CN115960844A - 使用感染原快速检测微生物的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于快速检测样品中微生物的方法和系统。还公开了遗传修饰的噬菌体，其包含晚期基因区中的指示基因。噬菌体(例如CBA120)的特异性允许检测特定微生物，例如大肠杆菌O157:H7，并且可以扩增指示信号以优化测定灵敏度。

Description

使用感染原快速检测微生物的方法和系统
本申请是申请日为2017年1月18日、发明名称为“使用感染原快速检测微生物的方法和系统”的中国发明专利申请No.201780007083.9的分案申请。
相关申请
本申请要求2016年1月18日提交的美国临时专利申请No.62/280,043和2016年1月19日提交的美国临时专利申请No.62/280,465的优先权。本申请还要求2016年9月13日提交的美国申请No.15/263,619的优先权。
参考通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表
序列表的正式副本通过EFS-Web以电子方式提交为ASCII格式的序列表，其文件名为1035526_ST25.txt，创建于2017年1月17日，大小为7千字节，并与说明书同时提交。该ASCII格式文档中包含的序列表是说明书的一部分，并且其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及使用感染原检测微生物的方法和系统。
背景
对提高检测生物、食品、水和临床样品中的细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度存在强烈兴趣。微生物病原体可以引起人和家畜中相当大的发病率，以及巨大的经济损失。此外，鉴于由摄入某些微生物(例如，大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌(Salmonella spp.)污染的食品引起的致病或毁灭性的疾病，微生物的检测对于食品药品管理局(FDA)和疾控中心(CDC)是高优先级的。
用于细菌检测的传统微生物测试依赖非选择性和选择性的富集培养，接着涂布在选择性的培养基上并进一步测试，以证实怀疑的菌落。这样的程序可能需要几天。已经研究了各种快速方法并引入实践来缩短时间需求。然而，这些方法具有缺陷。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤，以获得适当的灵敏度。聚合酶链反应(PCR)测试还包括扩增步骤，并且因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，可以经济地接受PCR测试的样品大小受到限制。使用稀释的细菌悬浮液，大部分小的子样品将不含细胞，并且因此仍然需要纯化和/或冗长的富集步骤。
传统生物富集所需的时间受样品的靶细菌群的生长速率、样品基质的影响和所需灵敏度的控制。在实践中，大部分高灵敏度方法使用过夜孵育并且总地花费大约24小时。由于培养所需的时间，根据待测定的生物体和样品来源，这些方法可能花费长达三天。这种滞后的时间通常是不合适的，因为受污染的食品、水(或其他产品)可能已经进入牲畜或人。此外，抗生素抗性细菌的增加和生物防御考虑使得全世界非常优先地考虑水、食品和临床样品中细菌病原体的快速鉴定。
因此，需要快速、简单和灵敏的微生物检测和鉴定，所述微生物如细菌和其他潜在致病的微生物。
概述
本发明的实施方案包括用于微生物检测的组合物、方法、系统和试剂盒。本发明可以以各种方式来具体说明。
在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含插入噬菌体基因组的晚期基因区的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的CBA120基因组。在一些实施方案中，重组噬菌体是遗传修饰的T4样或ViI样噬菌体基因组。在一些实施方案中，重组噬菌体特异性地感染大肠杆菌O157:H7。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌存在下区分大肠杆菌O157:H7。
在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因可以是密码子优化的并且可以编码产生固有信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还包含密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，例如Oplophorus萤光素酶，萤火虫萤光素酶，Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者它可以是遗传工程化基因。
本文还公开了制备重组指示噬菌体的方法。一些实施方案包括选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化至靶病原菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；并分离重组噬菌体的特定克隆。在一些实施方案中，选择的野生型噬菌体是CBA120。在一些实施方案中，选择的野生型噬菌体是T4样或ViI样。
在一些实施方案中，制备同源重组质粒/载体包括测定所选噬菌体的基因组的晚期区中的天然核苷酸序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计主要衣壳蛋白基因下游的同源重组序列，其中该序列包含密码子优化的指示基因；并将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中。设计序列的步骤可包括在密码子优化的指示基因的上游插入非翻译区，其包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。因此，在一些方法中，同源重组质粒包含密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
本发明的一些实施方案是包含如本文所述的重组指示噬菌体的组合物。例如，组合物可包括一种或多种野生型或遗传修饰的感染原(例如噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示噬菌体的混合物，其可编码和表达相同或不同的指示蛋白。
在一些实施方案中，本发明包括用于检测样品中目标微生物的方法，包括将样品与感染目标微生物的重组噬菌体一起孵育的步骤，其中重组噬菌体包含插入噬菌体的晚期基因区的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物，方法还包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明目标微生物存在于样品中。
在制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案中，野生型噬菌体是CBA120，靶病原菌是大肠杆菌O157:H7。在一些实施方案中，分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明指示基因表达的克隆的有限稀释测定法。
本发明的其他方面包括用于检测样品中的细菌(例如大肠杆菌O157:H7)的方法，包括将样品与衍生自CBA120的重组噬菌体一起孵育并检测由重组噬菌体产生的指示蛋白产物的步骤，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在大肠杆菌O157:H7。样品可以是食品、环境、水、商业或临床样品。在一些实施方案中，样品包括牛肉或蔬菜。
在用于检测细菌的方法的一些实施方案中，首先在有利于富集生长的条件下孵育样品，所述富集生长的时间为9小时或更短，8小时或更短，7小时或更短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短，3小时或更短，或2小时或更短。在一些实施方案中，获得结果的总时间小于12小时，小于11小时，小于10小时，小于9小时，小于8小时，小于7小时或小于6小时。在一些实施方案中，通过检测指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。在一些实施方案中，该方法检测用于食品安全工业的标准尺寸样品中少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个的特定细菌。
另外的实施方案包括用于检测大肠杆菌O157:H7的系统和试剂盒，其中所述系统或试剂盒包括衍生自CBA120的重组噬菌体。一些实施方案还包括用于与指示剂反应以检测由重组噬菌体表达的可溶性蛋白质产物的底物。这些系统或试剂盒可包括针对本发明的噬菌体、组合物和方法所描述的特征。在其他实施方案中，本发明包括用于根据本发明的方法或系统使用的非瞬时性计算机可读介质。
附图说明
通过参考以下非限制性附图可以更好地理解本发明。
图1显示野生型CBA120噬菌体的基因组的一部分和特别是注释的晚期基因区。
图2显示了设计用于与CBA120噬菌体基因组同源重组的质粒的一个实施方案。衣壳蛋白gp23(ORF187)被认为代表主要衣壳蛋白。由于该病毒体蛋白以非常高的水平表达，因此只要使用晚期基因启动子和/或其他类似的控制元件，可以预期插入该区域的任何基因具有相似的表达水平。
图3显示了图1中野生型CBA120基因组与图2中所示质粒的同源重组的实施方案。
图4描述了野生型和重组噬菌体的混合物的分离重组噬菌体，所述重组噬菌体来源于用质粒转化靶细菌，该质粒携带设计用于与天然噬菌体基因组以同源方式重组的序列，然后用野生型噬菌体感染转化的细菌以允许同源重组。一系列连续的感染和稀释步骤允许鉴定和分离表达指示/报告基因的重组噬菌体。
图5是重组指示噬菌体CBA120NanoLuc噬菌体的一个实施方案的电子显微照片。
图6描绘了根据本发明的一个实施方案，使用编码可溶性报告基因(例如萤光素酶)的指示噬菌体通过检测在细菌细胞感染期间指示噬菌体的复制产生的萤光素酶来检测细菌细胞。
图7显示了使用不同噬菌体浓度的CBA120NanoLuc感染具有已知数量细胞的样品以检测致病细菌，其中106个噬菌体/mL产生最高的信号与背景比。
图8显示使用106个噬菌体/mL的CBA120NanoLuc感染具有已知数量细胞的样品的实验的重复表明来自单个细胞的信号与来自0个细胞、2个细胞或更多个细胞的信号之间的显著差异。
图9显示，图8中所示实验的信号与背景比大于2.0。
图10显示了在富集5、6和7小时后进行测定时，在来自25g碎牛肉的1mL浓度样品中检测大肠杆菌O157:H7的相对光单位(RLU)和信号与背景比。
图11总结了如图10所示的来自25g碎牛肉的1mL浓度样品中大肠杆菌O157:H7的检测，并使用第二方法确认结果。
图12显示了在富集5小时后进行测定时，来自25g碎牛肉的10mL浓缩样品中的大肠杆菌O157:H7的检测的RLU和信号与背景比，并使用第二方法确认结果。
图13显示了在富集7、8和9小时后进行测定时，来自125g剪碎牛肉的1mL浓度样品中大肠杆菌O157:H7的检测的RLU和信号与背景比。
图14显示了在富集7、8和9小时后进行测定时，来自125g剪碎牛肉的10mL浓度样品中大肠杆菌O157:H7的检测的RLU和信号与背景比。
图15总结了如图13所示的来自125g剪碎牛肉的1mL浓度样品中大肠杆菌O157:H7的检测，并使用第二方法确认结果。
图16总结了如图14所示的来自125g剪碎牛肉的10mL浓度样品中大肠杆菌O157:H7的检测，并使用第二方法确认结果。
图17显示了经过滤并经受过滤测定形式的100mL菠菜洗涤液中的大肠杆菌O157:H7的检测的RLU和信号与背景比，并使用二级方法确认结果。
发明详述
本文中公开的是证明了令人惊讶的检测测定样品(例如，生物、血液、水和临床样品)中的目标微生物的灵敏度的组合物、方法和系统。在没有使用富集培养或在一些实施方案中使用最小孵育时间(在该过程中，微生物可能潜在地繁殖)进行的测定中，可以使用遗传修饰的感染原，在短于之前认为可能的时间周期中实现检测。还令人惊讶的是，使用潜在高感染复数(MOI)或高浓度的噬菌斑形成单位(PFU)用于与测试样品一起孵育的成功。这样的高噬菌体浓度(PFU/mL)之前据说对于细菌检测测定是有害的，因为据说它们引起“自外溶菌作用”。然而，高浓度的噬菌体可以促进发现、结合和感染低数量的靶细胞。
本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可以包括用于检测此类微生物的感染原。在某些实施方案中，本发明包括组合物，所述组合物包括具有插入噬菌体的晚期基因区中的指示基因的重组噬菌体。在某些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中指示基因的表达导致产生可溶性的指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示基因可以插入噬菌体的晚期基因(即，III类)区中。噬菌体可以衍生自T7，T4，T4样，ViI，ViI样(或ViI病毒，根据GenBank/NCBI)，CBA120或另一种野生型或工程化噬菌体。
在一些方面中，本发明包括检测目标微生物的方法。该方法可以使用用于检测目标微生物的感染原。例如，在某些实施方案中，目标微生物是细菌，而感染原是噬菌体。因此，在某些实施方案中，该方法可以包括检测样品中的目标细菌，通过将样品与感染目标细菌的重组噬菌体一起孵育。在某些实施方案中，重组噬菌体包括指示基因。在某些实施方案中，指示基因可以插入噬菌体的晚期基因区中，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达导致指示蛋白产物的产生。该方法可以包括检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示目标细菌存在于样品中。在一些实施方案中，指示蛋白是可溶的。
在某些实施方案中，本发明可以包括一种系统。该系统可以含有至少一些本发明的组合物。此外，该系统可以包括至少一些用于进行所述方法的组分。在某些实施方案中，将所述系统配制成试剂盒。在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统，其包括：用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组分，其中感染原包括指示部分；和用于检测指示部分的组分。在再其他实施方案中，本发明包括用于与所述方法或系统一起使用的软件。
因此，本发明的一些方法通过使用基于噬菌体的方法解决了对扩大表示细菌存在的可检测信号的需求。在某些实施方案中，检测少至单个细菌。本文中应用的原理可以应用于检测各种微生物。由于微生物表面上用于感染原的无数结合位点，在感染过程中产生一百或更多感染原子代的能力和编码的指示部分的高水平表达的可能，感染原或指示部分可以比微生物自身更快速地检测到。以这种方式，本发明的实施方案可以从甚至单个感染的细菌实现巨大的信号扩增。
本发明的各个方面利用可以结合特定微生物，如感染原的结合组分的结合剂的高特异性，作为检测和/或定量样品中的特定微生物的方式。在一些实施方案中，本发明利用感染原(如噬菌体)的高特异性。
在一些实施方案中，通过与目标微生物特异性的结合剂相关的指示部分来实现检测。例如，感染原可以包括指示部分，例如编码可溶性指示剂的基因。在一些实施方案中，指示剂可以由感染原(如噬菌体)编码，并且噬菌体被定名为指示噬菌体。
本文中公开和描述的本发明的一些实施方案利用以下发现：单个微生物能够结合特定的识别剂，如噬菌体。噬菌体感染和复制后，可以通过噬菌体复制过程中表达的指示部分检测子代噬菌体。这个原则基于微生物表面受体的特异性识别，允许从一或几个细胞扩大指示信号。例如，通过将甚至单个细菌细胞暴露于多个噬菌体，此后在复制过程中允许噬菌体的扩增和编码的指示基因产物的高水平表达，指示信号扩大，使得可以检测到单个细菌。
本发明的方法和系统的实施方案可以应用于检测和定量各种环境中的各种微生物(例如，细菌、真菌、酵母)，包括但不限于来自食品、水、临床和商业样品的病原体的检测。本发明的方法可以快速地提供高检测灵敏度和特异性，并且不需要传统的生物富集(例如，富集培养)，这是令人惊讶的方面，因为所有可利用的方法都需要培养。在一些实施方案中，检测在噬菌体的单个复制周期内是可能的，这是出乎意料的。
定义
除非本文中另外限定，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非内容另外需要，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。通常，结合本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名以及本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交的教导是本领域公知和常用的那些。通常根据本领域公知的以及按照本发明整个说明书中讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所述的常规方法进行已知的方法和技术，除非另外指出。根据制造商的说明进行酶反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文中所述的。结合本文中所述的实验室程序和技术使用的命名是本领域公知和常用的那些。
以下术语，除非另外指出，应当理解为具有以下含义：
如本文中使用的，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”可以指一个或多个，除非另外明确指出。
术语“或”的使用用来表示“和/或”，除非明确指出是指只是替换方案或替换方案是互相排他的，尽管公开内容支持表示只是替换方案和“和/或”的限定。如本文中使用的，“另一个”可以表示至少第二个或更多。
在整个本申请中，术语“约”用于表示数值包括该设备的固有误差变化、该方法用于测定该数值或样品间存在的变化。
术语“固体支持物”或“支持物”表示提供其上可以结合生物分子的基质和/或表面的结构。例如，固体支持物可以是测定孔(即，如微滴定平板或多孔平板)，或固体支持物可以是滤器、阵列或可移动支持物，如珠粒或膜上的位置(例如，滤板或侧流条)。
术语“结合剂”是指可以特异性和选择性地结合第二个(即，不同的)目标分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，作为氢键合、范德华相互作用或静电或疏水性相互作用的结果，或可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固体支持物相连(即，共价或非共价结合)的结合剂。
如本文中使用的，“分析物”是指待测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，目标分析物可以与结合剂相互作用。如本文中所述的，术语“分析物”可以指目标蛋白或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或，分析物可以不具有生物效应。分析物可以包括小分子、糖、寡糖、脂质、肽、肽模拟物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报告蛋白”或“指示剂”或“指示部分”是指可以在定量测定中测量的分子。例如，指示部分可以包括可以用于将底物转化成可以测量的产物的酶。指示部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶)。或，指示部分可以是可以定量的放射性同位素。或，指示部分可以是荧光团。或，可以使用其他可检测分子。
如本文中使用的，“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括多种细菌病毒中的一种或多种。在本公开内容中，术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”包括如分枝杆菌噬菌体(如，用于TB或paraTB)、真菌噬菌体(如，用于真菌)、支原体噬菌体这样的病毒，以及是指可以入侵活的细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他用显微镜可见的活生物体并且使用它们来自我复制的病毒的任何其他术语。在此，“显微镜可见的”表示最大尺寸为一毫米或更小。噬菌体是已经自然进化以使用细菌作为自我复制方式的病毒。噬菌体通过使自身连接至细菌并将其DNA(或RNA)注入该细菌中，并诱导其复制噬菌体上百乃至上千次，来进行这个过程。将这成为噬菌体扩增。
如本文中使用的，“晚期基因区”是指在病毒生命周期晚期转录的病毒基因组的区域。晚期基因区通常包括最大量表达的基因(例如，装配至噬菌体颗粒中的结构蛋白)。晚期基因与III类基因是同义的，并且包括具有结构和装配功能的基因。例如，晚期基因(与III类同义)在噬菌体T7中转录，例如，从传染后8分钟脂质裂解，I类(例如，RNA聚合酶)是早期从4-8分钟，而II类是早期从6-15分钟，因此在II和III的时间上存在重叠。晚期启动子是天然位于这样的晚期基因区并且在该区域中有活性的启动子。
如本文中使用的，“富集培养”是指传统培养，如在有利于微生物繁殖的培养基中的孵育，并且不应当与词语“富集”的其他可能的使用混淆，如通过除去样品的液体组分以浓缩其中所含微生物的富集，或不包括微生物繁殖的传统促进的其他富集形式。在本文所述方法的一些实施方案中，可以使用非常短时间段的富集培养，但不是必需的并且如果完全使用，时间段比传统富集培养短得多。
如本文中使用的，“重组”是指通常在实验室进行的遗传(即，核酸)修饰，以将不会另外被发现的遗传物质集合。该术语可以与本文中的术语“修饰”互换使用。
如本文中使用的，“RLU”是指由发光计(例如，
Figure BDA0003822063350000111
96)或检测光的类似仪器测量的相对光单位。例如，萤光素酶和合适的底物之间的反应的检测(例如，使用
Figure BDA0003822063350000112
的
Figure BDA0003822063350000113
)常常以检测到的RLU报告。
如本文中使用的，“获得结果的时间”是指从样品制备开始到数据收集的总时间。获得结果的时间不包括任何确认测试的时间。
样品
本发明方法和系统各自的实施方案可以允许样品中的微生物的快速检测和定量。例如，可以在缩短的时间段内进行根据本发明的方法并且具有优异的结果。
通过本发明的方法和系统检测的微生物包括天然、商业、医疗或兽医关注的病原体。这样的病原体包括革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、支原体和病毒。可以通过本发明的方法检测已经对其鉴定出对特定微生物具有特异性的感染原的任何微生物。本领域技术人员将认识到除了需要的特异性感染原/微生物对的可利用性，对本发明方法的应用没有限制。
通过本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，是食品或水传播的病原体的细菌细胞。通过本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，沙门氏菌属的所有种，大肠杆菌的所有菌株，包括但不限于大肠杆菌O157:H7，李斯特氏菌属(Listeria)的所有种，包括但不限于单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)，以及弯曲杆菌属(Campylobacter)的所有种。通过本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，是医疗或兽医重要的病原体的细菌细胞。这样的病原体包括但不限于芽孢杆菌属数种(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肠杆菌属数种(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、索氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和链球菌属数种(Streptococcusspp.)。
样品可以是环境或食品或水样品。一些实施方案可包括医疗或兽医样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭样。样品可以包括环境材料，如水样，或来自旋风收集器的空气样品或气溶胶样品的滤器。样品可以是肉、家禽、加工食品、奶、奶酪，或其他乳制品。医疗或兽医样品包括但不限于血液、痰液、脊髓液和粪便样品以及不同类型的拭样。
在一些实施方案中，样品可以直接用于本发明的检测方法中，不用制备、浓缩或稀释。例如，液体样品，包括但不限于，奶和汁液，可以直接测试。样品可以被稀释或悬浮于溶液中，其可以包括，但不限于，缓冲液或细菌培养基。可以通过将固体在液体中切碎、混合或浸软，将固体或半固体样品悬浮于液体中。样品应当维持在促进噬菌体连接宿主细菌细胞的pH范围内。样品还应当含有合适浓度的二价和单价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和K+。优选，将样品维持在保持样品内含有的任何病原体细胞的生活力的温度下。
优选在检测测定中，将样品维持在保持样品中存在的任何病原体细胞的生活力的温度下。在其中噬菌体连接细菌细胞的步骤期间，优选将样品维持在促进噬菌体连接的温度下。在其中噬菌体在受感染细菌细胞内复制或裂解这样的受感染细胞的步骤期间，优选将样品维持在促进噬菌体复制和宿主裂解的温度下。这样的温度至少约25摄氏度(℃)，更优选不高于约45摄氏度。最优选约37摄氏度。还优选将样品在噬菌体连接、复制和细胞溶解过程中温和地混合或振荡。
测定可以包括各种合适的对照样品。例如，不含噬菌体的对照样品或含有噬菌体但不含细菌的对照样品可以作为用于背景信号水平的对照来进行测定。
指示噬菌体
如本文中更详细描述的，本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可以包括用于检测致病微生物的感染原。在某些实施方案中，本发明包括重组指示噬菌体，其中噬菌体基因组经遗传修饰以包括指示基因或报告基因。在一些实施方案中，本发明可包括含有重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有掺入噬菌体基因组中的指示基因。
重组指示噬菌体可包括报告基因或指示基因。在感染原的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示基因可以插入噬菌体的晚期基因区中。晚期基因通常以比其他噬菌体基因更高的水平表达，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区可以是III类基因区，并且可以包括主要衣壳蛋白的基因。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)用于主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列。在一些实施方案中，序列包含密码子优化的报告基因，其前面是非翻译区。非翻译区可包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
在一些实施方案中，指示噬菌体源自T7、T4或其他类似的噬菌体。指示噬菌体还可以源自T4-样、T7-样、ViI、ViI样、CBA120或与T7、T7-样、T4、T4-样、CBA120、ViI或ViI样(或Vi1病毒样，根据GenBank/NCBI)噬菌体具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的基因组的另一种噬菌体。在一些实施方案中，指示噬菌体衍生自对特定病原微生物高度特异的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失，因此修饰的噬菌体可以与许多商业上可获得的噬菌体相比保持与野生型感染原更相似。环境衍生的噬菌体可能对环境中发现的细菌更具特异性，因此在遗传上不同于商业上可获得的噬菌体。
此外，认为非必需的噬菌体基因可能具有未被认识的功能。例如，明显非必需的基因可能在升高释放量中具有重要功能，例如在装配中具有精细切割、拟合或整理功能。因此，缺失基因以插入指示剂可能是有害的。大部分噬菌体可以包装比其天然基因组大几个百分比的DNA。鉴于这种考虑，对于修饰噬菌体，尤其是具有较小基因组的噬菌体，较小的指示基因可能是更合适的选择。OpLuc和
Figure BDA0003822063350000141
蛋白只有约20kDa(大约500-600bp来编码)，而Fluc为约62kDa(大约1,700bp来编码)。比较而言，T7的基因组大约为40kbp，而T4基因组为约170kbp，CBA120的基因组为约157kbp。此外，报告基因不应该由细菌内源表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应该产生高信号与背景比，并且应该能够及时地检测到。Promega的
Figure BDA0003822063350000142
是一种改良的Oplophorus gracilirostris(深海虾)萤光素酶。在一些实施方案中，
Figure BDA0003822063350000143
与Promega的
Figure BDA0003822063350000144
(咪唑并吡嗪酮底物(腔肠素类似物))组合可提供具有低背景的稳健信号。
在一些指示噬菌体实施方案中，指示基因可以插入未翻译区中，以避免功能基因的破坏，留下完整的野生型噬菌体基因，当感染非实验室菌株细菌时，这可以导致更高的适合度。另外，包含所有三个阅读框的终止密码子可以通过降低通读来提高表达，也称为泄露表达。这种策略还可以消除以低水平形成融合蛋白的可能性，其将呈现为不能与噬菌体分离的背景信号(例如，萤光素酶)。
指示基因可以表达各种生物分子。指示基因是表达可检测产物或产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可以使用各种类型的萤光素酶。在可替换的实施方案中，并且如本文中更详细描述的，萤光素酶是Oplophorus萤光素酶、萤火萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶或工程化萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶基因衍生自Oplophorus。在一些实施方案中，指示基因是遗传修饰的萤光素酶基因，例如
Figure BDA0003822063350000151
因此，在一些实施方案中，本发明包括遗传修饰的噬菌体，其包括在晚期(III类)基因区中的非噬菌体指示基因。在一些实施方案中，非天然指示基因处于晚期启动子的控制下。使用病毒晚期基因启动子确保报告基因(例如萤光素酶)不仅高水平表达，如病毒衣壳蛋白那样，而且没有关闭(shut down)，如内源性细菌基因乃至早期病毒基因那样。
在一些实施方案中，晚期启动子是T4-，T7-或Vi1-样启动子，或与选择的野生型噬菌体中发现的相似(即没有遗传修饰)的另一种噬菌体启动子。晚期基因区可以是III类基因区，并且噬菌体可以源自T7、T4、T4样、ViI、ViI样、CBA120或与T7、T4、T4样、ViI、ViI样或CBA120噬菌体具有至少70、75、80、85、90或95％的同源性的基因组的另一种天然噬菌体。
感染原的遗传修饰可以包括小片段的核酸、实质性部分的基因或完整基因的插入、缺失或置换。在一些实施方案中，插入或置换的核酸包括非天然序列。非天然指示基因可以插入噬菌体基因组中，使得其处于噬菌体启动子的控制下。在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。即，在一些实施方案中，可以配置遗传修饰，使得指示蛋白产物不包括野生型噬菌体的多肽。在一些实施方案中，指示蛋白产物是可溶性的。在一些实施方案中，本发明包括用于检测目标细菌的方法，包括将测试样品与这样的重组噬菌体一起孵育的步骤。
在一些实施方案中，在宿主细菌感染后指示基因在子代噬菌体中的表达产生游离的可溶性蛋白质产物。在一些实施方案中，非天然指示基因不邻近编码结构噬菌体蛋白的基因，并且因此不产生融合蛋白。
与使用检测部分与衣壳蛋白的融合体(即，融合蛋白)的系统不同，本发明的一些实施方案表达可溶性萤光素酶。这可以很大程度上提高测定的灵敏度(低至单个细菌)，并将测定简单化，对于一些实施方案，允许测定在短于1小时内完成，与由于使用产生可检测融合蛋白的构建体需要的其他纯化步骤的几个小时相对。此外，由于例如可能改变酶活性位点的构象或接近底物的蛋白折叠限制，融合蛋白活性可能比可溶性蛋白低。
此外，通过限定的融合蛋白限制了连接至噬菌体中的蛋白亚基上的部分的数量。例如，使用设计来作为用于融合蛋白平台的商业上可购得的系统将形成约415个融合部分的拷贝，对应于约415个的每个T7噬菌体颗粒中基因10B衣壳蛋白的拷贝。在没有这个限制的情况下，感染细菌可望表达比适合于噬菌体上的更多拷贝的检测部分(例如，萤光素酶)。另外，大的融合蛋白，如衣壳-萤光素酶融合体，可能抑制噬菌体颗粒的装配，因此产生较少的噬菌体子代。因此，可溶性的、非融合指示基因产物可能是优选的。
在一些实施方案中，指示噬菌体编码报告蛋白，例如可检测的酶。指示基因产物可以产生光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是商业上可购得的，如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示部分。在一些实施方案中，萤火萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，是指示部分。其他工程化萤光素酶或产生可检测信号的其他酶也可以是合适的指示部分。
在一些实施方案中，使用可溶性检测部分消除了从受感染样品细胞的裂解物除去污染亲本噬菌体的需要。使用融合蛋白系统，用于感染样品细胞的任何噬菌体将具有连接的检测部分，并且与也含有检测部分的子代噬菌体是不可区分的。因为样品细菌的检测依赖于新形成的(重头合成的)检测部分的检测，使用融合构建体需要另外的步骤从新形成的(子代噬菌体)部分分离老的(亲本)部分。这可以在噬菌体生命周期完成前，通过洗涤受感染的细胞多次来完成，在感染后通过物理或化学方式灭活过量的亲本噬菌体，和/或用结合部分(如生物素)化学修饰亲本噬菌体，其随后可以被结合并分离(如通过抗生物素蛋白链菌素覆盖的琼脂糖珠粒)。然而，即使在去除时使用所有这些尝试，当使用高浓度的亲本噬菌体来确保少量样品细胞的感染时，可能还是保留了亲本噬菌体，形成可能阻碍从受感染细胞子代噬菌体检测信号的背景信号。
相反，在本发明的一些实施方案中使用表达的可溶性检测部分，就不需要从最终裂解物纯化亲本噬菌体，因为亲本噬菌体将不具有任何连接的检测部分。因此，感染后存在的任何检测部分必须重新形成，表示受感染细菌的存在。为了利用这种益处，亲本噬菌体的产生和制备可以包括从细菌培养物中产生亲本噬菌体的过程中产生的任何游离检测部分纯化噬菌体。根据本发明的噬菌体的一些实施方案，可以使用标准噬菌体纯化技术来纯化，如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、大小排阻色谱和渗析或衍生技术(如Amicon条带浓缩器-Millipore，Inc.)。氯化铯等密度超离心可用作为本发明的重组噬菌体制备的一部分，使得从细菌宿主中的噬菌体繁殖时产生的污染萤光素酶蛋白分离亲本噬菌体颗粒。以这种方式，本发明的亲本重组噬菌体基本上不含细菌生产过程中产生的任何萤光素酶。当用测试样品孵育重组噬菌体时，噬菌体储液中存在的残留萤光素酶的去除可以实质性地降低看到的背景信号。
在修饰的噬菌体的一些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如，来自T7，T4或ViI)对天然噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和性，所述天然噬菌体转录用于装配至噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因。这些蛋白是由噬菌体形成的最大量蛋白，因为每个噬菌体颗粒包含数打或数百个这些分子的拷贝。使用病毒晚期启动子可以确保萤光素酶检测部分的最佳高水平表达。使用源自衍生指示噬菌体的初始野生型噬菌体的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-、T7-或ViI系统的T4、T7或ViI晚期启动子)、衍生指示噬菌体的初始野生型噬菌体特异性的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-或T7-系统的T4或T7晚期启动子)或在衍生指示噬菌体的初始野生型噬菌体下有活性的晚期病毒启动子(例如，具有基于T4-或T7-系统的T4或T7晚期启动子)，可以进一步确保检测部分的最佳表达。在一些情况下，使用标准细菌(非病毒/非噬菌体)启动子可能对表达是有害的，因为这些启动子在噬菌体感染过程中常常下调(为了噬菌体将用于噬菌体蛋白产生的细菌来源列为优先)。因此，在一些实施方案中，噬菌体优选工程化来编码和高水平表达可溶性(游离)指示部分，其中使用其没有将表达限于噬菌体结构组分的亚基的数量的基因组中的替换。
本发明的组合物可包含一种或多种野生型或遗传修饰的感染原(例如噬菌体)和一种或多种指示基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示噬菌体的混合物，其可编码和表达相同或不同的指示蛋白。
制备指示噬菌体的方法
用于制备指示噬菌体的方法的实施方案开始于选择用于遗传修饰的野生型噬菌体。一些噬菌体对靶细菌具有高度特异性。这为高度特异性检测提供了机会。
因此，本发明的方法利用与感染原相关的结合剂的高特异性，其识别并结合特定的目标微生物，作为扩增信号从而检测存在于样品中的低水平微生物(例如，单个微生物)的手段。例如，感染原(例如噬菌体)特异性识别特定微生物的表面受体，从而特异性地感染这些微生物。因此，这些感染原可以是用于靶向目标微生物的合适结合剂。
可以使用各种感染原。在备选实施方案中，细菌噬菌体，噬菌体，分枝杆菌噬菌体(例如用于TB和paraTB)，真菌噬菌体(例如用于真菌)，支原体噬菌体和可用于靶向目标微生物的任何其他可侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他微观活生物体的病毒。例如，在一个实施方案中，当目标微生物是细菌时，感染原可以包括噬菌体。例如，充分研究的大肠杆菌噬菌体包括T1，T2，T3，T4，T5，T7和λ；ATCC集合中可获得的其他大肠杆菌噬菌体例如包括phiX174，S13，Ox6，MS2，phiV1，fd，PR772和ZIK1。如本文所讨论的，噬菌体可在细菌内复制以产生数百个子代噬菌体。插入噬菌体基因组中的指示基因的产物的检测可用作样品中细菌的量度。
本发明的一些实施方案利用重组噬菌体的结合特异性和高水平遗传表达能力进行快速和灵敏的靶向以感染目标细菌和促进目标细菌的检测。在一些实施方案中，对CBA120噬菌体进行遗传修饰以包括报告基因。在一些实施方案中，噬菌体的晚期基因区经遗传修饰以包括报告基因。在一些实施方案中，报告基因位于主要衣壳基因的下游。在其他实施方案中，报告基因位于主要衣壳基因的上游。
制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化至靶病原菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；并分离重组噬菌体的特定克隆。
用于设计和制备同源重组质粒的各种方法是已知的。已知用质粒转化细菌的各种方法，包括热休克、F菌毛介导的细菌缀合，电穿孔和其他方法。用于在同源重组后分离特定克隆的各种方法也是已知的。本文描述的一些方法实施方案使用特定策略。
因此，制备指示噬菌体的方法的一些实施方案包括以下步骤：选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；确定所选噬菌体基因组晚期区的天然序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计用于在主要衣壳蛋白基因附近同源重组的序列，其中所述序列包含密码子优化的报告基因；将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中；将质粒/载体转化至靶病原菌；选择转化的细菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的细菌，从而允许质粒和噬菌体基因组之间发生同源重组；确定所得重组噬菌体裂解物的滴度；并进行有限稀释测定以富集和分离重组噬菌体。一些实施方案包括在第一次有限稀释测定后，根据需要进一步重复有限稀释和滴定步骤，按需要地，直到重组噬菌体代表混合物的可检测部分。例如，在一些实施方案中，可以重复有限稀释和滴度步骤，直到混合物中至少1/30的噬菌体是重组的，然后分离出特定的重组噬菌体克隆。预期1:30的重:野生型的比率产生每96个噬斑(例如，在96孔板中)平均3.2个转导单位(TU)。通过泊松分布，1:30比率因此产生96％的机会在96孔中的某处观察到至少一个TU。
图1描绘了野生型CBA120噬菌体基因组的示意图。鉴定晚期基因簇110，并注释晚期基因区中的开放阅读框120(ORF)。鉴定了主要衣壳蛋白130(MCP)的ORF187/gp23推定基因，并将其序列与晚期基因簇中的下游序列一起用于制备携带所需报告基因的重组质粒。
制备重组指示噬菌体的方法的一些实施方案包括设计可以容易地与野生型噬菌体基因组重组以产生重组基因组的质粒。在设计质粒时，一些实施方案包括添加密码子优化的报告基因，例如萤光素酶基因。一些实施方案还包括将元件添加到上游非翻译区中。例如，在设计与CBA120基因组重组的质粒时，可以在编码gp23/主要衣壳蛋白的C末端的序列和
Figure BDA0003822063350000201
报告基因的起始密码子之间加入上游非翻译区。非翻译区可包括启动子，例如T4，T4样，T7，T7样，CBA120，ViI或ViI样启动子。非翻译区还可以包括核糖体进入/结合位点(RBS)，也称为具有细菌系统的“Shine-Dalgarno序列”。这些元件或其他非翻译元件中的任一个或两个可以嵌入由随机序列构成的短上游非翻译区内，所述随机序列包含与噬菌体基因组的其余部分大约相同的GC含量。随机区域不应包括ATG序列，因为它将充当起始密码子。
有许多用于制备质粒的已知方法和商业产品。例如，PCR、定点诱变、限制性消化、连接、克隆和其他技术可以组合使用以制备质粒。合成质粒也可以商业订购(例如，GeneWiz)。也可以使用粘粒，或者CRISPR/CAS9系统可以用于选择性编辑噬菌体基因组。
图2显示了设计用于与CBA120噬菌体基因组重组以产生重组噬菌体的质粒的实施方案。该特定质粒命名为pUC57.HR.CBA120.NanoLuc。检测/指示部分由
Figure BDA0003822063350000211
报告基因941-1540编码。插入物(396-1883)是pUC57的标准AmpR形式。主要衣壳蛋白C末端片段由396-895，ORF187/gp23表示。在5'非翻译区内的T4样噬菌体晚期启动子共有序列(902-912)和Shine-Dalgarno核糖体进入/结合位点(927-934)由896-940表示。密码子优化的
Figure BDA0003822063350000212
报告基因由941-1540表示。非翻译区(UTR)和ORF185假定蛋白N-末端片段由1541-1838表示。转录终止子(1839-1883)仅在质粒中，并且由于重组而不成为噬菌体基因组的一部分。
ORF187/gp23片段396-895是编码病毒体蛋白的结构基因的一部分。由于这些病毒体蛋白以非常高的水平表达，因此只要使用晚期基因启动子和/或其他类似的控制元件，可以预期插入该区域的任何基因具有相似的表达水平。
图3显示了图2的质粒和图1的噬菌体基因组之间预期的同源重组以产生表达萤光素酶基因的重组噬菌体的示意图。在同源重组以产生重组噬菌体的该实施方案中，CBA120噬菌体基因组是157,304个碱基对，而合成的质粒是4,117个碱基对。由重组产生的最终重组基因组是157,949个碱基对。
在一些实施方案中，根据本发明的指示噬菌体包含经遗传工程改造的CBA120噬菌体，其包含报告基因，例如萤光素酶基因。例如，指示噬菌体可以是CBA120噬菌体，其中基因组包含
Figure BDA0003822063350000215
基因的序列。重组CBA120噬菌体基因组可以进一步包含T4、T7、CBA120、ViI或另一种晚期启动子。
因此，在由于图3中所示的重组产生的重组噬菌体的实施方案中，将指示基因(即，
Figure BDA0003822063350000213
)插入到晚期基因区中，恰好在编码主要衣壳蛋白的基因的下游，并且因此产生包含
Figure BDA0003822063350000214
基因的重组噬菌体基因组。构建体可另外包含共有T4、T7、CBA120、ViI或另一种晚期启动子或另一种合适的启动子以驱动萤光素酶基因的转录和表达。构建体还可以包含由几个UTR合成的复合非翻译区。该构建体确保产生可溶性萤光素酶，使得表达不限于噬菌体展示系统中固有的衣壳蛋白的数量。
图4描绘了使用图2中所示的质粒构建体从野生型和图3中所示的同源重组产生的重组噬菌体的混合物中分离重组噬菌体。
在第一个步骤402中，用噬菌体感染用同源重组质粒转化的细菌，形成具有大约120个野生型432:1个重组噬菌体434比例的亲本和重组噬菌体混合物的子代噬菌体。将所得到的重组噬菌体混合物稀释404至96孔平板406中，以获得平均每个平板3个重组转导单位(TU)，其对应于每孔约3.8个大部分野生型噬菌体的传染单位(IU)。测定96-孔平板的萤光素酶活性，以与含有野生型噬菌体的孔440相比，鉴定含有重组噬菌体的孔436。加入408细菌438；例如，每个孔可以含有约50μL混浊的大肠杆菌O157:H7培养物。这允许噬菌体复制并产生萤光素酶442。在410所示的37℃下孵育2小时后，可以针对萤光素酶442的存在筛选孔。任何阳性孔很可能已经用单个重组噬菌体接种，并且在这个阶段，混合物可以含有大约3.8个野生型噬菌体:1个重组体的比例，高于初始120:1比例的富集。在一个实施方案中，可溶性萤光素酶和噬菌体以大约16个野生型:1个重组的比例存在。如果需要(即，如果重组体：野生型的比例低于1:30)，来自这个富集培养物412的子代可以接受另外的有限稀释测定414，以增加比例并测定重组噬菌体转导单位的实际浓度。例如，可以从第一个纯化储液等分414约3个重组TU/96-孔平板416，形成大约～20个大部分野生型噬菌体/孔的接种的第二个稀释测试平板420。任何阳性的萤光素酶孔很可能已经接种单个重组连同～20个野生型噬菌体。可以针对萤光素酶442的存在分析这些孔。
添加细菌并孵育(例如，37℃2小时)418后，可溶性萤光素酶和噬菌体以大约20个野生型:1个重组体存在420。最后，可以进行噬菌斑测定422，以筛选表达萤光素酶446的重组体。可以单独挑选少量单独的(例如，n＝48)噬菌斑，并针对萤光素酶活性436，在第三个多孔平板中筛选426。在一个实施方案中，这种方法应当确保约3个重组体在待筛选的噬菌斑混合物中。可以从平板取出一个噬菌斑至96-孔平板的每个孔中424，并且进行萤光素酶测试426，以确定哪个孔含有呈现出萤光素酶442活性的噬菌体。证明萤光素酶活性的孔428表示纯的重组噬菌体434，而没有萤光素酶活性的孔430表示纯的野生型噬菌体432。
然后可以将单独的噬菌斑悬浮于缓冲液(例如，100μL TMS)或培养基中，并且将等份试样(例如，约5μL)加入含有混浊的大肠杆菌O157:H7培养物的孔中，并在孵育后测定(例如，在37℃下约45分钟至1小时)。预期阳性孔含有纯的重组噬菌体培养物。某些实施方案可包括另一轮的噬菌斑纯化。
因此，如图4举例说明的，通过设计用于与野生型噬菌体基因组重组的质粒的同源重组产生的重组噬菌体可以从构成仅0.005％总噬菌体基因组的混合物分离。分离后，可以进行大规模生产，以获得适用于大肠杆菌O157:H7检测测定中的高滴定度重组指示噬菌体储液。此外，氯化铯等密度梯度离心可以用于从污染荧光素蛋白分离噬菌体颗粒，以降低背景。
图5显示了如图3所示的通过图1中所示的野生型CBA120噬菌体基因组与图2中所示的质粒的重组产生的重组指示噬菌体的一个实施方案的电子显微照片。为了捕获图像，噬菌体在5-20％蔗糖密度梯度上纯化，将其吸附在经辉光放电处理的碳膜上，并用2％乙酸铀酰染色。在FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin透射电子显微镜中观察样品，并用EagleTM 2KCCD拍摄显微照片。该指示噬菌体命名为“CBA120NanoLuc”(或“CBA120NanoLuc指示噬菌体”)，并用于本文所述的测定中。本文实施例和附图中呈现的数据是使用该指示噬菌体用于感染待测样品中的细菌获得的。
以这种方式，并且如以下实施例中更详细描述的，可以产生具有插入野生型噬菌体中的目标报告基因(例如，萤光素酶基因，例如萤火虫、Oplophorus或工程化萤光素酶，如
Figure BDA0003822063350000231
)的重组噬菌体。
使用感染原检测微生物的方法
如本文所述，在某些实施方案中，本发明可包括使用感染性颗粒检测微生物的方法。本发明的方法可以以各种方式实施。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中目标细菌的方法，包括以下步骤：将样品与感染目标细菌的噬菌体一起孵育，其中噬菌体包含指示基因，使得在感染目标细菌后的噬菌体复制过程中指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物；检测指示蛋白质产物，其中指示蛋白质产物的阳性检测表明目标细菌存在于样品中。
在某些实施方案中，可以进行测定以利用可以修改以适应不同的样品类型或大小和测定形式的一般概念。使用本发明的重组噬菌体(即指示噬菌体)的实施方案可以允许快速检测特定细菌菌株，总测定时间在1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5或12小时内，取决于样品类型、样品大小和测定形式。例如，取决于噬菌体株和在测定中待检测的细菌菌株，待测样品的类型和大小、靶标生存所需的条件物理/化学环境的复杂性以及“内源性”非靶细菌污染物的浓度，所需的时间可以更短或更长。
图6说明了根据本发明的一个实施方案使用修饰的噬菌体检测目标细菌的测定的实施方案。将指示噬菌体614的等分试样分配到多孔板604的各个孔602中，然后加入含有细菌612的测试样品等分试样并孵育(606)一段时间(例如，37℃下45分钟)，使得足以复制噬菌体并产生可溶性指示剂616(例如萤光素酶)。然后可以测定(610)含有可溶性指示剂和噬菌体的平板孔608，以测量平板618上的指示剂活性(例如，萤光素酶测定)。本文描述了利用该方法的实验。在一些实施方案中，测试样品不浓缩(例如，通过离心)，但是与指示噬菌体直接孵育一段时间，随后测定萤光素酶活性。在其他实施方案中，可以使用各种工具(例如，离心机或过滤器)在富集之前或测试之前浓缩样品。例如，可以提取10mL等份的制备的样品并离心以沉淀细胞和大的碎片。可以将沉淀物重新悬浮在较小的体积中用于富集或用于测试(即，在用指示噬菌体感染样品之前)。
在一些实施方案中，可以在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在这样的实施方案中，取决于样品类型和大小，富集时间可以是1、2、3、4、5、6、7或至多8小时或更长。
因此，在一些实施方案中，指示噬菌体包括可检测的指示部分，并且可以通过扩大的指示部分产生的信号来检测单个病原体细胞(例如细菌)的感染。因此，该方法可以包括检测噬菌体复制过程中产生的指示部分，其中指示剂的检测表示样品中存在靶细菌。
在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测样品中的靶细菌的方法，包括步骤：将样品与感染靶细菌的重组噬菌体一起孵育，其中重组噬菌体包括插入噬菌体晚期基因区中的指示基因，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达导致产生可溶性指示蛋白产物；和检测指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表示样品中存在靶细菌。在一些实施方案中，检测的指示部分的量对应于样品中存在的靶细菌的量。
如本文更详细描述的，本发明的方法和系统可利用一系列浓度的亲本指示噬菌体来感染样品中存在的细菌。在一些实施方案中，指示噬菌体以足以快速发现、结合和感染样品中存在的极少量靶细菌(例如单细胞)的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，噬菌体浓度可足以在不到一小时内发现、结合和感染靶细菌。在其他实施方案中，在向样品中加入指示噬菌体后，这些事件可在少于2小时或少于3小时内发生。例如，在某些实施方案中，孵育步骤的噬菌体浓度大于1x105PFU/mL，大于1x106PFU/mL，或大于1x107PFU/mL。
在某些实施方案中，重组感染原可以纯化，使得不含感染原储液生产时产生的任何残余指示蛋白。因此，在某些实施方案中，在与样品一起孵育前，可以使用氯化铯等密度梯度离心纯化重组噬菌体。感染原是噬菌体时，这种纯化可以具有除去不具有DNA的噬菌体(即，空噬菌体或“空胞”)的附加益处。
在本发明方法的一些实施方案中，可以在不从样品中任何分离或纯化微生物的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，可以将含有一种或几种目标微生物的样品直接应用于测定容器，例如旋转柱、微量滴定孔或过滤器，并且在该测定容器中进行测定。本文公开了此类测定的各种实施方案。
可以将测试样品的等分试样直接分配到多孔板的孔中，可以添加指示噬菌体，并且在足以感染的一段时间后，可以添加裂解缓冲液以及指示部分的底物(例如，用于萤光素酶指示剂的萤光素酶底物)并测定指示剂信号的检测。该方法的一些实施方案可以在滤板上执行。在用指示噬菌体感染之前，可以在有或没有浓缩样品的情况下进行该方法的一些实施方案。
例如，在许多实施方案中，使用多孔板进行测定。平板(或可以进行检测的任何其他容器)的选择可能影响检测步骤。例如，一些平板可以包括彩色或白色背景，这可能影响光发射的检测。一般而言，白平板具有更高的灵敏度，但也产生更高的背景信号。其他颜色的平板可能会产生较低的背景信号，但灵敏度也会略低。另外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄漏到另一个邻近孔。有一些平板有白色的孔，但平板的其余部分是黑色的。这允许孔内的高信号但是防止孔到孔的光泄漏并因此可以减少背景。因此，平板或其他测定容器的选择可能影响测定的灵敏度和背景信号。
本发明的方法可包括各种其他步骤以增加灵敏度。例如，如本文更详细讨论的，该方法可包括在添加噬菌体之后但在孵育之前洗涤捕获和感染的细菌的步骤，以去除过量的亲代噬菌体和/或萤光素酶或污染噬菌体制剂的其他报告蛋白。
在一些实施方案中，可以完成对目标微生物的检测，而无需培养样品以增加微生物群体。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间小于12.0小时，11.0小时，10.0小时，9.0小时，8.0小时，7.0小时，6.0小时，5.0小时，4.0小时，3.0小时，2.5小时，2.0小时，1.5小时，1.0小时，45分钟或小于30分钟。最小化获得结果的时间对于病原体的食品和环境测试至关重要。
与本领域已知的测定相反，本发明的方法可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，该方法可以检测样品中存在的≤10个微生物细胞(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9个微生物)。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对大肠杆菌O157:H7具有高度特异性。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌存在下区分大肠杆菌O157:H7。在某些实施方案中，重组噬菌体可用于检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体检测样品中少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个的特定细菌。
因此，本发明的各个方面提供了通过指示部分检测测定样品中的微生物的方法。在一些实施方案中，在目标微生物是细菌的情况下，指示部分可以与感染原(如指示噬菌体)相关。指示部分可以与底物反应来发射可检测信号或可以发射固有信号(例如，荧光蛋白)。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示测试样品中少如50，20，10，9，8，7，6，5，4，3或2个目标微生物细胞的存在。在一些实施方案中，甚至单个目标微生物的细胞也可以产生可检测的信号。在一些实施方案中，噬菌体是T4样或ViI样噬菌体。在一些实施方案中，重组噬菌体衍生自CBA120。在某些实施方案中，CBA120重组噬菌体对大肠杆菌O157:H7具有高度特异性。
在一些实施方案中，由感染原编码的指示部分可以在感染原复制过程中或之后检测到。适宜用作指示部分的许多不同类型的可检测生物分子是本领域已知的，并且许多是商业上可购得的。在一些实施方案中，指示噬菌体包括酶，其用作指示部分。在一些实施方案中，将指示噬菌体的基因组进行修饰，以编码可溶性蛋白。在一些实施方案中，指示噬菌体编码可检测酶。指示剂可以发射光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶是商业上可购得的，如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以用作指示部分。在一些实施方案中，萤火萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，Oplophorus萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，
Figure BDA0003822063350000271
是指示部分。其他工程化的萤光素酶或产生可检测信号的其他酶也是合适的指示部分。
因此，在一些实施方案中，方法、系统或试剂盒的重组噬菌体由野生型噬菌体CBA120制备。在一些实施方案中，指示基因编码发射固有信号的蛋白质，例如荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白或其他)。指示剂可以发光和/或可以通过颜色变化检测。在一些实施方案中，指示基因编码与底物相互作用以产生信号的酶(例如萤光素酶)。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。在一些实施方案中，萤光素酶基因是以下之一：Oplophorus萤光素酶，萤火虫萤光素酶，海肾萤光素酶，External Gaussia萤光素酶，Lucia萤光素酶或工程化萤光素酶如
Figure BDA0003822063350000281
Rluc8.6-535或Orange Nano-lantern。
检测指示剂可以包括检测光的发射。在一些实施方案中，发光计可用于检测指示剂(例如萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可以用发光计实现，或者也可以使用其他仪器或设备。例如，分光光度计、CCD相机或CMOS相机可以检测颜色变化和其他光发射。绝对RLU对于检测很重要，但是信号与背景比也需要很高(例如，>2.0，>2.5或>3.0)，以便可靠地检测单个细胞或少量细胞。
在一些实施方案中，指示噬菌体被遗传工程化以含有用于酶(如萤光素酶)的基因，其只在噬菌体特异性地识别并感染的细菌感染时才产生。在一些实施方案中，指示部分在病毒生命周期的晚期表达。在一些实施方案中，如本文中所述的，指示剂是可溶性蛋白(例如，可溶性萤光素酶)并且没有与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。
因此，在利用指示噬菌体的一些实施方案中，本发明包括用于检测目标微生物的方法，包括以下步骤：捕获至少一种样品细菌；用多个指示噬菌体孵育至少一种细菌；允许感染和复制一段时间以产生子代噬菌体并表达可溶性指示剂部分；检测子代噬菌体，或优选指示剂，其中指示剂的检测证明细菌存在于样品中。
例如，在一些实施方案中，可以通过结合到板的表面，或通过细菌过滤器(例如，0.45μm孔径旋转过滤器或板过滤器)过滤样品来捕获测试样品细菌。在一个实施方案中，将感染原(例如指示噬菌体)以最小体积添加到在过滤器上直接捕获的样品中。在一个实施方案中，随后将过滤器或平板表面上捕获的微生物洗涤一次或多次以除去过量的未结合的感染原。在一个实施方案中，可以添加培养基(例如，Luria-Bertani肉汤，在本文中也称为LB，或胰蛋白酶大豆肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤，在本文中也称为TSB)以进一步孵育一段时间，以允许细菌细胞和噬菌体的复制和编码指示部分的基因的高水平表达。然而，测试测定的一些实施方案的令人惊讶的方面是使用指示噬菌体的孵育步骤的时间仅需要足以进行单个噬菌体生命周期。先前认为使用噬菌体的扩增能力需要更多时间，以使得噬菌体将复制数个循环。根据本发明的一些实施方案，指示噬菌体的单个复制循环可足以促进敏感和快速检测。
在一些实施方案中，将包含细菌的等份测试样品施加于旋转柱并且用重组噬菌体感染和任选的洗涤以除去任何过量噬菌体后，检测的可溶性指示剂的含量将与受感染的细菌产生的噬菌体含量成比例。
当细菌裂解时，可溶性指示剂(例如，萤光素酶)释放至周围液体中，其随后可以被测量和定量。在一个实施方案中，将溶液通过滤器旋转，并且在添加针对指示剂酶的底物(例如，萤光素酶底物)，收集用于在新容器(例如，在发光计中)中测试的滤液。或者，可以直接在滤器上测量指示信号。
在各种不同的实施方案中，纯化的亲本指示噬菌体不包括可检测指示剂自身，因为在用于与测试样品一起孵育前，亲本噬菌体可以被纯化。晚期(III类)基因的表达发生在病毒生命周期的晚期。在本发明的一些实施方案中，亲本噬菌体可以纯化，以排除任何现有的指示蛋白(例如，萤光素酶)。在一些实施方案中，在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性指示蛋白产物。因此，在许多实施方案中，不需要在检测步骤之前从子代噬菌体分离出亲本。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且指示噬菌体是噬菌体。在一个实施方案中，指示部分是可溶性萤光素酶，其在宿主微生物裂解时释放出来。
因此，在可替换的实施方案中，指示剂底物(例如萤光素酶底物)可以与保持在滤器上或结合平板表面的样品部分一起孵育。因此，在一些实施方案中，固体支持物是96-孔滤器平板(或常规96-孔平板)，并且通过将平板直接放入光度计中来检测底物反应。
例如，在一个实施方案中，本发明可以包括用于检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括步骤：用能够在感染时表达萤光素酶的多个亲本指示噬菌体感染96-孔滤板上捕获的细胞；洗掉过量噬菌体，添加LB肉汤并允许噬菌体复制和裂解特定大肠杆菌靶的时间(例如，30-90分钟)；和通过加入萤光素酶底物并直接在96-孔平板中测量萤光素酶活性来检测指示剂萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表示样品中存在大肠杆菌O157:H7。
在另一个实施方案中，本发明可以包括用于检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括步骤：用感染时能够表达萤光素酶的多个亲本指示噬菌体感染96-孔平板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；允许噬菌体复制并裂解特定大肠杆菌靶的时间(例如，30-120分钟)；和通过加入萤光素酶底物并直接在96-孔平板中测量萤光素酶活性来检测指示剂萤光素酶，其中萤光素酶活性的检测表示样品中存在大肠杆菌O157:H7。在这样的实施方案中，不需要捕获步骤。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消费的测试样品，如蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩LB肉汤、胰蛋白酶/胰蛋白胨大豆肉汤、蛋白胨水或或营养肉汤强化的蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是在LB肉汤中稀释的细菌。
在一些实施方案中，细菌的裂解可以在检测步骤之前、之中或之后发生。实验表明在一些实施方案中，添加萤光素酶底物时，受感染的未裂解的细胞是可检测的。据推测，萤光素酶可能脱离细胞和/或萤光素酶底物可能进入细胞，而没有完全的细胞溶解。因此，对于利用旋转滤器系统的实施方案，其中在光度计中只分析释放至裂解物中的萤光素酶(而不是萤光素酶仍然在完整的细菌内部)，需要裂解来用于检测。然而，对于利用滤板或96-孔平板和溶液或悬浮液中的样品的实施方案，其中充满完整和裂解细胞的初始平板在光度计中直接测定，对于检测，不需要裂解。
在一些实施方案中，指示部分(例如，萤光素酶)与底物的反应可能持续30分钟或更长，并且对于优化灵敏度，在不同时间点的检测可能是理想的。例如，在使用96-孔滤板作为固体支持物和萤光素酶作为指示剂的实施方案中，可以在初始以及以10-或15-分钟间隔获取光度计读数，直至反应完成。
令人惊讶地，对于感染测试样品利用高浓度的噬菌体成功地实现了在非常短的时间周期中非常少量的目标微生物的检测。在一些实施方案中，将噬菌体与测试样品一起孵育只需要足够用于单个噬菌体生命周期的时间长度。在一些实施方案中，用于此孵育步骤的噬菌体浓度高于7×106，8×106，9×106，1.0×107，1.1×107，1.2×107，1.3×107，1.4×107，1.5×107，1.6×107，1.7×107，1.8×107，1.9×107，2.0×107，3.0×107，4.0×107，5.0×107，6.0×107，7.0×107，8.0×107，9.0×107或1.0×108PFU/mL。
使用这样的高浓度噬菌体的成功是令人惊讶的，因为大量的噬菌体之前与“自外溶菌作用”相关，其杀灭靶细胞并由此防止从早期噬菌体测试产生有用的信号。可能是本文中所述的制备的噬菌体储液的清除有助于减轻这个问题(例如，通过氯化铯等密梯度超离心的清除)，因为除了除去任何与噬菌体相关的污染萤光素酶，这种清除也可能除去了菌蜕粒子(具有丢失的DNA的颗粒)。这种菌蜕粒子可以通过“自外溶菌作用”裂解细菌细胞，过早地杀灭细胞并由此防止指示信号的产生。电子显微镜证明了粗制噬菌体裂解物(即，在氯化铯清除之前)具有高于50％的菌蜕。这些菌蜕粒子可以通过刺穿细胞膜的许多噬菌体颗粒的作用引起微生物过早的死亡。因此，菌蜕粒子可能引起之前的问题，其中报道了高PFU浓度是有害的。此外，非常干净的噬菌体制备允许没有洗涤步骤而进行测试，这使得可以在没有初始浓缩步骤的情况下进行测定。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，该浓缩步骤允许更短的富集孵育时间。
测试方法的一些实施方案可以进一步包括验证测定。本领域已知用于确认初始结果的多种测定法，通常在稍后的时间点进行。例如，可以培养样品(例如，如实施例4中所述的
Figure BDA0003822063350000321
测定法)，可以使用PCR来确认微生物DNA的存在，或者可以使用其他确认性测定来确认初始结果。
图7-9显示了使用CBA120NanoLuc指示噬菌体对来自大肠杆菌O157:H7培养物的样品的基本测定(例如，如图6中所示进行)的数据。图7显示了三种不同的感染噬菌体浓度，105、106和107个噬菌体/mL。图8使用每个指定细胞数的6-10个重复，以证明与零个细胞(背景)或更高数量的细胞相比，来自单细胞的信号之间的显著差异。图9显示图8中所示实验的信号与背景比大于2.0。实施例3也描述了这些实验。
牛肉测定
用于检测食品中大肠杆菌O157:H7的现有方案是复杂、昂贵、缓慢、劳动密集且易于误报的。用对该病原体特异的重组噬菌体进行检测提供了有效、快速和简单的测试替代方案。
牛肉测定的实施方案包括样品制备步骤。一些实施方案可包括富集时间。例如，取决于样品类型和大小，可能需要富集1、2、3、4、5、6、7或8小时。在这些样品制备步骤之后，用表达报道分子或指示剂的高浓度重组噬菌体感染可以以多种测定形式进行，例如图6中所示。
牛肉测定的实施方案可以检测对应于工业标准的样品大小的单个致病细菌，取决于样品类型和大小，获得结果的时间减少20-50％。
图10-16显示了使用CBA120NanoLuc指示噬菌体的牛肉测定实验的数据，如实施例4中所述。
蔬菜洗涤分析
为了制备蔬菜洗涤物，可以称量蔬菜叶(例如菠菜或莴苣)并将其加入干净的塑料袋中。可以将液体添加到蔬菜洗涤液中。例如，在一些实施方案中，每克(g)蔬菜加入5mL水。也可以使用其他实验室液体(例如LB)。可以手动混合叶子和溶液几分钟。然后可以从塑料袋中提取液体并且可以将其用作“蔬菜洗涤物”。使用该方法，发现约1百万“内源性”细菌污染物存在于单个菠菜叶(1-2g)上。
该测定是定量的，因为检测到的信号与样品中目标细菌的量成比例。例如，可以将已知数量的大肠杆菌O157:H7细胞添加到植物洗涤样品中以模拟具有致病细菌的蔬菜污染。使用实施例5中描述的植物洗涤样品的实验证明每个测定来自0个细胞、1个细胞和7个细胞的信号之间的显著差异，证明了在蔬菜洗涤中检测单位数细胞数的能力。每次测定使用更多细菌细胞以剂量依赖性方式显示增加的信号。蔬菜洗涤液含有约106个非靶细菌/mL，对应于该测定中每个样品至少105个非靶细菌(包括0细胞大肠杆菌O157:H7对照)。从105个非靶细菌中辨别出少至单个靶细菌细胞的能力是令人惊讶的并且再次证明了该测定的特异性和灵敏性。图17显示了来自蔬菜洗涤实验的数据(实施例5)。
在一些实施方案中，本文所述方法的孵育步骤包括最终噬菌体浓度大于7x106,8x106,9x106,1.0x107,1.1x107,1.2x107,1.3x107,1.4x107,1.5x107,1.6x107,1.7x107,1.8x107,1.9x107,2.0x107,3.0x107,4.0x107,5.0x107,6.0x107,7.0x107,8.0x107,9.0x107,or1.0x108PFU/mL。先前报道这种高噬菌体浓度对这种测定是有害的，因此成功使用这种高浓度产生了意想不到的结果。在一些实施方案中，本发明的方法需要少于12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2小时来检测目标微生物。在一些实施方案中，所述方法可检测少至100、50、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个目标细菌细胞。这些时间范围比以前认为的要短。在一些实施方案中，甚至细菌的单个细胞也是可检测的。在另外的实施方案中，本发明包括系统(例如，计算机系统，自动化系统或试剂盒)，其包含用于实施本文公开的方法的组分，和/或使用本文所述的修饰的噬菌体。
本发明的系统和试剂盒
在一些实施方案中，本发明包括系统(例如，自动化系统或试剂盒)，其包括用于进行本文中公开的方法的组成部分。在一些实施方案中，指示噬菌体包含在根据本发明的系统或试剂盒中。本文描述的方法还可以使用此类指示噬菌体系统或试剂盒。鉴于进行所述方法需要少量的试剂和材料，本文中所述的一些实施方案特别适用于自动化和/或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒的每个组成部分可以包括可以从第一个位点传送至第二个位点的自包含单元。
在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统或试剂盒。在某些实施方案中，所述系统或试剂盒包括将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分和用于检测指示部分的组成部分，其中感染原包括指示部分。在本发明的系统和试剂盒的一些实施方案中，感染原是感染目标细菌的重组噬菌体，并且重组噬菌体包含插入噬菌体的晚期基因区中的指示基因作为指示部分，使得在宿主细菌感染后噬菌体复制过程中指示基因的表达形成可溶性的指示蛋白产物。一些系统进一步包括用于捕获固体支持物上的目标微生物的组成部分。
在其他实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中目标微生物的方法、系统或试剂盒，其包含对目标微生物特异的感染原组分，其中所述感染原包含指示剂部分，和用于检测指示剂部分的组分。在一些实施方案中，噬菌体是T4样，ViI，ViI样或CBA120噬菌体。在一个实施方案中，重组噬菌体衍生自CBA120。在某些实施方案中，重组噬菌体对特定细菌具有高度特异性。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对大肠杆菌O157:H7具有高度特异性。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在超过100种其他类型的细菌存在下区分大肠杆菌O157:H7。在某些实施方案中，系统或试剂盒检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，系统或试剂盒检测样品中少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个的特定细菌。
在某些实施方案中，系统和/或试剂盒可以进一步包括用于洗涤捕获的微生物样品的组成部分。另外地或替换地，系统和/或试剂盒可以进一步包括用于测定指示部分的量的组成部分，其中检测的指示部分的的量对应于样品中的微生物的量。例如，在某些实施方案中，系统或试剂盒可以包括用于测量萤光素酶活性的光度计或其他设备。
在一些系统和/或试剂盒中，相同的组成部分可以用于多个步骤。在一些系统和/或试剂盒中，步骤是自动化的或通过使用者经由计算机输入来控制和/或其中液体操作机器人进行至少一个步骤。
因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统或试剂盒，其包括：用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分，其中感染原包括指示部分；用于从固体支持物上的样品捕获微生物的组成部分；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染原的组成部分；和用于检测指示部分的组成部分。在一些实施方案中，相同组成部分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤(例如过滤组件)的步骤。一些实施方案另外包括用于测定样品中的目标微生物的量的组成部分，其中检测的指示部分的量对应于样品中的微生物的量。这样的系统可以包括与以上针对快速检测微生物方法描述的那些类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且感染原是噬菌体。在计算机化的系统中，系统可以全自动化、半自动化或由使用者通过计算机指引(或其一些组合)。
在一些实施方案中，系统可以包括用于从样品中的其他组分分离出目标微生物的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括一种包括用于检测目标微生物的组成部分的系统或试剂盒，其包括：用于从样品中的的其他组分分离出目标微生物的组成部分；用于用多个亲本感染原感染至少一个微生物的组成部分；用于裂解至少一个受感染微生物以释放微生物中存在的子代感染原的组成部分；和用于检测子代感染原或(以更高灵敏度)检测由感染原编码和表达的可溶性蛋白质的组分，其中感染原或感染原的可溶性蛋白质产物的检测表明该样品中存在微生物。感染原可包括CBA120NanoLuc。
系统或试剂盒可以包括用于检测子代感染原的各种组成部分。例如，在一个实施方案中，子代感染原(例如，噬菌体)可以包括指示部分。在一个实施方案中，子代感染原(例如，噬菌体)中的指示部分可以是在复制过程中表达的可检测部分，如可溶性萤光素酶蛋白。
在其他实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的试剂盒，该系统包括：用于将样品与目标微生物特异性的感染原一起孵育的组成部分，其中感染原包括指示部分；用于从固体支持物上的样品捕获微生物的组成部分；用于洗涤捕获的微生物样品以除去未结合的感染原的组成部分；和用于检测指示部分的组成部分。在一些实施方案中，相同的组成部分可以用于捕获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外包括扩用于测定样品中的目标微生物量的组成部分，其中检测的指示部分的量对应于样品中的微生物量。这样的试剂盒可以包括与以上针对快速检测微生物的方法描述的那些类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，微生物是细菌，并且感染原是噬菌体。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于从样品中的其他组分中分离目标微生物的组成部分。
本发明的这些系统和试剂盒包括各种组成部分。如本文中使用的，术语“组成部分”宽泛限定，并且包括适用于进行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。组成部分不需要以任何特定方式相对于彼此完整地连接或安置。本发明包括相对于彼此任何合适的组成部分的排列。例如，组成部分不需要在同一个房间中。但在一些实施方案中，组成部分在成套机组中彼此连接。在一些实施方案中，相同的组成部分可以进行多个功能。
计算机系统和计算可读介质
本发明或其任何组成部分中所述的系统可以以计算机系统的形式来具体说明。计算机系统的典型实例包括通用计算机、程序化微处理器、微控制器、外周集成电路元件和能够执行组成本发明技术方法的步骤的其他设备或设备的排列。
计算机系统可以包括计算机、输入装置、显示单元和/或互联网。计算机可以进一步包括微处理器。微处理器可以连接通讯总线。计算机还可以包括存储器。存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机系统可以进一步包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储设备，如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备还可以是用于将计算机程序或其他指令加载至计算机系统中的其他相似装置。计算机系统还可以包括通讯单元。通讯单元允许计算机通过I/O界面连接其他数据库和互联网。通讯单元允许将数据转移至其他数据库，以及从其他数据库接收数据。通讯单元可以包括调制解调器、以太网卡或能够使计算机系统连接数据库和网络的任何相似设备，如LAN、MAN、WAN和互联网。计算机系统因此有利于从使用者通过输入设备输入，通过I/O界面进入系统。
计算设备通常将包括提供用于一般管理和计算设备操作的可执行程序指令的操作系统，并且通常将包括存储指令的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，当通过服务器的处理器执行时，所述指令允许计算设备进行其预定的功能。用于计算设备的操作系统和一般功能性的合适指令是已知的或商业可购得的，并且容易由本领域普通技术人员来执行，特别是根据本文中的公开内容。
计算机系统执行一套存储在一个或多个存储元件中的指令，以处理输入数据。存储元件还可以按照需要容纳数据或其他信号。存储元件可以是处理器中存在的信息源或物理存储元件的形式。
环境可以包括如上讨论的各种数据存储以及其他存储器和存储介质。这些可以停留在各种位置，如一个或多个计算机本地(和/或存在于内部)的存储介质或通过网络远程来自任一个或全部计算机。在特定组的实施方案中，信息可以存在于本领域技术人员熟悉的存储区网络(“SAN”)。相似地，用于进行归属于计算机、服务器或其他网络设备的功能的任何所需文件可以本地和/或远程存储，按照需要。在系统包括计算设备的情况下，每个这样的设备可以包括可以通过总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这样的系统还可以包括一个或多个存储设备，如盘驱动器、光存储设备和固态存储设备，如随机存取存储器(“RAM”)或只读存储器(“ROM”)，以及可移动介质设备、存储卡、闪卡等。
这样的设备还可以包括如上所述的计算机可读存储介质阅读器、通讯设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通讯设备等)和工作存储器。计算机可读存储介质阅读器可以连接计算机可读存储介质或配置成接收计算机可读存储介质，所述存储介质表示远程、本地、固定的和/或可移动的存储设备以及用于临时和/或更多永久含有、存储、传输和接收计算机可读信息的存储介质。系统和各种设备通常还将包括各种软件应用、模块、服务器或位于至少一个工作存储设备内的其他元件，包括操作系统和应用程序，如客户应用或Web浏览器。应当认识到可替换的实施方案可以具有来自上述的各种变化。例如，还可以使用定制硬件和/或硬件、软件(包括便携式软件，如applet)或两者中可以执行特定元件。此外，可以使用与其他计算设备(如网络输入/输出设备)的连接。
用于包含编码或编码的一部分的非瞬态存储介质和计算机可读介质可以包括本领域已知或使用的任何合适介质，包括存储介质和通讯介质，如但不限于在任何方法或技术中执行的易变和非易变、可移动和不可移动的用于信息(如，计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的存储和/或传送的介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其他光学存储、磁盒、磁带、磁盘存储或其他磁存储设备，或任何其他可以用于存储所需信息并可以由系统设备存取的介质。基于本文中提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将认识到用于实施各种实施方案的其他方式和/或方法。
计算机可读介质可以包括，但不限于，能够给处理器提供计算机可读指令的电、光、磁或其他存储设备。其他实例包括，但不限于，软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、闪存，如NAND闪存或NOR闪存、ASIC、配置的处理器、光存储、磁带或其他磁存储，或从其计算处理器可以阅读指令的任何其他介质。在一个实施方案中，计算设备可以包括单种类型的计算机可读介质，如随机存取存储区(RAM)。在其他实施方案中，计算设备可以包括两种或更多种类型的计算机可读介质，如随机存取存储器(RAM)、盘驱动器和快速缓冲存储区。计算设备可以联通一个或多个外部计算机可读介质，如外部硬盘驱动器或外部DVD或Blu-Ray驱动器。
如以上讨论的，所述实施方案包括配置成执行计算机可读程序指令和/或存取存储器中储存的信息的处理器。指令可以包括由汇编者和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言书写的代码产生的处理器特异性的指令，所述编程语言包括，例如，C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(Adobe Systems，MountainView，Calif.)。在一个实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其他实施方案中，设备包括两个或更多个处理器。这样的处理器可以包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。这样的处理器可以进一步包括可编程的电子设备，如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑设备(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)，或其他相似的设备。
计算设备包括网络界面。在一些实施方案中，网络界面配置成通过有线或无线通讯链接来通讯。例如，网络界面可以允许通过以太网、IEEE802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外等通过网络通讯。作为另一个实例，网络界面允许通过如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窝通信网络这样的网络来通讯。在一些实施方案中，网络界面允许与另一个设备点对点连接，如通过通用串行总线(USB)、1394FireWire、串联或并联，或相似界面。合适的计算设备的一些实施方案可以包括两个或更多个网络界面，用于通过一个或多个网络通讯。在一些实施方案中，除了网络界面以外或替代网络界面，计算设备可以包括数据存储。
合适的计算设备的一些实施方案可以包括各种外部或内部设备或与各种外部或内部设备联通，所述设备如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、扬声器、一个或多个麦克风，或任何其他输入或输出设备。例如，计算设备可以与各种使用者界面设备和显示器联通。显示器可以使用任何合适的技术，包括，但不限于，LCD、LED、CRT等。
用于通过计算机系统执行的指令组可以包括命令处理器执行特定任务(如组成本发明技术的方法的步骤)的各种要求。指令组可以是软件程序的形式。此外，软件可以是分开的程序的集合、具有较大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式，如在本文中的技术中。软件还可以包括面向目标变成形式的模块编程。通过处理器的输入数据的处理可以是响应使用者要求、之前处理的结果或由另一个处理器形成的要求。
尽管已经关于某些实施方案公开了本发明，但所述实施方案的多种修改、变化和改变都是可能的，而没有脱离所附权利要求中限定的本发明的范围和精神。因此，认为本发明不限于所述的实施方案，而是具有由以下权利要求的语言限定的完整范围及其等价体。
可以根据以下编号段落中的任何一个来定义本文描述的技术的一些实施方案：
(1)重组噬菌体，其包含插入噬菌体CBA120基因组的晚期基因区的指示基因。
(2)段落1的重组噬菌体，其中重组噬菌体特异性感染大肠杆菌O157:H7。
(3)段落1或2的重组噬菌体，其中指示基因是密码子优化的并且编码产生固有信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。
(4)段落1-3任一项的重组噬菌体，其进一步包含密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
(5)一种制备重组指示噬菌体的方法，包括：选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；将同源重组质粒/载体转化至靶病原菌；用选择的野生型噬菌体感染转化的靶病原菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；并分离重组噬菌体的特定克隆。
(6)段落5的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括：确定所选噬菌体的基因组晚期区中的天然核苷酸序列；注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；设计用于主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列，其中该序列包含密码子优化的指示基因；和将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中。
(7)段落5或6的方法，其中设计序列还包括在密码子优化的指示基因的上游插入包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点的非翻译区。
(8)段落5-7任一项的方法，其中同源重组质粒包含位于密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
(9)段落5-8中任一项的方法，其中野生型噬菌体是CBA120，靶病原菌是大肠杆菌O157:H7。
(10)段落5-9中任一项的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明指示基因的表达的克隆的有限稀释测定。
(11)一种检测样品中大肠杆菌O157:H7的方法，包括：用衍生自CBA120的重组噬菌体孵育样品，和检测由重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在大肠杆菌O157:H7。
(12)段落11的方法，其中样品是食品、环境、水、商业或临床样品。
(13)段落11或12的方法，其中所述方法检测用于食品安全工业的标准尺寸的样品中的少至10、9、8、7、6、5、4、3、2或单个的细菌。
(14)段落11-13任一项的方法，其中样品包括牛肉或蔬菜。
(15)段落11-14中任一项的方法，其中所述样品首先在有利于富集生长的条件下孵育，所述富集生长的时间为9小时或更短，8小时或更短，7小时或更短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短，3小时或更短，或2小时或更短。
(16)段落11-15中任一项的方法，其中获得结果的总时间小于12小时，小于11小时，小于10小时，小于9小时，小于8小时，小于7小时或小于6小时。
(17)段落11-16任一项的方法，其中通过检测指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。
(18)用于检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含衍生自CBA120的重组噬菌体。
(19)段落18的试剂盒，其进一步包含用于与指示剂反应以检测由重组噬菌体表达的可溶性蛋白质产物的底物。
(20)一种用于检测大肠杆菌O157:H7的系统，其包含衍生自CBA120的重组噬菌体。
实施例
以下实施例中描述的结果证明在缩短的获得结果的时间内检测到少量细胞，甚至是单个细菌。
实施例1.从CBA120产生指示噬菌体
使用以下详细程序通过同源重组产生指示噬菌体CBA120NanoLuc，如图1-3所示。
CBA120噬菌体的基因组序列可在国家生物技术信息中心的GenBank上获得，其以“Escherichia phage Cba120”ID 12291提交。基因组是被完全注释的，尽管大多数基因被标记为“假设蛋白”，表示使用了自动开放阅读框架发现。假设蛋白质仅需要具有起始和终止密码子，并且可能不表达，因为DNA调节(启动子/增强子/操纵子等)未在序列中定义。
通过与其他噬菌体基因组比较确定晚期基因区。CBA120和所有其他ViI样噬菌体属于ViI样噬菌体组(ViI病毒或ViI病毒属)，它们与T4样噬菌体有关。噬菌体T4是研究最多的噬菌体，可以发现许多基因同源物，并且被标记为如此。这包括晚期基因区，其由高度表达的噬菌体结构蛋白组成。该区域被靶向用于插入
Figure BDA0003822063350000431
报告基因。主要衣壳蛋白被特异性鉴定。由于主要衣壳蛋白通常具有最高表达，因此将报道分子直接插入主要衣壳蛋白的下游可以使报道分子的表达最大化。
设计序列以在主要衣壳蛋白的下游插入密码子优化的
Figure BDA0003822063350000432
基因。如图2所示，设计了同源重组(HR)质粒，最初在插入点的上游和下游具有500bp。使用萤火虫萤光素酶作为报告基因的先前HR质粒产生较差的转化，其通过使用较短的下游区域而缓解。据推测，选择的完整500bp区域在细菌中存在毒性作用。因此，修饰的下游区域仅延伸约300bp。
上游区域由主要衣壳蛋白的3'末端组成，其中插入紧接在终止密码子(TAA)之后：SEQ ID NO：1
Ctttcatgctggaagttgaagcgaacggtatcggtgttgacacccgtcgtggtaaaggcaaccgtgttctgtgttctccgaacgtggcatccgctctggcgatgtctggcatgctggactatgctccggttctgcaggaaaacactaaactggctgttgacccgactggccagaccttcgctggtgttctgtccaacggtatgcgcgtctatgttgacccgtatgctgtagcagaatatatcaccctggcatacaaaggcgcaactgcgctggatgccggtatcttcttcgcgccgtatgtgccgctggaaatgtaccgcacccagggtgaaaccaccttcgctccgcgtatggcgttcaaaacccgttacggcatctgtgctaacccgttcgtacagattccggctaaccaagacccgcaggtttacgtgactgctgacggtattgctcaagacagcaacccgtatttccgcaaaggtctgatcaaatctctgttctaa
其后是MluI限制性位点，然后是T4晚期基因启动子共有序列，其由-10σ70因子共有结合序列(CTAAATAcCcc(SEQ ID NO：2))组成。该启动子是基于合成已知的-10序列设计的。随后插入14个随机碱基对、核糖体进入位点、Shine-Dalgarno共有序列(aaggaggt)，随后是6个随机碱基对。选择随机碱基对以保持与其他上游非翻译区相似的GC含量。SEQ ID NO：3
acgcgtCTAAATAcCccaaatactagtagataaggaggttttcga
插入了来自pNL1.3的具有分泌信号的密码子优化版本的Promega的
Figure BDA0003822063350000441
SEQ ID NO：4
ATGAATAGCTTTAGCACCAGCGCCTTTGGCCCTGTTGCCTTTAGCCTGGGCCTGCTGCTGGTTCTGCCGGCAGCATTTCCGGCCCCGGTGTTCACCCTGGAAGATTTTGTGGGCGATTGGCGCCAGACCGCCGGTTATAACCTGGATCAGGTGCTGGAACAGGGTGGTGTGAGCAGCCTGTTTCAGAATCTGGGCGTGAGCGTGACCCCGATTCAGCGCATTGTGCTGAGCGGCGAGAACGGCCTGAAAATTGATATTCATGTTATTATTCCGTATGAGGGTCTGAGCGGCGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATCTTTAAGGTGGTGTATCCGGTGGACGACCATCATTTCAAGGTGATCCTGCATTACGGCACACTGGTGATTGACGGCGTTACCCCGAACATGATCGACTATTTCGGCCGCCCGTATGAAGGTATCGCCGTGTTCGACGGCAAGAAAATTACCGTGACCGGTACCCTGTGGAACGGCAACAAGATCATTGACGAGCGCCTGATTAACCCGGATGGTAGCCTGCTGTTTCGCGTGACCATTAATGGCGTGACCGGCTGGCGTCTGTGTGAACGCATCCTGGCCTAA
接下来是298bp的下游HR片段，其包含假设的基因。SEQ ID NO：5
gcgacaggttttgataacaaaccccgcttcggcggggtttttctttatagggatatgtaagataataaagcctcatttatcaaaggaggttaaaatgtctcatcaattatctggcggtgcagtcgatactctattcgttcttttctggtttggacctcgtgaagctggggaaatacctgctaaatctggagaagccgaattggcctccctggggttttgtaaacgagttgatgttaaaaacgtaccaaaaggtcgagatacacatctgtgtgtactcaccgaggaaggttacaaatac
在此之后，将共有转录终止子与终止密码子一起插入，其仅应在质粒上起作用以减少任何通读和可能的毒性作用。由于同源重组仅在HR区发生，转录终止子不应包括在重组噬菌体中。SEQ ID NO：6taaTTTGATAACAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTTCTTTATAGG
将完整序列合成为质粒(GeneWiz)。使用Bio-Rad MicroPulser ElectroporationApparatus操作说明书和应用指南(目录号165-2100)中包含的方案将质粒转化到预先制备的大肠杆菌O157:H7电穿孔感受态细胞中。
将合成的质粒DNA(pUC57.CBA.HR.NanoLuc)(4μg质粒DNA)溶于高压灭菌的过滤去离子水(40μL)中，制成100ng/μL原液。将该质粒(1μL)与20μL解冻(在冰上)大肠杆菌O157:H7电穿孔感受态细胞(衍生自无毒大肠杆菌O157:H7细菌，ATCC 43888)混合。将细胞+DNA混合物转移到冰冷的Bio-Rad 0.1cm电穿孔杯中，并经受使用程序Ec1的MicroPulserElectroporation Apparatus。将混合物立即转移到1mL回收培养基(Life Technologies)中，并在42℃、220rpm下孵育1小时。
将1μL、100μL的等分试样和通过离心(2分钟，6800g)浓缩并重悬于100μL的剩余培养物接种到选择培养基(来自Teknova的LB+Amp琼脂平板)上，并在37℃孵育过夜。
第二天，通过接种100μL LB+Amp并在37℃下孵育2.5小时来筛选23个菌落(+1阴性对照)，然后筛选萤光素酶活性。将5μL的每种培养物进行Promega
Figure BDA0003822063350000451
萤光素酶测定，并在Promega
Figure BDA0003822063350000452
96荧光计上读数。所有23个菌落均为阳性。
将最高的3个孔混合并接种到4mL LB+Amp中并生长至1.8x107个细胞/mL。用来自Kutter实验室的野生型CBA120噬菌体(参见Kutter等，Virology Journal 2011，8：430)以MOI为0.1感染细菌，并将同源重组感染在37℃孵育3小时。
监测细菌浓度4小时；细菌在2小时加倍，然后开始下降，表明噬菌体感染成功。
实施例2.CBA120NanoLuc的分离
在同源重组以产生重组噬菌体基因组后，使用一系列滴度和富集步骤来分离表达
Figure BDA0003822063350000461
的特定重组噬菌体。
为了减少来自质粒表达的背景
Figure BDA0003822063350000462
信号，将裂解物在Amicon UltraConcentrator中用TMS洗涤3次，旋转以将体积从4mL浓缩至500μL；加入TMS使体积达到4mL，重复该系列。
为了确定重组与野生型噬菌体的初始比例，使用基于TCID50(组织培养感染剂量50％)的有限稀释测定来确定感染单位的浓度(IU/mL)，类似于病毒颗粒数量或噬斑形成单位，并确定萤光素酶转导单位的数量(TU/mL)。在这些测定中，将样品连续稀释，将每种稀释液等分到具有大肠杆菌O157:H7细菌的重复孔中。任何显示萤光素酶活性的孔必须已被至少一个重组噬菌体感染。任何显示细胞裂解的孔已被至少一个噬菌体感染。基于每种情况发生的最高稀释度，重新计算原始浓度。来自转化细胞的这些初始噬菌体混合物通常对于每种重组噬菌体TU产生20,000野生型IU的比例。然后采取步骤分离和扩增重组噬菌体。
如图4所示，在一些实验中，从包含0.83％总噬菌体的混合物中分离重组噬菌体。将噬菌体混合物稀释到96孔板中，得到每板平均3个重组TU，这相当于每孔大约3.8个感染单位(IU)的主要的野生型噬菌体。加入细菌使得每个孔含有50μL混浊的大肠杆菌O157:H7。在37℃孵育2小时后，对孔进行取样并筛选萤光素酶的存在。任何阳性孔可能已经被单个重组噬菌体接种，并且在该阶段该混合物含有1个重组噬菌体：3.8个野生型噬菌体的富集比例，其是高于原始1：120比例的富集。在筛选的96个孔中，有7个孔为阳性。在该实验中不需要进一步轮次的有限稀释测定。
进行噬斑测定，其中单独挑选噬斑并筛选萤光素酶转导能力，确保筛选的噬斑混合物中有约3个重组体。将每个噬菌斑悬浮在100μL TMS中，并将5μL加入到含有混浊的大肠杆菌O157:H7培养物的孔中，并在37℃孵育45分钟至1小时后测定孔。
预期阳性孔含有重组噬菌体的纯培养物，但进行另一轮噬斑纯化。最后，进行大规模生产以获得适用于大肠杆菌O157:H7检测试验的高滴度储液。使用氯化铯等密度梯度离心将噬菌体颗粒与污染性萤光素酶蛋白分离以减少背景。
实施例3.使用CBA120NanoLuc指示噬菌体的细菌检测
使用CBA120NanoLuc指示噬菌体检测大肠杆菌O157:H7在使用图6中所示的基本测定形式的实验中测试。首先，从培养物中取出1-10,000个细胞，并用105、106和107个噬菌体/mL在相同样品体积的LB中感染2小时。加入裂解缓冲液和
Figure BDA0003822063350000471
试剂后，使用
Figure BDA0003822063350000472
96仪器读取反应。图7显示，用于感染样品的106个噬菌体/mL实现了信号/背景的最高比率。
图8显示了6-10个重复的数据，每个重复使用来自LB中细胞培养物的相同细胞数。浓度为106个噬菌体/mL的噬菌体用于感染样品，感染的细胞在37℃孵育2小时。加入裂解缓冲液和
Figure BDA0003822063350000473
试剂后，使用
Figure BDA0003822063350000474
96仪器读取反应。图8显示CBA120NanoLuc可以检测单个(1)细胞，其信号显著高于背景。
图9根据图8的数据显示，CBA120NanoLuc可以检测单个(1)大肠杆菌O157:H7细胞，信号与背景比>2.0。
用于检测大肠杆菌O157:H7的CBA120NanoLuc指示噬菌体的性能也由AOAC研究所(证书号081601)于2016年8月1日认证。
实施例4.在牛肉测定中使用CBA120NanoLuc的细菌检测
CBA120NanoLuc用于在牛肉测定中检测大肠杆菌O157:H7。对于所有牛肉实验，使用50RLU作为背景值，并且3倍背景值被认为是阳性的(即，>150RLU是阳性，或信号/背景>3.0)。与下面描述的第二确认方法相比，没有误报或阴性。
对于25g牛肉样品，将预热的TSB培养基(42℃)加入到样品中至1：3的样品：培养基(25g：75mL)。将样品用Stomacher在低设置/或等效下混合30秒，然后在不振荡的情况下在42℃下孵育。通过在顶部折叠2-3次并剪裁闭合来封闭袋子。在42℃富集5小时(对于下一步中的10mL等分试样)或6小时(对于下一步中的1mL等分试样)后，轻轻地按摩袋以彻底混合内容物。
从袋中取出1mL或10mL的等分试样用于测试。这些对应于图10-16中所有牛肉测定实验的数据中的“1mL浓度”或“10mL浓度”。
将10mL的等分试样以3400g离心5分钟，弃去上清液，并将内容物重悬于1mL预热的TSB中。添加CBA120指示噬菌体以通过添加10μL的1x108个噬菌体/mL来感染样品中的任何目标细菌。
将1mL的等分试样在微量离心机中以最高速度离心1分钟，弃去上清液，并将内容物重悬于200μL预热的TSB中。为了感染靶细菌，加入15μL的1.2x107个噬菌体/mL的CBA120指示噬菌体。
将具有CBA120指示噬菌体的样品在37℃孵育2小时，短暂涡旋，离心5-10秒以沉淀碎片，并将150μL样品转移至96孔板(小心不扰乱碎片沉淀)。向每个孔中加入裂解缓冲液(10μL)并通过移液轻轻混合。将新鲜制备的
Figure BDA0003822063350000481
试剂(50μL)加入每个孔中，并通过移液(或自动注射)轻轻混合。(将
Figure BDA0003822063350000482
萤光素酶测定底物1:50稀释到
Figure BDA0003822063350000483
萤光素酶测定缓冲液中来制备
Figure BDA0003822063350000484
试剂，例如，为了制备1mL
Figure BDA0003822063350000485
试剂，将20μL
Figure BDA0003822063350000486
萤光素酶测定底物加入1mL
Figure BDA0003822063350000487
萤光素酶测定缓冲液中)
在添加底物3分钟后，在GLOMAX 96仪器上读板。
第二确认方法：
使用采用涂有O157抗体(
Figure BDA0003822063350000488
Life Technologies#71004)的颗粒的免疫磁性分离(IMS)并在选择性平板(
Figure BDA0003822063350000489
板，BD#214984)上铺板来对过夜富集的培养物进行大肠杆菌O157:H7的确认。
为了准备确认，将样品在42℃±1°孵育过夜(总共18-24小时或另外13-19小时)。从过夜培养物中取出1mL然后进行
Figure BDA00038220633500004810
抗-大肠杆菌O157程序。简言之，将20μL IMS颗粒加入稀释的过夜培养物中并在室温下孵育10分钟。用磁铁分离磁性颗粒3分钟，然后用PBS洗涤3次，每次1ml。最后一次洗涤后，将颗粒涂在
Figure BDA0003822063350000491
板(BD#214984)上，并在37℃±1°孵育18-24小时。
将红褐色的菌落(推定阳性)在TSB培养基中在37℃±1°培养过夜(18-24小时)用于血清学确认。使用凝集测定法(Remel Wellcolex E.coli O157:H7#R30959601)测定O157和H7抗原的存在。遵循制造商的说明进行，其中使用40μL过夜培养物。结果证实O157和/或H7抗原的存在或不存在，并提供对大肠杆菌O157:H7的确认。
来自25g牛肉样品的数据显示在图10-12中。图10-11对应于富集样品的1mL浓度，图12对应于富集样品的10mL浓度。在1mL浓度的6小时富集后和10mL浓度的5小时富集后检测所有阳性。图11-12显示了通过
Figure BDA0003822063350000492
铺板的确认。
对于较大的(125克)牛肉样品，用碎牛肉和剪碎牛肉进行实验。该程序是类似的，除了剪碎牛肉样品需要在高设置/或等效下用stomacher处理至少120秒。两种样品的富集随后在42℃下进行8小时，其余步骤如上所述。
来自125g牛肉样品的数据显示在图13-16中。图13和15对应于1mL浓度，图14和16对应于10mL浓度。图15-16显示了通过
Figure BDA0003822063350000493
铺板的确认。在富集7小时后检测到所有阳性。
实施例5.蔬菜洗涤测定
来自菠菜洗涤过滤器测定的数据显示在图17中，其显示该测定可以在富集3小时后在100mL菠菜洗涤中检测1个大肠杆菌O157:H7细胞。根据制造商的说明，通过在每个样品的过夜培养物上使用
Figure BDA0003822063350000494
测试来确认这些结果，如上文“第二确认方法”中所述。
为了制备蔬菜洗涤物，称重蔬菜叶(例如菠菜或生菜)并将其加入干净的塑料袋中。每克(g)蔬菜加入5mL水。将叶子和溶液手动混合几分钟。然后从塑料袋中提取液体并用作“蔬菜洗涤物”。使用该方法，通过CFU发现约1百万个细菌存在于单个菠菜叶(1-2g)上。
接下来，通过47mm 0.45μM过滤器真空过滤100mL“蔬菜洗涤物”。取出过滤器并放入小的可密封塑料袋中。将预热(42℃)TSB培养基(600μL)加入袋中以覆盖过滤器。然后将过滤器在42℃下孵育3小时，同时轻轻搅拌。取出等份的富集培养基(300μL)用于确认目的。然后将CBA120NanoLuc指示噬菌体加入袋中的剩余培养基中至终浓度为1x106个噬菌体/mL，轻轻搅拌袋，然后在37℃孵育2小时。最后，将100-150μL感染反应物转移到96孔板中。加入裂解缓冲液(10μL)和制备的
Figure BDA0003822063350000501
试剂(50μL)，并在发光计(
Figure BDA0003822063350000502
96)上读取样品。
图17显示了来自菠菜洗涤测定的数据，包括来自
Figure BDA0003822063350000503
铺板的确认结果。在植物洗涤物中从105个非靶细菌中辨别单个靶细菌细胞的能力是令人惊讶的，并且再次证明了该测定的特异性和灵敏性。
本发明涉及以下实施方式：
1.一种重组噬菌体，其包含插入噬菌体CBA120基因组的晚期基因区的指示基因。
2.实施方式1的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体特异性地感染大肠杆菌O157:H7。
3.实施方式1的重组噬菌体，其中所述指示基因是密码子优化的并且编码产生固有信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。
4.实施方式3的重组噬菌体，其进一步包含位于密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
5.一种制备重组指示噬菌体的方法，包括：
选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；
制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；
将同源重组质粒/载体转化至靶病原菌；
用选择的野生型噬菌体感染经转化的靶病原菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；和
分离重组噬菌体的特定克隆。
6.实施方式5的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括：
确定所选噬菌体的基因组晚期区中的天然核苷酸序列；
注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计用于主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列，其中该序列包含密码子优化的指示基因；和
将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中。
7.实施方式6的方法，其中设计序列还包括在密码子优化的指示基因的上游插入包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点的非翻译区。
8.实施方式5的方法，其中同源重组质粒包含位于密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
9.实施方式5的方法，其中野生型噬菌体是CBA120，靶病原菌是大肠杆菌O157:H7。
10.实施方式5的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明指示基因的表达的克隆的有限稀释测定。
11.一种检测样品中大肠杆菌O157:H7的方法，包括：
用衍生自CBA120的重组噬菌体孵育样品，和
检测由重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在大肠杆菌O157:H7。
12.实施方式11的方法，其中所述样品是食品、环境、水、商业或临床样品。
13.实施方式11的方法，其中所述方法检测用于食品安全工业的标准尺寸的样品中的少至10、9、8、7、6、5、4、3、2或单个的细菌。
14.实施方式12的方法，其中所述样品包括牛肉或蔬菜。
15.实施方式11的方法，其中所述样品首先在有利于富集生长的条件下孵育，所述富集生长的时间为9小时或更短，8小时或更短，7小时或更短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短，3小时或更短，或2小时或更短。
16.实施方式11的方法，其中获得结果的总时间小于12小时，小于11小时，小于10小时，小于9小时，小于8小时，小于7小时或小于6小时。
17.实施方式11的方法，其中通过检测指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。
18.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含衍生自CBA120的重组噬菌体。
19.实施方式18的试剂盒，还包含用于与指示剂反应以检测由所述重组噬菌体表达的可溶性蛋白质产物的底物。
20.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的系统，其包含衍生自CBA120的重组噬菌体。

Claims (21)

1.一种重组噬菌体，其包含插入噬菌体CBA120基因组的晚期基因区的指示基因。
2.权利要求1的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体特异性地感染大肠杆菌O157:H7。
3.权利要求1的重组噬菌体，其中所述指示基因是密码子优化的并且编码产生固有信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。
4.权利要求3的重组噬菌体，其进一步包含位于密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中非翻译区包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
5.一种制备重组指示噬菌体的方法，包括：
选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；
制备包含指示基因的同源重组质粒/载体；
将同源重组质粒/载体转化至靶病原菌；
用选择的野生型噬菌体感染经转化的靶病原菌，从而允许质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组；和
分离重组噬菌体的特定克隆。
6.权利要求5的方法，其中制备同源重组质粒/载体包括：
确定所选噬菌体的基因组晚期区中的天然核苷酸序列；
注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计用于主要衣壳蛋白基因下游的同源重组的序列，其中该序列包含密码子优化的指示基因；和
将设计用于同源重组的序列掺入质粒/载体中。
7.权利要求6的方法，其中设计序列还包括在密码子优化的指示基因的上游插入包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点的非翻译区。
8.权利要求5的方法，其中同源重组质粒包含位于密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其包含噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。
9.权利要求5的方法，其中野生型噬菌体是CBA120，靶病原菌是大肠杆菌O157:H7。
10.权利要求5的方法，其中分离重组噬菌体的特定克隆包括用于分离证明指示基因的表达的克隆的有限稀释测定。
11.一种检测样品中大肠杆菌O157:H7的方法，包括：
用衍生自CBA120的重组噬菌体孵育样品，和
检测由重组噬菌体产生的指示蛋白产物，其中指示蛋白产物的阳性检测表明样品中存在大肠杆菌O157:H7。
12.权利要求11的方法，其中所述样品是食品、环境、水、商业或临床样品。
13.权利要求11的方法，其中所述方法检测用于食品安全工业的标准尺寸的样品中的少至10、9、8、7、6、5、4、3、2或单个的细菌。
14.权利要求12的方法，其中所述样品包括牛肉或蔬菜。
15.权利要求11的方法，其中所述样品首先在有利于富集生长的条件下孵育，所述富集生长的时间为9小时或更短，8小时或更短，7小时或更短，6小时或更短，5小时或更短，4小时或更短，3小时或更短，或2小时或更短。
16.权利要求11的方法，其中获得结果的总时间小于12小时，小于11小时，小于10小时，小于9小时，小于8小时，小于7小时或小于6小时。
17.权利要求11的方法，其中通过检测指示剂产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。
18.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其包含衍生自CBA120的重组噬菌体。
19.权利要求18的试剂盒，还包含用于与指示剂反应以检测由所述重组噬菌体表达的可溶性蛋白质产物的底物。
20.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的系统，其包含衍生自CBA120的重组噬菌体。
21.一种制备指示噬菌体的方法，其中包括以下步骤：
选择特异性感染靶病原菌的野生型噬菌体；确定所选噬菌体基因组晚期区的天然序列；
注释基因组并鉴定所选噬菌体的主要衣壳蛋白基因；
设计用于在主要衣壳蛋白基因附近同源重组的序列，其中所述序列包含密码子优化的报告基因；
将设计用于同源重组的序列整合到质粒/载体中；将质粒/载体转化至靶病原菌；
选择转化的细菌；
用选择的野生型噬菌体感染转化的细菌，从而允许质粒和噬菌体基因组之间发生同源重组；确
定所得重组噬菌体裂解物的滴度；并
进行有限稀释测定以富集和分离重组噬菌体。
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