DE60117167T2

DE60117167T2 - Verfahren zur herstellung von submikropartikel-suspensionen pharmazeutischer substanzen

Info

Publication number: DE60117167T2
Application number: DE60117167T
Authority: DE
Inventors: Claire Boccaccio; Alessandra Nardin; Jean-Pierre Abastado
Original assignee: IDM Immuno Designed Molecules
Current assignee: IDM Immuno Designed Molecules
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2001-12-29
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2021-12-30
Also published as: US7252996B2; CA2434793A1; EP1352052B1; US20040197901A1; ATE317428T1; WO2002055675A8; ES2254527T3; AU2002240877B2; JP2004520033A; EP1352052A1; WO2002055675A1; DE60117167D1

Description

Die vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von kommitierten reifen dendritischen Zellen (DCs) und insbesondere einen Cocktail aus ribosomalen Bakterienextrakten oder ribosomalen Bakterienextrakten und Membranbakterienextrakten, der für die DCs-Reifung verwendet wird.
Dendritische Zellen sind als die am stärksten antigenpräsentierenden Zellen definiert, die sowohl primäre als auch sekundäre Immunantworten gegen spezielle exogene Antigene stimulieren können (Hart "Dedritic cells: unique leucocyte populations which control the primary immune response" Blood, 1997, vol.90, p3245). In vivo migrieren unreife dendritische Zellen, die Antigene in der Peripherie gefangen haben durch Lymphgefäße zu T-Zell-Zonen von Lymphorganen, wo sie von diesen Antigenen stammende Epitope in Zusammenhang mit MHC-Molekülen präsentieren und die Aktivierung und die Vermehrung von antigenspezifischen naiven T-Zellen erlauben.
Stimulierte Lymphozyten können zytotoxisch oder auxiliär sein, aber auch regulierende oder unterdrückende Lymphozyten sein, abhängig vom Typ der dendritischen Zellen und vom vorher existierenden Zytokinmuster.
Während der Migration durchlaufen die dendritischen Zellen einen Reifungsprozess, der zu morphologischen und phänotypischen Veränderungen führt. Reifung führt zu einer verringerten Fähigkeit der DCs Antigene zu fangen und zu einer erhöhten Fähigkeit zur Antigenpräsentation. Reifende DCs exprimieren höhere Niveaus an kostimulierenden Molekülen, erreichen die Expression von CD83 an ihrer Oberfläche, sie erzeugen Zytokine, die Effektor-T-Zell-Unterarten stimulieren und erwerben Migrationsfähigkeiten (für einen Rückblick siehe „Immunobiology of dendritic cells", Banchereau et al., 2000, Ann. Rev. Immunol., 18:767–811).
Vor kurzem wurden Möglichkeiten zur ex vivo Herstellung großer Mengen von dendritischen Zellen entwickelt, gefolgt von einem wachsenden Interesse für die Verwendung dieser Zellen in der Immunotherapie und als zellulärere Impfstoffe.
Dendritische Zellen können aus verschiedenen Gewebequellen erhalten werden oder bilden Vorstufen, die im Blut oder Knochenmark vorhanden sind. Unreife dendritische Zellen können aus Blutzellen durch Differenzierung von Monozyten unter Verwen dung von bestimmten Kulturbedingungen erhalten werden (Boyer et al., "Generation of phagocytic MAK and MAC-DC for therapeutic use: Characterization and in vitro functional properties", Exp. Hematol.1999, vol.27, pp751–761). Sich vermehrende Vorstufen von dendritischen Zellen wurden auch in der kleinen CD34 + Unterfraktion von Zellen in Humanblut identifiziert (Inaba et al. "Identification of proliferating dendritic cells precursors in mouse blood", 1992, J.Exp.Med., vol.175, p.1157) und es wurden Verfahren entwickelt um diese Zellen zu differenzieren.
Nachdem sie z. B. in Anwesenheit von IL-13 von Blutmonozyten differenziert wurden zeigen dendritische Zellen einen unreifen Phänotyp: Sie sind wirksam beim Antigenfang durch Pinozytose und Phagozytose, zeigen niedrige Niveaus des Kostimulationsmoleküls CD80 und exprimieren nicht den Oberflächenmarker CD83 (Boyer et al, 1999).
Reife dendritische Zellen sind stärkere Immunmodulatoren als unreife DCs. Insbesondere wurde die Fähigkeit von dendritischen Zellen eine Immunantwort in vivo zu induzieren mit ihrem Reifegrad in Verbindung gebracht. (Labeur M.S et al "Generation of tumor immunity by bone-marrow derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage", J. Immunol., 1999, 162, 168–175).
Es werden mehrere bekannte Agenzien für die Reifung von DCs zu Versuchszwecken verwendet wie Poly IC, Liganden von CD40, Anti-CD40 Antikörper, Endotoxine, lebende Bakterien, Kulturüberstände und Cocktails von agonistischen Zytokinen einschließlich TNFα. Jedoch sind klinische Untersuchungen, bei denen Patienten mit reifen dendritischen Zellen geimpft werden, in Entwicklung, wobei Zellen verwendet werden, die an ihrer Oberfläche fremde Antigene präsentieren nachdem sie mit Peptiden angeregt wurden oder mit bestimmten Antigenen beladen wurden. Es ist daher erforderlich, reproduzierbare Reifebedingungen mit klinischer Güte zu entwickeln, um kommitierte reife dendritische Zellen mit definierter Immunmodulationsfähigkeit zu erhalten.
Es wurde gezeigt, dass das Mykobakterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) dendritische Zellen aktiviert. (Kim et al., "Enhanced antigen-presenting activity and tumour necrosis factor a-independent activation of dendritic cells following treatment with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin", Immunology, 1999, vol.97, pp 626–633). Jedoch ist BCG ein lebender abgeschwächter Bakterienstamm und seine Verwendung in einem zellulären Impfstoff weist mehrere Nachteile einschließlich Sicherheitsbedenken auf.
Ribomunyl^® (International Non-proprietory Name, oder generischer Name: Ribosomale Bakterienfraktionen und Membranbakterienfraktionen, Membranproteoglykane) ist bekannt für seinen nicht spezifischen natürlichen Immunstimulationseffekt. Es enthält sowohl Proteoglykane von Klebsiella pneumoniae (0.015 mg in einer Dosis Lyophylisat) als auch ribosomale Fraktionen beinhaltend 70 % RNA von 4 verschiedenen Bakterienstämmen, Klebsiella pneumoniae (35 Teile), Streptococcus pneumoniae (30 Teile), Streptococcus pyogenes Gruppe A (30 Teile) und Haemophilus influenzae (5 Teile) (0.01 mg ribosomale Extrakte in einer Dosis Lyophylisat). Die Proteoglykane wirken als ein Adjuvans und ein nicht spezifisches Immunstimulanz, wohingegen die Immunogenizität der Ribosome entweder Peptiden, die natürlich an Ribosome gebunden sind oder Epitopen, die an Membranribosome und zytoplasmische Ribosome gebunden sind zuzuschreiben ist. (Clot et al „Pharmacology of ribosomal immunotherapy", Drugs, 1997, vol. 54, suppl.1, pp 33–36). Ribomunyl^®, auch als RBL bezeichnet, löst mukosale Immunantworten aus. (Béné& Faure, „From Peyer's patches to tonsils", Drugs, 1997, 54, suppl.1, pp24–28). Es wurde gezeigt, dass RBL die allgemeine angeborene Immunantwort stimuliert, indem es auf polymorphonukleare Zellen (PMNs) und Makrophagen wirkt, um die Produktion von einigen Zytokinen (IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, CSF) zu erhöhen und fähig ist natürliche Killerzellen zu aktivieren.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen aus unreifen dendritischen Zellen zu schaffen. Dieses Verfahren umfasst den Schritt des Inkontaktbringens in einem Kulturmedium von unreifen dendritsichen Zellen mit einem Reifungsmittel das eine bakterielle Mischung von ribosomalen Fraktionen oder von ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält.
Der Ausdruck „Reifung" ist definiert als die Wirkung auf unreife hochphagozytische dendritische Zellen, die zur phänotypischen und/oder funktionalen Modifikation der Zellen führt. Die damit verbundenen phänotypischen Modifikationen sind die Erhöhung bei der Zelloberflächenexpression von CD80, CD86, CD83, MHC Klasse I und II Molekülen und die Abnahme bei der CD14-Oberflächenexpression. Die funktiona len Änderungen können der Verlust von phagozytischen Eigenschaften, die Aneignung von Migrationsfähigkeiten und eine erhöhte allogene T-Zell-Stimulationseffizienz und Änderungen im Zytokin- und Chemokinexpressionsprofil und insbesondere eine erhöhte IL-12 Sekretion sein. Die IL-12-Produktion durch DCs ist für ihre in vivo Funktion entscheidend, da für dieses Zytokin gezeigt wurde, dass es eine Polarisation der Immunantwort zum Th1-Weg in vivo erzeugt. Eine Th1-Typ-Antwort wird als Immunantwort betrachtet, die eine Stimulation von antigenspezifischen T-Lymphozyten CD8+ mit sich bringt, wohingegen eine Th2-Typ-Immunantwort eher eine Stimulation einer Antikörperantwort und eventuell eine Unempfänglichkeit der zytotoxischen Lymphozyten auf ein Antigen mitsichbringt.
Der Ausdruck „kommitierte DCs" wird definiert als reife DCs, die ihre Immunantwort klar auf Th1-Immunstimulation oder auf Immunregulation richten.
Der Ausdruck „ribosomale Extrakte" wird definiert als Bakterienextrakte, die ribosomale Fraktionen enthalten und insbesondere Einzel- und/oder Doppelstrangribonukleinsäure. Ribosomale Extrakte oder Fraktionen entsprechen jedem Extrakt, das Ribosomen gereinigt oder teilweise gereinigt aus einer Bakterienkultur enthält. Das Verfahren zur Herstellung solcher Extrakte umfasst zumindest einen Schritt der Lyse der Bakterien, die nach der Kultivierung erhalten wurden und einen Schritt der Abtrennung der Fraktion, die bakterielle Ribosomen enthält, aus dem Gesamtlysat, insbesondere durch Zentrifugieren oder Filtrieren.
Der Ausdruck „Membranextrakte" ist definiert als bakterielle Extrakte die in Membranfraktionen angereichert sind. Membranextrakte oder Fraktionen entsprechen jedem Extrakt oder jeder Fraktion, das bzw. die Membranen gereinigt oder teilweise gereinigt aus einer Bakterienkultur enthält. Das Verfahren zur Herstellung solcher Extrakte umfasst zumindest einen Schritt der Lyse der Bakterien, die nach der Kultivierung erhalten wurden, und einen Schritt der Abtrennung der Fraktion, die die Bakterienmembranen enthält, insbesondere durch Zentrifugieren oder Filtrieren.
Die verschiedenen bakteriellen Fraktionen können gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wie ein Verfahren das durch Haeuw J.F. et al (Eur. J. Biochem., 255, 446–454, 1998) beschrieben ist oder wie ein Verfahren das im US-Patent 4 249 540 eingereicht durch Pierre Fabre S.A. beschrieben ist, hergestellt werden.
Der Ausdruck „Bakterienmischung" ist definiert als eine Mischung von Bakterienextrakten, möglicherweise von verschiedenen Bakterienstämmen stammend, die Membranfraktionen und ribosomale Fraktionen enthalten.
Der Ausruck „Reifungsmedium" ist definiert als ein Kultivierungsmedium, das geeignet ist zur Lebenserhaltung und Differenzierung der Zellen und dem das Reifungsmittel zugesetzt ist, wobei ein solches Kultivierungsmedium leicht ausgetauscht werden kann.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen dadurch gekennzeichnet, dass das Reifungsmittel eine bakterielle Mischung von ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen und Interferon-γ(IFN-γ) enthält. Das Interferon-γ hat eine synergistische Wirkung zu dem Reifungsmittel um die Reifungsmerkmale der DCs und ihren stimulierenden Phänotyp zu erhöhen. Ein „stimulierender Phänotyp" der dendritischen Zellen ist definiert als das Herbeiführen einer Th1-Antwort und Sekretion eines Zytokinprofils das zytotoxische T-Lymphozyten begünstigt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass unreife dendritische Zellen mit einem Reifungsmittel kontaktiert werden, das Membranfraktionen, die von Klebsiella pneumoniae sind, enthält. Solche Reifungsmittel können in Konzentrationen von etwa 0.01 bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise von etwa 0.1 bis etwa 10 μg/ml in dem Reifungsmedium verwendet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass unreife dendritische Zellen mit einem Reifungsmittel kontaktiert werden, das ribosomale Fraktionen enthält, die von den Bakterienstämmen Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes Gruppe A und Haemophilus influenzae sind. Solche Reifungsmittel können in einer Konzentration von etwa 0.01 bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise von etwa 0.1 bis etwa 10 μg/ml im Reifungsmedium verwendet werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden unreife dendritische Zellen mit einem Reifungsmittel kontaktiert, das eine bakterielle Mischung von ribosomalen und Membranextrakten enthält, das in einer Dosis von etwa 0.01 bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise von etwa 0.1 bis etwa 10 μg/ml in dem Reifungsmedium verwendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Reifungsmittel Ribomunyl^® (Inava Laboratory, Pierre Fabre).
In einer anderen besonderen Ausführungsform der Erfindung werden unreife dendritische Zellen mit einem Reifungsmittel kontaktiert das einen bakteriellen Cocktail von ribosomalen Extrakten und Membranextrakten und Interferon-γ in einer Dosis von 10 bis 10000 Ul/ml und vorzugsweise von etwa 100 bis etwa 1000 Ul/ml enthält. Die Fähigkeit von IFN-γ die Reifungswirkung zu erhöhen wurde getestet und als wirksam, insbesondere im Bezug auf die IL-12 Sekretion der dendritischen Zellen (siehe Beispiel 3) befunden. Wenn man die Wirkungen auf die Zytokinsekretion von kontaktierenden unreifen dendritischen Zellen mit einem Reifungsmittel, das Ribomunyl^® (RBL) alleine enthält, oder mit einem Reifungsmittel, das RBL und IFN-γ enthält, oder mit einem bekannten Reifungsmittel wie Poly I:C kombiniert mit Anti-CD40 vergleicht, führt der Kontakt von Zellen mit RBL und IFN-γ zu einem IL-12 Sekretionsniveau das höher ist als jenes, das mit anderen Reifungsmitteln erzielt wird und der Kontakt von Zellen mit RBL induziert ein IL-10 Sekretionsniveau das höher ist als bei anderen Reifungsmitteln (siehe Beispiel 3). Das Verhältnis zwischen dem Niveau der IL-12 Sekretion und dem Niveau der IL-10 Sekretion zeigt, dass wenn sowohl RBL als auch IFN-γ verwendet werden, die Zellen effektiv in Richtung eines immunstimulierenden Phänotyps reifer dendritischer Zellen übertragen werden.
Andererseits führt der Erhalt von DCs, die ein höheres IL-10 Sektretionsniveau und ein niedrigeres IL-12 Sekretionsniveau haben, durch Verwendung z. B. von RBL alleine als Reifungsmittel, zu reifen dendritischen Zellen, die interessante immunregulierende Eigenschaften, insbesondere zur Steuerung von Autoimmunerkrankungen besitzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung von antigenbeladenen reifen dendritischen Zellen. Zellen können durch Phagozytose, Pinozyto se, Affinitätsbindung, Fusion, Nukleinsäure (DNA, RNA)-Transfer oder rezeptorvermittelte Aufnahme gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, beladen werden. Das Kultivierungsmedium für dendritische Zellen kann mit löslichen oder teilchenförmigen Antigenen, einschließlich Tumor-Targetzellen oder Zelltrümmern, oder spezifischen Peptiden, gegen die eine Immunantwort erwartet wird, ergänzt werden. Das Kultivierungsmedium kann auch mit genetischem Material, das für ein Peptid oder ein Protein, gegen welches eine Modulation der Immunantwort erwünscht ist, codiert, ergänzt werden, wobei dieses genetische Material mit einem Vektor verbunden ist, der fähig ist, die Transfektion der dendritischen Zellen zu erlauben.
Wo es erwünscht ist, dass Zellen Antigene durch Phagozytose aufnehmen, wird es bevorzugt Antigen zur Kultur von unreifen dendritischen Zellen vor der Zugabe des Reifungsfaktors für dendritische Zellen zuzugeben. Phagozytose kann erwünscht sein, wenn bestimmte Antigene, Zelllysate oder Immunkomplexe verwendet werden. Wenn lösliche Peptidantigene verwendet werden, ist es bevorzugt, das Antigen den dendritischen Zellen nach einer zwischenzeitlichen Reifung auszusetzen.
Unreife DCs können durch irgendein Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, erhalten werden. Als ein Beispiel können monozytenabgeleitete dendritische Zellen gemäß den Patentanmeldungen WO 94/26875, WO 96/22781 oder WO 97/44441 hergestellt werden. Dendritische Zellen können auch gemäß Banchereau et al („Immunobiology of dendritic cells" Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:767–911) hergestellt werden.
Dendritische Zellen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhalten werden können, sind fähig, auf präzise T-Zell-Unterpopulationen zu wirken. Das heißt, dass dendritische Zellen gemäß der Erfindung fähig sind, Th2/Th1 Immunantwort zu stimulieren oder zu regulieren. DCs sind fähig, in vivo antigenspezifische Vermehrung von T-Zellen zu induzieren, und somit zu antigenspezifisch erhöhter Zytotoxizität und Immunstimulation zu führen, oder in vivo regulierende T-Zellen und daher die Inhibition von antigenspezifischen zytotoxischen T-Zellen zu induzieren, was zu einer Unempfänglichkeit für ein spezifisches Antigen führt. Das Gleichgewicht zwischen immunstimulierendem und immunregulierendem Vermögen der reifen dendritischen Zellen hängt von den Reifungsbedingungen ab, die auf die unreifen Zellen angewandt werden und von dem Typ der DCs, die diesen Bedingungen unterworfen werden.
Eine induzierte Immunantwort kann gekennzeichnet sein durch eine klinische in vivo Immunantwort gegen ein gegebenes Pathogen oder einen Tumor, was zu seiner Abnahme oder Eliminierung führt. In vitro kann dies für dendritische Zellen in einem Immunstimulationstest für antigenspezifische zytotoxische T-Lymphozyten gemessen werden. Die Funktionalität von dendritischen Zellen, die gemäß der Erfindung behandelt wurden, kann als ihre Targeterkennungskapazität und durch eine Analyse ihrer Zytokin- und Chemokinabgabe gemessen werden. Eine regulierte Immunantwort kann klinisch, im Falle einer Autoimmunerkrankung, durch die Abnahme oder das Verschwinden der Symptome beobachtet werden. In vitro sind antigenpräsentierende Zellen, die fähig sind, eine Immunantwort zu regulieren, gekennzeichnet durch ihre verringerte Sekretion von stimulierenden Zytokinen (IL-1, IL-12, IFN-γ) und ihre erhöhte Sekretion von bestimmenden hemmenden Zytokinen (IL 10, TGF-β).
Die Zellmorphologie von dendritischen Zellen nach der Behandlung mit Ribomunyl^® und IFN-γ ist durch das Vorhandensein von Dendriten gekennzeichnet, wobei diese an unreifen dendritischen Zellen nicht sichtbar sind (Banchereau et al., 2000).
Die Flusszytometrieanalye des Phänotyps der Zellen nach einem 40 Stunden Kontakt mit einem Reifungsmittel, das entweder RBL alleine oder RBL plus Interferon-γ enthält, zeigt, dass die dendritische Zellpopulation nur teilweise gereift ist, wie es z. B. durch das CD83-Expressionsmuster (siehe 3) bewiesen wird. Diese Teilreifung könnte möglicherweise den dendritischen Zellen erlauben, ihren Reifungsprozess in vivo fortzusetzen nachdem sie dem Patienten injiziert wurden. Insbesondere könnten solche Zellen fähig sein, wirksam von ihrem Injektionspunkt zu Lymphknoten zu wandern. Diese Eigentschaften kann interessante Möglichkeiten für therapeutische Anwendungen in vivo eröffnen.
Die in der vorliegenden Anmeldung zitierten Beispiele geben einen Kontakt zwischen dendritischen Zellen und dem Reifungsmittel während 40 Stunden an. Aber das Verfahren gemäß der Erfindung kann einen Schritt für das Kontaktieren der unreifen dendritischen Zellen mit einem Reifungsmittel während 18 Stunden oder selbst während einer kürzeren Zeit, entsprechend dem erwarteten Reifungsniveau der dendritischen Zellen, enthalten.
Dendritische Zellen, die gemäß dem Verfahren erhalten werden können, sind für Immunotherapie und für Vaccinologie verwendbar. Verabreichung der Zellen an einen Patienten ist möglich, wobei die Zellen und die Zusätze klinische Qualität haben.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, Zellulärimpfstoffzusammensetzungen und immunotherapeutische Arzneimittel, die antigenpräsentierende Zellen enthalten, die gemäß dem beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, können an Patienten in verschiedenen galenischen Formen abgegeben werden, umfassend die intradermale, subkutane, intravenöse, intralymphatische, intranodale, intramucosale oder intramuskuläre Verabreichung. Die Anzahl der dendritischen Zellen in einer einzelnen verabreichten Dosis liegt zwischen etwa 10⁶ bis etwa 10⁹ Zellen für einen Patienten und vorzugsweise zwischen etwa 10⁷ bis etwa 10⁸ Zellen für einen Patienten für eine Einzeldosis. Als ein Beispiel kann der Patient eine Injektion pro Woche für 6 aufeinanderfolgende Wochen erhalten.
Beschreibung der Figuren
1: Ribomunyl^®-Dosis-Antwort für dendritische Zellreifung.
Unreife DCs wurden für 40 Stunden in der Gegenwart von Dosen im Bereich von 0.001 bis 10 μg/ml Ribomunyl inkubiert. Um die Reifung zu verfolgen, wurden die DCs mit Anti-CD83 Antikörpern, Anti-CD86 und Anti-HLA ABC Antikörpern gefärbt und die Fluoreszenz mit einem Flusszytometer analysiert.
Die X-Achse stellt die verwendeten Dosen von Ribomunyl in μg/ml in dem Reifungsmedium dar. Die Expression der Marker ist, für CD 86 und HLA-ABC Marker, als willkürliche Einheiten der Hauptfluoreszenzintensität (linke Y-Achse) und für CD83 Marker als Prozentsatz der Zellen, die die Marker exprimieren (rechte Y-Achse) dargestellt. Die hellen und dunklen Histogramme entsprechen jeweils der CD86 und der HLA-ABC Expression, wohingegen die Kurve den Prozentsatz der Zellen, die CD83 Marker exprimieren, darstellt.
2: DCs Wiedergewinnung und Mortalität bei verschiedenen Reifungsbedingungen
Unreife DCs wurden für 40 Stunden in der Gegenwart von Standardreagenzien Anti-CD40 (3 μg/ml) und Poly(I:C) (100 μg/ml), in der Gegenwart von den Reagenzien in Klinikgüte Ribomunyl (1 μg/ml) oder Ribomunyl (1 μg/ml) und IFN-γ bei 1000 UI/ml inkubiert. Die Zellwiedergewinnung nach Kultivierung wurde durch Zählen lebender Zellen unter dem Mikroskop auf einer Malassezzählkammer abgeschätzt. Zelllebensfähigkeit wurde durch FACS unter Verwendung von TOPRO-3 Technologie (Molecular Probes) gemessen.
Die X-Achse stellt die verschiedenen verwendeten Reifungsbedingungen dar, wohingegen die Y-Achse den Prozentsatz der wiedergewonnen Zellen oder den Prozentsatz der Zellmortalität darstellt. Die Histogramme entsprechen der Expression der Zellwiedergewinnung, die Rauten entsprechen dem Prozentsatz der Zellmortalität.
3: Phänotypische FACS-Analyse von DCs ohne jegliche Reifungsbehandlung und nach Inkubation mit verschiedenen Reifungsmitteln
Unreife DCs wurden für 40 Stunden in der Gegenwart von Standartreagenzien Anti-CD40 (3 μg/ml) und Poly(I:C) (100 μg/ml), in der Gegenwart von Reagenzien mit Klinikgüte Ribomunyl (1 μg/ml) oder Ribomunyl (1 μg/ml) und IFN-γ bei 1000 UI/ml inkubiert. Die Volllinien entsprechen einer Isotypkontrolle. Die gepunkteten Linien entsprechen den Probenanalysen.
4: T-Zellen allogene Stimulation von reifen DCs
Allogene gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) wurde an DCs, die entweder durch Behandlung mit RBL (1 μg/ml), RBL (1 μg/ml) + IFN-γ (1000 U/ml), Poly I:C + Anti-CD40 oder mit IFN-γ alleine (1000 UI/ml) gereift wurden, und an unreifen DCs durchgeführt. DCs wurden während 5 Tagen mit einer festgelegten Zahl an allogenen T-Lymphozyten, die in einem peripheren Blutleukozytenextrakt vorhanden waren, inkubiert. Zellvermehrung wurde durch [³H]-Thymidinaufnahme von Zellen quantifiziert, die mit 1 μCi von [Methyl-3H]-Thymidin für die letzten 18 Stunden der Kultivierung inkubiert wurden.
Die X-Achse stellt die verschiedenen DCs/T-Zell-Verhältnisse dar, wohingegen die Y-Achse der Quantifizierung der [³H]-Thymidinaufnahme der Zellen entspricht. Dunkle Rauten stellen Werte dar, die durch nichtbehandelte DCs (= unreife DCs) erhalten wurden, weiße Kreise stellen Werte dar, die mit IFN-γ behandelt wurden, schwarze Dreiecke entsprechen Zellen, die mit RBL alleine behandelt wurden, weiße Dreiecke entsprechen Zellen, die mit RBL + IFN-γ behandelt wurden, und schwarze Quadrate entsprechen Zellen, die mit Poly I:C und Anti-CD40 behandelt wurden.
5: IL12 Sekretion von reifen DCs
Kulturüberstände, nach 40 Stunden Zellkultur bei 2.10⁶ DCs/ml, wurden mit kommerziellen ELISA-Kits auf IL-12 p70 Zytokinsekretion untersucht.
Die X-Achse zeigt die verschiedenen verwendeten Reifungsbedingungen an, sowie die Kontrolle (nicht behandelte Zellen), die Y-Achse stellt die Menge an IL-12 p70 in pg/ml in dem Kulturüberstand dar.
6: IL10-Sekretion von reifen DCs
Kulturüberstände, nach 40 Stunden Zellkultur bei 2.10⁶ DCs/ml, wurden durch kommerzielle ELISA-Kits für IL-10 Zytokinsekretion untersucht.
Die X-Achse zeigt die verschiedenen verwendeten Reifungsbedingungen an, sowie die Kontrolle (nicht behandelte Zellen), die Y-Achse stellt die Menge an IL10 in pg/ml in dem Kulturüberstand dar.
Beispiele
Beispiel 1: Ribomunyl^®-Dosis-Antwort für dendritische Zellreifung.
Dendritische Zellen
Unreife dendritische Zellen (DCs) wurden durch Kultur von peripheren Blutmonozyten gemäß der Patentanmeldung WO 97/44441 und Boyer et al. (Generation of phagocytic MAK und MAC-DC for therapeutic use: Characterization and in vitro functional properties" Exp. Hematol., 1999, 27, 751–761) hergestellt und abgeschlämmt. DCs wurden in AIMV Medium ergänzt mit 500 U/ml GM-CSF (Leucomax, Novartis Pharma) und 50 ng/ml IL13 (Sanofi Synthelabo) (= vollständiges AIMV Medium) differenziert und nach 7 Tagen Kultivierung abgeschlämmt. 2.10⁷ DCs/ml wurden dann in Humanalbumin 4 % und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) suspendiert und in flüssigem Stickstoff gefroren.
Reifung
Am Tag vor der Reifung wurden die DCs aufgetaut und über Nacht in vollständigem AIMV Medium mit 500 U/ml GM-CSF und 50 ng/ml IL13 belassen. Ribomunyl (RBL) (Inava Laboratory, Pierre Fabre) wurde in einer Apotheke gekauft. Jedes Fläschchen von lyophilisiertem RBL enthält 0.010 mg ribosomale Fraktionen und 0.015 mg Membranfraktionen. RBL wird in AIMV Medium (0.1 mg/ml aktiver Fraktionen) improvisiert resuspendiert. 2.10⁶ DCs/ml wurden dann für 40 Stunden unter Anwesenheit von Dosen von 0,001–0,01–0,1–1 und 10 μg/ml Ribomunyl inkubiert.
Zellmorphologie
Die Morphologie dendritischer Zellen, die durch Differenzierung von Blutmonozyten und weitere Behandlung mit Ribomunyl + IFN-γ erhalten wurden, zeigt die Erscheinung von Dendriten, welche Merkmale reifer DCs sind, wobei solche Dendriten nicht sichtbar sind wenn unreife DCs beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).
Phänotypische Analyse
Um die Reifung zu verfolgen wurden DCs auf ihre Expression von CD83, CD86 und HLA-ABC Markern analysiert. DCs wurden in Phosphatpuffersaline (PBS) ergänzt mit 1 % fötalem Kälberserum mit 4.10⁶ Zellen/ml suspendiert. 100 μl Zellsuspension (4.10⁵ Zellen in jedem Röhrchen) wurden auf Eis im Dunklen für 30 Minuten mit fluorchromkonjugierten monoklonalen Antikörpern inkubiert: 10 μl PE-konjugierter mAb Anti-CD83, 10 μl PE-konjugierter mAb Anti-CD86 oder 10 μl FITC-konjugierte Anti-HLA-ABC (Immunotech, Marseille, Frankreich). Zellen wurden dann wieder in PBS gewaschen, bei 1400 U/min für 5 Minuten bei 20 °C zentrifugiert und in PBS das TOPRO 3 bei 3 nM enthält resuspendiert, um tote Zellen von der Analyse auszuschließen.
Flusszytometrieanalyse wurde mit einem Becton Dickinson Zytometer mit einer Cell-Quest Software durchgeführt.
Ergebnisse
Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Die Expression von CD86 und HLA-ABC Markern ist als Hauptfluoreszenzintensität in willkürlichen Einheiten angegeben (linke Y-Achse) und die Expression von CD83 Markern ist als ein Prozentsatz von Zellen, die den Marker exprimieren, angegeben (rechte Y-Achse).
Ein Bereich zwischen 1 ng/ml und 10 μg/ml Ribomunyl^® wurde getestet um die optimale Konzentration von RBL, die fähig ist DC-Reifung nach 40 Stunden Kultivierung mit der geringstmöglichen Toxizität zu induzieren, zu evaluieren.
Zwischen 1 ng/ml und 0,1 μg/ml wird basierend auf CD14, CD83, HLA-ABC und CD86 Expression keine Reifung erhalten. Über 1 μg/ml sieht man Auftreten von CD83 Expression, ein Hinaufregeln von CD86 und HLA-ABC. Die Zellmortalität steigt nicht ungeachtet der verwendeten RBL Konzentration (nicht gezeigt). Eine RBL Dosis von 1 μg/ml für 40 Stunden Reifung wurde daher für weitere Studien gewählt.
Beispiel 2: Analyse von unter verschiedenen Bedingungen hergestellten DCs: Morphologie der Zellen, Wiedergewinnung, Mortalität und Kapazität T-Zellenvermehrung zu induzieren
Zellen
Unreife dendritische Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. 2.10⁶ DCs wurden in vollständigem AIMV Medium für 40 Stunden in der Gegenwart von Standardreifungsreagenzien Anti-CD40 (3 μg/ml) und Poly(I:C) (100 μg/ml), in Gegenwart des Reagenz in Klinikgüte Ribomunyl^® (RBL 1 μg/ml) oder in Gegenwart von RBL (1 μg/ml) und IFN-γ (Imukin, 1000 U/ml) inkubiert. Die Kultur wurde mit 2.10⁶ DCs/ml in 24-Well-Platten durchgeführt.
Zellwiedergewinnung und Mortalität
Die Zellwiedergewinnung nach Kultur wurde durch Zählen lebender Zellen auf Malassezzählkammern abgeschätzt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Trypan Blau Ausschluss beurteilt. Zelllebensfähigkeit wurde auch durch FACS unter Verwendung von TOPRO-3 gemessen.
Phänotypische Analyse
Der DCs Phänotyp wurde durch Doppelfärbungsflusszytometrieanalyse unter Verwendung der gleichen Marker CD83, CD86 und HLA-ABC und Verwendung der gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1, plus CD14 Marker (10 μl von FITC-konjugierten mAb Anti-CD14, Becton Dickinson) bestimmt.
Allogene gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)
Eine variable Anzahl von DCs (nicht behandelt, behandelt mit Reagenz mit Klinikgüte oder behandelt mit Poly I:C + Anti-CD40) wurde für 5 Tage mit einer fixen Anzahl von allogenen T-Lymphozyten inkubiert. Zellvermehrung wurde durch [³H]-Thymidinaufnahme von Zellen, die mit 1 μCi von [Methyl-3H]-Thymidin während den letzten 18 Stunden der Kultur inkubiert wurden, quantifiziert.
Ergebnisse:
Zellwiedergewinnung und Mortalität
Die Anzahl der gewonnen DCs nach RBL Behandlung während 40 Stunden ist 1,5fach geringer als nichtbehandelte DCs (2). Zellmortalität ist als ein Prozentsatz von wiedergewonnenen Zellen ausgedrückt.
Die Zellwiedergewinnung nach der Behandlung mit RBL oder mit RBL und γIFN war geringer als jene nichtbehandelter Zellen, wobei die Zugabe von IFN-γ die Zellenwiedergewinnung nicht wesentlich modifiziert, welche höher bleibt als die Zellenwiedergewinnung nach Poly I:C + Anti-CD40 Behandlung.
Phänotypische Analyse
Der DCs Phänotyp (3) zeigt eine Erhöhung von CD83 Marker an der Zelloberfläche nach RBL und nach RBL + IFN-γ Behandlung. Nach RBL Behandlung zeigt das bimodale Muster der CD83 Expression das Vorhandensein von zwei Zellpopulationen, die sich durch ihre CD83 Expressionsniveaus unterscheiden. Das CD83 Expressionsniveau an RBL + IFN-γ behandelten Zellen ist vergleichbar zu jenem von Poly I:C + Anti-CD40 behandelten Zellen, indikativ für reife Zellen.
Allogene gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)
4 zeigt, dass in gemischter Lymphozytenreaktion RBL behandelte DCs 5fach stärkere Stimulatoren waren als unbehandelte oder nur mit γIFN allein behandelte DCs. Diese Stimulation ist ähnlich jener, die mit DCs erhalten wird, die mit Poly I:C plus Anti-CD40 behandelt sind.
Der Zusatz von IFN-γ zu RBL hat die DCs-Kapazität allogene T-Zell-Vermehrung zu induzieren nicht signifikant erhöht.
Beispiel 3: Zytokinsekretion von dendritischen Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen gereift wurden
Zellen
Unreife dendritische Zellen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. 2.10⁸ DCs wurden unter den gleichen Bedingungen wie in den vorherigen Beispielen gereift.
Zytokindetektion
Kulturüberstände wurden nach 40 Stunden Zellkultur mit 2.10⁶ DCs/ml, durch ELISA auf IL-12 p70 und IL-10 Zytokinsekretion durch herkömmliches ELISA untersucht.
Zytokinherstellung wurde in den Überständen von DCs-Kulturen unter Verwendung von passenden Antikörpern, die spezifisch für IL12p70 (MAB611, BAF219) und für IL10 (MAB217, BAF217) waren, gemessen. Die Tests wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller (R & D systems) durchgeführt.
Ergebnisse:
RBL Behandlung induziert die Herstellung kleiner Mengen von IL12p70. Zugabe von IFN-γ und RBL zu DCs induziert eine 10fache Erhöhung in der IL12p70 Zellsekretion. Dieser Wert ist 4 mal höher als jener der mit Poly I:C plus Anti-CD40 Behandlung erzielt wurde. (5).
RBL induzierte Sekretion einer großen Menge von IL10. Zugabe von IFN-γ und RBL zu DCs verringert signifikant das Niveau von IL10, das durch die Zellen sekretiert wird, verglichen zu IL10 Sekretion durch RBL behandelte Zellen. Hohe Niveaus von IL12p70 werden in Überständen von RBL plus IFN-γ behandelten DCs gefunden. Das hohe Niveau von IL10, das durch RBL behandelte DCs erzeugt wird, sinkt signifikant bei IFN-γ Zugabe (6).

Claims

In vitro-Verwendung eines Reifungsmittels, das eine bakterielle Mischung aus ribosomalen Fraktionen oder ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält, für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen aus unreifen dendritischen Zellen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Reifungsmittel eine bakterielle Mischung aus ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Reifungsmittel Inferon-γ und eine bakterielle Mischung aus ribosomalen Fraktionen oder ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Reifungsmittel Interferon-γ und eine bakterielle Mischung aus ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält.
Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen aus unreifen dendritischen Zellen, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens von unreifen dendritischen Zellen in einem Kultivierungsmedium mit einem Reifungsmittel enthält, das eine bakterielle Mischung von ribosomalen Fraktionen oder ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält.
Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Reifungsmittel Interferon-γ und eine bakterielle Mischung von ribosomalen Fraktionen oder ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält.
Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die Membranfraktionen vom Bakterienstamm Klebsiella pneumoniae sind.
Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die ribosomale Fraktion von dem Bakterienstämmen Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes Gruppe A und Haemophilus influenzae ist.
Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Reifungsmittel eine bakterielle Mischung von ribosomalen Fraktionen oder ribosomalen Fraktionen und Membranfraktionen enthält, das in einer Dosis von etwa 0,1 bis etwa 10 μg/ml und vorzugsweise etwa 10 μg/ml im dem Reifungsmedium verwendet wird.
Verfahren für die Herstellung von reifen dendritischen Zellen gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 9, wobei das Reifungsmittel Interferon-γ enthält, das in einer Dosis von etwa 100 bis etwa 1000 UI/ml und vorzugsweise von etwa 1000 UI/ml in dem Reifungsmedium verwendet wird.