CN114729332A - 用于使用重组繁殖缺陷性指示噬菌体检测微生物的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了使用繁殖缺陷性指示噬菌体快速检测微生物的组合物、方法、试剂盒和系统。这样的繁殖缺陷性指示噬菌体对结合和感染特定的感兴趣微生物的特异性允许对感兴趣微生物的靶向和灵敏的检测。

Description

用于使用重组繁殖缺陷性指示噬菌体检测微生物的装置和 方法
通过引用并入
本申请要求于2019年8月26日提交的美国临时申请号62/891,701的优先权。下列美国专利申请的公开内容全部通过引用并入本文：于2019年1月14日提交的美国申请号16/247,490，于2019年1月14日提交的美国专利申请号16/247,486，于2019年3月11日提交的美国申请号16/298,695，于2018年3月9日提交的美国临时申请号62/640,793，于2019年1月30日提交的美国临时申请号62/798,980，于2013年2月21日提交的美国申请号13/773,339，于2015年2月18日提交的美国申请号14/625,481，于2016年9月13日提交的美国申请号15/263,619，于2017年1月18日提交的美国申请号15/409,258，于2018年1月12日提交的美国临时申请号62/616,956，于2018年2月9日提交的美国临时申请号62/628,616，于2018年4月24日提交的美国临时申请号62/661,739，于2018年3月9日提交的美国临时申请号62/640,793，和于2019年1月30日提交的美国临时申请号62/798,980。
发明领域
本公开涉及用于使用重组感染原检测感兴趣微生物的方法、设备、系统。
背景技术
在提高检测生物样品、食品样品、水样品和临床样品中的细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度方面存在着强烈的兴趣。微生物病原体可以导致人和家畜的极高患病率，以及巨大的经济损失。鉴于摄入被某些微生物(例如，葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella spp.))污染的食品所导致的威胁生命或致命的疾病的爆发，对微生物的检测对于食品药品管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)来说具有高优先性。
用于检测细菌的传统微生物检验依赖于非选择性和选择性富集培养，接着铺板接种在选择性培养基上，并进一步测试以确认疑似菌落。此类程序可以需要几天。已经对多种多样的快速方法进行了研究并将其引入到实践中以减少时间要求。然而，至今为止，减少时间要求的方法具有一些缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术一般要求过夜富集步骤以便获得足够的灵敏度，因此缺少当天发布结果的能力。聚合酶链式反应(PCR)测试也包括扩增步骤，因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，可以经济地接受PCR测试的样品大小有限。能够接受PCR的稀释细菌悬浮液要不含细胞，因此仍然需要纯化和/或冗长的富集步骤。
传统生物富集所需的时间由样品的靶细菌群体的生长速率、样品基质的作用以及所需的灵敏度决定。在实践中，大多数高灵敏度方法采用过夜孵育，并且总共花费约24小时。由于培养所需的时间，导致这些方法可能花费多至三天，取决于要鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不适宜的，因为这样的延迟使得污染的食品或水或其他产品有机会进入到家畜或人类中。另外，抗生素耐药细菌的增加和生物防卫考虑因素使得快速鉴定水、食品和临床样品中的细菌病原体成为全世界的关键要务。
因此，对于更快速的、简单的和灵敏的检测和鉴定微生物(诸如细菌和其他潜在致病的微生物)存在着需求。
发明内容
本公开的实施方案包括用于检测微生物(诸如但不限于细菌)的装置、组合物、方法、设备、系统和试剂盒。本公开可以以多种多样的方式实施。本申请的一些示例性实施方案在下面进行讨论。
本公开的示例性实施方案是重组噬菌体，所述重组噬菌体包含在所述噬菌体的基因组的晚期基因区中的指示基因，其中所述重组噬菌体是繁殖缺陷性的，并且其中所述重组噬菌体能够特异性地感染感兴趣微生物。在一些实施方案中，所述重组噬菌体因病毒粒子组装所需要的晚期基因的改变而成为繁殖缺陷性的。在重组噬菌体的一些实施方案中，所述指示基因被插入到所述重组噬菌体的晚期基因的序列中，使得所述晚期基因无功能并且所述重组噬菌体成为繁殖缺陷性的。在重组噬菌体的一些实施方案中，所述指示基因代替所述重组噬菌体的晚期基因的序列的至少一部分，使得所述重组噬菌体成为繁殖缺陷性的，其中所述晚期基因是病毒粒子组装所需要的。重组噬菌体来源于对大肠杆菌、或沙门氏菌属(Salmonella)、或李斯特氏菌属(Listeria)或葡萄球菌属(Staphylococcus)特异的噬菌体。在一些实施方案中，所述重组噬菌体来源于对大肠杆菌特异的噬菌体。在其他实施方案中，所述重组噬菌体来源于对沙门氏菌属特异的噬菌体。在重组噬菌体的一些实施方案中，所述晚期基因是病毒粒子组装所需要的。
本公开的示例性实施方案是包含至少两种重组噬菌体的组合物，所述两种重组噬菌体各自包含在所述噬菌体的基因组的晚期基因区中的指示基因，其中所述重组噬菌体是繁殖缺陷性的，并且其中所述重组噬菌体能够特异性地感染一种或多种感兴趣微生物。在组合物的一些实施方案中，所述至少两种重组噬菌体中的每一种包含不同的指示基因。在组合物的一些实施方案中，所述至少两种重组噬菌体中的每一种能够特异性地感染不同的感兴趣微生物。在组合物的一些实施方案中，所述至少两种重组噬菌体能够感染多种感兴趣微生物。在组合物的一些实施方案中，所述多种感兴趣微生物包括至少两种不同类别的细菌。在组合物的一些实施方案中，所述至少两种不同类别的细菌包括至少两种不同属的细菌、至少两种不同种的细菌、至少两种不同菌株的细菌或至少两种不同血清型的细菌中的一种或多种。
本公开的示例性实施方案是制备重组噬菌体的方法。这种方法可以包括下列步骤：选择特异性地感染靶微生物的亲代噬菌体；改变所述亲代噬菌体的基因以产生重组的繁殖缺陷性的噬菌体；用同源重组(HR)质粒转化靶微生物的工程化菌株，所述工程化菌株能够表达所述繁殖缺陷性的噬菌体中突变的基因的产物，所述同源重组(HR)质粒包含指示基因和在所述指示基因侧翼并与所述亲代噬菌体中的期望序列同源的HR序列；用所述亲代噬菌体或所述繁殖缺陷性的亲代噬菌体感染所述转化的靶微生物，使得能够在所述HR质粒和所述亲代噬菌体或所述重组的繁殖缺陷性的噬菌体的基因组之间发生HR；以及分离重组噬菌体的特定克隆，所述特定克隆是繁殖缺陷性的且能够表达所述指示基因的产物。在制备重组噬菌体的方法的一些实施方案中，所述改变所述亲代噬菌体的基因以产生所述繁殖缺陷性的噬菌体通过所述HR质粒和所述亲代噬菌体的基因组之间发生的HR实现，其中所述亲代噬菌体的基因通过用所述指示基因替代所述亲代噬菌体的至少一部分来改变。在一些实施方案中，改变所述基因包括使亲代噬菌体的基因部分地或全部地缺失。因此，在一些实施方案中，所述方法包括改变亲代噬菌体的基因组，其中使亲代噬菌体的至少一个基因缺失。在一些实施方案中，使至少两个、三个、四个或五个基因缺失。
制备重组噬菌体的方法的一些实施方案可以进一步包括生成所述靶微生物的工程化菌株的步骤。在一些实施方案中，所述生成靶微生物的工程化菌株的步骤可以包括利用编码并能够表达在所述重组的繁殖缺陷性的噬菌体中改变的基因的质粒(“反式质粒(trans plasmid)”)转化所述靶微生物。制备重组噬菌体的方法的一些实施方案可以进一步包括，在转化步骤前，制备包含所述指示基因的同源重组质粒的步骤。在一些实施方案中，所述生成靶微生物的工程化菌株的步骤可以包括利用反式质粒和包含指示基因的HR质粒转化所述靶微生物的步骤。在制备重组噬菌体的方法的一些实施方案中，改变亲代噬菌体的基因以生成繁殖缺陷性的噬菌体通过利用包含反式质粒和HR质粒的工程化靶微生物的野生型亲代噬菌体感染来实现，这样可以在HR质粒和亲代噬菌体的基因组之间发生HR，其中所述亲代噬菌体的基因通过用所述指示基因替代所述亲代噬菌体的至少一部分来改变，而含有在繁殖缺陷性的重组噬菌体中改变的基因的质粒(反式质粒)提供了反式基因，补充了所述繁殖缺陷性的噬菌体中的基因缺失或改变。在制备重组噬菌体的方法的进一步的实施方案中，使亲代噬菌体的基因缺失以生成繁殖缺陷性的噬菌体通过利用包含反式质粒和HR质粒的工程化靶微生物的野生型亲代噬菌体感染来实现，这样可以在HR质粒和亲代噬菌体的基因组之间发生HR，其中所述亲代噬菌体的基因组通过用所述指示基因替代所述亲代噬菌体的至少一部分来改变，而含有在繁殖缺陷性的重组噬菌体中改变的基因的质粒(反式质粒)提供了反式基因，补充了所述繁殖缺陷性的噬菌体中的基因缺失或改变。
在制备重组噬菌体的方法的一些实施方案中，改变亲代噬菌体的基因以生成繁殖缺陷性的噬菌体通过利用不包含编码且能够表达繁殖缺陷性的噬菌体中改变的基因的质粒而包含HR质粒的工程化靶微生物的野生型亲代噬菌体感染来实现，这样可以在HR质粒和亲代噬菌体的基因组之间发生HR，其中所述亲代噬菌体的基因通过用所述指示基因替代所述亲代噬菌体的至少一部分来改变，而野生型亲代噬菌体感染或共感染细菌反式地提供了所述基因，补充了所述繁殖缺陷性的噬菌体中的基因缺失或改变。
在一些实施方案中，分离重组噬菌体的特定克隆的步骤可以包括执行有限稀释测定以分离证明有指示基因的表达的克隆，所述特定克隆是繁殖缺陷性的且能够表达所述指示基因的产物。重组噬菌体来源于对大肠杆菌、或沙门氏菌属、或李斯特氏菌属或葡萄球菌属特异的噬菌体。在制备重组噬菌体的方法的一些实施方案中，重组噬菌体来源于对大肠杆菌特异的噬菌体。在制备重组噬菌体的方法的一些实施方案中，重组噬菌体来源于对沙门氏菌属特异的噬菌体。
本公开的示例性实施方案是检测样品中的感兴趣微生物的方法，包括下列步骤：将样品与本公开的实施方案所述的重组噬菌体孵育；以及检测所述指示基因的产物，其中对所述指示基因的产物的阳性检测指示所述感兴趣微生物存在于所述样品中。在检测样品中的感兴趣微生物的方法的一些实施方案中，样品可以是食品样品、环境样品、水样品或商品样品。在检测样品中的感兴趣微生物的方法的一些实施方案中，所述方法检测所述样品中的少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个微生物。在检测样品中的感兴趣微生物的方法的一些实施方案中，感兴趣微生物是大肠杆菌。在检测样品中的感兴趣微生物的方法的一些实施方案中，感兴趣微生物是沙门氏菌属。
本公开的示例性实施方案中还包括用于检测样品中的感兴趣微生物的试剂盒，所述试剂盒包含根据本公开的实施方案的重组噬菌体和用于与指示基因的产物反应以检测所述指示基因的产物的底物。本公开的示例性实施方案中还包括用于检测感兴趣微生物的系统，该系统包括权利要求1所述的重组噬菌体和用于检测指示基因的产物的组分。
附图说明
本公开可以通过参照下列非限制性的附图来更好地理解。
图1示意性地图示了制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的示例性方法，其中将繁殖缺陷性和指示基因引入至亲代噬菌体中在一步重组过程中完成。
图2示意性地图示了利用表达噬菌体复制所需的基因的质粒转化并用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染的“容许性”微生物。
图3示意性地图示了利用CBA120大肠杆菌-特异性噬菌体的共感染反式互补的同源重组产生繁殖缺陷性的指示噬菌体CBA120.Δgp22.NanoLuc。
图4是说明在静止期大肠杆菌O157:H7 ATCC 43888中CBA120.Δgp22.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限的表。
图5示意性地图示了在用表达gp22前头支架蛋白(prohead scaffold protein)的质粒转化的工程化大肠杆菌O157:H7株(“容许性”大肠杆菌O157:H7株)中进行的对大肠杆菌O157:H7血清型特异的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的繁殖。
图6示出了繁殖缺陷性的指示噬菌体的示例性生长曲线，其中噬菌体在容许性大肠杆菌O157:H7株中成功地生长。
图7示意性地图示了使用对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体的策略。
图8是说明与在对数期的大肠杆菌O157:H7上进行的对大肠杆菌O157:H7血清型特异的能够复制的指示噬菌体相比，使用繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的原始信号结果的条形图。
图9是说明与在对数期的大肠杆菌O157:H7上进行的对大肠杆菌O157:H7血清型特异的能够复制的指示噬菌体相比，使用繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的信号背景比结果的条形图。
图10是说明与在静止期的大肠杆菌O157:H7上进行的对大肠杆菌O157:H7血清型特异的能够复制的指示噬菌体相比，使用繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的原始信号结果的条形图。
图11是说明与在静止期的大肠杆菌O157:H7上进行的对大肠杆菌O157:H7血清型特异的能够复制的指示噬菌体相比，使用繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的信号背景比结果的条形图。
图12是说明特异性测定对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体的线图。
图13示意性地图示了利用TSP1沙门氏菌-特异性噬菌体的共感染反式互补的同源重组产生繁殖缺陷性的指示噬菌体TSP1.Δgp22.NanoLuc。
图14示意性地图示了在用表达gp22前头支架蛋白的质粒转化的工程化沙门氏菌株(“容许性”沙门氏菌株)中进行的对沙门氏菌属特异的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的繁殖。
图15是说明与容许性沙门氏菌相比，在野生型沙门氏菌中使用繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的原始信号结果的条形图。
图16是说明在静止期鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC 19585中SP1.Δgp22.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限的表。
图17是说明在对数期鼠伤寒沙门氏菌ATCC 19585中SP1.Δgp22.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限的表。
图18示意性地图示了利用SEA1沙门氏菌-特异性噬菌体的共感染反式互补的同源重组产生繁殖缺陷性的指示噬菌体SEA1.Δgp84.NanoLuc。
图19示意性地图示了在用表达gp84基片楔形蛋白的质粒转化的工程化沙门氏菌株(“容许性”沙门氏菌株)中进行的对沙门氏菌属特异的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的繁殖。
图20是说明与容许性沙门氏菌相比，在野生型沙门氏菌中使用SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的原始信号结果的线图。
图21是说明在野生型沙门氏菌株7001、8326、13076和27869中使用SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的原始信号结果的线图。
图22是说明在野生型沙门氏菌株7001、8326、13076和27869中SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的复制的空斑测定的条形图。
图23是说明在用AmpR pUC57 SEA1.Trans gp84转化的对数期新港沙门氏菌(Salmonella newport)ATCC 27869中SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限的表。
图24是说明在静止期猪霍乱沙门氏菌(Salmonella chloreaesuis)ATCC 7001中SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限的表。
图25是说明在对数期猪霍乱沙门氏菌ATCC 7001中SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限的表。
图26A是说明每孔SEA1.NanoLuc复制的噬菌体和SEA1.Δgp84.NanoLuc不复制的CFU的近似数目的表。图26B是说明与对鼠伤寒沙门氏菌特异的SEA1.NanoLuc复制的噬菌体相比，使用复制的噬菌体和SEA1.Δgp84.NanoLuc与繁殖缺陷性的指示噬菌体相比较的检测测定在2小时感染后的RLU信号结果的表。图26C是说明与对鼠伤寒沙门氏菌特异的SEA1.NanoLuc复制的噬菌体相比，使用复制的噬菌体和SEA1.Δgp84.NanoLuc与繁殖缺陷性的指示噬菌体相比较的检测测定在4小时感染后的RLU信号结果的表。
图27描绘了使用一系列连续感染和稀释步骤分离重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体来鉴定繁殖缺陷性的指示噬菌体。
图28描绘了根据本公开的实施方案，使用编码可溶性萤光素酶的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体通过检测萤光素酶来检测感兴趣微生物。
图29描绘了根据本公开的实施方案用于使用重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的过滤板测定，其中感兴趣微生物和重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体在过滤板上孵育，并且直接检测指示蛋白，无需移除孵育培养基。
图30描绘了根据本公开的实施方案用于使用重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的“无浓缩测定”。
图31描绘了根据本公开的实施方案用于使用重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的杂交免疫噬菌体(Hybrid Immuno-Phage，HIP)测定，其中在与重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体孵育前，使用针对感兴趣微生物的抗体来俘获测定孔的表面上的微生物。
具体实施方式
定义
除非本文中另外限定，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员普遍理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应当包括复数，且复数术语应当包括单数。通常，本文所述的结合细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学以及杂交使用的命名以及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学以及杂交的技术是在本领域中众所周知和普遍使用的那些。除非另外指明，否则已知的方法和技术通常根据本领域中众所周知的常规方法以及如在各种一般文献和在整个本说明书中讨论的更具体的文献中所述执行。酶促反应和纯化技术根据生产厂商的说明书执行，如本领域中普遍实现的那样或如本文所述执行。结合本文所述的实验室操作和技术使用的命名是本领域中众所周知和普遍使用的那些。
除非另外指明，则下面的术语应当被理解为具有下列的含义：
如本文所用，术语“一个”、“一种”和“该”可以指一个或多个/一种或多种，除非具体地另外指明。
术语“或”的使用用来意指“和/或”，除非明确地指明是指仅为择一或备选者是互斥的，尽管本公开支持指仅为择一以及“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用来表示包括用来测定数值的装置、方法的固有误差变化，或样品中存在的变化的数值。
术语“固相支持物”或“支持物”意指提供其上可以结合生物分子的基底和/或表面的结构。例如，固相支持物可以是测定孔(即，诸如微量滴定板或多孔板)，或固相支持物可以是滤器、阵列或移动支持物上的位置，所述移动支持物诸如珠子或膜(例如，滤板或侧流测试条)，
术语“结合剂”是指可以特异性和选择性地结合第二(即，不同的)感兴趣分子的分子。相互作用可以是非共价的，例如，作为氢键键合、范德华相互作用、或静电或疏水相互作用的结果，或它可以是共价的。术语“可溶性结合剂”是指不与固相支持物缔合(即，共价或非共价结合)的结合剂。
如本文所用，术语“繁殖缺陷的”或“繁殖缺陷性的”或“复制缺陷的”或“复制缺陷性的”是指噬菌体繁殖能力的损害。即，繁殖缺陷性的噬菌体可以不能生成新的噬菌体颗粒，例如，因缺少衣壳组装所需的蛋白所致。噬菌体基因组中各种各样的缺失、插入或置换可以使噬菌体成为繁殖缺陷性的。
如本文所用，“分析物”是指被测量的分子、化合物或细胞。在某些实施方案中，感兴趣的分析物可以与结合剂相互作用。如本文所述，术语“分析物”可以指感兴趣的蛋白或肽。分析物可以是激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可以不具有生物学效应。分析物可以包括小分子、糖类、寡糖、脂类、肽、拟肽物、有机化合物等。
术语“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报告物”或“指示物”或“指示部分”是指由可以在定量测定中被测量到的分子(诸如酶)产生的分子或化合物。例如，指示物或指示部分可以包括可以用来将底物转变成可以测量的产物的酶。指示物或指示部分可以是催化生成生物发光发射的反应的酶(例如萤光素酶)。或者，指示物或指示部分可以是可以定量的放射性同位素。或者，指示物或指示部分可以是荧光团。或者，可以使用其他可检测分子。术语“指示基因”用来指编码指示物的基因，所述指示物诸如蛋白，例如酶。
如本文所用，“噬菌体”包括可以侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其他微观活生物体的多种病毒中的一种或多种。在本公开中，术语“噬菌体”和相关术语包括诸如下列的病毒：可以侵入细菌和古细菌的细菌噬菌体，可以侵入分枝杆菌(细菌科，包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合菌群的分枝杆菌，包括结核的致病物，以及鸟分枝杆菌(Mycobacterium avis)复合菌群的分枝杆菌，包括结核的致病物)的分枝杆菌噬菌体，可以侵入真菌的真菌噬菌体，支原体噬菌体，以及可以感染原生动物、酵母和其他微观活生物体的病毒。在此，“微观”意指最大尺寸为1毫米或更小。噬菌体是自然界中已经进化为使用细菌、分枝杆菌或古细菌作为复制它们自身的工具的病毒。在自然界中，噬菌体自身附着到微生物上并将其DNA(或RNA)注入到该微生物中，然后可以诱导所述微生物将噬菌体复制几百或甚至几千次。这称为噬菌体扩增。例如，充分研究的大肠杆菌噬菌体包括T1、T2、T3、T4、T5、T7和λ；在ATCC保藏中心可获得的其他大肠杆菌噬菌体包括，例如，phiX174、S13、Ox6、MS2、phiV1、fd、PR772和ZIK1。沙门氏菌属噬菌体包括TSP1、TSP11、SPN1S、10、ε15、SEA1、TSP1和P22。李斯特氏菌属噬菌体包括P100、LMA8、LMA4、LPES1、LipZ5、P40、vB_LmoM_AG20、P70、P100、LP-JS3、LP-ES1和A511。葡萄球菌属噬菌体包括葡萄球菌噬菌体ISP、P4W、病毒K、Twort、phi11、187、P68和phiWMY。
如本文所用，“晚期基因区”是指在病毒生命周期的晚期转录的病毒基因组的区域。晚期基因区典型地包括表达最丰富的基因(例如，组装成噬菌体颗粒的结构蛋白)。噬菌体的晚期基因与III类基因是同义的，并且包括具有结构和组装功能的基因。例如，晚期基因(与III类基因同义)在噬菌体T7中转录，例如从感染后8分钟直至裂解，I类基因(例如，RNA聚合酶)较早从4至8分钟，II类基因从6至15分钟，因此在II类和III类的时间上有重叠。晚期启动子天然地位于此晚期基因区中且有活性。
如本文所用，“用于富集的培养”是指传统的培养，诸如在有利于繁殖微生物的培养基中孵育，并且应当不要与措词“富集”的其他可能用途混淆，诸如通过移除样品的液体组分以浓缩包含在其中的微生物的富集，或不包括传统的促进微生物繁殖的其他富集形式。在本文所述的方法的一些实施方案中可以采用持续一定时间段的用于富集的培养。
如本文所用“重组”是指基因(即，核酸)修饰，如通常在实验室中进行以将在其他情况下没有发现在一起的遗传物质合并在一起。该术语与本文中的术语“修饰的”可互换使用。如本文所用“RLU”是指相对光单位，如通过光度计(例如，
Figure BDA0003520044270000121
96)或检测光的类似仪器测量。例如，对萤光素酶和适宜底物之间的反应(例如，
Figure BDA0003520044270000122
与NanoGlo)的检测经常以检测到的RLU报告。
概述
本文公开了证明对测试样品(例如，生物样品、食品样品、水样品和环境样品)中的感兴趣微生物(诸如细菌和古细菌)的检测有令人惊异的灵敏度的组合物、方法和系统。感兴趣微生物的一些非限制性实例为：芽孢杆菌属(Bacillus spp.)，百日咳博得特氏菌(Bordetella pertussis)，布鲁氏杆菌属(Brucella spp.)，弯曲杆菌属(Camplylobacterspp.，诸如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))，肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)，克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，肉毒杆菌(Clostridium botulinum)，肠杆菌属(Enterobacter spp.)，埃希氏菌属(Escherichia spp.，诸如大肠杆菌，例如，大肠杆菌O157:H7和大肠杆菌的其他产生志贺毒素的菌株和产生肠毒素的菌株)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，李斯特氏菌属(诸如单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))，肺炎支原体，假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，沙门氏菌属(例如，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))，宋内志贺式菌(Shigella sonnei)，耶尔森菌属(Yersinia spp.)，弧菌属(Vibrio spp.)，葡萄球菌属(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))，和链球菌属(Streptococcus spp.)。检测可以在比以前在没有利用用于富集的培养的条件下进行的测定中使用基因修饰的噬菌体被认为可能的时间范围更短的时间范围内实现，或在一些具有最小的孵育时间(期间微生物可以潜在地倍增)的实施方案中实现。还令人惊讶的是成功使用了潜在的高感染复数(MOI)，或高浓度的空斑形成单位(PFU)，用于与测试样品孵育。这样高的噬菌体浓度(PFU/mL)以前被认为不利于细菌检测测定，因为它们被认为导致“自外裂解”。然而，高浓度的噬菌体可以促进发现、结合和感染低数目的靶细胞。
本发明的组合物、方法、系统和试剂盒可以包含用于检测感兴趣微生物的重组噬菌体。在某些实施方案中，本发明可以包括包含重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有插入到噬菌体的晚期基因区中的指示基因。这样的重组噬菌体称作“指示噬菌体”。在某些实施方案中，在感染宿主微生物后指示基因的表达导致产生可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，所述指示基因可以插入到噬菌体的晚期基因(即，III类)区中。根据本发明的实施方案的重组噬菌体可以来源于短尾病毒(podoviruses)诸如T7、T7-样，肌尾病毒(myoviruses)诸如T4、T4-样，长尾病毒(siphoviruses)，诸如T5、P70、Saka6，和相关的噬菌体，ViI、ViI-样(或Vi1病毒，根据GenBank/NCBI)，克罗诺杆菌属特异性噬菌体，诸如Saka2或Saka4，沙门氏菌属噬菌体SPN1S，沙门氏菌属噬菌体10，沙门氏菌属噬菌体ε15，沙门氏菌属噬菌体SEA1，沙门氏菌属噬菌体Spn1s，沙门氏菌属噬菌体P22，李斯特氏菌属噬菌体LipZ5，李斯特氏菌属噬菌体P40，李斯特氏菌属噬菌体vB_LmoM_AG20，李斯特氏菌属噬菌体P70，李斯特氏菌属噬菌体A511，葡萄球菌属噬菌体P4W，葡萄球菌属噬菌体K，葡萄球菌属噬菌体Twort，葡萄球菌属噬菌体SA97，大肠杆菌O157:H7噬菌体CBA120，或另一种野生型或工程化噬菌体。
根据本发明的实施方案的指示噬菌体是繁殖缺陷性的，意指它们在感染被检测的感兴趣微生物后不能有效地繁殖或根本不能繁殖。根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体由于一个或多个合适基因(例如，病毒粒子组装所需的晚期基因)的改变而成为繁殖缺陷性的。在一些实施方案中，根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体独立于指示基因的引入通过在合适的基因中引入突变而成为繁殖缺陷性的。在一些其他的实施方案中，根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体通过用指示基因替代合适基因的至少一部分而成为繁殖缺陷性的。根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体可以在宿主微生物中繁殖或复制，所述宿主微生物被工程化改造以产生噬菌体繁殖所需的突变基因的产物。此类工程化微生物称为“容许性的”。
繁殖缺陷性的指示噬菌体相对于以前记载的指示噬菌体拥有几个优势。由于繁殖缺陷性的指示噬菌体需要特殊的工程化微生物来进行繁殖，因此限制了没有经验和/或未经受训的供应商生产和分销它们的可能性。生产和分销受污染的低质量试剂在诊断学领域是个严重的问题。通过将指示噬菌体的生产和分销限于拥有某种合格资质和满足某些标准的实体(例如，通过官方认证过程)，提供繁殖缺陷性的指示噬菌体，减少了生产低质量或受污染的指示噬菌体并将其分销给诊断操作者的风险。此外，不能在环境中存在的宿主微生物中繁殖，繁殖缺陷性的指示噬菌体消除了含有限定浓度和/或量的指示噬菌体的标准化诊断试剂在进行诊断操作程序之前被宿主微生物污染的风险，污染可以导致试剂中指示噬菌体的浓度或量的未被察觉的增加，并且因此导致不准确的检测数据。这个问题在定量或半定量检测中特别重要，此时使用的指示噬菌体的浓度或量与被检测的信号的强度相关。此外，还由于在诊断过程期间在感兴趣微生物中不能繁殖，根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体允许更准确地定量或半定量检测样品中的感兴趣微生物。准确性的改善来自于在整个检测过程中控制样品中存在的繁殖缺陷性的指示噬菌体的量的能力。由于在检测过程期间不产生新的有活力的指示噬菌体，仅有初始使用的繁殖缺陷性的指示噬菌体能够在感染后表达指示基因产物。与早期基因相比晚期基因的缺失和替换确保了指示基因的高表达，其原因在于晚期基因固有的高表达水平，以及早期基因的缺失经常导致基因组不能复制，减少了每个细胞中指示基因的拷贝数。感染后指示噬菌体的繁殖可以将显著的变异性引入到在诊断过程期间产生的指示物信号的量中。因此，使用根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体使得更容易地标准化定量和半定量检测，提高了检测而结果的准确性。
在一些方面，本发明包括检测感兴趣微生物的方法。所述方法可以使用噬菌体来检测感兴趣微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可以包括通过将样品与感染所述感兴趣微生物的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体孵育来检测样品中的感兴趣微生物。在一些实施方案中，重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体是噬菌体。在某些实施方案中，指示基因可以插入到噬菌体的晚期基因区中，使得在感染宿主微生物后指示基因的表达导致产生指示基因产物。所述方法可以包括检测指示基因产物，其中对所述指示基因产物的阳性检测指示所述感兴趣微生物存在于所述样品中。在一些实施方案中，指示基因产物是蛋白。在一些实施方案中，指示基因产物是可溶性蛋白。
在某些实施方案中，本发明可以包括系统。所述系统可以包含本发明的组合物中的至少一些。所述系统还可以包含用于执行所述方法的组件中的至少一些。在某些实施方案中，所述系统被配置成试剂盒。因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的系统，包含：用于将所述样品与对所述感兴趣微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体孵育的组件，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示基因；以及用于检测所述指示物的组件。还在其他实施方案中，本发明包括用于与所述方法或系统一起使用的软件。
本发明的一些实施方案通过使用基于噬菌体的方法以扩增指示细菌存在的可检测信号，解决了微生物检测领域中的需求。在某些实施方案中，检测少至单个细菌。本文应用的原理可以应用于检测各种各样的微生物。因为微生物表面上用于噬菌体的大量结合位点以及编码的指示物的高表达水平潜力，所述指示物可以比微生物本身更容易检测到。以此方式，本发明的实施方案可以从甚至单个感染的细胞实现极大的信号放大。
本文公开和描述的本发明的一些实施方案利用了下面的事实：单个微生物能够结合根据本发明的实施方案的多个重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体。在被重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体感染后，它们通过由所述重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体编码并在所述微生物中表达的指示物而被检测。此原理允许基于对微生物表面受体的特异性识别从一个或几个细胞放大指示物信号。例如，通过将甚至单个细菌细胞暴露于多个繁殖缺陷性的指示噬菌体，此后使编码的指示基因产物表达，指示物信号被放大使得感兴趣微生物可以很高的灵敏度被检测到。例如，样品中存在的单个细菌可以使用本发明的实施方案检测到。本发明的实施方案利用了噬菌体可以结合特殊微生物的高特异性作为检测和/或定量样品中的特定微生物的方式。在一些实施方案中，本发明利用了繁殖缺陷性的指示噬菌体的高特异性。
本发明的方法和系统的实施方案可以应用于在各种各样的环境中各种各样的微生物(诸如，但不限于，细菌和古细菌)的检测和定量，包括但不限于从食品、水、和商品样品中检测病原体。本发明的方法提供了高检测灵敏度和特异性以及快速检测。
样品
本发明的组合物、方法、试剂盒和系统的每个实施方案允许快速的检测和/或定量样品中的感兴趣微生物。例如，根据本发明的实施方案的方法可以在缩短的时间段中执行，并具有较佳的结果。
使用本发明的实施方案在样品中可检测到的微生物包括，但不限于，作为通过食品-或水-传播的病原体的细菌。可通过本发明检测到的细菌包括，但不限于：芽孢杆菌属，百日咳博得特氏菌，布鲁氏杆菌属，弯曲杆菌属(诸如空肠弯曲杆菌)，肺炎衣原体，克罗诺杆菌属，产气荚膜梭菌，肉毒杆菌，肠杆菌属，埃希氏菌属(诸如大肠杆菌，例如，大肠杆菌O157:H7和大肠杆菌的其他产生志贺毒素的菌株和产生肠毒素的菌株)，肺炎克雷伯氏菌，李斯特氏菌属(诸如单核细胞增生李斯特氏菌)，肺炎支原体，沙门氏菌属(例如，伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌)，宋内志贺式菌，耶尔森菌属，弧菌属，葡萄球菌属(例如，金黄色葡萄球菌)，和链球菌属。
样品可以是，但不限于：环境样品，食品样品或水样品。一些实施方案可以包括医疗或兽医样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样品可以包括环境材料，诸如水样品，或来自空气样品的过滤物，或来自旋风收集器的气溶胶样品。样品可以是鱼、肉(诸如牛肉、猪肉或羊肉、家禽肉)、加工食品、花生酱、婴儿配方奶粉、奶粉、茶、淀粉、蛋、奶、奶酪或其他乳制品的样品。医疗或兽医样品包括，但不限于：血液，唾液，脑脊液，粪便样品，和灌洗冲洗液。在一些实施方案中，灌洗用来收集生物学样品。灌洗是溶液(例如，盐水)流过开放创面或植入的修复体。因此，在一些实施方案中，生物学样品是创面灌洗液或修复体灌洗液。在一些实施方案中，样品可以是不同类型的拭子。
在一些实施方案中，样品可以在根据本发明的实施方案的检测方法中直接使用，无需准备、浓缩或稀释。例如，液体样品，包括，但不限于，奶和汁，可以直接测定。在其他实施方案中，样品可以在溶液中稀释或悬浮，所述溶液可以包括，但不限于，缓冲液溶液或细菌培养基。固体或半固体的样品可以通过将固体切碎、混合或浸渍在液体中而悬浮在液体中。在一些实施方案中，样品应该保持在促进重组的噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH范围内。在一些实施方案中，优选的pH范围可以是适合于噬菌体附着于细菌细胞的范围。样品应当还包含适宜浓度的二价和单价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和K+。
在一些实施方案中，样品保持在维持样品中存在的任何病原体细胞的活力的温度。在其中噬菌体附着于细菌细胞的步骤期间，样品可以保持在促进噬菌体活性的温度。这样的温度为至少约25℃以及不超过约45℃。在一些实施方案中，样品保持在约37℃。在一些实施方案中，样品在重组噬菌体结合或感染期间接受轻柔混合或振摇。
本发明的实施方案可以利用各种适宜的对照样品。例如，不包含噬菌体的对照样品或含有噬菌体不含感兴趣微生物的对照样品可以作为用于背景信号水平的对照进行测定。
繁殖缺陷性的指示噬菌体
如本文更详细地描述的那样，根据本发明的实施方案的组合物、方法、系统和试剂盒可以包括用于检测致病微生物的繁殖缺陷性的指示噬菌体。在某些实施方案中，本发明包括重组繁殖缺陷性指示噬菌体，所述重组繁殖缺陷性指示噬菌体具有一个或多个基因修饰以包括指示基因并使得该噬菌体是繁殖缺陷性的。上述基因修饰可以在一个基因修饰步骤期间或多个基因修饰步骤(诸如两个或更多个基因修饰步骤)期间引入。在一些实施方案中，本发明可以包括包含繁殖缺陷性的指示噬菌体的组合物。
重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体可以包括报告物或指示基因。在感染源的某些实施方案中，指示基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在感染宿主微生物(诸如细菌)后指示基因的表达产生可溶性指示蛋白产物。在某些实施方案中，指示基因可以插入到繁殖缺陷性的指示噬菌体的晚期基因区中。因为晚期基因编码结构蛋白，因此它们一般以比其他噬菌体基因更高的水平表达。
根据本发明的实施方案的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体包含使重组噬菌体在感染宿主生物体后不能繁殖的改变。根据一些考虑因素选择合适的基因和改变。适合于改变的噬菌体基因是影响感染后噬菌体在宿主微生物中繁殖的能力但不影响重组的繁殖缺陷性的噬菌体感染宿主微生物的能力的基因。在一些实施方案中，选择被改变以使重组噬菌体成为繁殖缺陷性的基因，使得它们不是噬菌体的基因组复制所需要的基因。这确保了重组噬菌体基因组复制为典型的高拷贝数，产生高拷贝数的指示基因。早期和即时早期基因经常归为噬菌体基因组复制所需的基因类别中。早期和即时早期基因(例如T7 RNA聚合酶)还可以是晚期基因启动子所控制的基因表达所需的，诸如重组噬菌体中的指示基因。因此，即时早期和早期基因，也称作I类或II类基因，可能不适合改变。在一些实施方案中，选择被改变以使重组噬菌体成为繁殖缺陷性的基因，因为它们是成熟的噬菌体病毒粒子产生所需要的。例如，适合用于改变或缺失的基因可以是结构上重要的基因，诸如病毒粒子组装所需的基因。在一些实施方案中，选择被改变使重组噬菌体成为繁殖缺陷性的基因，它们是成熟的噬菌体病毒粒子产生所需要的且不以高拷贝数表达的晚期基因。在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以包含超过一个(即，一个或多个)改变的基因。可以适合用于改变或缺失以使重组噬菌体成为繁殖缺陷性的基因的一些实例如下：在噬菌体T4和相关的噬菌体以及T4病毒(例如，SEA1、Saka4和TSP12噬菌体)和密切相关的Viulikevirus(例如，CBA120、TSP1噬菌体)中，可以适合用于改变的基因中的一些为：编码头部完成蛋白(head completion protein)的gp4；编码入口顶点蛋白(portal vertex protein)的gp20；编码前头核心支架蛋白和蛋白酶的gp21；编码前头支架蛋白的gp22；编码基片楔形亚基的gp25；编码基片插孔亚基的gp26；编码基片楔形组件的gp53；编码基片-尾管起始蛋白的gp54。在短尾病毒(T7、MP87噬菌体)中，可以适合用于改变的基因中的一些为：编码病毒粒子蛋白的gp6.7；编码尾部蛋白的gp7.3；编码头-尾连接蛋白的gp8；编码支架蛋白的gp9；gp13。在长尾病毒(T5、P70-相关噬菌体)中，可以适合用于改变的基因中的一些为：编码前头蛋白酶的Gp150和编码入口蛋白的gp152。要理解的是上面的列表是非限制性的，并且其他基因可以在各种各样的噬菌体中改变。
在一些实施方案中，根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体包含合适基因中的突变。此类突变可以是琥珀突变、赭石突变(ochre mutation)、碱基置换、缺失或插入、或上述类型突变的任意组合。突变或它们的组合可以使得所选择用于改变的基因通过改变所编码的蛋白结构而变得无功能，遏制被改变的基因的转录或表达(例如，通过改变启动子)，导致转录或表达的提前终止等。在一些其他的实施方案中，在繁殖缺陷性的指示噬菌体中，合适的基因通过用指示基因替代合适基因的至少一部分而被改变。结果，重组噬菌体成为繁殖缺陷性的并且掺入指示基因序列。在一些实施方案中，可以优选地用指示基因替代噬菌体中合适基因的至少一部分，而非将一个或多个突变引入到合适基因中，从而避免了所述一个或多个突变在所述合适基因中的回复或遏制以及所述重组噬菌体恢复到繁殖感受态。
在一些实施方案中，繁殖缺陷性指示噬菌体可以来源于短尾病毒(诸如T7、T7-样)，肌尾病毒(诸如T4、T4-样)，ViI、ViI-样(或Vi1病毒，根据GenBank/NCBI)，克罗诺杆菌属特异性噬菌体(诸如Saka2或Saka4)，沙门氏菌属噬菌体SPN1S，沙门氏菌属噬菌体10，沙门氏菌噬菌体ε15，沙门氏菌属噬菌体SEA1，沙门氏菌属噬菌体Spn1s，沙门氏菌属噬菌体P22，沙门氏菌属噬菌体TSP1，沙门氏菌属噬菌体TSP11，李斯特氏菌属噬菌体LipZ5，李斯特氏菌属噬菌体P40，李斯特氏菌属噬菌体vB_LmoM_AG20，李斯特氏菌属噬菌体P70，李斯特氏菌属噬菌体A511，李斯特氏菌属噬菌体LMA4，李斯特氏菌属噬菌体LMA8，李斯特氏菌属噬菌体LPES1，李斯特氏菌属噬菌体LPJP1，葡萄球菌属噬菌体P4W，葡萄球菌属噬菌体K，葡萄球菌属噬菌体Twort，葡萄球菌属噬菌体SA97，葡萄球菌属噬菌体ISP，大肠杆菌O157:H7噬菌体CBA120，或其他的野生型或工程化噬菌体。在一些实施方案中，指示噬菌体来源于基因组与可以从下列衍生的噬菌体具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的噬菌体：短尾病毒，诸如T7、T7-样，肌尾病毒，诸如T4、T4-样，ViI、ViI-样(或Vi1病毒，根据GenBank/NCBI)，克罗诺杆菌属特异性噬菌体，诸如Saka2或Saka4，沙门氏菌属噬菌体SPN1S，沙门氏菌属噬菌体10，沙门氏菌属噬菌体ε15，沙门氏菌属噬菌体SEA1，沙门氏菌属噬菌体Spn1s，沙门氏菌属噬菌体P22，李斯特氏菌属噬菌体LipZ5，李斯特氏菌属噬菌体P40，李斯特氏菌属噬菌体vB_LmoM_AG20，李斯特氏菌属噬菌体P70，李斯特氏菌属噬菌体A511，葡萄球菌属噬菌体P4W，葡萄球菌属噬菌体K，葡萄球菌属噬菌体Twort，葡萄球菌属噬菌体SA97，大肠杆菌O157:H7噬菌体CBA120，或其他野生型或工程化噬菌体。在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体来源于对特定微生物高度特异的噬菌体。例如，繁殖缺陷性指示噬菌体可以从对在某些环境中发现的细菌特异的环境衍生的噬菌体制备。
选择插入到繁殖缺陷性的指示噬菌体中的指示基因可以通过各种各样的考虑因素来指导。例如，大多数噬菌体可以包装比它们天然基因组大百分之几的DNA。在这种考虑因素下，较小的指示基因可以是修饰噬菌体(特别是具有较小基因组的噬菌体)的更适宜的选择。OpLuc和
Figure BDA0003520044270000211
蛋白仅约20kDa(编码大约500-600bp)，而FLuc约62kDa(编码大约1,700bp)。作为比较，T7的基因组为大致40kbp，而T4基因组为约170kbp。此外，报告基因应当不被细菌内源性表达(即，不是细菌基因组的一部分)，应当生成高信号背景比，并且应当容易地以及时方式检测到。
Figure BDA0003520044270000212
的
Figure BDA0003520044270000213
是一种修饰的Oplophorus gracilirostris(深海虾)萤光素酶。在一些实施方案中，
Figure BDA0003520044270000214
与NanoGlo(也是
Figure BDA0003520044270000215
的产品，咪唑并吡嗪酮底物(furimazine))的组合，可以提供具有低背景的稳定信号。在一些实施方案中，超过一个指示基因可以插入到繁殖缺陷性的噬菌体中。例如，可以插入超过一个拷贝(诸如两个拷贝)的相同指示基因，这可以提高使用繁殖缺陷性的指示噬菌体的测定的信号强度和/或信噪比。在另一实施例中，可以插入不同的指示基因，诸如两个不同的指示基因，这可以允许双峰信号检测。例如，
Figure BDA0003520044270000221
基因可以与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因一起插入，或
Figure BDA0003520044270000222
基因可以与编码不同的萤光素酶(诸如萤火虫萤光素酶)的基因一起插入。
指示基因可以编码各种各样的生物分子或本身可以是可检测的生物分子。例如，指示基因可以编码可检测的多肽或蛋白。在另一个实施例中，指示基因可以是表达可检测产物的基因或编码产生可检测产物的酶的基因。在再一个实例中，指示基因可以编码可检测的核酸或包括可检测的核酸。例如，指示基因可以编码可检测的适体，诸如RNA Mango，或指示基因可以包含可利用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)检测的核酸序列。在一些实施方案中，指示基因的产物可以是可检测的酶。指示基因产物可以生成光和/或可以通过颜色变化检测。各种适宜的酶是可商购的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可以充当指示部分。例如，在一些实施方案中，指示基因编码萤光素酶。可以使用各种类型的萤光素酶。萤光素酶可以是Oplophorus萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶、或工程化萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示部分。在一些实施方案中，萤光素酶基因来源于Oplophorus。在一些实施方案中，指示基因是基因修饰的萤光素酶基因，诸如
Figure BDA0003520044270000223
其他工程化萤光素酶或生成可检测信号的其他酶也可以是适宜的指示部分。
对繁殖缺陷性指示噬菌体的基因修饰可以包括插入、缺失或置换小核酸片段、基因的大部分或整个基因。在一些实施方案中，插入或置换的核酸包含非天然序列。例如，非天然指示基因可以插入到噬菌体基因组中使得其处在噬菌体启动子的控制下。可以插入非天然指示基因使得其替代晚期噬菌体基因的序列的至少一部分，并且指示基因的插入使得得到的重组噬菌体成为繁殖缺陷性的。在指示基因的所有三个读码框中包含终止密码子可以通过减少通读而有助于增加表达，也称作泄露表达。这种策略还可以消除融合蛋白以低水平制备的可能性，后者将表现为不能与噬菌体分开的背景信号。因此，在一些实施方案中，非天然指示基因不是融合蛋白的一部分。即，在一些实施方案中，基因修饰可以被构造成使得指示蛋白产物不包含噬菌体的多肽。在一些实施方案中，本发明包括基因修饰的繁殖缺陷性指示噬菌体，其包含在晚期(III类)基因区中的非噬菌体指示基因。在一些实施方案中，非天然指示基因处在晚期启动子的控制下。使用病毒晚期基因启动子保证了报告基因(例如，萤光素酶)不仅以高水平表达，像病毒衣壳蛋白，而且不会如类似的内源性细菌基因或早期噬菌体基因那样关闭。在一些实施方案中，晚期启动子是T4-、T7-或ViI-样启动子，或是类似于野生型噬菌体中发现的启动子的另一种噬菌体启动子。
在一些实施方案中，在用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染后，在感兴趣微生物中繁殖缺陷性的指示噬菌体的指示基因的表达导致可溶性蛋白产物的产生。在一些实施方案中，非天然指示基因与编码结构噬菌体蛋白的基因不相邻，因此不产生融合蛋白。不像采用检测部分与衣壳蛋白的融合体(融合蛋白)的系统，本发明的一些实施方案表达可溶性指示物或报告物(例如，可溶性萤光素酶)。在一些实施方案中，指示物或报告物理想地不含噬菌体结构。即，指示物或报告物不附着于噬菌体结构。这样，所述指示物或报告物的基因不与繁殖缺陷性的指示噬菌体的基因组中的其他基因融合。这可以极大地增加其中使用根据本发明的实施方案的繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测测定的灵敏度(灵敏度可以增加到低至检测样品中的单个微生物)，并简化所述测定，使得对于一些实施方案来说所述测定在2小时或更少的时间内完成，与利用产生可检测的融合蛋白的构建体所需的附加纯化步骤所致的几小时不同。此外，融合蛋白的活性可能比可溶性蛋白低，例如，因蛋白折叠约束所致，蛋白约束可以改变酶活性位点的构象或与底物的接近度。如果浓度为10个细菌细胞/mL样品，例如，对于所述测定，不到2小时可能是足够的。
此外，就定义来看，融合蛋白限制了与噬菌体中的蛋白亚基附接的部分的数目。例如，使用设计用来充当融合蛋白的平台的市售系统将产生约415个拷贝的融合部分，对应于每个T7噬菌体颗粒中的大约415个拷贝的基因10B衣壳蛋白。没有这种约束，被感染的细菌预期可以表达比噬菌体上可以放得下的多很多的拷贝的检测部分(例如，萤光素酶)。
在重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的一些实施方案中，使用晚期启动子(诸如III类启动子，例如，来自T7、T4、ViI或Saka)用于转录指示基因。此类晚期启动子对转录组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因的相同噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力。这些蛋白是由噬菌体制备的最丰富的蛋白，因为每个噬菌体颗粒包含几十个或几百个拷贝的这些分子。使用病毒晚期启动子可以确保指示基因产物(诸如萤光素酶)表达的最优高水平。使用来源于衍生繁殖缺陷性的指示噬菌体的原始野生型噬菌体的晚期启动子，对所述原始野生型噬菌体特异的晚期启动子，或在所述原始野生型噬菌体的控制下有活性的晚期启动子(例如，T4、T7、ViI或Saka晚期启动子与基于T4-、T7-、ViI-或Saka-的系统)，可以进一步确保检测部分的最优表达。在一些情况下使用标准的细菌(非病毒/非噬菌体)启动子可能对表达不利，因为这些启动子在噬菌体感染期间经常是下调的(以便噬菌体对细菌资源按重要性进行排序以用于噬菌体蛋白生产)。因此，在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体优选地被改造以编码和高水平地表达可溶性(游离的)指示部分，所述改造使用基因组中不将表达限制为噬菌体结构组件的亚基数目的位置进行。
在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体被设计为优化期望性状以用于检测感兴趣微生物的测定中。在一些实施方案中，采用对基因修饰的生物信息学和事前分析以优化期望性状。例如，在一些实施方案中，编码噬菌体尾蛋白的基因可以被优化以识别和结合特定种的细菌。在其他实施方案中，编码噬菌体尾蛋白的基因可以被优化以识别和结合整个属的细菌，或该属内特定组的种。以此方式，噬菌体可以被优化以检测较宽或较窄组的病原体。在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以被设计为提高报告基因的表达。另外地和/或备选地，在一些情况下，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以被设计为增加噬菌体的裂解量以改善检测。将繁殖缺陷性的指示噬菌体设计为在感染后产生增加的拷贝数的噬菌体基因组或增加晚期基因的表达水平将产生增加的裂解量。
在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体的稳定性可以被优化以提高保存期。例如，可以增加酶抗生素溶解度(enzybiotic solubility)以增加后续的噬菌体稳定性。另外地和/或备选地，繁殖缺陷性的指示噬菌体的热稳定性可以被优化。热稳定的噬菌体在储存期间保留了更好的功能活性，由此增加了保存期。因此，在一些实施方案中，热稳定性和/或pH耐受性可以被优化。
本发明的组合物可以包含一种或多种繁殖缺陷性指示噬菌体和一个或多个指示基因。在一些实施方案中，组合物可以包括对不同的感兴趣微生物特异的不同的繁殖缺陷性的指示噬菌体的混合物。此类混合物可以用于同时检测多种感兴趣微生物。在一些实施方案中，组合物可以包括可以编码和表达相同或不同指示蛋白的不同的繁殖缺陷性的指示噬菌体的混合物。在一些实施方案中，繁殖缺陷性的噬菌体的混合物包含至少两种不同类型的繁殖缺陷性指示噬菌体。
制备(制作)繁殖缺陷性指示噬菌体的方法
用于制备繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的实施方案可以以选择用于基因修饰的亲代噬菌体开始。例如，一些噬菌体对靶微生物高度特异，其可以包括对靶微生物的特定株或血清型的特异性。这呈现了高度特异性检测的机会。亲代噬菌体可以是在任何环境中发现的野生型噬菌体或工程化噬菌体。根据本发明的实施方案的方法利用了与噬菌体相关的结合高特异性，噬菌体识别并结合特定的感兴趣微生物作为放大信号的方式并由此检测样品中存在的低水平的微生物(在一些情况下，低至单个微生物)。例如，噬菌体特异性地识别特定微生物的表面受体并因此特异性地感染那些微生物。这样，它们适宜用于靶向感兴趣微生物。本发明的一些实施方案利用了指示噬菌体的结合特异性和高水平基因表达能力用于快速和灵敏的靶向以感染和促进对感兴趣微生物的检测。因此，制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案可以包括与选择特异性地感染感兴趣靶微生物的亲代噬菌体相关的步骤。
制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案包括一个或多个改变亲代噬菌体的基因以产生重组的繁殖缺陷性的噬菌体的步骤。例如，一些实施方案可以包括将一个或多个突变引入到合适的基因中以使亲代噬菌体成为繁殖缺陷性的一个或多个步骤。此类合适的基因和突变在本文件的其他地方记载。
制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案包括改变亲代噬菌体的基因以产生重组的繁殖缺陷性的噬菌体的步骤。对于繁殖，繁殖缺陷性的噬菌体需要噬菌体的宿主微生物(诸如细菌)的能够表达被改变以使得所述噬菌体成为繁殖缺陷性的基因的产物的工程化菌株。此类工程化菌株可以称为“容许性的”。因此，制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案可以包括生成宿主微生物的此类容许性的工程化菌株的步骤。制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案可以包括利用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染宿主微生物的容许性的工程化菌株的步骤。制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案可以包括制备包含指示基因的同源重组质粒/载体的步骤。制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案可以包括将所述同源重组质粒/载体转化到用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染的容许性的工程化宿主微生物中的步骤。制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些其他实施方案可以包括将所述同源重组质粒/载体转化到容许性的工程化宿主微生物中的步骤，接着用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染述经转化的容许性的工程化宿主微生物的步骤。在一些实施方案中，容许性的工程化宿主微生物的感染和将同源重组质粒/载体转化到容许性的工程化宿主微生物中可以在同一步骤中实现。在其他实施方案中，容许性的工程化宿主微生物的感染和将同源重组质粒/载体转化到容许性的工程化宿主微生物中在两个步骤或超过两个步骤中实现。一旦容许性的工程化宿主微生物接纳了繁殖缺陷性的噬菌体和同源重组质粒/载体，则在所述质粒/载体和噬菌体基因组之间发生同源重组。然后可以分离包含指示基因的重组的繁殖缺陷性的噬菌体(繁殖缺陷性的指示噬菌体)。
在一些实施方案中，亲代噬菌体的被改变使得噬菌体成为繁殖缺陷性的基因可以通过用指示基因替代亲代噬菌体的至少一部分来改变。因此，制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案包括制备包含指示基因的同源重组质粒/载体的步骤，所述指示基因的侧翼为被靶向的基因的序列，该基因在亲代噬菌体中缺失以使得所述亲代噬菌体成为繁殖缺陷性的。然后同源重组质粒/载体可以被转化进用所述亲代噬菌体感染的容许性的工程化宿主微生物中，由此允许在所述质粒/载体和亲代噬菌体基因组之间发生同源重组。制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些其他实施方案可以包括将所述同源重组质粒/载体转化到容许性的工程化宿主微生物中的步骤，接着用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染述经转化的容许性的工程化宿主微生物的步骤，由此允许在所述质粒/载体和亲代噬菌体基因组之间发生同源重组。在一些实施方案中，容许性的工程化宿主微生物的感染和将同源重组质粒/载体转化进容许性的工程化宿主生物体中可以在同一步骤中实现，由此允许在所述质粒/载体和亲代噬菌体基因组之间发生同源重组。然后可以分离包含指示基因的重组的繁殖缺陷性的噬菌体(繁殖缺陷性的指示噬菌体)。
在制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案中，将繁殖缺陷性和指示基因引入至亲代噬菌体中在一步重组过程中实现。此类过程的重组策略图示在图1中。实施方案的诸如此类的优势是简化了生成繁殖缺陷性的指示噬菌体的过程。此类实施方案的另一优势在于它们允许使用报告基因来检测和分离繁殖缺陷性的指示噬菌体。如果引入基因改变赋予包括指示基因的能够繁殖的噬菌体(能够繁殖的指示噬菌体)以繁殖缺陷性，则具有和不具有繁殖缺陷性改变的噬菌体都将生长，会使得对指示噬菌体的筛选更加费力。
图3示意性地图示了在宿主微生物中的同源重组(HR)质粒和亲代噬菌体基因组之间发生的同源重组过程，导致生成根据本发明的一个实施方案的指示噬菌体。在图示的同源重组过程中，噬菌体是CBA120大肠杆菌噬菌体，报告基因是
Figure BDA0003520044270000281
报告基因。因此，在图示的实施方案中，宿主微生物是大肠杆菌。要理解的是图3旨在是示例性的和非限制性的，可以使用其他噬菌体、对应的宿主生物体和报告基因。在一些实施方案中，可以优选利用已从环境分离的噬菌体用于制备繁殖缺陷性的指示噬菌体。以此方式，可以生成对天然来源的微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体。
设计并制备同源重组质粒的各种方法是已知的。用质粒转化细菌的各种方法是已知的，包括热激、F纤毛介导的细菌接合、电穿孔和其他方法。在同源重组后分离特定克隆的各种方法也是已知的。本文所述的一些方法实施方案利用特定的策略。
制备繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案可以包括选择特异性地感染感兴趣靶微生物的亲代噬菌体的步骤；确定所选择的亲代噬菌体的晚期区中的天然序列；注释基因组并标识所选择的亲代噬菌体的合适的晚期基因，其中改变所述合适的晚期基因旨在使所述亲代噬菌体成为繁殖缺陷性的；设计邻接主要晚期基因的用于同源重组的序列并包含密码子优化的报告基因；将设计用于同源重组的序列插入到质粒/载体中；将所述质粒/载体转化到包含编码有功能的合适的晚期基因的质粒的靶微生物中；选择被转化的靶微生物；用所选择的亲代噬菌体感染经转化的微生物，由此允许在所述质粒和噬菌体基因组之间发生同源重组；测定所得的重组噬菌体裂解物的滴度；并进行有限稀释测定以富集和分离重组噬菌体。在亲代噬菌体级分中富集繁殖缺陷性的重组噬菌体级分可以全部地或部分地在容许性靶细胞中进行，所述容许性靶细胞包含反式质粒。一些实施方案包括在首次有限稀释测定后，根据需要进一步重复有限稀释和滴定步骤，直至重组噬菌体代表混合物的可检测级分为止。例如，在一些实施方案中，可以重复有限稀释和滴定步骤直至在分离重组噬菌体的特定克隆之前混合物中至少1/30的噬菌体是重组的。在一些实施方案中，期望1:30的重组体：亲代的比率，产生每96个空斑平均3.2个转导单位(TU)(例如，在96孔板中)。重组体与亲代噬菌体的初始比率可以通过基于如以前在美国申请号15/409,258中所记载的TCID50(组织培养感染剂量50％)进行有限稀释测定来确定。通过泊松分布，1:30比率产生的在96孔板中某处观察到至少一个TU的几率为96％。
一些实施方案包括设计(和任选地制备)需要插入指示基因的用于同源重组的序列。在一些实施方案中，所述同源重组序列被设计为替代晚期基因以使得亲代噬菌体成为繁殖缺陷性的。在一些实施方案中，指示基因的序列包含前面为非翻译区的经密码子优化的报告基因。非翻译区可以包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，插入的基因构建体进一步包含其自己的外源性专用启动子以驱动指示基因的表达。外源性启动子是除噬菌体基因组中任何内源性启动子之外的启动子。当噬菌体产生多顺反子mRNA转录物时，在转录物的第一个基因/顺反子上游仅需要单一启动子。常规的重组构建体仅使用内源性噬菌体启动子来驱动插入的基因。在报告基因和核糖体结合位点的上游添加额外的启动子可以通过充当用于转录的第二起始位点来增加基因表达。
有大量已知的方法和市售产品用于制备质粒。例如，可以组合使用PCR、定点诱变、限制性消化、连接、克隆和其他技术来制备质粒。合成质粒还可以商业订购(例如，GeneWiz)。也可以采用粘粒，或可以使用CRISPR/CAS9系统来选择性地编辑噬菌体基因组。制备指示噬菌体的方法的一些实施方案包括设计可以容易地与起始的噬菌体基因组重组以生成重组基因组的质粒。在设计质粒中，一些实施方案包括添加密码子优化的报告基因，诸如萤光素酶基因。一些实施方案进一步包括向非翻译区上游添加元件。例如，可以将上游非翻译区加入到编码
Figure BDA0003520044270000291
报告基因的起始密码子的序列之前。非翻译区可以包括启动子，诸如T4、T4-样、T7、T7-样、ViI或ViI-样启动子。非翻译区还可以包括核糖体进入/结合位点(RBS)，也称作带有细菌系统的“Shine-Dalgarno序列”。这些元件中的任一个或两个，或其他非翻译元件，可以嵌在由包含与噬菌体基因组其余部分具有大致相同GC含量的随机序列组成的短上游非翻译区内。随机区应当不包括ATG序列，因为ATG序列将充当起始密码子。
如本文件中其他地方讨论的那样，根据本发明的实施方案分离和繁殖重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体可以仅在表达被改变以使繁殖缺陷性的指示噬菌体成为繁殖缺陷性的一个或多个基因的“容许性”宿主微生物中进行。此类“容许性”微生物，例如，细菌，可以通过用表达噬菌体繁殖所需的基因的质粒转化它们而被改造。图2图示了用表达噬菌体繁殖所需的基因的质粒转化并且还用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染的此类“容许性”微生物的细胞。选择含有噬菌体繁殖所需的基因的质粒从而与用于将指示基因插入到噬菌体基因组中的同源重组质粒相容。例如，可以选择表达噬菌体繁殖所需的基因的质粒和同源重组质粒使得它们包含不同的抗生素抗性标志物，使得两个质粒都可以同时保持在宿主生物体内。在另一个实施例中，选择表达噬菌体繁殖所需的基因的质粒和同源重组质粒以包含相容的复制起始点，以便不会彼此干扰。相容的质粒的实例是使用ori复制起始点的pUC衍生的质粒和使用RCR(滚环式复制)复制起始点的pBAV1k-T5-GFP质粒。由于繁殖缺陷性的噬菌体需要宿主微生物的工程化“容许性”菌株进行复制，因此制备重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体的方法的一些实施方案包括一个或多个生成能够表达繁殖缺陷性的噬菌体中的被改变以使其成为繁殖缺陷性的基因的产物的靶微生物的工程化菌株的步骤。在一些实施方案中，生成靶微生物的工程化菌株涉及用编码和能够表达重组的繁殖缺陷性的噬菌体中改变的一个或多个基因的质粒转化靶微生物。备选地，所需的基因可以通过各种其他方法被整合到靶微生物基因组中，诸如通过转座子、同源重组、定点重组/整合或其他方法。
图27示意性地图示了从亲代噬菌体和由同源重组得到的繁殖缺陷性的指示噬菌体的混合物中分离繁殖缺陷性的重组噬菌体的过程的实例。在第一步402，用亲代噬菌体感染用同源重组质粒和表达所需的噬菌体基因的质粒转化的容许性宿主微生物，得到含有亲代和繁殖缺陷性的重组指示噬菌体的混合物的子代噬菌体434，其中亲代噬菌体与繁殖缺陷性的指示噬菌体的比率非常低。得到的噬菌体混合物稀释404到96孔板406中，得到平均5个重组转导单位(TU)/板(9.3PFU/孔)。如下所述，然后测定96孔板的报告基因活性以鉴定含有繁殖缺陷性的指示噬菌体的孔436，与含有亲代噬菌体的孔440比较。将含有表达所需噬菌体基因的质粒的容许性宿主微生物438加入到每孔中(408)；例如，当宿主微生物是细菌时，每孔可以包含约50μL的浑浊细菌培养物。这使得繁殖缺陷性的指示噬菌体复制并产生可溶性报告基因产物442。在孵育步骤410(例如，在37℃孵育5小时)后，可以筛选孔中报告基因产物442的存在。任何阳性孔都有可能接种了单个繁殖缺陷性的指示噬菌体，在此阶段，混合物可以包含大致10个亲代噬菌体:1个重组体的比率，超过原始比率的富集。如果需要(例如，如果重组体:总体的比率低于1:30)，来自此富集培养物的子代412可以接受一次或多次额外的有限稀释测定414以增加该比率并测定重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体转导单位的实际浓度。例如，如果该比率为1:384的重组体:PFU(其中PFU通过在容许性细菌上进行的空斑测定来确定)，则每个96孔板416约5个重组TU以及1920个污染的全部噬菌体(5x384＝1920)可以由之前的阳性孔等分414，得到第二个稀释测定板420的每孔20个主要为亲代噬菌体的大致接种量(1920PFU/96孔＝20PFU/孔)。任何阳性萤光素酶孔都有可能接种了单个重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体以及19个亲代噬菌体。这些孔可以分析萤光素酶442的存在。
在加入宿主微生物并孵育418后，可溶性报告基因产物和噬菌体以大致20：1存在420。此比率可以通过对重组体的TU50滴定，和对总PFU的空斑测定验证，TU50滴定是一种基于组织培养感染剂量50(TCID50)测定的有限稀释测定，对报告基因产物活性而非细胞杀死评分。最后，可以进行空斑测定422以筛选表达报告基因产物的重组体446。可以单独挑出小数目的单个(例如，n＝48)空斑，并在第三个多孔板426中筛选萤光素酶活性436。在一些实施方案中，这种方式应当确保筛选足够的空斑，使得基于重组体与总噬菌体的已知比率大约三个指示噬菌体存在于被筛选的空斑的混合物中。可以从平板中移除一个空斑到96板424的每个孔中，并进行报告基因产物测定426以确定哪个孔包含表现出报告基因产物活性的噬菌体442。证明这样的活性的孔428代表纯的重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体434，而没有这样的活性的孔430代表纯的亲代噬菌体432。然后可以将单个空斑悬浮在缓冲液(例如，100μL缓冲液)或培养基中，并将等分试样(例如，约5μL)加入到包含宿主微生物培养物的孔中，并在孵育后测定(例如，在37℃约45分钟至1小时)。期望阳性孔含有繁殖缺陷性的指示噬菌体的纯培养物。某些实施方案可以包括附加轮次的空斑纯化。因此，如图27所示，由设计用于与亲代噬菌体基因组重组的质粒的同源重组产生的繁殖缺陷性的指示噬菌体可以从包含非常小百分比(例如，0.005％)的指示噬菌体的混合物中分离。
在分离后，可以进行大规模生产以获得适宜用于根据本发明的实施方案的检测方法中的高滴度繁殖缺陷性的指示噬菌体母液。繁殖缺陷性的指示噬菌体母液的生产和制备可以包括从在细菌培养物中生产繁殖缺陷性指示噬菌体期间产生的任何游离的检测部分纯化繁殖缺陷性指示噬菌体。可以采用标准的噬菌体纯化技术来纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案，诸如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱和透析或衍生的技术(诸如Amicon牌浓缩仪–Millipore，Inc.)。作为纯化程序的结果，繁殖缺陷性的指示噬菌体母液可以基本上不含在生产期间产生的任何报告基因产物。移除繁殖缺陷性的指示噬菌体母液中存在的残留的指示基因产物可以很大程度上减少当繁殖缺陷性的指示噬菌体用于检测样品中的感兴趣微生物时观察到的背景信号。
使用繁殖缺陷性的指示噬菌体检测微生物的方法
如本文所述，在某些实施方案中，本发明可以包括使用繁殖缺陷性的指示噬菌体来检测微生物的方法。根据本发明的实施方案的使用繁殖缺陷性的指示噬菌体检测微生物的方法可以以各种各样的方式实现。
在一个实施方案中，本发明可以包括检测样品中的感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：将样品与感染所述感兴趣微生物的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示基因，使得在感染所述感兴趣微生物后指示基因的表达导致产生指示基因产物；以及检测所述指示基因产物，其中阳性检测(即，检测到指示基因产物的存在、量或水平)表示所述感兴趣微生物存在于样品中。在再一个实施方案中，本发明可以包括检测样品中的感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：将样品与感染所述感兴趣微生物的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示基因，使得在感染所述感兴趣微生物后指示基因的表达导致产生可溶性指示基因产物；以及检测所述可溶性指示基因产物，其中阳性检测(即，检测到可溶性指示基因产物的存在、量或水平)表示所述感兴趣微生物存在于样品中。在再一个实施方案中，本发明可以包括检测样品中的感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：将样品与感染所述感兴趣微生物的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示基因，使得在感染所述感兴趣微生物后指示基因的表达导致产生可溶性指示基因产物；以及检测所述可溶性指示基因产物，其中阳性检测(即，检测到可溶性指示基因产物蛋白的存在、量或水平)表示所述感兴趣微生物存在于样品中。在上述实施方案的变化形式中，所述感兴趣微生物可以是感兴趣细菌。例如，在示例性实施方案中，本发明可以包括检测样品中的感兴趣细菌的方法，包括以下步骤：将样品与感染所述感兴趣细菌的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示基因，使得在感染所述感兴趣细菌后指示基因的表达导致产生可溶性指示基因产物；以及检测所述指示基因产物，其中指示基因产物的阳性检测表示所述感兴趣细菌存在于样品中。
在某些实施方案中，可以执行使用繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的方法(此类方法可以称作“测定”)以利用一般概念，所述一般概念可以被修改以适应不同的样品类型或尺寸以及测定形式。采用本发明的繁殖缺陷性的指示噬菌体(即，指示噬菌体)的实施方案可以允许快速检测特定的细菌菌株，取决于样品类型、样品尺寸和测定形式，总测定时间低于1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5或26.0小时。例如，取决于噬菌体菌株和在测定中待检测的细菌菌株、待测试的样品的类型和尺寸、靶标活力所需的条件、物理/化学环境的复杂性以及“内源性”非靶细菌污染物的浓度，所需的时间量可以短一些或长一些。
图28显示了根据本发明的实施方案使用产生可溶性萤光素酶的繁殖缺陷性的指示噬菌体的策略。在此方法中，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以被改造以表达可溶性萤光素酶。萤光素酶的表达由病毒衣壳启动子(例如，噬菌体T7或T4晚期启动子)驱动，得到高表达。在图28中所示的实施方案中，将包含待检测的微生物502的样品500的至少一部分置于旋转柱滤器中并离心以去除过多的液体，加入适宜复数的被基因改造以表达可溶性萤光素酶503的繁殖缺陷性的指示噬菌体504。感染的细胞可以孵育足以使感染发生的时间(例如，在37℃ 30-240分钟)。在一些实施方案中，可以发生细胞裂解。在其他实施方案中，细胞可以不裂解。然后可以收集裂解液中的繁殖缺陷性的指示噬菌体504加游离的萤光素酶503，例如，通过离心收集，并使用光度计518定量滤液中的萤光素酶水平。备选地，可以采用高通量法，其中将样品施加到96孔滤板，并且在执行上面列举的所有操作后，可以直接测定原始96孔滤板中的萤光素酶，不需要最终的离心步骤。或可以采用其他简化的或自备的形式，如前所述。在用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染后，此类方法可以不需要离心或对任何组分的其他分离。在一些实施方案中，可以使用具有2、3、4或更多个室的单个装置来执行测定的感染和孵育步骤，接着利用适宜的装置检测，例如，利用手持式光度计检测发光。
图29描绘了根据本发明的实施方案使用繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的滤板测定。简言之，包含感兴趣微生物618的样品616可以加入至多孔滤板604的孔602并离心606，通过从样品去除液体而浓缩样品。将繁殖缺陷性的指示噬菌体620加入至孔中并与额外加入的培养基孵育持续以足以吸附的时间608，接着感染感兴趣的靶微生物并推进噬菌体生命周期610(例如，～45分钟-2小时)以使繁殖缺陷性的指示噬菌体实现晚期基因生产，这通常在感染周期的晚期发生(但繁殖缺陷性的指示噬菌体不会产生任何成熟的病毒粒子)。最后，加入萤光素酶底物并使其与存在的任何萤光素酶624反应。在光度计614中测量产生的发射，检测萤光素酶活性626。
在某些实施方案中，可以在俘获表面上或附近在不浓缩感兴趣微生物的条件下执行所述测定。图30图示了根据本发明的实施方案使用繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的“无浓缩测定”。将繁殖缺陷性的指示噬菌体714的等分试样分配到多孔板704的单个孔702中，然后加入含有感兴趣微生物712的测试样品等分试样并孵育706(例如，在37℃45分钟)足以使噬菌体生成可溶性指示物716(例如，萤光素酶)的时间段。然后可以测定710含有可溶性指示物和繁殖缺陷性的指示噬菌体的板孔708以测量板718上的指示物活性(例如，萤光素酶测定)。在此实施方案中，测试样品不浓缩(例如，通过离心)而是简单地直接与繁殖缺陷性的指示噬菌体孵育一定的时间段，随后测定萤光素酶活性。
在一些实施方案中，在测试前样品可以通过在促进生长的条件下孵育进行富集。在这样的实施方案中，取决于样品类型和尺寸，富集期可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个小时或更长。
在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体包含可检测的指示部分，并且单个致病细胞(例如，细菌)的感染可以通过经由所述指示部分生成的放大信号检测。因此所述方法可以包括检测在繁殖缺陷性的指示噬菌体感染期间产生的指示部分，其中检测到指示物表明感兴趣微生物(诸如感兴趣细菌)存在于样品中。在示例性实施方案中，本发明可以包括检测样品中的感兴趣细菌的方法，包括以下步骤：将样品与感染感兴趣细菌的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育，其中繁殖缺陷性的指示噬菌体包含被插入到噬菌体的晚期基因区中的指示基因，使得在感兴趣细菌的感染后指示基因的表达导致产生可溶性指示基因产物；以及检测所述指示基因产物，其中所述指示基因产物的阳性检测(即，对存在、水平或量的检测)表示所述感兴趣细菌存在于样品中。在一些实施方案中，检测到的指示部分的量对应于样品中存在的感兴趣细菌的量。
如本文中更详细描述的那样，根据本发明的实施方案的方法和系统可以利用一定范围浓度的繁殖缺陷性的指示噬菌体来感染样品中可能存在的感兴趣微生物(诸如细菌)。在一些实施方案中，将繁殖缺陷性的指示噬菌体以足以快速地发现、结合和感染以非常低的数目(诸如单个细胞)存在于样品中的靶微生物(诸如细菌)的浓度加入到样品中。在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体的浓度可以足以在小于1小时内发现、结合和感染靶细菌。在其他实施方案中，这些事件可以在将繁殖缺陷性的指示噬菌体加入到样品后小于2小时或小于3小时内发生。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的繁殖缺陷性的指示噬菌体浓度大于1x105PFU/mL，大于1x106PFU/mL，大于1x107PFU/mL，或大于1x108PFU/mL。
在检测样品中的感兴趣微生物的方法的一些实施方案中，在将样品与感染感兴趣微生物的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育的步骤前，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以进行纯化以便不含可能在传染源母液的生产时产生的任何残留的指示蛋白。因此，在某些实施方案中，所述方法可以包括纯化繁殖缺陷性的指示噬菌体的步骤。重组的繁殖缺陷性的指示噬菌体可以通过各种方法纯化，例如，在与样品一起孵育前通过使用氯化铯等密度梯度离心纯化。纯化可以具有去除不具有DNA的噬菌体(即，空噬菌体或“菌蜕噬菌体(ghosts)”)的附加益处。
在本发明的方法的一些实施方案中，可以在不从样品对微生物进行任何分离或纯化的条件下检测所述微生物。例如，在某些实施方案中，含有一个或几个感兴趣微生物的样品可以直接施加到测定容器诸如离心柱、微量滴定孔或滤器，并且测定在该测定容器中进行。在本文中公开了此类测定的各种实施方案。
在所述方法的许多实施方案中，使用多孔板来进行测定。例如，可以将测试样品的等分试样直接分配到多孔板的孔中，将繁殖缺陷性的指示噬菌体加入到孔中，并且在足以进行感染的一段时间后，可以加入裂解缓冲液以及指示部分的底物(例如，萤光素酶指示物的萤光素酶底物)并测定以检测指示物信号。所述方法的一些实施方案可以在滤板上进行。所述方法的一些实施方案可以在用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染前浓缩或不浓缩样品的条件下进行。
对平板(或其中可以进行检测的任何其他容器)的选择可能影响检测步骤。例如，一些平板可以包括彩色的或白色背景，这可能影响对光发射的检测。一般来说，白色平板具有较高的灵敏度，但也产生较高的背景信号。其他颜色的平板可能产生较低的背景信号，但也具有稍低的灵敏度。另外，背景信号的一个原因是光从一个孔泄露到另一个邻近孔。有一些平板具有白色孔，但平板的其余部分是黑色的。这允许孔内有高信号，但防止了孔与孔之间的光泄露，因此可以减少背景。因此，对平板或其他测定容器的选择可能影响测定的灵敏度和背景信号。
根据本发明的实施方案的方法可以包括各种其他步骤以增加灵敏度。例如，如本文更详细描述的那样，方法可以包括：在加入繁殖缺陷性的指示噬菌体后但在孵育前，洗涤俘获的和感染的微生物(诸如细菌)的步骤，以去除过多的繁殖缺陷性的指示噬菌体和/或萤光素酶或污染繁殖缺陷性的指示噬菌体制剂的其他报告蛋白。
根据本发明的实施方案的方法可以包括一个或多个与样品准备相关的步骤，这些步骤可以称作“取样”或“取样步骤”。在一些实施方案中，样品可以在根据本发明的实施方案的方法中直接使用，不需准备、浓缩或稀释。例如，液体样品可以直接测定。在其他实施方案中，样品可以在溶液中稀释或悬浮，所述溶液可以包括，但不限于，缓冲溶液或细菌培养基。为固体或半固体的样品可以通过将固体切碎、混合或浸渍在液体中而悬浮在液体中。在一些实施方案中，样品应该保持在促进繁殖缺陷性的指示噬菌体附着于感兴趣微生物(诸如感兴趣细菌)的pH范围内。在一些实施方案中，优选的pH范围可以是适合于繁殖缺陷性的指示噬菌体附着于细菌细胞的范围。样品应当还包含适宜浓度的二价和单价阳离子，包括但不限于Na+、Mg2+和K+。
在整个检测测定中，优选样品保持在维持样品中潜在存在的任何感兴趣微生物的活力的温度。在其中繁殖缺陷性的指示噬菌体附着于细菌细胞的步骤期间，优选将样品保持在促进复制缺陷的指示噬菌体的活性的温度。这样的温度为至少约25℃且不超过约45℃。在一些实施方案中，样品保持在约37℃。在一些实施方案中，样品在繁殖缺陷性的指示噬菌体结合或附着于感兴趣微生物期间接受轻柔混合或振摇。
可以使用各种各样的方式进行取样。在一些实施方案中，样品(例如，食品样品)首先被液化，并将固相支持物(例如，固相支持物或珠子)浸在液体样品中。在一些实施方案中，在取样前，首先将固相支持物浸泡在试管中的培养基中。在一些实施方案中，在取样前固相支持物是干燥的。在一些实施方案中，液体样品首先培养一段时间(“培养富集”)，例如，小于24小时，小于12小时，小于9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少或2小时或更少的富集期。在其他实施方案中，样品可以在将感兴趣微生物俘获在固相支持物上后进行富集。在一些实施方案中，带有微生物的固相支持物可以在生长培养基中孵育以使微生物的数量扩增。此步骤称作“孵育富集”。在此类实施方案中，取决于样品类型和尺寸，富集期可以为1、2、3、4、5、6、7或多至8小时或更长。
在一些实施方案中，对感兴趣微生物的检测可以在不需要培养样品作为增加微生物群的方式的条件下完成。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间小于26.0、25.0、24.0、23.0、22.0、21.0、20.0、19.0、18.0、17.0、16.0小时、15.0小时、14.0小时、13.0小时、12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或小于30分钟。最小化获得结果的时间在各种应用中是至关重要的，例如，检测食品和环境的病原体时。
根据本发明的实施方案的方法可以包括旨在使繁殖缺陷性的指示噬菌体感染感兴趣微生物的步骤。例如，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以通过已知方法与感兴趣微生物接触，这些方法中的一些记载在本文中。在接触感兴趣微生物后，繁殖缺陷性的指示噬菌体感染感兴趣微生物并表达指示基因。感染时间，即，样品首次接触繁殖缺陷性的指示噬菌体时的时间点和起始检测步骤(例如，将酶促指示部分的底物加入至与繁殖缺陷性的指示噬菌体接触的样品)时的时间点之间的时间段可以发生变化，这取决于繁殖缺陷性的指示噬菌体的类型和样品中感兴趣微生物的浓度。使用其中感兴趣微生物(诸如细菌)被俘获在固相支持物上的仪器，可以显著地减少感染所需的时间，例如，感染时间可以为1小时或更少，而在标准测定中(其中不使用固相支持物来俘获细菌)，感染一般至少4小时。在某些实施方案中，本文公开的方法的感染时间为小于6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或小于30分钟。在一些实施方案中，感染时间为约1小时、约2小时或约3小时。
根据本发明的实施方案的方法可以包括与检测由指示物产生的信号相关的一个或多个步骤。通过表达指示基因产生的指示物可以使用已知方法检测。例如，一个或多个信号产生组分可以与所述指示物反应以生成可检测信号。在一些实施方案中，所述指示物可以是生物发光化合物。如果指示物是酶，则通过使所述酶与一个或多个底物反应或附加的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得对可检测信号的放大。在另一种信号产生系统中，所述指示物可以是发荧光化合物，其中不需要对指示物的酶促操作来产生可检测信号。发荧光的分子包括，例如，荧光素和罗丹明以及它们的衍生物和类似物，它们适合用作此类系统中的指示物。还在另一个实施方案中，指示部分可以是辅因子，则通过使所述辅因子与酶和一个或多个底物反应或附加的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得对可检测信号的放大。在一些实施方案中，可检测信号是比色的。需注意到对特定指示物的选择对于本发明不是至关重要的，但所述指示物要能够本身生成可检测信号，或是仪器可检测到的，或结合一种或多种附加的信号产生组分(诸如酶/底物信号产生系统)可检测到。在一些实施方案中，检测步骤将要求加入指示酶的底物进行作用。可以以各种各样的方式加入底物。在一些实施方案中，指示物(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更长，并且在各种时间点的检测可以期望用于优化灵敏度。在一些实施方案中，可以初始地获取光度计读数并且以3分钟、或5分钟、或10分钟或15分钟的间隔获取读数直至反应结束。
本发明的方法的一些实施方案包括与检测指示物的信号相关的一个或多个步骤，所述步骤可以称作“检测”。检测指示基因产物可以包括检测其酶促活性。检测指示基因产物可以包括检测光发射或检测光密度。在一些实施方案中，其中底物与测试样品混合的仪器的室或容器是透明的，使得由感染和后续的与底物的孵育得到的任何光学信号是可检测到的，无需将样品从仪器的室或容器移出。在此情况下，可以通过仪器的室的壁或容器的壁检测信号。在一些实施方案中，包含反应的样品的仪器或容器被插入到用于检测产生的该信号的设备中。在其他实施方案中，检测设备用来扫描包含反应的样品的仪器。
在一些实施方案中，可以使用光度计来检测指示物(例如，萤光素酶)与底物的反应。对RLU的检测可以利用光度计来实现，或还可以使用其他机器或装置，一些实例为来自
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(Madison，WI)的
Figure BDA0003520044270000402
20/20和
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在一些实施方案中，分光光度计、CCD照相机或CMOS照相机可以检测颜色变化和其他光发射。绝对RLU对检测是重要的，但信号背景比也需要很高(例如，>2.0，>2.5，或>3.0)以便可靠地检测单个细胞或低数目的细胞。背景信号可以通过使用如上所述的相同程序测量不包含微生物的对照样品来获得。在一些实施方案中，对来自报告基因或指示基因的信号的检测可以包括，例如，使用采用光电二极管或PMT(光电倍增管)技术的设备。在一些实施方案中，可以采用手持式光度计来检测信号。合适的PMT手持式光度计可获自3M(Maplewood，MN)，
Figure BDA0003520044270000411
(Seattle，WA)，和CHARM
Figure BDA0003520044270000412
(Lawrence，MA)。合适的光电二极管手持式光度计可获自
Figure BDA0003520044270000413
(Camarillo，CA)和
Figure BDA0003520044270000414
(Lansing，MI)。与常规的光度计(诸如
Figure BDA0003520044270000416
或
Figure BDA0003520044270000415
20/20)相比，对于同一个样品，这些手持式光度计典型地产生低得多的读数，但多个实验表明产生的信号足以被这些手持式光度计检测到。能够使用这些手持式装置来检测微生物还赋予了便利性和灵活性，而使用常规的非手持式检测装置的检测方法经常缺少这样的便利性和灵活性。
在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体被基因改造以包含酶(诸如萤光素酶)的基因，所述酶仅在噬菌体特异性识别并感染的微生物的感染后产生。在一些实施方案中，指示部分在病毒生命周期的晚期表达。在一些实施方案中，如本文所述，所述指示物是可溶性蛋白(例如，可溶性萤光素酶)并且不与限制其拷贝数的噬菌体结构蛋白融合。因此，在利用繁殖缺陷性的指示噬菌体的一些实施方案中，本发明包括检测感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：俘获至少一个感兴趣的样品微生物；将所述至少一个感兴趣微生物与多个繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育；允许感染的时间和可溶性指示部分的表达；以及检测所述指示部分，其中检测到指示部分表明所述感兴趣微生物存在于样品中。
例如，在一些实施方案中，测试样品感兴趣微生物可以通过结合到平板的表面而被俘获，或通过使样品经过细菌滤器(例如，0.45μm孔径的旋转滤器或平板滤器)过滤而被俘获。在一个实施方案中，将繁殖缺陷性的指示噬菌体以最小的体积直接加入到滤器上俘获的样品。在一个实施方案中，后续将在滤器或平板表面上俘获的微生物洗涤一次或多次以去除过量的未结合的繁殖缺陷性的指示噬菌体。在一个实施方案中，可以加入培养基(例如，Luria-Bertani肉汤，在本文中也称LB，缓冲蛋白胨水，在本文中也称BPW，或胰蛋白大豆肉汤或胰蛋白胨大豆肉汤，在本文中也称TSB)用于进一步的孵育时间，以允许编码指示部分的基因足够高水平的表达。在一些实施方案中，与繁殖缺陷性的指示噬菌体的孵育步骤仅需要足够长从而实现编码指示部分的基因的充分表达水平，所述表达水平足以允许从指示部分检测到指定水平的信号(例如，约100-10000RLU/s或约200-5000RLU/s)，或足以允许指定水平的信噪比(例如，1-500、5-200或10-100)。
在一些实施方案中，可以将包含感兴趣微生物的测试样品的等分试样施加到离心柱，并且在用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染和任选的洗涤以去除任何过量的繁殖缺陷性的指示噬菌体后，检测到的可溶性指示物的量将与被感染的感兴趣微生物中繁殖缺陷性的指示噬菌体的量成正比。
然后，可以测量和定量在细菌裂解后释放到周围液体中的可溶性指示物(例如，萤光素酶)。在一个实施方案中，使溶液离心穿过滤器，在加入指示酶的底物(例如，萤光素酶底物)后将收集的滤液在新的容器(例如，在光度计中)中测定。备选地，指示物信号可以在滤器上直接测量。因此，在一个示例性实施方案中，指示物底物(例如，萤光素酶底物)可以与保留在滤器上或结合在平板表面的样品部分孵育。因此，在一些实施方案中，固相支持物是96孔滤板(或规则的96孔板)，并且可以通过将平板直接放置在光度计中检测底物反应。例如，在一个实施方案中，本发明可以包括检测感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：用多个能够在感染后表达萤光素酶的繁殖缺陷性的指示噬菌体感染被俘获在96孔滤板上的感兴趣微生物的细胞；洗掉过量的繁殖缺陷性的指示噬菌体；加入LB肉汤并允许繁殖缺陷性的指示噬菌体表达萤光素酶和裂解感兴趣微生物的时间(例如，30-120分钟，60-120min或80-100min，例如，约90min)；以及通过添加萤光素酶底物并在96孔板中直接测量萤光素酶活性来检测指示物萤光素酶，其中检测到萤光素酶活性表明感兴趣细菌存在于样品中。
在另一个实施方案中，本发明可以包括检测感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：用多个能够在感染后表达萤光素酶的繁殖缺陷性的指示噬菌体感染在96孔板中的液体溶液或悬浮液中的细胞；允许繁殖缺陷性的指示噬菌体表达萤光素酶和裂解感兴趣微生物的时间(例如，30-120分钟，60-120min或80-100min，例如，约90min)；以及通过添加萤光素酶底物并在96孔板中直接测量萤光素酶活性来检测指示物萤光素酶，其中检测到萤光素酶活性表明感兴趣微生物存在于样品中。在这样的实施方案中不需要俘获步骤。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是消耗性的测试样品，诸如蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩LB肉汤、胰蛋白/胰蛋白胨大豆肉汤、蛋白胨水或营养肉汤强化的蔬菜洗涤液。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是在LB肉汤中稀释的细菌。
在一些实施方案中，感兴趣微生物的裂解可以发生在检测步骤之前、期间或之后。在一些实施方案中，感染的未裂解细胞可以在加入萤光素酶底物后可检测到。萤光素酶可以离开细胞和/或萤光素酶底物可以进入细胞，无需完全裂解细胞。因此，对于利用旋转滤器系统的实施方案，其中在光度计仅分析释放到裂解物中的萤光素酶(而不是仍然在完整的细菌内部的萤光素酶)，检测需要进行裂解。然而，对于利用其中样品在溶液或悬浮液中的滤板或96孔板的实施方案，其中在光度计中直接测定充满了完整的和裂解的细胞的原始平板，检测不需要进行裂解。
在一些实施方案中，指示部分(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更多，并且在各个时间点的检测可以期望用于优化灵敏度。例如，在使用96孔滤板作为固相支持物以及萤光素酶用作指示物的实施方案中，可以初始地获取光度计读数并且以10分钟或15分钟的间隔获取读数直至反应结束。
令人惊讶地，被用来感染测试样品的高浓度的繁殖缺陷性的指示噬菌体成功地在非常短的时间框架内实现了对非常低数目的靶微生物的检测。在一些实施方案中，噬菌体与测试样品的孵育仅需足够单个噬菌体生命周期的时间。在一些实施方案中，用于此孵育步骤的繁殖缺陷性的指示噬菌体浓度为大于7x106，8x106，9x106，1.0x107，1.1x107，1.2x107，1.3x107，1.4x107，1.5x107，1.6x107，1.7x107，1.8x107，1.9x107，2.0x107，3.0x107，4.0x107，5.0x107，6.0x107，7.0x107，8.0x107，9.0x107，或1.0x108PFU/mL。
本发明的方法的实施方案可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可以检测样品中存在的≤10个微生物细胞(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9个微生物)。例如，在某些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体对感兴趣细菌高度特异。在一个实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以在其他类型细菌的存在下区分所述感兴趣细菌。在某些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体可以用来检测样品中的特定类型的单一细菌。在某些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体检测样品中的少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个特定的细菌。
被利用用于感染的大数目的噬菌体以前被认为与“自外裂解”相关，它们杀死靶细胞并由此阻止了有用信号的生成。对已制备的繁殖缺陷性的指示噬菌体母液的纯化，如本文所述，可以有助于减轻此问题(例如，通过氯化铯等密度梯度超速离心纯化)。除了去除与繁殖缺陷性的指示噬菌体相关的任何污染的萤光素酶以外，此纯化还可以去除菌蜕粒子(丢失了DNA的粒子)。菌蜕粒子可以通过“自外裂解”裂解细菌细胞，过早地杀死细胞，由此阻止了指示物信号的生成。电子显微镜证明了粗制噬菌体裂解物(即，在氯化铯纯化前)可以具有超过50％的菌蜕噬菌体。这些菌蜕粒子可以通过许多噬菌体粒子刺破细胞膜的作用促进微生物的过早死亡。因此菌蜕粒子可能有助于前面的问题，其中高PFU浓度据报道是不利的。而且，繁殖缺陷性的指示噬菌体的纯化制剂允许所述测定在没有洗涤步骤的条件下进行，使得所述测定能够在没有初始浓缩步骤的条件下进行。然而，要理解的是，本发明的方法的一些实施方案包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，此浓缩步骤允许较短的富集孵育时间。
本发明的方法的一些实施方案可以进一步包括确证测定。在本领域中已知有各种各样的测定用于确认初始结果，通常在较晚的时间点确认。例如，样品可以进行培养(例如，如在实施例中所述的
Figure BDA0003520044270000451
测定)，可以利用PCR来确认微生物DNA的存在，或可以使用其他确证测定来确认初步结果。
在某些实施方案中，除了利用感染源检测以外，本发明的方法组合使用了结合剂(例如，抗体)以从样品纯化和/或浓缩感兴趣微生物，诸如感兴趣细菌。例如，在某些实施方案中，本发明包括检测样品中的感兴趣微生物的方法，包括以下步骤：使用对所述感兴趣微生物特异的俘获抗体从所述样品将所述微生物(诸如感兴趣细菌)俘获在先前的支持物上；将样品与感染感兴趣细菌的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育，其中繁殖缺陷性的指示噬菌体包含被插入到繁殖缺陷性的指示噬菌体的晚期基因区中的指示基因，使得在感兴趣细菌的感染后指示基因的表达导致产生可溶性指示蛋白产物；以及检测所述指示蛋白产物，其中所述指示蛋白产物的阳性检测表示所述感兴趣细菌存在于样品中。
例如，图31描绘了根据本发明的实施方案的使用繁殖缺陷性的指示噬菌体检测感兴趣微生物的杂交免疫噬菌体(HIP)测定。首先将样品施加到包被了微生物特异性抗体的微量滴定板孔802。然后洗涤滴定板以促进感兴趣微生物与俘获抗体的结合804。在足以允许完全俘获的时间后，将包含微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体的溶液加入到每个样品806。与所述噬菌体孵育导致单个或多个噬菌体与俘获的微生物的结合和附着808。最后，孵育样品以促进萤光素酶表达，导致细胞裂解并释放可溶性萤光素酶810。
系统和试剂盒
在一些实施方案中，本发明包括包含用于执行本文公开的方法的组件的系统(例如，自动化系统或试剂盒)。在一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体包含在根据本发明的系统或试剂盒中。本文所述的方法也可以利用这样的繁殖缺陷性的指示噬菌体系统和/或试剂盒。鉴于执行所述方法所需的试剂和材料的量很小，本文所述的一些实施方案特别适合用于自动化和/或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒的每个组件可以包括可从第一场所输送到第二场所的自备装置。
在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的系统或试剂盒。在某些实施方案中，所述系统或试剂盒可以包括用于将样品与对感兴趣微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体孵育的组件，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示部分，以及用于检测所述指示部分的组件。在本发明的系统和试剂盒两者的一些实施方案中，繁殖缺陷性的指示噬菌体能够特异性地感染感兴趣细菌并且包含插入到所述繁殖缺陷性的指示噬菌体的晚期基因区中作为指示部分的指示基因，使得在感染所述微生物期间所述指示基因的表达导致产生可溶性指示蛋白产物。一些系统进一步包括用于将感兴趣微生物俘获在固相支持物上的组件。在某些实施方案中，所述系统或试剂盒可以包括：包括固相支持物(所述固相支持物包括细胞结合组分)的仪器，和信号检测组件，其中所述信号检测组件可以检测用繁殖缺陷性的指示噬菌体感染样品中的微生物所产生的指示基因产物。在一些实施方案中，所述信号检测组件是光度计，其可以是手持式装置。
在其他实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的方法、系统或试剂盒，包括对所述感兴趣微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体组分，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示部分，以及用于检测所述指示部分的组件。在某些实施方案中，所述繁殖缺陷性的指示噬菌体对特定的微生物(诸如细菌)高度特异。在一些实施方案中，所述繁殖缺陷性的指示噬菌体可以在其他类型微生物的存在下区分感兴趣微生物，诸如细菌。在某些实施方案中，系统或试剂盒检测样品中的少至2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个特异的感兴趣微生物。
在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的系统或试剂盒，包括具有第一室的仪器，所述第一室包含繁殖缺陷性的指示噬菌体。所述仪器可以进一步包括包含底物的第二室，和/或包含培养基的第三室。这些室中的一个或多个被密封并通过快动密封与仪器的其他部分分开，破坏快动密封导致室的内容物离开室并与样品混合。备选地，系统或试剂盒可以进一步包括分开的包含底物和/或培养基的容器。
在某些实施方案中，系统和/或试剂盒可以进一步包括用于洗涤俘获的微生物样品的组件。另外地或备选地，系统和/或试剂盒可以进一步包括用于测定指示部分的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。例如，在某些实施方案中，系统或试剂盒可以包括光度计或用于测量萤光素酶活性的其他装置。
在一些实施方案中，系统和/或试剂盒可以包括用于将感兴趣微生物与样品中的其他组分分离的组件。在一些系统和/或试剂盒中，相同的组件可以用于多个步骤。在一些系统和/或试剂盒中，步骤是自动化的或由用户经由计算机输入控制和/或其中液体处理机器人执行至少一个步骤。在计算机化系统中，所述系统可以是完全自动化、半自动化或由用户通过计算机引导(或它们的一些组合)。
因此在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的系统或试剂盒，包括：用于将样品与对感兴趣微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育的组件，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包含指示部分；用于从样品中将感兴趣微生物俘获在固相支持物上的组件；用于洗涤俘获的感兴趣微生物以去除未结合的繁殖缺陷性的指示噬菌体的组件；以及用于检测所述指示部分的组件。在一些实施方案中，同一组件可以用于俘获和/或孵育和/或洗涤的步骤(例如，过滤组件)。一些实施方案另外地包括用于测定样品中感兴趣微生物的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中微生物的量。这样的系统可以包括与上面所述用于快速检测微生物的方法的那些实施方案类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，所述微生物是细菌。在计算机化系统中，所述系统可以是完全自动化、半自动化或由用户通过计算机引导(或它们的一些组合)。在一些实施方案中，所述系统可以包括用于将感兴趣微生物与样品中的其他组分分离的组件。
在一个实施方案中，本公开包括系统或试剂盒，所述系统或试剂盒包括用于检测感兴趣微生物的组件，包括：用于将至少一个微生物与样品中的其他组分分离的组件；用于用多个繁殖缺陷性的指示噬菌体感染至少一个微生物的组件；用于裂解至少一个感染的微生物以释放所述微生物中存在的繁殖缺陷性的指示噬菌体的组件；和用于检测繁殖缺陷性的指示噬菌体或可能以较高的灵敏度检测由所述繁殖缺陷性的指示噬菌体编码和表达的可溶性蛋白的组件，其中检测到繁殖缺陷性的指示噬菌体或繁殖缺陷性的指示噬菌体的可溶性蛋白产物表示所述微生物存在于所述样品中。所述繁殖缺陷性的指示噬菌体可以是携带
Figure BDA0003520044270000481
指示基因的
Figure BDA0003520044270000482
繁殖缺陷性的指示噬菌体。
在其他实施方案中，本公开可以包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的试剂盒，所述系统包括：用于将样品与对感兴趣微生物特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体一起孵育的组件，其中所述繁殖缺陷性的指示噬菌体包括指示部分；用于从样品中将感兴趣微生物俘获在固相支持物上的组件；用于洗涤俘获的感兴趣微生物以去除未结合的繁殖缺陷性的指示噬菌体的组件；以及用于检测所述指示部分的组件。在一些实施方案中，同一组件可以用于俘获和/或孵育和/或洗涤的步骤。一些实施方案另外地包括用于测定样品中感兴趣微生物的量的组件，其中检测到的指示部分的量对应于样品中感兴趣微生物的量。这样的试剂盒可以包括与上面所述用于快速检测微生物的方法的那些实施方案类似的各种实施方案和子实施方案。在一个实施方案中，所述微生物是细菌。在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于将感兴趣微生物与样品中的其他组分分离的组件。
本公开的这些系统和试剂盒包括各种组件。如本文所用，术语“组件”具有广义的定义，并且包括适合用于执行所述方法的任何合适的仪器或仪器的集合体。所述组件不一定一体地连接或相对于彼此以任何特定的方式定位。本公开包括所述组件相对于彼此的任何合适的排列方式。例如，所述组件不一定在同一空间内。但在一些实施方案中，所述组件彼此连接在一个集成单元内。在一些实施方案中，相同的组件可以执行多种功能。
计算机系统和计算机可读介质
在某些实施方案中，本公开可以包括系统。所述系统可以包括本公开的至少一些组合物。此外，所述系统可以包括用于执行所述方法的至少一些组件。在某些实施方案中，所述系统被配置为试剂盒。因此，在某些实施方案中，本公开可以包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的系统。所述系统可以包括本公开的至少一些组合物。此外，所述系统可以包括用于执行所述方法的至少一些组件。在某些实施方案中，所述系统被配置为试剂盒。因此，在某些实施方案中，本公开可以包括用于快速检测样品中的感兴趣微生物的系统，包括如上所述的仪器。例如，所述仪器可以包括第一室，所述第一室包含具有插入到噬菌体基因组中的基因构建体的重组噬菌体，其中所述构建体包含启动子和指示基因；其中固相支持物包括细胞结合组件。在一些实施方案中，所述系统还包括手持式检测装置。
本技术中所述的系统或任一个其组件，可以以计算机系统的形式体现。计算机系统的典型实例包括通用计算机、编程微处理器、微控制器、外围集成电路元件和能够实施构成本技术的方法的步骤的其他装置或装置配置。
计算机系统可以包括计算机、输入装置、显示单元和/或互联网。计算机可以进一步包括微处理器。所述微处理器可以连接到通信总线。计算机还可以包括存储器。存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机系统可以进一步包括存储装置。存储装置可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器(诸如软盘驱动器、光盘驱动器等)。存储装置还可以是用于加载计算机程序或其他指令到计算机系统中的其他类似设备。计算机系统还可以包括通信单元。所述通信单元允许计算机通过I/O接口连接到其他数据库和互联网。所述通信单元允许数据传输到其他数据库，以及从其他数据库接收数据。所述通信单元可以包括调制解调器、以太网卡或使计算机系统能够连接到数据库和网络(诸如LAN、MAN、WAN和互联网)的任何类似装置。因此计算机系统可以帮助用户通过输入装置输入，通过I/O接口可访问所述系统。
计算装置典型地包括操作系统，所述操作系统提供用于综合管理和操作该计算装置的可执行程序指令，并且典型地包括存储指令的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，当服务器的处理器执行所述指令时允许该计算装置执行其预期功能。所述操作系统和所述计算装置的通用功能的合适实现形式是已知的或可商购的，并且很容易由本领域普通技术人员实施，特别是按照本文的公开内容。
计算机系统执行存储在一个或多个存储元件中的一系列指令，以便处理输入数据。所述存储元件还可以根据需要保持数据或其他信息。所述存储元件可以是处理机中存在的信息源或物理存储元件的形式。
环境可以包括如上面所述的各种各样的数据存储和其他存储器和存储介质。这些可以驻留在各种位置，诸如一个或多个计算机局域的存储介质上(和/或驻留在一个或多个计算机中的存储介质上)或远程来自网络中的任一个或全部计算机。在特定组的实施方案中，信息可以驻留在本领域技术人员熟悉的存储区域网络(“SAN”)中。类似地，可以根据情况局域地和/或远程地存储用于执行赋予计算机、服务器或其他网络设备的功能的任何必要文件。在系统包括计算装置的情况下，每个这样的装置可以包括可以通过总线电连接的硬件元件，所述元件包括：例如，至少一个中央处理单元(CPU)，至少一个输入装置(例如，鼠标，键盘，控制器，触摸屏，或小键盘)，以及至少一个输出装置(例如，显示装置，打印机或话筒)。这样的系统还可以包括多一个或多个存储装置，诸如硬盘驱动器、光存储装置和固态存储装置诸如随机存取存储器("RAM")或只读存储器("ROM")、以及可移动介质装置、存储卡、闪卡等。
此类装置还可以包括如上所述的计算机可读存储介质读出器、通信装置(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外线通信装置等)和工作存储器。计算机可读存储介质读出器可以与计算机可读存储介质连接，或配置成接收计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质表现为远程、局域、固定和/或可移动的存储装置以及用于暂时地和/或更永久地容纳、存储、传输和检索计算机可读信息的存储介质。所述系统和各种装置还典型地包括许多软件应用、模块、服务或位于至少一个工作存储装置内的其他元件，包括操作系统和应用程序，诸如客户端应用或网络浏览器。应当理解的是备选的实施方案可以与上面所述的那些具有大量的变化。例如，也可以使用定制硬件和/或特定的元件可以以硬件、软件(包括可移植软件，诸如小程序)或两者来实现。此外，可以采用与其他计算装置诸如网络输入/输出装置的连接。
用于包含代码或一部分代码的非瞬态存储介质和计算机可读介质可以包括本领域中已知或使用的任何适宜的介质，包括存储介质和通讯介质，诸如但不限于在任何方法或技术中实现的用于存储和/或传输信息(诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的易失性和非易失性、可移动和不可移动的介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其他存储技术、CD-ROM、数字多用盘(DVD)或其他光学存储器、磁盒、磁带、磁盘存储器或其他磁存储装置、或可以用来存储期望信息并可以被系统装置访问的任何其他介质。基于本公开和本文提供的教导，本领域普通技术人员将会理解用于实施各种实施方案的其他方式和/或方法。
计算机可读介质可以包括，但不限于，能够提供带有计算机可读指令的处理器的电子、光学、磁、或其他存储装置。其他实例包括，但不限于：软盘，CD-ROM，DVD，磁盘，内存条，ROM，RAM，SRAM，DRAM，内容可寻址存储器("CAM")，DDR，闪存存储器诸如NAND闪存或NOR闪存，ASIC，配置的处理器，光存储器，磁带或其他磁存储器，或计算机处理器可以从中读取指令的任何其他介质。在一个实施方案中，计算装置可以包括单一类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)。在其他实施方案中，计算装置可以包括两种或多种类型的计算机可读介质诸如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和缓存(cache)。计算装置可以与一个或多个外部计算机可读介质诸如外部硬盘驱动器或外部DVD或蓝光驱动器(Blu-Raydrive)通信。
如上所述，所述实施方案包括被配置成执行计算机可执行程序指令和/或访问存储器中存储的信息的处理器。所述指令可以包括由编译程序和/或解释程序从以任何合适的计算机编程语言编写的代码生成的处理器专用指令，所述计算机编程语言包括：例如，C，C++，C#，Visual Basic，Java，Python，Perl，JavaScript，和ActionScript(Adobe Systems，Mountain View，Calif.)。在实施方案中，计算装置包括单一处理器。在其他实施方案中，所述装置包括两个或更多个处理器。此类处理器可以包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。此类处理器可以进一步包括可编程电子器件诸如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑器件(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电子可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)或其他类似器件。
计算装置包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置用于经由有线或无线通信链路通信。例如，网络接口可以允许经由以太网、IEEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外线等在网络中通信。作为另一实例，网络接口可以允许在网络诸如CDMA、GSM、UMTS或其他蜂窝通信网络中通信。在一些实施方案中，网络接口可以允许与另一装置点对点连接，诸如经由通用串行总线(USB)、1394火线、串联或并联或类似的接口连接。合适的计算装置的一些实施方案可以包括两个或更多个网络接口用于在一个或多个网络中通信。在一些实施方案中，计算装置可以包括数据存储器，另外包括网络接口或代替网络接口。
合适的计算装置的一些实施方案可以包括一些外部或内部装置或与这些外部或内部装置通信，所述外部或内部装置诸如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、扬声器、一个或多个麦克风或任何其他输入或输出装置。例如，计算装置可以与各种用户接口装置和显示器通信。显示器可以使用任何合适的技术，包括，但不限于：LCD，LED，CRT等。
由计算机系统执行的一组指令可以包括指示处理机执行特定任务(诸如构成本技术的方法的步骤)的各种命令。该组指令可以为软件程序的形式。此外，软件可以是以下形式：独立程序的集合体，带有大型程序的程序模块或程序模块的一部分，如本技术中的那些。软件还可以包括面向对象编程形式的模块化编程。处理机对输入数据的处理可以响应于用户命令、先前处理的结果或由另一处理机提出的请求。
尽管本公开已经参照某些实施方案进行了公开，但在不背离本公开的范围和精神的情况下有可能对所述的实施方案作出大量的修改、改动和改变，本公开的范围和精神由附带的权利要求所限定。因此，意在本公开不限于所述的实施方案，而是本公开具有由下列权利要求的语言及其等效形式所限定的全部范围。
实施例
下面的实施例描述了在缩短的获得结果的时间内对小数量细胞、甚至是单个细菌的检测，且意在举例说明而非限制本公开。
实施例1.由对大肠杆菌O157:H7血清型特异的噬菌体建立和分离繁殖缺陷性的指示噬菌体
通过使用如图3中所示的同源重组从对大肠杆菌O157:H7血清型特异的亲代噬菌体构建对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体。为了生成繁殖缺陷性的指示噬菌体，用
Figure BDA0003520044270000531
编码序列替代亲代噬菌体的gp22前头支架蛋白的编码序列。用包含
Figure BDA0003520044270000532
基因(其侧翼为匹配在gp22侧翼的细菌基因组序列)的同源重组质粒(图3中的HR质粒)和包含gp22表达盒的质粒(图3中的pBAV.gp22)转化大肠杆菌O157:H7，两个质粒各自进行单独的抗生素选择以保证转化的细菌包含两种质粒。这些双重转化的细菌用亲代噬菌体感染以允许与HR质粒的同源重组，使噬菌体的gp22拷贝缺失，然后缺失的部分由编码gp22的质粒反式提供。在同源重组后，使用一系列滴定和富集步骤以分离表达
Figure BDA0003520044270000533
的特异性重组噬菌体。进行大规模生产以获得适宜用于检测测定的繁殖缺陷性的指示噬菌体的高效价母液。由于繁殖缺陷性的指示噬菌体(称为CBA120Δgp22 NanoLuc)不能在野生型大肠杆菌O157:H7中繁殖，因此在用高拷贝基于pUC的表达gp22前头支架蛋白的质粒转化的工程化大肠杆菌O157:H7株(“容许性”大肠杆菌O157:H7株)中进行繁殖，如图5中所示。如图6中显示的生长曲线所示，繁殖缺陷性的指示噬菌体在容许性大肠杆菌O157:H7株中成功地生长。使用氯化铯等密度梯度离心将噬菌体粒子与污染的萤光素酶蛋白分离以减少背景。
实施例2.在检测测定中测试对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体
使用对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体CBA120Δgp22NanoLuc的策略显示在图7中。在感染大肠杆菌O157:H7后，繁殖缺陷性的指示噬菌体产生可溶性萤光素酶。由于缺少了gp22蛋白，繁殖缺陷性的指示噬菌体不能形成噬菌体头部。繁殖缺陷性的指示噬菌体不产生有活力的子代噬菌体。
为了评估CBA120Δgp22 NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的活性，将其检测活性与CBA120 NanoLuc的活性比较，CBA120 NanoLuc是对大肠杆菌O157:H7特异的能够繁殖的指示噬菌体，其中
Figure BDA0003520044270000541
基因在gp23后插入，主要衣壳蛋白基因处在T4晚期基因启动子的控制下。将大肠杆菌O157:H7(ATCC 43888)的对数期和静止期培养物稀释以获得当使用100μl样品时在图8-11的x轴上指示的大致数目的CFU。每个样品用CBA120 NanoLuc或CBA120Δgp22 NanoLuc在37℃感染2小时。加入裂解缓冲液和萤光素酶底物并在光度计上对样品进行读数。对每个噬菌体在每个CFU水平进行5个测量重复。将每个CFU的RLU值平均。使用每个CFU水平读数时的平均值并除以0CFU读数的平均值计算图8-11的y轴上作图的信号/背景值。
在处于对数期的大肠杆菌O157:H7培养物样品上进行上述实验，其中由于高转录和蛋白表达水平，细菌细胞典型地产生较高的信号水平。结果在图8和9中示出。还在处于静止期的大肠杆菌O157:H7培养物样品上进行上述实验，其中由于低转录和蛋白表达水平，细菌细胞典型地产生较低的信号水平。结果在图10和11中示出。在图8和9中，白色条表示对繁殖缺陷性的指示噬菌体(标记为CBA12.Δgp22.NL)获得的结果，填充条表示对阳性对照(标记为CBA120NL)获得的结果。图8-11显示了繁殖缺陷性的指示噬菌体与阳性对照表现相当。
实施例3.测试对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体的特异性
测试了对大肠杆菌O157:H7血清型特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体的特异性。如先前实施例中所述进行检测测定以检测一定范围的细菌。结果在图12中示出。在检测大肠杆菌O157:H7或工程化容许性大肠杆菌O157:H7期间产生萤光素酶信号。在对非靶标细菌(包括几种大肠杆菌血清型)的尝试性检测期间没有检测到萤光素酶信号。
实施例4.从对沙门氏菌属特异的TSP1噬菌体建立和分离繁殖缺陷性的指示噬菌体
通过使用如图13中所示的同源重组从对沙门氏菌属特异的亲代噬菌体构建对沙门氏菌属特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体。为了生成繁殖缺陷性的指示噬菌体，用野生型TSP1中的
Figure BDA0003520044270000551
编码序列替代亲代噬菌体的gp22前头支架蛋白的编码序列。用包含NanoLuc基因(其侧翼为匹配在gp22侧翼的细菌基因组序列)的同源重组(HR)质粒(即，gp21前头核心和蛋白酶以及gp23主要衣壳蛋白)(图13)转化沙门氏菌ATCC 19585。转化的细菌用亲代噬菌体感染以允许与HR质粒的同源重组，使噬菌体的gp22拷贝缺失，由此同时建立了繁殖缺陷性的突变体并插入了指示基因(即，
Figure BDA0003520044270000552
)以形成繁殖缺陷性的指示噬菌体。感染的细胞产生了重组体:野生型噬菌体比率大致为1:8的野生型和重组噬菌体的混合物。共感染野生型噬菌体通过反式补充缺失的gp22基因支持了重组体复制。在同源重组后，使用一系列滴定和富集步骤以分离表达
Figure BDA0003520044270000561
的特异性重组噬菌体。进行大规模生产以获得适宜用于检测测定的繁殖缺陷性的指示噬菌体的高效价母液。由于繁殖缺陷性的指示噬菌体(称为TSP1.Δgp22 NanoLuc)不能在野生型沙门氏菌19585中繁殖，因此在用高拷贝基于pUC的表达gp22前头支架蛋白的质粒转化的工程化沙门氏菌株(“容许性”沙门氏菌株)中进行繁殖，如图14中所示。
将分离的TSP1.Δgp22.NanoLuc斑悬浮在TMS缓冲液中，接种到野生型或容许性沙门氏菌19585培养物中，并在37℃孵育3小时。在10μl样品上进行NanoGlo
Figure BDA0003520044270000562
测定。TSP1.Δgp22.NanoLuc感染野生型和容许性沙门氏菌两者产生超出背景的高信号(100RLU/s)(图15)。
实施例5.测试对沙门氏菌属特异的繁殖缺陷性的TSP1指示噬菌体的检测限
为了评估TSP1.Δgp22.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体在静止期沙门氏菌中的检测限，使鼠伤寒沙门氏菌ATCC 19585生长18-20小时至静止期。将静止期培养物在TSB中稀释，并根据图16中显示的平板布局将细胞转移到96孔板。将TSP1.Δgp22.NanoLuc噬菌体加入至沙门氏菌静止期培养物并在37℃孵育2小时。在用噬菌体感染后，加入裂解缓冲液、测定缓冲液和底物，并将平板在光度计中读数1秒。结果显示在图16中。
为了评估TSP1.Δgp22.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体在对数期沙门氏菌中的检测限，使鼠伤寒沙门氏菌ATCC 19585生长18-20小时至静止期。然后将静止期细胞培养物在TSB中稀释，并生长至对数早期。然后将对数期沙门氏菌培养物在TSB中稀释，并根据图17中显示的布局将细胞转移到96孔板。将TSP1.Δgp22.NanoLuc噬菌体加入至沙门氏菌对数期培养物并在37℃孵育2小时。在用噬菌体感染后，加入裂解缓冲液、测定缓冲液和底物，并将平板在光度计中读数1秒。结果显示在图17中。
实施例6.从对沙门氏菌属特异的噬菌体建立和分离繁殖缺陷性的SEA1指示噬菌体
通过使用如图18中所示的同源重组从对沙门氏菌属特异的亲代噬菌体构建对沙门氏菌属特异的繁殖缺陷性的指示噬菌体。为了生成繁殖缺陷性的指示噬菌体，用野生型SEA1中的
Figure BDA0003520044270000572
编码序列替代亲代噬菌体的gp84基片楔形亚基蛋白的编码序列。用包含NanoLuc基因(其侧翼为匹配在gp84侧翼的细菌基因组序列)的同源重组(HR)质粒(即，gp83头部完成蛋白以及gp85基片插孔亚基和尾部溶菌酶)(图18)转化沙门氏菌27869。然后这些转化的细菌用亲代噬菌体感染以允许与HR质粒的同源重组，使噬菌体的gp84拷贝缺失，由此同时建立了繁殖缺陷性的突变体并插入了指示基因(即，
Figure BDA0003520044270000573
)以形成繁殖缺陷性的指示噬菌体。感染的细胞产生了野生型和重组噬菌体的混合物。共感染野生型噬菌体通过反式补充缺失的gp84基因支持了重组体复制。在同源重组后，使用一系列滴定和富集步骤以分离表达
Figure BDA0003520044270000571
的特异性重组噬菌体。进行大规模生产以获得适宜用于检测测定的繁殖缺陷性的指示噬菌体的高效价母液。由于繁殖缺陷性的指示噬菌体(称为SEA1.Δgp84.NanoLuc)不能在野生型沙门氏菌27869中繁殖，因此在用高拷贝基于pUC的表达gp84基片楔形亚基蛋白的质粒转化的工程化沙门氏菌株(“容许性”沙门氏菌株)中进行繁殖，如图19中所示。
实施例7.测试对野生型和容许性沙门氏菌特异的繁殖缺陷性的SEA1指示噬菌体
将野生型沙门氏菌27869的时程感染与pUC57.trans.SEA1.gp84转化的27869容许细胞比较。将1.0x106个细胞/孔的野生型沙门氏菌27869(在200μl TSB中)或pUC57.trans.SEA1.gp84转化的27869容许细胞(在200μl TSB+carb中)与重组噬菌体(MOI为0.1)一起孵育，一式三份。在10μl样品上在37℃进行NanoGlo测定4小时。在野生型沙门氏菌中由繁殖缺陷性的重组噬菌体产生的信号很早就达到平台期且信号弱，证明噬菌体在野生型沙门氏菌中缺少持续的生长(图20)。然而，在容许性沙门氏菌中的信号随时间推移继续增加，表明有多轮的感染和继续生长(图20)。
下一步，进行野生型沙门氏菌株7001、8326、13076和27869的时程感染。将1.0x106个细胞/孔的每种野生型沙门氏菌株与重组噬菌体(MOI为0.1)在100μl TSB中孵育。在10μl样品上在37℃在0、1、2和5小时时进行NanoGlo测定。在野生型沙门氏菌中由繁殖缺陷性的重组噬菌体产生的信号很早就达到平台期且信号弱(图21)。
通过对5小时野生型培养物(40μl培养物)进行空斑测定评估SEA1.Δgp84.NanoLuc噬菌体在野生型沙门氏菌株上的复制。从野生型沙门氏菌株7001、8326、13076和27869的培养物没有形成空斑(图22)，证实了在野生型沙门氏菌株上缺少SEA1.Δgp84.NanoLuc的复制。
实施例8.测试对沙门氏菌属特异的繁殖缺陷性的SEA1指示噬菌体的检测限
为了评估SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的检测限，将新港沙门氏菌ATCC 27869用AmpR puc57.SEA1.Trans gp84转化。将对数期培养物在TSB中稀释，并根据图23中显示的平板布局将细胞转移到96孔板。将SEA1.Δgp84.NanoLuc噬菌体加入至沙门氏菌对数期培养物并在37℃孵育2小时。在用噬菌体感染后，加入裂解缓冲液、测定缓冲液和底物，并将平板在光度计中读数1秒。结果显示在图23中。
为了评估SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体在静止期沙门氏菌中的检测限，使猪霍乱沙门氏菌ATCC 27869生长18-20小时至静止期。然后将静止期细胞在TSB中稀释，并根据图24中显示的平板布局将细胞转移到96孔板。将SEA1.Δgp84.NanoLuc噬菌体加入至沙门氏菌静止期培养物并在37℃孵育2小时。在用噬菌体感染后，加入裂解缓冲液、测定缓冲液和底物，并将平板在光度计中读数1秒。结果显示在图24中。
为了评估SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体在对数期沙门氏菌中的检测限，使猪霍乱沙门氏菌ATCC 27869生长18-20小时至静止期。然后将静止期细胞在TSB中稀释，并生长至对数早期。然后将对数期培养物在TSB中稀释，并根据图25中显示的平板布局将细胞转移到96孔板。将SEA1.Δgp84.NanoLuc噬菌体加入至沙门氏菌静止期培养物并在37℃孵育2小时。在用噬菌体感染后，加入裂解缓冲液、测定缓冲液和底物，并将平板在光度计中读数1秒。结果显示在图25中。
实施例9.在检测测定中测试对沙门氏菌属特异的繁殖缺陷性的SEA1指示噬菌体
为了评估SEA1.Δgp84.NanoLuc繁殖缺陷性的指示噬菌体的活性，将其检测活性与SEA1 NanoLuc的活性比较，SEA1 NanoLuc是对沙门氏菌属特异的能够繁殖的指示噬菌体，其中
Figure BDA0003520044270000591
基因在gp84后插入。每个样品用SEA1 NanoLuc或SEA1.Δgp84.NanoLuc在37℃感染2小时和4小时。加入裂解缓冲液和萤光素酶底物并在光度计上对样品进行读数。对每个噬菌体在每个CFU水平进行5个测量重复，如图26A中所示。每个CFU的RLU值显示在图26B(2小时感染)和图26C(4小时感染)中。

Claims (28)

1.一种重组噬菌体，所述重组噬菌体包含在所述噬菌体的基因组的晚期基因区中的指示基因，其中所述重组噬菌体是繁殖缺陷性的，并且其中所述重组噬菌体能够特异性地感染感兴趣微生物。
2.根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述噬菌体由于病毒粒子组装所需要的晚期基因的改变或缺失而成为繁殖缺陷性的。
3.根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述指示基因被插入到所述重组噬菌体的晚期基因的序列中，使得所述晚期基因无功能并且所述重组噬菌体成为繁殖缺陷性的。
4.根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述指示基因代替所述重组噬菌体的晚期基因的序列的至少一部分，使得所述重组噬菌体成为繁殖缺陷性的，其中所述晚期基因是病毒粒子组装所需要的。
5.根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述重组噬菌体来源于对大肠杆菌(E.coli)、或沙门氏菌属(Salmonella)、或李斯特氏菌属(Listeria)或葡萄球菌属(Staphylococcus)特异的噬菌体。
6.根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述晚期基因是病毒粒子组装所需要的。
7.一种包含至少两种重组噬菌体的组合物，所述两种重组噬菌体各自包含在所述噬菌体的基因组的晚期基因区中的指示基因，其中所述重组噬菌体是繁殖缺陷性的，并且其中所述重组噬菌体能够特异性地感染一种或多种感兴趣微生物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少两种重组噬菌体中的每一种包含不同的指示基因。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述至少两种重组噬菌体中的每一种能够特异性地感染不同的感兴趣微生物。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述至少两种重组噬菌体能够感染多种感兴趣微生物。
11.根据权利要求7所述的组合物，其中所述感兴趣微生物包括大肠杆菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属和葡萄球菌属中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述多种感兴趣微生物包括至少两种不同类别的细菌。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述至少两种不同类别的细菌包括至少两种不同属的细菌、至少两种不同种的细菌、至少两种不同菌株的细菌或至少两种不同血清型的细菌中的一种或多种。
14.一种制备重组噬菌体的方法，包括：
选择特异性地感染靶微生物的亲代噬菌体；
改变所述亲代噬菌体的基因以产生重组的繁殖缺陷性的噬菌体；
用同源重组(HR)质粒转化靶微生物的工程化菌株，所述工程化菌株能够表达所述繁殖缺陷性的噬菌体中突变的基因的产物，所述同源重组(HR)质粒包含指示基因和在所述指示基因侧翼并与所述亲代噬菌体中的期望序列同源的HR序列；
用所述亲代噬菌体或所述繁殖缺陷性的亲代噬菌体感染所述转化的靶微生物，使得能够在所述HR质粒和所述亲代噬菌体或所述重组的繁殖缺陷性的噬菌体的基因组之间发生HR；以及
分离重组噬菌体的特定克隆，所述特定克隆是繁殖缺陷性的且能够表达所述指示基因的产物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述改变所述亲代噬菌体的基因以产生所述繁殖缺陷性的噬菌体通过所述HR质粒和所述亲代噬菌体的基因组之间发生的HR实现，其中所述亲代噬菌体的基因通过用所述指示基因替代所述亲代噬菌体的至少一部分而改变。
16.根据权利要求14所述的方法，进一步包括生成所述靶微生物的工程化菌株。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述生成所述靶微生物的工程化菌株包括利用编码并能够表达在所述重组的繁殖缺陷性的噬菌体中改变的基因的质粒转化所述靶微生物。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述转化所述工程化菌株进一步包括利用反式质粒转化所述工程化菌株。
19.根据权利要求14所述的方法，进一步包括，在所述转化前，制备包含所述指示基因的所述同源重组质粒。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述分离重组噬菌体的特定克隆包括执行有限稀释测定以分离证明有所述指示基因的表达的克隆，所述特定克隆是繁殖缺陷性的且能够表达所述指示基因的产物。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组噬菌体来源于对大肠杆菌、或沙门氏菌属、或李斯特氏菌属或葡萄球菌属特异的噬菌体。
22.一种检测样品中的感兴趣微生物的方法，包括：
将样品与权利要求1所述的重组噬菌体孵育；以及
检测所述指示基因的产物，其中对所述指示基因的产物的阳性检测指示所述感兴趣微生物存在于所述样品中。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述样品是食品样品、环境样品、水样品或商品样品。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法检测所述样品中的少至10、9、8、7、6、5、4、3、2个或单个微生物。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述感兴趣微生物是大肠杆菌、或沙门氏菌属、或李斯特氏菌属或葡萄球菌属。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述感兴趣微生物是沙门氏菌属。
27.一种检测样品中的感兴趣微生物的试剂盒，包含权利要求1所述的重组噬菌体和用于与所述指示基因的产物反应以检测所述指示基因的产物的底物。
28.一种检测感兴趣微生物的系统，包含权利要求1所述的重组噬菌体和用于检测所述指示基因的产物的组件。
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