JP2022024167A - 感染性因子を使用する微生物の迅速検出のための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】サンプル中の微生物の迅速検出のための方法およびシステムが本明細書に開示される。後期遺伝子領域にインジケーター遺伝子を含む遺伝的に改変されたバクテリオファージも、開示される。CBA120などのバクテリオファージの特異性は、E.coli O157:H7などの特異的微生物の検出を可能にし、アッセイ感度を最適化するためにインジケーターシグナルを増幅することができる。バクテリオファージCBA120ゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、組換えバクテリオファージ。
【選択図】なし
Description
本願は、2016年1月18日に出願した米国仮特許出願第62/280,043号および2016年1月19日に出願した米国仮特許出願第62/280,465号に対する優先権を主張する。この出願はまた、2016年9月13日に出願した米国出願第15/263,619号に対する優先権を主張する。
配列表の公式のコピーは、2017年1月17日に作成されたサイズが7キロバイトの、本明細書と並行して出願された、1035526_ST25.txtという名前のファイルと一緒にアスキーフォーマットの配列表として、EFS-ウェブを介して電子的に提出される。このアスキーフォーマット文書に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、感染性因子を使用する、微生物の検出のための方法およびシステムに関する。
生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル中の細菌、ウイルス、および他の微生物の検出のための速度および感度を改善することには、強い重要性がある。微生物病原体は、ヒトおよび飼いならされた動物において実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。また、微生物の検出は、ある種の微生物(例えば、Escherichia coliもしくはSalmonella spp.)で汚染された食品の摂取によって引き起こされる生命を脅かすもしくは致命的な病気の大流行を考慮すると、食品医薬品局(FDA)および疾病対策センター(CDC)にとっての優先順位は高い。
物)は既に、家畜もしくはヒトの中へと入り込んでしまっている可能性があるので、不適切である。さらに、抗生物質耐性細菌および生体防御の懸念事項の増加により、水サンプル、食品サンプルおよび臨床サンプル中の細菌病原体の迅速同定が、世界的に欠くことのできない優先事項になっている。
本発明の実施形態は、微生物の検出のための組成物、方法、システムおよびキットを含む。本発明は、種々の方法で具現化され得る。
試験サンプル(例えば、生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル)中の目的の微生物の検出に関して驚くべき感度を示す、組成物、方法およびシステムが本明細書で開示される。検出は、富化のための培養もなしに、もしくはいくつかの実施形態では最小限のインキュベーション時間(その間に、微生物が潜在的に増殖し得る)を伴って行われるアッセイにおいて、遺伝的に改変された感染性因子を使用して、以前に可能と考えられた時間枠より短い時間枠で達成され得る。また、試験サンプルとともにインキュベートするために、潜在的に高い感染多重度(MOI)、もしくは高濃度のプラーク形成単位(PFU)を使用することの成功は驚くべきである。このような高いファージ濃度(PFU/mL)は、細菌検出アッセイにおいて有害であると以前に主張された。なぜならそれらは、「非感染溶菌(lysis from without)」を引き起こすと主張されたからである。しかし、高濃度のファージは、少数の標的細胞の発見、結合および感染を容易にし得る。
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。
本明細書において使用する場合、「a」、「an」、および「the」という用語は、他に特に留意しない限り、1つまたは複数を指すことができる。
本発明の方法およびシステムの実施形態の各々は、サンプル中の微生物の迅速検出および定量を可能にし得る。例えば、本発明に従う方法は、優れた結果を有する、短縮した期間で行われ得る。
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、病原性微生物の検出において使用するための感染性因子を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、組換えインジケーターバクテリオファージを含み、ここで、バクテリオファージゲノムはインジケーターまたはレポーター遺伝子を含むように遺伝的に改変される。いくつかの実施形態において、本発明は、バクテリオファージのゲノムに組み込まれるインジケーター遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を含み得る。
マトグラフィー、および透析または派生技術(例えば、Amiconブランドの濃縮器 - Millipore, Inc.)。塩化セシウム等密度超遠心分離は、親ファージ粒子を、上記細菌宿主中のファージの増殖の際に生成される汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離するために、本発明の組換えファージの調製の一部として用いられ得る。このようにして、本発明の親組換えバクテリオファージは、上記細菌における生成の間に生成される任意のルシフェラーゼが実質的ない。上記ファージストックに存在する残りのルシフェラーゼの除去は、上記組換えバクテリオファージが試験サンプルとともにインキュベートされる場合に観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に低減し得る。
インジケーターバクテリオファージを作製する方法の実施形態は、遺伝的改変のための野生型バクテリオファージの選択から始める。いくつかのバクテリオファージは、標的細菌に高度に特異的である。このことは、高度に特異的な検出の機会を提供する。
野生型:1 組換えファージというおよその比で存在した。必要な場合(すなわち、組換えファージ:野生型ファージの比が1:30より低い場合)、この富化した培養物412からの子孫は、その比を増大させ、組換えファージ形質導入単位の実際の濃度を決定するために、さらなる限界希釈アッセイ414(複数可)に供され得る。例えば、96ウェルプレート416あたり約3の組換えTUは、第1の精製ストックからアリコートし得414、第2の希釈アッセイプレート420のウェルあたり約20の主に野生型ファージのおよその播種をもたらす。任意の陽性ルシフェラーゼウェルは、約20 野生型ファージとともに、単一組換えファージを播種した可能性がある。これらのウェルは、ルシフェラーゼ442の存在について分析され得る。
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、微生物を検出するための感染性粒子を使用するための方法を包含し得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。
coli O157:H7が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。このような実施形態において、捕捉する工程は、必須ではない。いくつかの実施形態において、上記液体溶液もしくは懸濁物は、消費可能な試験サンプル(例えば、野菜洗浄液)であり得る。いくつかの実施形態において、上記液体溶液もしくは懸濁物は、濃縮されたLB
Broth、Tryptic/Tryptone Soy Broth、Peptone WaterもしくはNutrient Brothで強化された野菜洗浄液であり得る。いくつかの実施形態において、上記液体溶液もしくは懸濁物は、LBブロス中で希釈された細菌であり得る。
食品中のE.coli O157:H7の検出のための既存のプロトコールは、複雑、高価、遅く、労働集約型で偽陽性を起こしやすい。この病原体に特異的な組換えバクテリオファージによる検出は、有効で、速く、単純な代替試験を提供する。
野菜洗浄液を調製するために、野菜の葉(例えば、ホウレンソウもしくはレタス)は秤量され、きれいなプラスチックバッグに加えられ得る。野菜洗浄液に液体を加えることができる。例えば、いくつかの実施形態において、5mLの水が野菜の各グラム(g)あたりに添加される。他の検査液体(例えば、LB)を使用することもできる。葉および溶液を、数分間にわたって手動で混合してもよい。次いで、液体をプラスチックバッグから抜き出し、「野菜洗浄液」として使用することができる。この方法を使用して、約100万個の「内因性の」混在細菌が、1枚のホウレンソウの葉(1~2g)に存在することが見いだされた。
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で開示される方法を行うための構成要素を含むシステム(例えば、自動化システムもしくはキット)を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるシステムまたはキットにはインジケーターファージが含まれる。本明細書に記載される方法は、このようなインジケーターファージシステムまたはキットも利用し得る。本明細書で記載されるいくつかの実施形態は、上記方法を行うために必要とされる試薬および材料の最小限の量を考慮すると、自動化もしくはキットに特に適している。ある種の実施形態において、上記キットの構成要素の各々は、第1の部位から第2の部位へと送達可能である自己充足式ユニットを含み得る。
て、上記工程は、ユーザーによってコンピューター入力を介して自動化もしくは制御され、そして/または液体取り扱いロボットが少なくとも1つの工程を行う。
上記システムは、現在の技術もしくはその構成要素のうちのいずれかにおいて記載されるように、コンピューターシステムの形態で具現化され得る。コンピューターシステムの代表例としては、汎用コンピューター、プログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラー、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実装し得る他のデバイスもしくはデバイスの配置が挙げられる。
、または他の類似のデバイスをさらに含み得る。
FireWire、シリアル接続もしくはパラレル接続、または類似のインターフェイスを介したポイントツーポイント接続を可能にし得る。適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、1以上のネットワーク上での通信のための2以上のネットワークインターフェイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスに加えてもしくはその代わりに、データストアを含み得る。
標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、
インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド/ベクターを調製する工程、
該相同組換えプラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、
形質転換された該標的病原性細菌に、選択された該野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、該プラスミド/ベクターと該バクテリオファージのゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および
組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程
を含む、方法。
選択された前記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定する工程、
該ゲノムを注釈し、選択された該バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を同定する工程、
該主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する工程であって、該配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含む工程、および
相同組換えのために設計された該配列をプラスミド/ベクターに組み込む工程
を含む、パラグラフ5に記載の方法。
該サンプルをCBA120に由来する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程、および
該組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで該インジケータータンパク質生成物の陽性検出はE.coli O157:H7が該サンプルに存在することを示す工程
を含む、方法。
前記サンプルが、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである、パラグラフ11に記載の方法。
食品安全産業のための標準サイズのサンプル中の10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個程度の少なさの細菌を検出する、パラグラフ11または12に記載の方法。
前記サンプルが牛肉または野菜を含む、パラグラフ11~13のいずれかに記載の方法。
前記サンプルが、9時間またはそれ未満、8時間またはそれ未満、7時間またはそれ未満、6時間またはそれ未満、5時間またはそれ未満、4時間またはそれ未満、3時間またはそれ未満、または2時間またはそれ未満の富化時間の間、成長を有利にする条件で最初にインキュベートされる、パラグラフ11~14のいずれかに記載の方法。
結果までの合計時間が、12時間未満、11時間未満、10時間未満、9時間未満、8時間未満、7時間未満、または6時間未満である、パラグラフ11~15のいずれかに記載の方法。
前記インジケーターを検出する工程によって生成されるシグナル対バックグラウンドの比が、少なくとも2.0または少なくとも2.5である、パラグラフ11~16のいずれかに記載の方法。
CBA120に由来する組換えバクテリオファージを含む、E.coli O157:H7を検出するためのキット。
前記組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む、パラグラフ18に記載のキット。
CBA120に由来する組換えバクテリオファージを含む、E.coli O157:H7を検出するためのシステム。
CBA120からのインジケーターファージの創製
図1~3に図示される以下の詳細な手順を使用した相同組換えを通して、インジケーターファージCBA120NanoLucを創製した。
for Biotechnology Information’s GenBankで利用可能であった。ゲノムは完全に注釈されていたが、遺伝子のほとんどは「仮定のタンパク質」と表示され、自動化オープンリーディングフレームディスカバー(automatedOpen Reading Frame discover)が使用されたことを意味する。DNA調節(プロモータ
ー/エンハンサー/オペレーター等)が配列中に規定されていないので、仮定のタンパク質は、開始および終止コドンを有することのみが必要であり、発現されなくてもよい。
であるシャインダルガルノコンセンサス配列(aaggaggt)を挿入し、続いてさらに6つのランダム塩基対を挿入した。他の上流の非翻訳領域に類似のGC含量を保つために、ランダム塩基対が選択された。配列番号3
8巻:430頁を参照)からの野生型CBA120バクテリオファージを0.1のMOIで細菌に感染させ、相同組換え感染媒体を37℃で3時間インキュベートした。
CBA120NanoLucの単離
組換えバクテリオファージゲノムを生成するための相同組換えの後、NANOLUC(登録商標)を発現する特異的組換えバクテリオファージを単離するために、一連の滴定および富化工程を使用した。
CBA120NanoLucインジケーターファージを使用した細菌検出
CBA120NanoLucインジケーターファージを使用したE.coli O157:H7の検出は、図6に示された基本アッセイフォーマットを使用した実験で試験した。第1に、1~10,000の範囲内の細胞数を培養物からとり、LBの同一のサンプル体積中の105、106および107ファージ/mLを2時間感染させた。溶解緩衝液およびNANO-GLO(登録商標)試薬の添加の後、GLOMAX(登録商標)96機器を使用して反応物を読み取った。図7は、サンプルを感染させるために使用された106ファージ/mLで、シグナル/バックグラウンドの最大比が達成されたことを示す。
CBA120NanoLucを使用した牛肉アッセイにおける細菌検出
牛肉アッセイでE.coli O157:H7を検出するために、CBA120NanoLucを使用した。牛肉実験の全てのために、50RLUをバックグラウンド値として使用し、バックグラウンド値の3倍を陽性と考えた(すなわち、>150RLUは陽性である、またはシグナル/バックグラウンド>3.0)。下に記載される二次確認方法と比較したとき、偽陽性または陰性はなかった。
ることなく42℃でインキュベートした。上部を2~3回折畳み、クリップで閉じることによって、バッグを密閉した。42℃での富化から5時間後(次の工程での10mLアリコートのために)または6時間後(次の工程での1mLアリコートのために)、バッグを静かに揉んで内容物を完全に混合した。
E.coli O157:H7の確認は、O157抗体(DYNABEADS(登録商標)、Life Technologies#71004)でコーティングされた粒子による免疫磁気分離(IMS)を使用し、および選択的プレート(CHROMAGAR(登録商標)プレート、BD#214984)へプレーティングして、一晩富化した培養物で行われた。
野菜洗浄液アッセイ
ホウレンソウ洗浄液フィルターアッセイからのデータは図17に示し、それは、アッセイが3時間の富化の後に100mLのホウレンソウ洗浄液中のE.coli O157:H7の1細胞を検出することができることを示す。これらの結果は、上の「二次確認方法」に記載されるように、製造業者の指示に従い各サンプルの一晩培養物に対してDYNABEADS(登録商標)/CHROMAGAR(登録商標)検査を使用することによって確認された。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
バクテリオファージCBA120ゲノムの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、組換えバクテリオファージ。
(項目2)
E.coli O157:H7に特異的に感染する、項目1に記載の組換えバクテリオファージ。
(項目3)
前記インジケーター遺伝子がコドン最適化され、内因性シグナルを生成する可溶性タンパク質生成物または基質との反応の際にシグナルを生成する可溶性酵素をコードする、項目1に記載の組換えバクテリオファージ。
(項目4)
前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に非翻訳領域をさらに含み、該非翻訳領域が、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む、項目3に記載の組換えバクテリオファージ。
(項目5)
組換えインジケーターバクテリオファージを調製する方法であって、
標的病原性細菌に特異的に感染する野生型バクテリオファージを選択する工程、
インジケーター遺伝子を含む相同組換えプラスミド/ベクターを調製する工程、
該相同組換えプラスミド/ベクターを標的病原性細菌に形質転換する工程、
形質転換された該標的病原性細菌に、選択された該野生型バクテリオファージを感染させ、それによって、該プラスミド/ベクターと該バクテリオファージのゲノムとの間で相同組換えを起こさせる工程、および
組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程
を含む、方法。
(項目6)
相同組換えプラスミド/ベクターを調製する工程が、
選択された前記バクテリオファージのゲノムの後期領域中の天然のヌクレオチド配列を決定する工程、
該ゲノムを注釈し、選択された該バクテリオファージの主要カプシドタンパク質遺伝子を同定する工程、
該主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する工程であって、該配列がコドン最適化インジケーター遺伝子を含む工程、および
相同組換えのために設計された該配列をプラスミド/ベクターに組み込む工程
を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
配列を設計する工程が、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を、前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に挿入することをさらに含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記相同組換えプラスミドが、バクテリオファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含む非翻訳領域を前記コドン最適化インジケーター遺伝子の上流に含む、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記野生型バクテリオファージがCBA120であり、前記標的病原性細菌がE.coli O157:H7である、項目5に記載の方法。
(項目10)
組換えバクテリオファージの特定のクローンを単離する工程が、前記インジケーター遺伝子の発現を示すクローンを単離するための限界希釈アッセイを含む、項目5に記載の方法。
(項目11)
サンプル中のE.coli O157:H7を検出するための方法であって、
該サンプルをCBA120に由来する組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程、および
該組換えバクテリオファージによって生成されるインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、ここで該インジケータータンパク質生成物の陽性検出はE.coli O157:H7が該サンプルに存在することを示す工程
を含む、方法。
(項目12)
前記サンプルが、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである、項目11に記載の方法。
(項目13)
食品安全産業のための標準サイズのサンプル中の10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個程度の少なさの細菌を検出する、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記サンプルが牛肉または野菜を含む、項目12に記載の方法。
(項目15)
前記サンプルが、9時間またはそれ未満、8時間またはそれ未満、7時間またはそれ未満、6時間またはそれ未満、5時間またはそれ未満、4時間またはそれ未満、3時間またはそれ未満、または2時間またはそれ未満の富化時間の間、成長を有利にする条件で最初にインキュベートされる、項目11に記載の方法。
(項目16)
結果までの合計時間が、12時間未満、11時間未満、10時間未満、9時間未満、8時間未満、7時間未満、または6時間未満である、項目11に記載の方法。
(項目17)
前記インジケーターを検出する工程によって生成されるシグナル対バックグラウンドの比が、少なくとも2.0または少なくとも2.5である、項目11に記載の方法。
(項目18)
CBA120に由来する組換えバクテリオファージを含む、E.coli O157:H7を検出するためのキット。
(項目19)
前記組換えバクテリオファージによって発現される可溶性タンパク質生成物を検出するための、インジケーターと反応させるための基質をさらに含む、項目18に記載のキット。
(項目20)
CBA120に由来する組換えバクテリオファージを含む、E.coli O157:H7を検出するためのシステム。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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