异性的噬菌体可能是有利的。对于其它应用，使用能够感染李斯特菌属的多个种的李斯特菌属特异性的噬菌体可能是有利的。因而，在某些实施方案中，噬菌体被突变以能够感染李斯特菌属的至少2、3、4、5、6和7个种。在其它实施方案中，噬菌体被突变以能够感染单核细胞增生李斯特菌的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种血清型。
在某些实施方案中，所述方法包括制备一系列以不同比例包含宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株的第一共培养混合物。在其它实施方案中，分别培养宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株以得到各自的储备培养物。在某些实施方案中，所述宿主细菌菌株是针对单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)。在其它实施方案中，所述靶细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌51782(血清型3a)。在其它实施方案中，所述靶细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌血清型1/2a。在某些实施方案中，所述靶细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌血清型1/2b。在其它实施方案中，所述靶细菌菌株包含下述单核细胞增生李斯特菌血清型中的一种或多种：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4c、4d、4e和7。
在分别培养宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株的体积后(它们从未在选择的感兴趣噬菌体存在下培养)，将细菌培养物以不同的比例相互组合以创建一系列共培养物。在一种情况下，多个第一共培养物的系列包含1:0、9:1、1:1、1:9和0:1比例的宿主细菌菌株:靶宿主细菌菌株。在其它情况下，所述多个第一共培养物包含在1:0至0:1的任何合适比例。
在其它实施方案中，所述方法包括将噬菌体菌株加入第一共培养混合物中的每一个中。共培养与噬菌体的比例可能随造成生产性培养感染的噬菌体/宿主最小感染复数(MOI)而异。在一些情况下，MOI是至少0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0。在某些实施方案中，MOI是1.0。在某些实施方案中，所述噬菌体菌株对李斯特菌属的多个种具有特异性。在其它实施方案中，所述噬菌体菌株对单核细胞增生李斯特菌具有特异性。在其它实施方案中，所述噬菌体对单核细胞增生李斯特菌的一种血清型具有特异性。例如，选择的噬菌体可能对单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)具有特异性。在某些情况下、噬菌体选自A511、P100、LMTA-94、LMA4、LMA8、P70、LP-ES1、LP-ES3A。
在某些情况下，所述方法包括在细菌培养条件下孵育第一共培养混合物和噬菌体菌株。适合宿主和/或靶宿主生物的生长培养基由1.2-1.5％琼脂制成，倒入无菌培养皿中，并使其凝固以产生“基层”。将300μL处于对数中期的细菌培养物与100μL噬菌体混合，并在室温下在摇动下孵育15-20分钟。然后将感染的培养物与适用于生长的细菌的4mL熔融(50-55℃)培养基(用0.7-1.0％琼脂制成)混合，并倒在培养皿中的琼脂基层的顶部上面。使“顶层”冷却至室温并固化，然后在所培养的细菌菌株的最佳生长条件下孵育12-15小时。
在某些实施方案中，所述方法包括从多个第一共培养物中的每一个收集噬菌体裂解物。在某些实施方案中，在孵育之后，从每个比例的第一共培养混合物中分离噬菌体裂解物。在某些实施方案中，将每种共培养混合物离心并且过滤上清液以获得噬菌体裂解物。例如，可以将每种共培养物在室温下以3220×g离心20分钟。在某些实施方案中，所述过滤器小于0.75、0.65、0.55、0.45、0.35、0.25或0.15μm。在某些实施方案中，所述过滤器是0.45μm。在某些情况下，将来自多个第一共培养物中的每一个的噬菌体裂解物合并以获得单一体积的噬菌体裂解物。
在某些实施方案中，所述方法包括测定噬菌体裂解物以确定细菌宿主范围是否已经扩大。在某些情况下，将合并的噬菌体裂解物铺板在鉴定的宿主菌株上和选择的靶宿主菌株上以形成单个噬斑。例如，可以使用双重覆盖测定来检查噬菌体对宿主和靶宿主生物体的特异性。将宿主细菌和靶宿主细菌的原初对数中期培养物繁殖并用于双重覆盖测定中。如果形成噬斑形成单位(PFU)，则检测到针对在测定中使用的生物体的感染活性。此步骤确保对原始宿主的感染活性不会丢失，并暴露已经经历期望的宿主扩大事件的突变噬菌体。
在某些实施方案中，如本文详细描述的，然后将合并的噬菌体裂解物传代到多个第一共培养物中，分离，并再次测定。重复传代，直到检测到感染靶宿主细菌菌株的突变噬菌体。在某些实施方案中，将噬菌体传代至少2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
在某些实施方案中，所述方法包括分离具有扩大的宿主范围的突变噬菌体。在确认针对宿主和靶宿主生物体的活性之后，所述方法包括分离突变噬菌体。在某些实施方案中，然后将分离的突变噬菌体群体扩增以产生突变噬菌体的储备物。
公开的方法提出了造成噬菌体感染预定细菌宿主(否则它不会感染)的程序。
因此，本发明的方法利用与传染物相关的结合剂的高特异性，所述结合剂识别并结合感兴趣的特定微生物。
在其它应用中，使用具有更狭窄宿主范围的噬菌体可能是有利的。例如，使用李斯特菌属特异性的噬菌体可能是有利的，其仅能感染临床上有关的血清型(1/2a、1/2b和4b)且不能感染非致病性李斯特菌血清型。因而，在某些实施方案中，噬菌体被突变以能够感染单核细胞增生李斯特菌的致病性血清型且不能感染单核细胞增生李斯特菌的非致病性血清型。
在某些实施方案中，通过修饰负责宿主特异性的蛋白，可以减少或改变噬菌体的宿主范围。细菌宿主特异性可以由细胞壁-结合结构域(CBD)或在噬菌体中存在的其它蛋白决定。CBD对于特异性细胞壁识别是重要的，且可以存在于内溶素或spanin或尾丝或尾部刺突蛋白中或来自内溶素或spanin或尾丝或尾部刺突蛋白。例如，尾部刺突蛋白结合细菌宿主的细胞表面并介导细菌宿主识别。因此，尾部刺突蛋白的突变可以用于改变突变的噬菌体的识别特定细菌菌株的能力。
因此，在某些实施方案中，可以突变编码尾丝或尾部刺突蛋白的基因以改变或降低特定噬菌体的特异性。例如，噬菌体可能具有两种尾部刺突蛋白：一种提供对第一单核细胞增生李斯特菌血清型(例如，4b)的特异性，且第二种提供对第二单核细胞增生李斯特菌血清型(例如，7)的特异性。因而，在某些实施方案中，可以突变一种尾部刺突蛋白以改变噬菌体的特异性。可以使用本领域公知的用于突变噬菌体的任何分子方法来改变尾丝/尾部刺突蛋白，从而缩小噬菌体的特异性。例如，可以对噬菌体进行随机诱变方案。
在某些情况下，噬菌体基因组可能被划分为重叠的DNA片段。编码感兴趣的尾部刺突蛋白(即，对不感兴趣的血清型特异性的尾部刺突蛋白)的片段可以使用易错PCR进行扩增以在基因内引入定向诱变。然后可以重新组装基因组DNA的片段以产生噬菌体基因组的文库。然后可以将合并的噬菌体基因组转染到李斯特菌属中，从而产生突变的后代噬菌体。然后可以测定后代噬菌体在感兴趣的李斯特菌属菌株上的噬斑形成。然后可以分离具有期望特异性的活噬菌体突变体。
因而，在某些实施方案中，本公开内容涉及一种产生具有减小的宿主范围的突变噬菌体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(i)突变编码噬菌体的尾部刺突蛋白的基因；(ii)从突变的噬菌体产生后代噬菌体裂解物；(iii)测定噬菌体裂解物以确定细菌宿主范围是否已经减小；和(iv)分离具有减小的宿主范围的突变噬菌体。
指示剂突变噬菌体
如本文更详细描述的，本公开内容的组合物和方法可以包含用于检测致病性微生物的传染物。在某些实施方案中，本公开内容包含重组指示剂突变噬菌体，其中所述噬菌体基因组被遗传修饰以包括指示剂或报道基因。在某些实施方案中，本公开内容可以包括包含重组突变噬菌体的组合物，所述重组突变噬菌体具有整合到先前突变的噬菌体的基因组中的指示基因。在某些实施方案中，根据本文详细描述的方法产生突变噬菌体。在某些实施方案中，所述突变噬菌体具有扩大的和/或缩小的宿主范围。
重组指示剂突变噬菌体可以包括报道基因或指示基因。在传染物的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制期间指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，可以将指示基因插入突变噬菌体的晚期基因区域。晚期基因的表达水平通常高于其它噬菌体基因，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区域可以是III类基因区域并且可以包括主要衣壳蛋白的基因。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)用于主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列。其它实施方案包括设计(和任选地制备)用于主要衣壳蛋白基因上游的同源重组的序列。在某些实施方案中，所述序列包含在非翻译区之后的密码子优化的报道基因。非翻译区可以包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体来自噬菌体的有尾噬菌体目。有尾噬菌体目是具有双链DNA(dsDNA)基因组的有尾噬菌体目。有尾噬菌体目的每个病毒体具有含有病毒基因组的二十面体头部和柔性的尾部。有尾噬菌体目包含5个噬菌体科：肌尾噬菌体科(Myoviridae)(长收缩性尾部)、长尾病毒科(Siphoviridae)(长非收缩性尾部)、短尾病毒科(Podoviridae)(短非收缩性尾部)、Ackermannviridae和Herelleviridae。术语肌尾噬菌体可以用于描述具有二十面体头部和长收缩性尾部的任何噬菌体，其涵盖在肌尾噬菌体科和Herelleviridae科内的噬菌体。在某些实施方案中，选择的野生型噬菌体是肌尾噬菌体科的成员，诸如，李斯特菌属噬菌体B054、李斯特菌属噬菌体LipZ5、李斯特菌属噬菌体PSU-VKH-LP041和李斯特菌属噬菌体WIL-2。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是Herelleviridae科的成员。在Herelleviridae科下的Pecentumvirus属包括噬菌体诸如李斯特菌属噬菌体LMSP-25、李斯特菌属噬菌体LMTA-148、李斯特菌属噬菌体LMTA-34、李斯特菌属噬菌体LP-048、李斯特菌属噬菌体LP-064、李斯特菌属噬菌体LP-083-2、李斯特菌属噬菌体LP-125、李斯特菌属病毒P100、李斯特菌属噬菌体List-36、李斯特菌属噬菌体WIL-1、李斯特菌属噬菌体vB_LmoM_AG20和李斯特菌属病毒A511。LMA4和LMA8同样也属于Herelleviridae科下的pecentumvirus属。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是LMA4或LMA8。在某些情况下，选择的野生型噬菌体是LP-ES3A，其衍生自A511但是已经被改造成能够感染单核细胞增生李斯特菌的血清型3A。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是Ackermannviridae科的成员。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是长尾病毒科的成员，其包括李斯特菌属噬菌体A006、A118、A500、B025、LP-026、LP-030-2、LP-030-3、LP-037、LP-101、LP-110、LP-114、P35、P40、P70、PSA、vB_LmoS_188和vB_Lmos_293。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是LP-ES1。LP-ES1同样也属于长尾病毒科下的Homburgvirus属。
在某些实施方案中，指示剂噬菌体衍生自李斯特菌属特异性的噬菌体。指示剂噬菌体可以从Pecentumvirus、Tequatravirus、ViI、Kuttervirus、Homburgvirus、A511、P100、P70、LMTA-94、LMA4、LMA8、P70、LP-ES1、LP-ES3A或另一种噬菌体构建，所述另一种噬菌体的基因组与李斯特菌属噬菌体LMTA-94、P70、T7、T7-样、T4、T4-样、李斯特菌属多个种特异性的噬菌体、ViI或ViI-样(Kuttervirus，按照GenBank/NCBI)噬菌体具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。在其它实施方案中，选择的野生型噬菌体是A511、P100、P70、LP-ES1、LP-ES3A、LMA4或LMA8。在某些实施方案中，所述指示剂噬菌体衍生自对特定致病性微生物高特异性的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失，且因此与许多商购可得的噬菌体相比，修饰后的噬菌体可能与野生型传染物更加相似。环境衍生的噬菌体可能对在环境中发现的细菌更具特异性，且因此在遗传上与商购可得的噬菌体不同。
在本发明的另一个方面，混合组合物包含至少一种类型的重组噬菌体。在某些实施方案中，混合组合物包含至少一种类型的从LMA4、LMA8、A511、P70、LP-ES1和LP-ES3A构建的重组噬菌体。在其它实施方案中，所述混合组合物包含至少一种类型的从LMA8、LP-ES1和LP-ES3A构建的重组噬菌体。
此外，被认为是非必需的噬菌体基因可能具有未被识别的功能。例如，一个明显非必需的基因可能在提高裂解量方面具有重要的功能，诸如在组装中的细微切割、适配或修剪功能。因此，删除基因以插入指示剂可能是有害的。大多数噬菌体可以包装比其天然基因组大几个百分点的DNA。考虑到这一点，较小的指示基因对于修饰噬菌体而言(尤其是修饰具有较小基因组的噬菌体)可能是更合适的选择。OpLuc和
Figure BDA0003419843990000141
蛋白仅约20kDa(编码序列大约500-600bp)，而FLuc是约62kDa(编码序列大约1,700bp)。相比之下，T7的基因组为约40kbp，而T4的基因组为约170kbp，李斯特菌属特异性的噬菌体的基因组为约157kbp。此外，报道基因不应当由细菌内源性地表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应产生高信号/背景比，并应易于以及时方式检测。Promega的
Figure BDA0003419843990000151
是一种经修饰的细角刺虾(Oplophorus gracilirostris，深海虾)萤光素酶。在某些实施方案中，与Promega的
Figure BDA0003419843990000152
咪唑并吡嗪酮底物(furimazine)组合的
Figure BDA0003419843990000153
可以提供具有低背景的稳健信号。
在某些指示剂突变噬菌体实施方案中，指示基因可以插入非翻译区以避免功能基因的破坏，使野生型噬菌体基因保持完整，这在感染非实验室细菌菌株时可导致更大的适合性。另外，在所有三个读码框中都包含终止密码子可能有助于通过减少连读(read-through，也称作泄漏表达)来增加表达。这种策略还可以消除在低水平产生融合蛋白的可能性，这将表现为无法与噬菌体分离的背景信号(例如，萤光素酶)。
指示基因可以表达多种生物分子。指示基因是表达可检测产物或表达产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可以使用多种类型的萤光素酶。在替代实施方案中，并且如本文更详细描述的，萤光素酶是刺虾(Oplophorus)萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶(Renilla luciferase)或经工程改造的萤光素酶之一。在某些实施方案中，萤光素酶基因源自刺虾。在某些实施方案中，指示基因是遗传修饰的萤光素酶基因，诸如
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因而，在某些实施方案中，本发明包括遗传修饰的噬菌体，其包含在晚期(III类)基因区域中的非噬菌体指示基因。在某些实施方案中，非天然指示基因处于晚期启动子的控制之下。使用病毒晚期基因启动子会确保报道基因(例如，萤光素酶)不仅像病毒衣壳蛋白一样高水平表达，而且不会像内源性细菌基因或甚至早期病毒基因那样关闭。
在某些实施方案中，所述晚期启动子是Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus或Kuttervirus启动子或另一种与在选择的野生型噬菌体中发现的类似(即，没有遗传修饰)的噬菌体启动子。晚期基因区域可以是III类基因区域，且噬菌体可以衍生自李斯特菌属噬菌体LMTA-94、P70、A511、LP-ES1、LP-ES3A、LMA4、LMA8、Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus、Kuttervirus、T7、T4、T4-样、ViI、李斯特菌属多个种特异性的噬菌体或另一种野生型噬菌体，所述另一种野生型噬菌体的基因组与LMTA-94、LMA4、LMA8、Pecentumvirus、Tequatravirus、Homburgvirus、Kuttervirus、T7、T4、ViI或李斯特菌属特异性的噬菌体具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性。Pecentumvirus晚期基因启动子不同于T4或Tequatravirus启动子，因为它不仅包含-10区域，还包含-35区域。该-35区域不同于在大多数细菌启动子中发现的标准-35区域。
对传染物的遗传修饰可以包括对核酸的小片段、基因的主要部分或整个基因的插入、缺失或置换。在某些实施方案中，插入或置换的核酸包含非天然序列。可以将非天然指示基因插入到噬菌体基因组中，使其处于噬菌体启动子的控制之下。因而，在某些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的部分。也就是说，在某些实施方案中，可以构造遗传修饰使得指示蛋白产物不包含野生型噬菌体的多肽。在某些实施方案中，指示蛋白产物是可溶性的。在某些实施方案中，本发明包括一种用于检测感兴趣细菌的方法，其包括将检验样品与这样的重组噬菌体一起孵育的步骤。
在某些实施方案中，在感染宿主细菌后的后代噬菌体中指示基因的表达产生游离的、可溶性的蛋白产物。在某些实施方案中，非天然指示基因与编码结构噬菌体蛋白的基因不相邻，因此不产生融合蛋白。与利用检测部分与衣壳蛋白的融合体(即融合蛋白)的系统不同，本发明的一些实施方案表达可溶性的指示剂或报道物(例如，可溶性的萤光素酶)。在某些实施方案中，指示剂或报道物理想地不含噬菌体结构。也就是说，指示剂或报道物不附着至噬菌体结构。因此，指示剂或报道物的基因不与重组噬菌体基因组中的其它基因融合。这可能会大大提高测定的灵敏度(低至单个细菌)，并简化测定，从而对于一些实施方案允许测定在两个小时或更短时间内完成，而不是几个小时(因为产生可检测的融合蛋白的构建体需要额外的纯化步骤)。此外，融合蛋白的活性可能低于可溶性蛋白，这是由于例如可能改变酶活性位点的构象或对底物的接近的蛋白折叠约束。例如，如果浓度是10个细菌细胞/mL样品，则不到两小时对于测定可能就是足够的。
此外，根据定义，融合蛋白限制了噬菌体中与蛋白亚基相连的部分的数目。例如，使用设计充当融合蛋白平台的商购系统将产生融合部分的大约415个拷贝，其对应于每个T7噬菌体颗粒中基因10B衣壳蛋白的大约415个拷贝。如果没有这种约束，可以预期受感染的细菌会表达比噬菌体能容纳的多得多的指示蛋白产物(例如，萤光素酶)拷贝。此外，大的融合蛋白，诸如衣壳-萤光素酶融合体，可能抑制噬菌体颗粒的组装，从而产生较少的噬菌体后代。因此，可溶性的非融合指示基因产物可能是优选的。
在某些实施方案中，指示剂噬菌体编码报道物，诸如可检测的酶。指示基因产物可以产生光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在某些实施方案中，这些酶可充当指示蛋白产物。在某些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示蛋白产物。在某些实施方案中，刺虾萤光素酶是指示蛋白产物。在某些实施方案中，
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是指示剂部分。其它经工程改造的萤光素酶或产生可检测信号的其它酶也可以是适当的指示蛋白产物。
在某些实施方案中，可溶性指示蛋白的使用消除了从受感染的样品细胞的裂解物中除去污染性亲代噬菌体的需要。使用融合蛋白系统，用于感染样品细胞的任何噬菌体都会具有附着的检测部分，并且与同样含有检测部分的子代噬菌体无法区分。由于样品细菌的检测依赖于新创建的(从头合成的)检测部分的检测，因此使用融合构建体需要额外的步骤来将旧的(亲代)部分与新创建的(子代噬菌体)部分分开。这可以如下实现：在噬菌体生命周期完成之前洗涤受感染的细胞多次，通过物理或化学方法灭活在感染后多余的亲代噬菌体，和/或用结合部分(诸如生物素)对亲代噬菌体进行化学修饰，所述结合部分然后可以结合和分离(诸如通过链霉抗生物素蛋白包被的琼脂糖珠)。但是，即使进行了所有这些除去尝试，当使用高浓度的亲代噬菌体来确保感染少量样品细胞时，亲代噬菌体仍可能残留，从而产生背景信号，其可能掩盖来自受感染细胞后代噬菌体的信号的检测。
相比之下，对于在本发明的某些实施方案中表达的可溶性指示蛋白产物，不需要从最终裂解物中纯化亲代噬菌体，因为亲代噬菌体不具有任何附着的指示蛋白。因此，在感染后存在的任何指示蛋白都必须从头产生，表明受感染的一种或多种细菌的存在。为了利用这种益处，亲代噬菌体的产生和制备可以包括从在细菌培养物中产生亲代噬菌体的过程中产生的任何游离指示蛋白中纯化噬菌体。可以采用标准的噬菌体纯化技术来纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案，诸如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱法和透析或衍生技术(诸如Amicon商标浓缩器-Millipore,Inc.)。氯化绝等密度超速离心可用作本发明的重组噬菌体制备的一部分，以将亲代噬菌体颗粒与噬菌体在细菌宿主中增殖后产生的污染性萤光素酶蛋白分离。以此方式，本发明的亲代重组噬菌体基本上不含在细菌生产过程中产生的任何萤光素酶。存在于噬菌体储液中的残留萤光素酶的除去可以显著降低当重组噬菌体与检验样品一起孵育时观察到的背景信号。
在修饰的噬菌体的某些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如，来自Pecentumvirus、Homburgvirus、T7、T4、ViI或LMA4/8)对转录组装进噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因的同一噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力。这些蛋白是由噬菌体产生的最丰富的蛋白，因为每个噬菌体颗粒包含这些分子的数十或数百个拷贝。病毒晚期启动子的使用可以确保萤光素酶指示蛋白的最佳高水平表达。源自衍生出指示剂噬菌体的原始野生型噬菌体、对其具有特异性或在其中具有活性的晚期病毒启动子(例如，Pecentumvirus、Homburgvirus、T4、T7、ViI或LMA4/8晚期启动子，其具有Pecentumvirus、T4、基于T7-、ViI-或LMA-的系统)可以进一步确保指示蛋白的最佳表达。标准的细菌(非病毒/非噬菌体)启动子在某些情况下的应用可能不利于表达，因为这些启动子在噬菌体感染期间通常会被下调(为了使噬菌体优先将细菌资源用于噬菌体蛋白生产)。因此，在某些实施方案中，优选地将噬菌体工程改造成编码和以高水平表达可溶性(游离)指示蛋白，使用基因组中不使表达受限于噬菌体结构组分的亚基数量的位置。
本公开内容的组合物可以包含一种或多种野生型或遗传修饰的传染物(例如，噬菌体)和一种或多种指示基因。在某些实施方案中，组合物可以包括不同指示剂噬菌体的混合物，所述不同指示剂噬菌体可以编码和表达相同的或不同的指示蛋白。在某些实施方案中，噬菌体的混合物包含至少两种不同类型的重组噬菌体。
使用突变噬菌体检测李斯特菌属多个种的方法
如本文中所指出的，在某些实施方案中，本公开内容涉及使用传染性颗粒检测微生物的方法。
在另一个方面，本公开内容涉及一种用于检测样品中感兴趣细菌的方法，其包括下述步骤：将样品与感染宿主细菌和感兴趣的靶宿主细菌的噬菌体一起孵育，其中所述噬菌体包含指示基因，使得在感染感兴趣的细菌以后在噬菌体复制过程中指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示样品中存在感兴趣的细菌。
在某些实施方案中，如在本文中详述的，使选择的噬菌体突变以扩大和/或缩小宿主范围。在某些实施方案中，选择的噬菌体可以对单核细胞增生李斯特菌的一种血清型具有特异性。例如，一些噬菌体对单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)具有特异性，但是不能检测单核细胞增生李斯特菌的其它血清型，例如，单核细胞增生李斯特菌51782(血清型3a)。在某些实施方案中，选择的噬菌体对单核细胞增生李斯特菌的一种血清型具有特异性，但是不能感染单核细胞增生李斯特菌的另一种血清型。在某些情况下，选择的噬菌体对单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)具有特异性，但是不能感染单核细胞增生李斯特菌51782(血清型3a)。
在某些实施方案中，所述突变的噬菌体感染宿主细菌和感兴趣的靶宿主细菌。在某些实施方案中，所述宿主细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌19115(血清型4b)。在其它实施方案中，所述靶细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌51782(血清型3a)。
在某些实施方案中，所述突变噬菌体可以被工程改造成在噬菌体复制过程中表达可溶性萤光素酶。萤光素酶的表达由病毒衣壳启动子(例如，噬菌体T7或T4晚期启动子)驱动，从而产生高表达。制备亲代噬菌体，使得它们不含萤光素酶，因此在测定中检测到的萤光素酶必定来自细菌细胞感染过程中后代噬菌体的复制。因此，通常不需要从后代噬菌体中分离出亲代噬菌体。
在某些实施方案中，在测试之前不需要富集在样品中的细菌。在某些实施方案中，通过在促进生长的条件下孵育，可以在检验之前富集样品。在这样的实施方案中，富集阶段可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或更长，取决于样品类型和大小。
在一个实施方案中，本发明可以包括一种用于检测样品中感兴趣细菌的方法，其包括下述步骤：将样品与感染感兴趣细菌的重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含插入在噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在感染宿主细菌后在噬菌体复制过程中指示基因的表达导致可溶性指示蛋白产物的产生；和检测所述指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示所述样品中存在感兴趣的细菌。在某些实施方案中，检测到的指示蛋白的量对应于在样品中存在的感兴趣细菌的量。
如本文更详细描述的，所述方法可以利用一定浓度范围的亲代指示剂噬菌体来感染在样品中存在的细菌。在某些实施方案中，将指示剂噬菌体以特定浓度添加到样品中，所述特定浓度足以快速发现、结合和感染在样品中以非常低的数量存在的靶细菌，诸如单个细胞。在某些实施方案中，噬菌体浓度可以足以在不到一小时内发现、结合和感染靶细菌。在其它实施方案中，这些事件可以在向样品添加指示剂噬菌体后不到两小时、或不到三小时、或不到四小时内发生。例如，在某些实施方案中，孵育步骤的噬菌体浓度大于1x105PFU/mL，大于1x106PFU/mL，或大于1x107PFU/mL。
在某些实施方案中，可以纯化重组传染物以不含在传染物储液产生后可能生成的任何残留指示蛋白。因而，在某些实施方案中，可以在与样品孵育之前使用氯化绝等密度密度梯度离心来纯化重组噬菌体。当传染物是噬菌体时，这种纯化可能具有除去不含DNA的噬菌体(即，空噬菌体或“幽灵”)的额外益处。
在本发明方法的某些实施方案中，可以在不从样品中进行微生物的任何分离或纯化的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，可以将含有一种或几种感兴趣微生物的样品直接施加到测定容器(诸如旋转柱、微量滴定孔或过滤器)中，并且在该测定容器中进行测定。在本文中公开了此类测定的各种实施方案。
可以将检验样品的等分试样直接分配到多孔板的孔中，可以加入指示剂噬菌体，并在足以感染的时间段以后，可加入裂解缓冲液以及指示蛋白的底物(例如，萤光素酶指示剂的萤光素酶底物)并进行测定以检测指示剂信号。可以在过滤板上进行所述方法的一些实施方案。可以在用指示剂噬菌体感染之前在浓缩或不浓缩样品的情况下进行所述方法的某些实施方案。
例如，在许多实施方案中，使用多孔平板来进行测定。平板(或可在其中进行检测的任何其它容器)的选择可能影响检测步骤。例如，一些平板可能包括彩色或白色背景，这可能影响光发射的检测。一般而言，白色平板具有更高的灵敏度，但也会产生更高的背景信号。其它颜色的平板可能会产生较低的背景信号，但也具有略低的灵敏度。此外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄漏到另一个相邻的孔。一些平板具有白色的孔，但平板的其余部分是黑色。这允许孔内的高信号，但防止孔至孔的光泄漏并因此可以减少背景。因此，平板或其它测定容器的选择可能影响测定的灵敏度和背景信号。
本发明的方法可以包括各种其它步骤以增加灵敏度。例如，如本文更详细讨论的，所述方法可以包括以下步骤：在加入噬菌体之后但在孵育之前洗涤捕获的和感染的细菌，以除去污染噬菌体制备物的多余亲代噬菌体和/或萤光素酶或其它报道蛋白。
在某些实施方案中，可以在不需要培养样品作为增加微生物群体的方式的情况下完成感兴趣微生物的检测。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间小于28.0小时、27.0小时、26.0小时、25.0小时、24.0小时、23.0小时、22.0小时、21.0小时、20.0小时、19.0小时、18.0小时、17.0小时、16.0小时、15.0小时、14.0小时、13.0小时、12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或小于30分钟。最大限度地缩短获得结果的时间在病原体的食品和环境检验中是至关重要的。
与本领域已知的测定相反，本发明的方法可以检测个体微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可以检测在样品中存在的≤10个微生物细胞(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9个微生物细胞)。例如，在某些实施方案中，所述重组噬菌体是对李斯特菌属的多个种高特异性的。在一个实施方案中，所述重组噬菌体可以在有其它类型的细菌存在下区分李斯特菌属的多个种。在某些实施方案中，所述重组噬菌体可以用于检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，所述重组噬菌体检测样品中少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个细胞的特定细菌。
因此，本发明的方面提供了通过指示蛋白检测检验样品中的微生物的方法。在其中感兴趣微生物是细菌的某些实施方案中，指示蛋白可以与传染物诸如指示剂噬菌体相关联。指示蛋白可与底物反应以发出可检测信号或可发出固有信号(例如，荧光蛋白)。在某些实施方案中，检测灵敏度可以揭示少至50、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个感兴趣微生物细胞在检验样品中的存在。在某些实施方案中，甚至感兴趣微生物的单个细胞也可产生可检测信号。在某些实施方案中，噬菌体是P100病毒、T4-样或ViI-样噬菌体。在某些实施方案中，所述重组噬菌体衍生自李斯特菌属特异性的噬菌体。在某些实施方案中，重组李斯特菌属特异性的噬菌体是对李斯特菌属的多个种高特异性的。
在某些实施方案中，由传染物编码的指示蛋白可以在传染物复制期间或之后是可检测的。适合用作指示剂部分的许多不同类型可检测生物分子是本领域已知的，并且许多是商购可得的。在某些实施方案中，指示剂噬菌体包含作为指示蛋白的酶。在某些实施方案中，指示剂噬菌体基因组被修饰以编码可溶性蛋白。在某些实施方案中，指示剂噬菌体编码可检测的酶。指示剂可以发光和/或可以通过添加的底物中的颜色变化来检测。各种合适的酶是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在某些实施方案中，这些酶可充当指示蛋白。在某些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示蛋白。在某些实施方案中，刺虾萤光素酶是指示蛋白。在某些实施方案中，
Figure BDA0003419843990000211
是指示蛋白。其它经工程改造的萤光素酶或产生可检测信号的其它酶也可以是合适的指示蛋白。
因此，在某些实施方案中，方法、系统或试剂盒的重组噬菌体由野生型李斯特菌属特异性的噬菌体制备。在某些实施方案中，指示基因编码发出固有信号的蛋白，诸如荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或其它)。指示剂可以发光和/或可以通过颜色变化来检测。在某些实施方案中，指示基因编码与底物相互作用以产生信号的酶(例如，萤光素酶)。在某些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。在某些实施方案中，所述萤光素酶基因是刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、External Gaussia萤光素酶、Lucia萤光素酶或经工程改造的萤光素酶(诸如
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Rluc8.6-535或Orange Nano-lantern)之一。
检测指示剂可以包括检测光的发射。在某些实施方案中，可以使用光度计来检测指示剂(例如，萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可以用光度计实现，或也可以使用其它机器或装置。例如，分光光度计、CCD照相机或CMOS照相机可以检测颜色变化和其它光发射。绝对RLU对于检测是重要的，但信号/背景比也需要高(例如，>2.0、>2.5或>3.0)，以便可靠地检测单个细胞或少量细胞。
在某些实施方案中，指示剂噬菌体被遗传工程改造成含有酶(诸如萤光素酶)的基因，所述酶仅在噬菌体特异性地识别和感染的细菌的感染后产生。在某些实施方案中，指示蛋白在病毒生命周期的后期表达。在某些实施方案中，如本文中所述，指示剂是可溶性蛋白(例如，可溶性萤光素酶)，并且不与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
因此，在使用指示剂噬菌体的某些实施方案中，本发明包括一种检测感兴趣微生物的方法，其包括以下步骤：捕获至少一个样品细菌；将至少一个细菌与多个指示剂噬菌体一起孵育；留出时间进行感染和复制以产生后代噬菌体并表达可溶性指示蛋白；和检测后代噬菌体或优选地检测指示剂，其中指示剂的检测证实样品中存在细菌。
例如，在某些实施方案中，通过结合至平板的表面，或通过穿过细菌学过滤器(例如，0.45μm孔径旋转过滤器或平板过滤器)过滤样品，可以捕获检验样品细菌。在一个实施方案中，将最小体积的传染物(例如，指示剂噬菌体)添加到在过滤器上直接捕获的样品中。在一个实施方案中，随后将在过滤器或平板表面上捕获的微生物洗涤一次或多次以除去多余的未结合的传染物。在一个实施方案中，可以添加培养基(例如，Luria-Bertani液体培养基，本文也称为LB，缓冲的蛋白胨水，本文也称为BPW，或胰蛋白酶大豆液体培养基或胰蛋白胨大豆液体培养基，本文也称为TSB)持续进一步的孵育时间，以允许细菌细胞和噬菌体的复制以及编码指示蛋白的基因的高水平表达。但是，检验测定的一些实施方案的一个令人惊讶的方面是，与指示剂噬菌体的孵育步骤仅需要对于单个噬菌体生命周期足够长。以前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多时间，使得噬菌体会复制几个周期。根据本发明的一些实施方案，指示剂噬菌体的单个复制周期可以足以促进灵敏且快速的检测。
在某些实施方案中，可以将包含细菌的检验样品的等分试样施加到旋转柱上，并且在用重组噬菌体感染和任选的洗涤以除去任何多余的噬菌体之后，检测到的可溶性指示剂的量将与受感染的细菌产生的噬菌体的量成比例。
然后可以测量和量化在细菌裂解后释放到周围液体中的可溶性指示蛋白(例如，萤光素酶)。在一个实施方案中，使溶液旋转穿过过滤器，并且在添加指示剂酶的底物(例如，萤光素酶底物)之后，将滤液收集在新的容器中(例如，在光度计中)用于测定。备选地，可以在过滤器上直接测量指示剂信号。
在不同的实施方案中，纯化的亲代指示剂噬菌体本身不包含可检测的指示剂，因为亲代噬菌体可以在用于与检验样品一起孵育之前被纯化。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本发明的某些实施方案中，可以纯化亲代噬菌体以排除任何现有的指示蛋白(例如，萤光素酶)。在某些实施方案中，在感染宿主细菌后在噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。因而，在许多实施方案中，没有必要在检测步骤之前将亲代噬菌体与后代噬菌体分开。在一个实施方案中，微生物是细菌并且指示剂噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示剂部分是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解后被释放。
因而，在一个替代实施方案中，可以将指示剂底物(例如，萤光素酶底物)与保留在过滤器上或结合到平板表面的样品部分一起孵育。因此，在某些实施方案中，固体支持物是96-孔滤板(或常规的96-孔板)，并且可以通过将平板直接放置在光度计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本发明可以包括一种用于检测李斯特菌属的多个种的方法，其包括以下步骤：用多个能够在感染后表达萤光素酶的亲代指示剂噬菌体感染被捕获在96-孔滤板上的细胞；洗掉多余的噬菌体；添加LB液体培养基并留出时间让噬菌体复制和裂解特定的李斯特菌属的多个种靶标(例如，30-120分钟)；和通过在96-孔板中加入萤光素酶底物并直接测量萤光素酶活性来检测指示剂萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测指示样品中存在李斯特菌属的多个种。
在另一个实施方案中，本发明可以包括一种用于检测李斯特菌属的多个种的方法，其包括以下步骤：用多个能够在感染后表达萤光素酶的亲代指示剂噬菌体感染96-孔板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；留出时间让噬菌体复制和裂解特定的李斯特菌属的多个种靶标(例如，30-120分钟)；和通过在96-孔板中加入萤光素酶底物并直接测量萤光素酶活性来检测指示剂萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测指示样品中存在李斯特菌属的多个种。在这样的实施方案中，不需要捕获步骤。在某些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消耗的检验样品，诸如蔬菜洗液。在某些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩的LB液体培养基、胰蛋白酶/胰蛋白胨大豆液体培养基、蛋白胨水或营养物液体培养基强化的植物洗液。在某些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是在LB液体培养基中稀释的细菌。
在某些实施方案中，细菌的裂解可以发生在检测步骤之前、期间或之后。实验提示，在某些实施方案中，在加入萤光素酶底物后可检测到受感染的未裂解细胞。据推测，萤光素酶可能会离开细胞和/或萤光素酶底物可能进入没有完全细胞裂解的细胞。因此，对于利用旋转过滤器系统的实施方案，其中在光度计中仅分析释放到裂解物中的萤光素酶(且不分析仍在完整细菌内的萤光素酶)，需要裂解才能检测。但是，对于利用具有在溶液或悬浮液中的样品的过滤板或96-孔平板的实施方案，其中将充满完整和裂解细胞的原始平板直接在光度计中进行测定，裂解不是检测所必需的。
在某些实施方案中，指示蛋白产物(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更长，并且可能需要在不同时间点进行检测以优化灵敏度。例如，在使用96-孔滤板作为固体支持物和萤光素酶作为指示剂的实施方案中，可以在最初和以10或15分钟间隔读取光度计读数，直到反应结束。
令人惊讶的是，用于感染检验样品的高浓度噬菌体在非常短的时间范围内成功地实现了对极少数靶微生物的检测。在某些实施方案中，噬菌体与检验样品的孵育仅需要对于单个噬菌体生命周期足够长。在某些实施方案中，该孵育步骤的噬菌体浓度大于7x106、8x106、9x106、1.0x107、1.1x107、1.2x107、1.3x107、1.4x107、1.5x107、1.6x107、1.7x107、1.8x107、1.9x107、2.0x107、3.0x107、4.0x107、5.0x107、6.0x107、7.0x107、8.0x107、9.0x107或1.0x108PFU/mL。
用如此高浓度噬菌体的成功是令人惊讶的，因为大量噬菌体以前与“自外裂解”有关，这会杀死靶细胞并从而阻止从早期噬菌体测定中产生有用的信号。本文描述的制备的噬菌体储液的清理可能有助于缓解这个问题(例如，通过氯化绝等密度密度梯度超速离心进行清理)，因为除了除去与噬菌体相关的任何污染性萤光素酶以外，该清理也可以除去幽灵颗粒(失去DNA的颗粒)。幽灵颗粒可以通过“自外裂解”来裂解细菌细胞，从而过早杀死细胞并由此防止指示信号的产生。电子显微术证实，粗制的噬菌体裂解物(即，在氯化绝清理之前)可能具有大于50％的幽灵。这些幽灵颗粒可能通过许多噬菌体颗粒刺穿细胞膜的作用促进微生物的过早死亡。因此，幽灵颗粒可能促进之前的问题，据报道高PFU浓度是有害的。此外，非常纯的噬菌体制品允许在没有洗涤步骤的情况下进行测定，这使得可能在没有初始浓缩步骤的情况下进行测定。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在某些实施方案中，该浓缩步骤允许更短的富集孵育时间。
检验方法的一些实施方案可以进一步包括确认性测定。本领域已知多种测定用于确认初始结果，通常是在稍后的时间点。例如，可以培养样品(例如，在实施例中描述的
Figure BDA0003419843990000251
测定，PCR可以用于确认微生物DNA的存在，或其它确认性测定可以用于确认初始结果。
在某些实施方案中，除了用传染物检测外，本发明的方法组合使用结合剂(例如，抗体)来从样品纯化和/或浓缩感兴趣微生物，诸如李斯特菌属的多个种。例如，在某些实施方案中，本发明包括一种用于检测样品中的感兴趣微生物的方法，其包括下述步骤：使用对感兴趣微生物(诸如李斯特菌属的多个种)特异性的捕获抗体，从在先前支持物上的样品捕获微生物；将样品与感染李斯特菌属的多个种的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包含插入在噬菌体的晚期基因区域中的指示基因，使得在感染宿主细菌后在噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物；和检测所述指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测指示样品中存在李斯特菌属的多个种。
在某些实施方案中，设计合成的噬菌体以优化用于病原体检测测定的所需性状。在某些实施方案中，生物信息学和先前的遗传修饰分析被用来优化所需的性状。例如，在某些实施方案中，可以优化编码噬菌体尾蛋白的基因以识别并结合特定细菌种。在其它实施方案中，可以优化编码噬菌体尾蛋白的基因以识别并结合整个细菌属或属内种的特定组。以此方式，可以优化噬菌体以检测更宽或更窄的病原体组。在某些实施方案中，可以设计合成的噬菌体以提高报道基因的表达。另外和/或备选地，在一些情况下，可以设计合成噬菌体以增加噬菌体的裂解量，从而改进检测。
在某些实施方案中，可以优化噬菌体的稳定性以提高储存期限。例如，可以增加噬菌体裂解酶溶解度(enzybiotic solubility)以增加随后的噬菌体稳定性。另外和/或备选地，可以优化噬菌体热稳定性。热稳定的噬菌体在储存期间更好地保持功能活性，从而延长储存期限。因而，在某些实施方案中，可以优化热稳定性和/或pH耐受性。
在某些实施方案中，遗传修饰的噬菌体或合成衍生的噬菌体包含可检测的指示剂。在某些实施方案中，所述指示剂是萤光素酶。在某些实施方案中，所述噬菌体基因组包含指示基因(例如，萤光素酶基因或编码可检测指示剂的另一基因)。
实施例
实施例1.识别单核细胞增生李斯特菌的3A血清型的李斯特菌属噬菌体进化
第1代：在噬菌体进化的一个例子中，在含有1mM CaCl2的2mL脑心浸液(BHI)中，以下述比例(％宿主/靶标:100/0、90/10、50/50、10/90和0/100)制备19115(血清型4b)/51782(血清型3a)单核细胞增生李斯特菌的混合物(共5个试管，每种噬菌体一组)。
将噬菌体以1.0的MOI单独添加到每个试管中。将试管在30℃下振荡孵育过夜。将试管离心并将上清液(噬菌体裂解物)穿过0.45μm过滤器过滤。
将所有噬菌体裂解物(来自所有宿主/靶标比例试管)合并并铺板用于在宿主和靶菌株上形成单个噬斑。通过用移液器尖部挑取噬斑并加入到Luria液体培养基(LB)MOPS缓冲液中，从在靶菌株上形成的噬斑制备噬斑裂解物。将噬斑裂解物铺板用于在宿主和靶菌株上形成单个噬斑。将这些步骤重复共至少4次以分离突变噬菌体。
第2代至第3代：将来自上述步骤4的噬菌体裂解物(250μL)添加到含有1mM CaCl2的4mL BHI中。将噬菌体裂解物在30℃下振荡(～160rpm)孵育10小时。将试管离心并将上清液(噬菌体裂解物)穿过0.45um过滤器过滤。将噬菌体裂解物铺板用于在宿主和靶菌株上形成单个噬斑。
通过用移液器尖部挑取噬斑并加入到Luria液体培养基(LB)MOPS缓冲液中，从在靶菌株上形成的噬斑制备噬斑裂解物。将噬斑裂解物铺板用于在宿主和靶菌株上形成单个噬斑。将这些步骤重复共至少4次以分离突变噬菌体。
如果用前两次传代在靶菌株上没有看到噬斑，则重复所有步骤。

Claims (13)

1.一种产生具有扩大的宿主范围的突变噬菌体的方法，其包括：
(i)制备一系列以不同比例包含宿主细菌菌株和靶宿主细菌菌株的第一共培养混合物；
(ii)将噬菌体菌株加入第一共培养混合物中的每一个中；
(iii)在细菌培养条件下孵育第一共培养混合物和噬菌体菌株；
(iv)从多个第一共培养物中的每一个收集噬菌体裂解物；
(v)合并来自所述多个第一共培养物中的每一个的噬菌体裂解物；
(vi)测定噬菌体裂解物以确定噬菌体宿主范围是否已经扩大；和
(vii)分离具有扩大的宿主范围的突变噬菌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所选择的噬菌体菌株感染宿主细菌菌株且不感染靶宿主细菌菌株。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所选择的噬菌体菌株选自A511、P100、LMA4和LMA8。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)19115。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶宿主细菌菌株是单核细胞增生李斯特菌51782。
6.根据权利要求1所述的方法，其中多个第一共培养物的系列包含1:0、9:1、1:1、1:9和0:1的比例的宿主细菌菌株:靶宿主细菌菌株。
7.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤直到测定的噬菌体显示扩大的宿主范围的证据。
8.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括将在每个共培养比例培养所得到的噬菌体传代。
9.一种具有扩大的宿主范围的重组突变噬菌体，其包含插入在噬菌体基因组的晚期基因区域中的指示基因，其中所述重组噬菌体已经进行突变以感染宿主细菌和靶宿主细菌。
10.根据权利要求9所述的重组突变噬菌体，其中所述重组噬菌体衍生自野生型A511、P100、LMA4或LMA8噬菌体。
11.根据权利要求9所述的重组突变噬菌体，其中所述指示基因经过密码子优化并且编码产生固有信号的可溶性蛋白产物或编码在与底物反应后产生信号的可溶性酶。
12.根据权利要求9所述的重组突变噬菌体，其进一步包含在密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
13.一种包含至少两种不同类型的重组突变噬菌体的混合组合物，其中至少一种重组噬菌体包含根据权利要求9所述的指示基因。
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