DE60209915T2

DE60209915T2 - Prozess zur herstellung reifer dendritischer zellen und eines impfstoffes

Info

Publication number: DE60209915T2
Application number: DE60209915T
Authority: DE
Inventors: Malcolm Adams; Cyril Donninger
Original assignee: BIOCLONES Pty Ltd; BIOCLONES Ltd Pty; BIOCLONES Pty Ltd SANDTON
Current assignee: BIOCLONES Pty Ltd; BIOCLONES Ltd Pty; BIOCLONES Pty Ltd SANDTON
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2002-08-08
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2022-08-09
Also published as: CA2457322A1; DE60209915D1; WO2003014335A1; EP1417300B1; CA2457322C; ES2263806T3; US20040253722A1; US7981673B2; MXPA04001152A; EP1417300A1; GB0119346D0; AU2002324255B2; ZA200401842B; ATE320481T1; JP2004538000A; DK1417300T3; BR0212016A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reifen von menschlichen dendritischen Zellen, ein Verfahren zur Steigerung der Herstellung von Interleukin 12 (IL 12) in reifen dendritischen Zellen und einen Impfstoff, der gereifte dendritische Zellen enthält, die gesteigerte Level von IL 12 herstellen.
Es hat sich herausgestellt, dass cytotoxische CD8+ T-Zellen-Lymphozyten (CTL) Tumorzellen, die Tumorantigene auf der Zelloberfläche in Zusammenhang mit MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Klasse 1-Molekülen ⁽¹⁾ präsentieren, erkennen und abtöten können. Jedoch ist bei der Mehrzahl der Patienten, bei denen Krebs diagnostiziert wurde, die zelluläre Immunantwort des Patienten nicht ausreichend als Antwort auf Tumorantigene aktiviert und deshalb ist der Körper des Patienten nicht in der Lage, in geeigneter Weise die Tumorzellen abzutöten und sich so selbst vor der weiteren Ausbreitung des Krebses zu schützen. Patienten können deshalb mit Chemotherapie oder Strahlentherapie behandelt werden, welche beide ohne Unterscheidung die normalen Zellen abtöten können und für den Patienten schwere toxische Nebenwirkungen verursachen können. Wenn die zelluläre Immunantwort durch Tumorantigene ausreichend aktiviert werden könnte, wäre es ohne die unerwünschten, mit den herkömmlichen Typen von Krebsbehandlung zusammenhängenden Nebenwirkungen möglich, dass der Körper des Patienten in der Lage wäre, die Tumorzellen selbst auszurotten.
Deshalb besteht ein Bedarf, therapeutisch ein zelluläres Immunsystem eines Krebspatienten zu aktivieren, so dass es auf Tumor-begleitende Antigene antwortet.
Dendritische Zellen sind unter den wirkungsvollsten Antigen-präsentierenden Zellen zum Starten von sowohl cytotoxischen CD8+ T-Zellen (CTL)- als auch CD4+ T-Helfer (Th1)-Antworten ⁽²⁾. Sie sind in der Lage Antigene aufzunehmen und zu verarbeiten und zu den regionalen Lymphknoten zu migrieren, um CD8+ T-Zellen-Antworten ⁽²⁾ zu induzieren. Sie haben das Vermögen, auch exogene Antigene im Kontext von MHC Klasse 1-Molekülen, die auf der Zelloberfläche vorhanden sind, zu präsentieren ⁽³⁾. Diese Merkmale zusammengenommen ermöglichen den dendritischen Zellen, ein Antigen in einer Weise zu präsentieren, die zum Starten von sowohl CD8+ als auch CD4+ T-Zellen-Antworten in der Lage ist, wodurch ein Grund für die Verwendung von dendritischen Zellen als ein zellulärer Impfstoff geliefert wird. Jedoch ist es dafür notwendig, dendritische Zellen zu haben, die in ausreichender Anzahl und in einem funktionell optimalen Antigen-beladenen Zustand verfügbar sind.
Mäusestudien unterstützten das immunisierende Vermögen von aus Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, die in vitro mit GM-CSF und Interleukin 4 (IL 4) vermehrt wurden und mit den relevanten definierten Tumor-begleitenden CTL-Epitopen gepulst wurden ^(4,5). Die Studien haben gezeigt, dass dendritische Zellen, die mit definierten Tumor-begleitenden Antigenpeptiden geprimt wurden, in der Lage sind, etablierte Tumore, die die geeigneten Tumorantigene exprimieren, auszurotten. Es wurde gezeigt, dass diese durch dendritische Zellen vermittelten Antitumorantworten in Tiermodellen von CD4+ T-Helfer (MHC Klasse II)- sowie CD8+ (MHC Klasse I)-Antworten und auch von der Herstellung von Th1-Lymphokinen abhängen ⁽⁵⁾.
Diese Tierstudien führten zu einer Anzahl von klinischen Phase I-Studien beim Menschen unter Verwendung von reifen und unreifen autologen dendritischen Zellen, die mit Tumorantigenen beladen waren. Zum Beispiel behandelten Nestle et al. ⁽⁶⁾ 16 Patienten mit metastasierenden Melanomen mit unreifen von Monozyten abgeleiteten dendritischen GM-CSF/IL 4-Zellen, die man in fötalem Kälberserum wachsen ließ. Eine klinische Antwort war bei 5 von 16 Patienten erkennbar, normalerweise dauerhaft (2 vollständige Antworten und 3 teilweise Antworten) mit Haut-, Weichteil-, Lungen- und Pankreasmetastasen. Von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen, die mit spezifischen MAGE-3-Tumorpeptiden gepulst wurden und mit TNF-α gereift wurden, induzierten in ähnlicher Weise bei 6 von 11 Patienten mit Haut-, Lymphknoten-, Lungen- und Lebermetastasen Antworten ⁽⁷⁾. Eine wesentliche Ausbreitung von MAGE-3 HLA A1-spezifischen CD8+ T-Zellen wurde bei 6 von 11 Patienten beobachtet, und eine Antwort von Hautmetastasen stand im Zusammenhang mit einem CD8+ T-Zellen-Infiltrat.
Beweise, die die Wirksamkeit von dendritischen Zellen als Immuntherapeutika unterstützen, wurden auch bei klinischen Studien gesammelt, die Patienten mit metastasierendem Krebs von anderen Typen von primären Tumoren einbezogen. Eine Immunisierung mit dendritischen Zellen, die durch die Fusion von allogenen Monozyten und autologen Tumorzellen hergestellt und mit TNF-α gereift wurden, waren bei der Induzierung von zellulären Immunantworten bei 7 von 11 Patienten mit metastasierenden Nierenzellkarzinomen erfolgreich, einschließlich 4 vollständigen Remissionen ⁽⁸⁾. Unreife dendritische GM-CSF/IL 4-Zellen, die mit Prostatamembranantigen P1 und P2 gepulst wurden, wurden bei 37 Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs verwendet. Eine vollständige Antwort und 10 teilweise Antworten (> 50% Verringerung von PSA-Levels oder signifikante Auflösung bei einem Knochenscan) wurden beobachtet ⁽⁹⁾. Bei einer Reihe von 9 Patienten ⁽¹⁰⁾ mit fortgeschrittenem Zervixkrebs, die mit unreifen dendritischen GM-CSF/IL 4-Zellen behandelt wurden, welche mit allogenem spezifischen HPV 16 +ve-Tumorlysat-spezifischen HPV-CTL gepulst worden waren, wurde bei 2 von 2 auswertbaren (HPV16 + HLA 002^*) Patienten nach einer Impfung eine Antwort im peripheren Blut gezeigt. Bei einem Patienten stieg die Häufigkeit von HPV16E7 (11-20) auf 2,2%, wie durch Klasse 1-Tetramere nachgewiesen wurde, und bei dem anderen Patienten enthüllte der IFN-γ ELISPOT-Test eine spezifische Antwort auf von 4 HPV 16 E6 und 7 abgeleitete CTL-Epitope 1 Woche bzw. 2 Monate nach der Impfung. Bei 1 von 4 auswertbaren HPV 16 +-Patienten wurde auch eine spezifische T-Helfer-Antwort beobachtet. Die durch ELISPOT nachgewiesene T-Zellen-Immunität korrelierte mit der DTH-Antwort auf ein Tumorlysat, und für diese Patienten folgte ein günstiges klinisches Ergebnis (NED der Erkrankung 18 Monate oder später nach der Resektion der Lungenmetastasen, stabile Erkrankung für 3 Monate oder länger nach der Progression).
Deshalb ist es machbar, klinisch relevante spezifische Klasse I- und T-Helfer-Antworten bei Patienten mit Metastasen einer Vielzahl von Krebstypen unter Verwendung von dendritischen, von Monozyten abgeleiteten Zellen, die mit unterschiedlichen von Tumor-begleitenden Antigenen gepulst wurden, zu induzieren. Jedoch besteht momentan in Bezug auf die Definition des immunologisch aktiven Phänotyps, die Dosis, den Weg und das Bereitstellungsverfahren kein Konsens für eine optimale Krebsimmunisierung mit dendritischen Zellen ⁽¹¹⁾.
Es scheint, dass reife dendritische Zellen beim Präsentieren von Antigenen und Einleiten einer CTL- und T-Helfer-Antwort wahrscheinlich wirksamer sind als unreife dendritische Zellen ⁽²⁾. Obwohl klinische Antikrebs-Antworten nach einer Immunisierung mit unreifen dendritischen Zellen beobachtet wurden, ist es wahrscheinlich, dass bei diesen Patienten dendritische Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt in vivo durch einen bis jetzt nicht definierten Reiz gereift worden sein können. Dendritische Zellen erlangen normalerweise in ihrem unreifen Zustand Antigene von peripheren Geweben. Die Reifung ist durch eine Regulierung ihres Antigen-Aneignungsvermögens nach unten, eine erhöhte Expression von MHC und costimulierenden Molekülen auf ihrer Oberfläche, einen erhöhten Level von IL 12-Herstellung durch sie und eine veränderte Expression von Chemokinrezeptoren charakterisiert ⁽¹²⁾.
Folglich kann ein Mittel zur beliebigen Reifung von dendritischen Zellen in vitro vor ihrer Verwendung für eine Impfung den Vorteil eines Phänotyps mit einem optimalen Migrationsvermögen zu Lymphknoten, um T-Zellen in Lymphknoten zu primen, einem optimalen Th1-Lymphokin ⁽¹³⁾-Herstellungsvermögen sowie einem stabilen funktionellen Zustand, der für die Krebs-begleitenden tolerogenen Einflüsse wie Interleukin 10 am wenigsten empfindlich ist ⁽¹⁴⁾, bieten.
Für die Frage, ob die T-Zellen durch eine Wechselwirkung mit dendritischen Zellen aktiviert oder energetisiert werden, scheint die Natur der „Aktivierung" oder des „Gefahrensignals" kritisch zu sein, welche durch Pathogene induziert oder durch Faktoren eingeleitet werden können, die durch gestresste, beschädigte oder nekrotische Zellen freigesetzt werden, wie ursprünglich von Matzinger vorgeschlagen ⁽¹⁵⁾. Jedoch muss die Natur der optimalen „Aktivierung" oder des optimalen „Gefahrensignals" kritisch noch definiert werden, obwohl in vitro-Daten anzudeuten scheinen, dass, was auch immer ihre letztendliche Natur ist, es erforderlich ist, dass sie zur Induzierung der Reifung von dendritischen Zellen und von IL 12-Herstellung durch die dendritischen Zellen, zwei Eigenschaften, die für eine optimale CD8+ T-Zellen-Antwort wichtig sind, in der Lage ist.
Bakterielle DNA, CD40-Ligand, entzündungsfördernde Mittel wie LPS, virale Infektionen, CpG-Oligodeoxynucleotide und Hitzeschockproteine können alle eine Reifung von dendritischen Zellen auslösen ^(16-19). Es ist auch bekannt, dass Lymphokine wie TNF-α und Typ 1-Interferone eine reversible Reifung der dendritischen Zellen induzieren ^(20-21). Hingegen scheint es so zu sein, dass der Überstand von aktivierten Monozyten (von Monozyten abgeleitetes Medium) ein Mittel ist, welches zur Induzierung eines stabilen Reifungszustandes in der Lage ist, dass es aber schwierig ist, seine Qualität für eine klinische Verwendung zu standardisieren ⁽²²⁾. Für eine klinische immuntherapeutische Verwendung von dendritischen Zellen scheint ein stabiler dendritischer Zell-Phänotyp, der hohe Levels an biologisch aktivem IL 12 herstellt, ideal zu sein.
Es wurde gefunden, dass poly [I]:poly [C] (Polyriboinosin:Polyribocytidylsäure), eine synthetische dsRNA (doppelsträngige RNA), einen stabilen reifen Phänotyp mit hohen Expressionslevels von CD86 und dem Reifungsmarker CD83 induziert. Der reife Phänotyp wird für 48 Stunden nach der Zytokinentfernung aufrechterhalten und diese reifen dendritischen Zellen stellen hohe Levels an IL 12 und niedrige Levels an IL 10 her ⁽²³⁾. Es scheint, dass eine Aktivierung von dendritischen Zellen mit einem mikrobiellen Reiz (z.B. CpG-Oligonucleotide) und einer Spanne von bakteriellen Reizen in der Abwesenheit eines von T-Zellen abgeleiteten Signals ausreichend ist, um wesentliche Levels an IL 12 freizusetzen ⁽²⁴⁾. Unter diesen Bedingungen regulieren dendritische Zellen die CD40-Expression nach oben, und eine anschließende Vernetzung von CD40 kann zu einer weiter gesteigerten IL12-Herstellung führen ⁽²⁴⁾. Die Vorstellung, dass die optimale Herstellung von IL 12 p70 durch dendritische Zellen eine Synergie zwischen dem CD40-Vernetzen und der mikrobiellen Stimulierung einbezieht, steht mit in vitro-Studien am Menschen im Einklang, welche zeigen, dass die Wechselwirkung zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen nicht ausreicht, um hohe Levels von IL 12-Herstellung zu induzieren, wenn nicht mikrobielle Reize und/oder Zytokine als die Zusatzstoffe verwendet werden, oder alternativ die IL 12-Herstellung durch die Wechselwirkung der dendritischen Zellen mit den T-Zellen induziert wird ^(25-26). Diese Daten betonen die Wichtigkeit eines bakteriellen Reizes bei der Herstellung von hohen Levels von IL 12 durch dendritische Zellen. Zusätzlich deuten diese Daten an, dass die Wirksamkeit von CD40 mABs ^(27-29) durch Coverabreichung eines geeigneten bakteriellen Zusatzstoffes bei der Immuntherapie verstärkt werden könnte.
Für eine klinische immuntherapeutische Verwendung besteht ein Bedarf für einen nicht toxischen Reiz von klinischer Qualität, der in der Lage ist, dendritische Zellen zur Herstellung von maximalen Levels von IL 12 zu veranlassen, wenn dendritische Zellen als zellulärer Impfstoff verwendet werden. Alternativ sollte der Reiz in der Lage sein, als ein potentieller systemischer Zusatzstoff zu einem Impfstoff, der die Förderung einer Th 1-Wirkung erfordert, gegeben werden zu können. Poly [I]:poly [C] in Dosen von bis zu 75 mg/m² intravenös sowie ihre verschiedenen stabilen Derivate (im Wesentlichen dsRNA-Komplexe mit Polylysin oder Cellulose) wurden in den neunzehnhundertsiebziger und neunzehnhundertachtziger Jahren in mehreren Phase 1- und 2-Antikrebsstudien getestet. Jedoch mussten diese Studien wegen der toxischen Wirkungen von poly [I]:poly [C], die Schock, Nierenversagen und Koagulopathien und Hyperempfindlichkeitsreaktionen einschlossen, ^(30-32) abgebrochen werden.
Modifizierungen der Strukturcharakteristika von poly [I]:poly [C] durch die Einführung von nicht gepaarten Basen (Uracil und Guanin) führten zu einmaligen dsRNAs, die als „spezifisch konfigurierte dsRNAs" oder „nicht zusammenpassende dsRNAs" bezeichnet wurden ⁽³³⁾. Es scheint, dass diese Bereiche die dsRNA-Hydrolyse beschleunigen und die Toxizität bei Menschen verringern ⁽³⁴⁾, wogegen die Fähigkeit zur Förderung der Interferonsynthese erhalten bleibt. Ampligen^® (poly [I]:poly [C₁₂U]) ist eine solche synthetische dsRNA, die regelmäßig vorkommende nicht zusammenpassende Bereiche (keine Wasserstoffbrückenbindung) entlang der helikalen dsRNA-Kette enthält. Ampligen^® übt eine immunregulatorische Aktivität, antivirale Aktivität gegen RNA- und DNA-Viren und antiproliferative Aktivität auf Tumorzellen in vitro und in vivo aus ⁽³³⁾.
Die klinische Erfahrung mit Ampligen^® beruht momentan auf insgesamt mehr als 300 Patienten. Es wurde kein Beweis einer Dosis-einschränkenden Organtoxizität, einschließlich hämatologischer, Leber- oder Nierentoxizität, beobachtet, und Ampligen^® (poly [I]:poly [C₁₂U]) wird unter GMP-Bedingungen zur klinischen Verwendung hergestellt ⁽³⁴⁾.
Der Ausdruck „spezifisch konfiguriert", wie hier verwendet, soll eine doppelsträngige RNA bezeichnen, die regelmäßig vorkommende Bereiche von nicht zusammenpassenden Basen enthält. Da zwischen den nicht zusammenpassenden Basen keine Wasserstoffbrückenbindungen vorhanden sind, ist die Doppelhelix geschwächt. Die Halbwertszeit der dsRNA ist deshalb verringert, da sie einfacher und schneller abgebaut wird, was die dsRNA für Menschen und Tiere weniger toxisch macht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von reifen dendritischen Zellen in vitro bereitgestellt, wobei das Verfahren den folgenden Schritt aufweist:
Kultivieren der unreifen dendritischen Zellen in der Gegenwart eines spezifisch konfigurierten doppelsträngigen RNA (dsRNA)-Polymers mit hohem Molekulargewicht.
Das spezifisch konfigurierte dsRNA-Polymer mit hohem Molekulargewicht kann aus der Gruppe, die aus poly [I]:poly [C_xU]; poly [I]:poly [G_xU]; poly [A]:poly [U_xC]; poly [A]:poly [U_xG]; poly [U]:poly [A_xC]; poly [U]:poly [I_xU]; poly [C]:poly [G_xA]; poly [C]:poly [G_xU]; poly [G]:poly [C_xA]; und poly [G]:poly [C_xU] besteht, ausgewählt werden, wobei x im Durchschnitt eine Zahl von 3 bis 40, und vorzugsweise 6 bis 20 ist. Stärker bevorzugt ist das dsRNA-Polymer poly [I]:poly [C₁₂U], das kommerziell unter dem Handelsnamen Ampligen^® erhältlich ist, oder poly [C]:poly [I₁₂U]. Typischerweise ist das dsRNA-Polymer poly [I]:poly [C₁₂U].
Das Molekulargewicht der dsRNA reicht typischerweise von 100 bis 2.500 kD und vorzugsweise von 300 bis 1.500 kDa.
Die unreifen dendritischen Zellen können aus einem menschlichen oder tierischen Körper isoliert werden und können von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut kultiviert werden.
Das Verfahren zur Herstellung der reifen dendritischen Zellen kann die reifen dendritischen Zellen zur Herstellung von IL 12 p70 für mehr als 19 Stunden und vorzugsweise für mehr als 43 Stunden aktivieren.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von reifen Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen in vitro bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
unreife dendritische Zellen werden einem Antigen ausgesetzt; und
die dendritischen Zellen werden gemäß dem wie im Wesentlichen vorstehend beschrieben Verfahren gereift.
Das Antigen kann ein Krebs-Antigen, zum Beispiel ein Tumor-begleitendes Antigen, sein. Das Antigen kann alternativ ein Antigen sein, das sich von einem menschlichen Parasiten, Virus oder Mikroorganismus ableitet.
Die unreifen dendritischen Zellen können dem Antigen ausreichend lange ausgesetzt werden, um die dendritischen Zellen zu veranlassen, das Antigen aufzunehmen und zu verarbeiten.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Induzierung einer zellulären Immunantwort in einem menschlichen oder tierischen Körper bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält:
unreife dendritische Zellen werden einem Antigen in vitro ausgesetzt, bis eine ausreichende Anzahl der dendritischen Zellen zu Antigen-präsentierenden Zellen wird;
die unreifen dendritischen Zellen werden gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren gereift; und
die Antigen-präsentierenden reifen dendritischen Zellen werden in eine pharmazeutisch geeignete Formulierung eingebracht.
Das Antigen kann ein krebsbegleitendes Antigen sein oder kann von einem menschlichen oder tierischen Parasiten, Virus und Mikroorganismus abgeleitet sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der Antigen-präsentierende reife dendritische Zellen enthält, die durch das im Wesentlichen wie vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurden.
Der Impfstoff kann zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren für einen Patienten mit Krebs, oder bei dem ein Virus, Parasit oder Mikroorganismus diagnostiziert wurde, dienen.
Der Impfstoff kann außerdem einen geeigneten Verdünner, Arzneimittelträger oder Hilfsstoff enthalten.
Der Impfstoff kann auch einen geeigneten bakteriellen oder systemischen Zusatzstoff enthalten.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem menschlichen oder tierischen Körper bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
Kultivieren unreifer dendritischer Zellen mit einem krebsbegleitenden Antigen, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung von Tumorantigen-präsentierenden dendritischen Zellen;
Reifen der dendritischen Zellen gemäß einem im Wesentlichen wie vorstehend beschriebenen Verfahren; und
Injizieren der Antigen-präsentierenden Zellen in den menschlichen oder tierischen Körper.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Parasiten, Virus oder Mikroorganismus in einem menschlichen oder tierischen Körper bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
Kultivieren unreifer dendritischer Zellen mit einem Parasit-, Virus- oder Mikroorganismus-begleitenden Antigen, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben, zur Herstellung von Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen;
Reifen der dendritischen Zellen gemäß einem im Wesentlichen wie vorstehend beschriebenen Verfahren; und
Injizieren der Antigen-präsentierenden Zellen in den menschlichen oder tierischen Körper.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die 1 und 2 detaillierter beschrieben.
In den Figuren zeigt:
1 das UV-Wellenlängen-Spektrum für poly [C]:poly [I₁₂U];
2 das UV-Wellenlängen-Spektrum für poly [I]:poly [C₆U];
3 das UV-Wellenlängen-Spektrum für poly [I]:poly [C₂₄U];
4 die Wirkung von poly [I]:poly [C] und Ampligen^® auf von Monozyten abgeleitete unreife dendritische Zellen, wie durch Klasse II und CD83 bestimmt wurde;
5 die Wirkungen auf die CD83- und Klasse II-Expression von dendritischen Zellen von gesunden Personen, die mit poly [I]:poly [C₆U], poly [I]:poly [C₂₄U] und poly [C]:poly [I₁₂U] behandelt wurden; und
6 den Einfluss der Reifungsmittel poly [I]:poly [C] und Ampligen^® auf dendritische Zellen und den Zeitverlauf der IL 12 p70-Herstellung durch dendritische Zellen.
Verfahren und Materialien
Quelle der dendritischen Zellen:
Mononukleare Zellen aus peripherem Blut wurden unter Verwendung von Leukophorese erhalten. Die dendritischen Zellen wurden aus adhärenten mononuklearen Zellen aus peripherem Blut (unter Verwendung eines modifizierten Verfahrens nach Romani) in serumfreiem Medium AIM-V (GIBCO) in der Gegenwart von 1000 IU/ml GM-CSF (Novartis) und 1000 IU/ml IL 4 (Pharmingen) für 6 bis 7 Tage kultiviert. Eine Population von unreifen dendritischen Zellen wurde geerntet und in zwei gleiche Aliquote aufgeteilt. Ein Aliquot wurde mit einem Reifungsmittel behandelt. Die Zellen wurden in der Kultur bei 37°C für weitere zwei Tage belassen.
Charakterisierung des Immunphänotyps der dendritischen Zelldifferenzierung
Eine durchflusszytometrische Analyse der dendritischen Zelldifferenzierung wurde an FACScan (Becton Dickinson) unter Verwendung von Fluoreszeinkonjugierten monoklonalen Antikörpern zu CD14, CD1a, CD80, CD86, CD40, CD54, CD83, Klasse I und Klasse II durchgeführt.
Endpunkte der Reifung von dendritischen Zeilen:

a) Die IL 12-Herstellung wurde unter Verwendung eines IL 12 p70-ELISA-Testkits (R&D Systems) getestet. Der Test verwendet den quantitativen Sandwichenzym-Immuntest, der zur Messung von IL 12 in Zellkulturüberständen gestaltet wurde.
b) Die CD83- und die Regulierung nach oben von Klasse II- und CD86-Expression wurden unter Verwendung von Durchflusszytometrie bestimmt.

Quelle der Reifungsmittel:

a) Poly [I]:poly [C] wurde von Sigma Ltd. (UK) erhalten;
b) Ampligen^® (poly [I]:poly [C₁₂U]) wurde von Bioclones (Pty.) Limited, Südafrika erhalten;
c) Andere spezifisch konfigurierte dsRNA-Polymere mit hohem Molekulargewicht wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt.

Verfahren zur Herstellung von Polymerkonfigurationen:
Einzelsträngige RNA (ssRNA)-Moleküle wurden durch enzymatische Polymerisation von Nucleotiddiphosphaten unter Verwendung der Enzympolynucleotidphosphorylase (EC 2.7.7.8), die aus Microccocus luteus isoliert wurde, synthetisiert. Im Falle von spezifisch konfigurierten einzelsträngigen RNAs, die mehr als ein Nucleotid enthalten, wurden die Polymere unter Verwendung der angegebenen Molverhältnisse der jeweiligen Nucleotiddiphosphate synthetisiert. Die genauen Verhältnisse im Endpolymer wurden dann bestimmt.
Die einzelsträngigen RNA-Moleküle, die synthetisiert wurden, (poly [C₆U], poly [C₂₄U] und poly [I₁₂U]) sind in Tabelle 1 aufgelistet. TABELLE 1: EINZELSTRÄNGIGE RNA-KONFIGURATIONEN
Die einzelsträngigen RNAs wurden unter Verwendung von Polynucleotidphosphorylase bei 0,4 Einheiten/ml in einem Puffer, der 0,1 M Tris pH-Wert 9,0, 0,3 M Harnstoff, 7,5 mM MgCl₂ und 0,5 mM EDTA·Na₂ und die jeweiligen Nucleosiddiphosphate (NDPs) in den richtigen Anteilen für eine Endkonzentration von 23,5 mM enthielt, synthetisiert. Die Polymerisation wurde bei 22 bis 24°C für 22 bis 40 Stunden abhängig vom Polymer durchgeführt. Während dieser Zeit wurden in-Prozeß-Proben genommen, um die Einbringung von NDP in das Polymer durch HPLC zu bestimmen. Auch wurden zu speziellen Zeiten Viskositätsmessungen durchgeführt. Am Ende der Polymerisation (normalerweise bestimmt durch den Grad der Einbringung von Nucleotiddiphosphat) wurde die Polymer-enthaltende Lösung dreifach unter Verwendung eines Millipore Minitan-Geräts, das eine Absperrmembran für ein nominales Molekulargewicht von 100.000 enthält, konzentriert. Tris, SDS und Phenol wurden dann zu der Lösung gegeben und für 3 × 60 Sekunden-Intervalle bewegt. Die Lösung wurde dann bei 5.000 UpM in einer Beckman JA10-Rotationsvorrichtung zentrifugiert, und die untere Phenolschicht wurde entfernt. Phenol, Tris und SDS wurden dann zugegeben, und das Verfahren wurde dreimal wiederholt. Nach der Phenolextraktion wurde das Polymer dann mit gekühltem Ethanol nach Zugeben von KCl bis zu einer Konzentration von 0,5 M gefällt. Der Polymerniederschlag wurde wieder gelöst und ein zweites Mal gefällt. Der zweite Polymerniederschlag wurde in Wasser gelöst und diafiltriert, zuerst gegen einen EDTA-Puffer, um jegliche Schwermetalle zu entfernen, und dann gegen Kaliumacetat und schließlich gegen 10 Volumenteile Wasser, bevor er durch einen 0,22 μm-Filter filtriert und lyophilisiert wurde.
Analyse von ssRNA
Jede Charge der ssRNA wurde wie folgt analysiert:
Größe
Man ließ die Moleküle auf Agarose-Gelelektrophorese laufen, um für ihre Anpassung an den komplementären Strang eine Abschätzung der Größe bereit zu stellen. Alle Proben wurden mit einem poly C₁₂U-Standardmaterial (Chargennummer RU040105) mit einem mittleren Sedimentationskoeffizienten von 6,8 S und einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von 500.000, wie durch Mehrfachwinkellichtstreuung bestimmt, verglichen. Basierend auf der Mobilität der Proben bei Agarose-Gelelektrophorese wurden die größte und kleinste ssRNA für eine analytische Ultrazentrifugation an einer analytischen Beckman XLA-Ultrazentrifuge ausgewählt. Das größte Polymer, poly C, wies einen mittleren Sedimentationskoeffizienten von 8,9 S auf und das kleinste, poly I₁₂U, wies einen mittleren Sedimentationskoeffizienten von 5,3 S auf. Man erwartet, dass alle verbleibenden Polymere innerhalb dieses Größenbereichs liegen.
Moläquivalente
Die Moläquivalente wurden durch Messen des Gesamtphosphors bestimmt. Dieser Wert wurde zur Bestimmung des Gewichts des Polymers verwendet, das notwendig ist, um während des Aufschmelzens eine Polymerkonzentration von 8 mM zu erreichen (d.h. 8 mM bezüglich Phosphor [1 Phosphor = 1 Monomer]). Der anorganische Phosphor wurde auch bestimmt, um eine genaue Bestimmung des organischen Phosphors sicher zu stellen.
Spektralcharakteristika
Eine UV-Wellenlängen-Auftragung wurde als ein Mittel zur Identifizierung aufgezeichnet und auch als eine Bewertung der Hypochromie über Aufschmelzen des doppelsträngigen Polymers.
Basenverhältnisse
Die Polymere wurden enzymatisch zu den eingebrachten Nucleotiden abgebaut und man ließ sie an HPLC laufen, um die Basenreinheit und auch die Basenverhältnisse von jenen Polymeren mit einer beliebigen Einbringung von mehr als einer Base in den Einzelstrang zu zeigen.
Endotoxin
Das Endotoxin wurde unter Verwendung des Cape Cod LAL-Verfahrens (da Endotoxin selbst eine Reifung von dendritischen Zellen induzieren kann, war es wichtig, dass die Polymere im Wesentlichen frei von Endotoxin waren) bestimmt.
Aufschmelzen von dsRNA
Das Aufschmelzen wurde in Ampligen^®-Puffer, der 10 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,4), 150 mM Natriumchlorid und 1 mM Magnesiumchlorid enthielt, durchgeführt. Die Polymere wurden bezüglich des organischen Gesamtphosphors bei 50°C zu 8 mM gelöst und durch Mischen von gleichen Volumina der jeweiligen komplementären ssRNA-Lösungen, Erwärmen auf 65°C für 10 Minuten und dann Kühlen auf Raumtemperatur aufgeschmolzen. Das Material wurde dann durch einen 0,22 μm-Filter filtriert und unter laminarem Fluss in Fläschchen abgefüllt.
Analyse von dsRNA
Spektral
Proben der zwei ssRNA-Lösungen, die zum Aufschmelzen hergestellt wurden, sowie die aufgeschmolzene dsRNA wurden verwendet und die UV-Wellenlängen-Profile bewertet (1 bis 3). Die hypochrome Verschiebung (im Allgemeinen bei der Peakextinktion der ssRNA) wurde als ein Hinweis für Aufschmelzen gewertet.
Endotoxin
Das Endotoxin der dsRNA wurde unter Verwendung des Cape Cod LAL-Tests bewertet.
Konzentration
Man nahm an, dass die Konzentration äquivalent zur Ausgangskonzentration der ssRNA-Einheiten war.
Tabelle 2: Analyse von dsRNA
Die verringerte hypochrome Verschiebung, die für poly [I]:poly [C₆U] erhalten wurde, kann durch die erhöhte Häufigkeit des nicht zusammenpassenden Uridins in der doppelsträngigen RNA erklärt werden, welche einen höheren Anteil an einzelsträngiger RNA in der dsRNA-Kette enthalten wird, wenn man mit einem Polymer mit stärkerer Basenpaarung wie poly [I]:poly [C₁₂U] oder poly [I]:poly [C₂₄U] vergleicht.
Experimentelle Studien
(a) Vergleich der Wirkungen bei der Reifung von dendritischen Zellen von Ampligen^® und anderen spezifisch konfigurierten dsRNA-Polymeren mit hohem Molekulargewicht und poly [I]:poly [C] auf unreife, von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen:
Ein direkter Vergleich von poly [I]:poly [C₁₂U], poly [C]:poly [I₁₂U], poly [I]:poly [C₆U], poly [I]:poly [C₂₄U] und poly [I]:poly [C] als Reifungsmittel für menschliche, von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen wurde durch FACS-Analyse, wie durch Veränderungen beim Zelloberflächen-Phänotyp bestimmt, durchgeführt.
Unreife dendritische Zellen wurden durch Kultivieren von leukophoretisierten mononuklearen Zellen aus peripherem Blut in der Gegenwart von GM-CSF und IL 4 für sieben Tage erzeugt. Der Reifungsreiz wurde in die Kultur für 48 Stunden bei einer einheitlichen Kulturbedingung eingebracht, wobei poly [I]:poly [C] bei einem Test und poly [I]:poly [C₁₂U], poly [C]:poly [I₁₂U], poly [I]:poly [C₆U] und poly [I]:poly [C₂₄U] bei den anderen Tests verwendet wurden. Durch FACS-Analyse wurde der Phänotyp der reifen dendritischen Zellen bestimmt (4 und 5). Die reifen dendritischen Zellen wurden als stark positiv für CD83 (ein Glykoprotein, das vorwiegend auf der Oberfläche von reifen dendritischen Zellen exprimiert wird) identifiziert. Auch Klasse II-Moleküle wurden nach oben reguliert, verglichen mit unreifen dendritischen Zellen (unbehandelt). Bei den getesteten Dosisievels wurde kein Beweis für eine Zelltoxizität beobachtet.
(b) Vergleich des Zeitverlaufs von poly [I]:poly [C] und Ampligen^® (und anderer spezifisch konfigurierter dsRNA-Polymere mit hohem Molekulargewicht) bei der Reifung von dendritischen Zellen und der IL 12-Herstellung:
Mononukleare Zellen wurden durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Adhärente Zellen wurden für sechs Tage in der Gegenwart von IL 4 und GM-CSF kultiviert. Die Zellen wurden nach einer Charakterisierung des Immunphänotyps (unreif) geerntet und in serumfreiem Medium in der Gegenwart von IL 4 und GM-CSF wieder kultiviert. Drei getrennte Platten der Zellen wurden wie folgt hergestellt:

Platte eins – keine Behandlung;
Platte zwei – poly [I]:poly [C] (100 μg/ml);
Platte drei – poly [I]:poly [C₁₂U] (250 μg/ml).

Sieben Stunden nach der Zugabe des Reifungsmittels wurde das Kulturmedium von jeder Platte entfernt und frisches Medium ohne das Reifungsmittel wurde zugegeben. Dies wurde in Zeitintervallen wiederholt, und die IL 12-Herstellung wurde in jedem gesammelten Kulturüberstand bestimmt.
Ergebnisse
Reifungswirkung:
Die FACS-Analyseergebnisse, die poly [I]:poly [C₁₂U], poly [C]:poly [I₁₂U], poly [I]:poly [C₆U], poly [I]:poly [C₂₄U] und poly [I]:poly [C] als Reifungsmittel für menschliche, von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen vergleichen, sind in den 4 und 5 zusammengefasst und veranschaulicht.
Verglichen mit den unbehandelten dendritischen Zellen verursachten poly [I]:poly [C], Ampligen^®, poly [C]:poly [I₁₂U], poly [I]:poly [C₆U] und poly [I]:poly [C₂₄U] einen signifikant höheren Expressionslevel der zwei Marker, wobei eine höhere Amplitudenantwort mit Ampligen^®, poly [C]:poly [I₁₂U], poly [I]:poly [C₆U] und poly [I]:poly [C₂₄U] in Zusammenhang steht.
IL 12 (p70)-Herstellung:
Bei einer Untersuchung über den Zeitverlauf stellten die unbehandelten dendritischen Zellen kein IL 12 her, wie durch die spezifische ELISA-Technik nachweisbar war. Das poly [I]:poly [C] und Ampligen^® zeigten bei 4 Stunden keine IL 12-Herstellung. Jedoch verursachten sie beide bei 19 Stunden wesentliche und gleich hohe Levels an IL 12. Der IL 12-Level war darauffolgend bei 27 Stunden niedriger und der Abfall hielt bei 43 Stunden an. Der Gesamtabfall des Herstellungslevels zu jedem Zeitpunkt war verglichen mit Ampligen^® bei poly [I]:poly [C] ausgeprägter.
Die Ergebnisse zeigen zum ersten Mal das Vermögen von Ampligen^® sowohl eine Phänotypreifung von dendritischen Zellen als auch eine Aktivierung der IL 12-Herstellung in diesen Zellen zu verursachen. Ampligen^® zeigte auch ein größeres Vermögen zur Reifung von dendritischen Zellen, verglichen mit poly [I]:poly [C]. Darüber hinaus scheint die durch Ampligen^® induzierte IL 12-Herstellung für einen längeren Zeitraum unterhalten zu werden, verglichen mit der, die mit poly [I]:poly [C] zusammenhängt.
Die Gesamtbefunde weisen darauf hin, dass Ampligen^® mit seinem nicht toxischen klinischen Profil ein wesentliches Potential als ein Mittel zur Verursachung der Reifung von dendritischen Zellen und Aktivierung der IL 12-Herstellung aufweist, zwei Merkmale, von welchen man annimmt, dass sie wichtig sind beim optimalen Starten und Induzieren von Antigen-spezifischer zytotoxischer T-Zellen-Antwort durch dendritische Zellen mit Antigen-Primern. Da Ampligen^® in klinischer Qualität hergestellt wird und ein nicht toxisches klinisches Profil aufweist, ist es darüber hinaus zur Verwendung zusammen mit dendritischen Zellen, die in einem Impfstoff verwendet werden sollen, geeignet.
Ein Impfstoff zur Stimulierung der zellulären Immunantwort bei Patienten, bei denen Krebs diagnostiziert wurde, kann hergestellt werden. Bei dem Herstellungsverfahren des Impfstoffes werden unreife dendritische Zellen den Tumorbegleitenden Antigenen des Patienten ausgesetzt, um Tumorantigenpräsentierende unreife dendritische Zellen herzustellen. Die Antigenpräsentierenden dendritischen Zellen werden dann in der Gegenwart von Ampligen^® durch das vorstehend beschriebene Verfahren gereift und dann in ein Arzneimittel in der Form eines Impfstoffes eingebracht. Der Impfstoff kann dann dem Patienten injiziert werden, wobei erwartet wird, dass die reifen dendritischen Zellen zu den regionalen Lymphknoten des Patienten wandern, um eine CTL-Antwort zu induzieren.
Die Anmelderin nimmt an, dass poly [I]:poly [C₁₂U], poly [C]:poly [I₁₂U], poly [I]:poly [C₆U] und poly [I]:poly [C₂₄U] für die Klasse von spezifisch konfigurierten dsRNA-Polymeren mit hohem Molekulargewicht repräsentativ sind, und aufgrund der gezeigten Ergebnisse kann man erwarten, dass andere spezifisch konfigurierte dsRNA-Polymere mit hohem Molekulargewicht ebenfalls zur Reifung von dendritischen Zellen geeignet sein werden. Beispiele von solchen spezifisch konfigurierten dsRNA-Polymeren mit hohem Molekulargewicht sind poly [I]:poly [C_xU]; poly [I]:poly [G_xU]; poly [A]:poly [U_xC]; poly [A]:poly [U_xG]; poly [U]:poly [A_xC]; poly [U]:poly [I_xU]; poly [C]:poly [G_xA]; poly [C]:poly [G_xU]; poly [G]:poly [C_xA]; und poly [G]:poly [C_xU], wobei x im Durchschnitt eine Zahl von 3 bis 40, vorzugsweise 6 bis 20 ist, und die dsRNAs im Durchschnitt ein Molekulargewicht von 100 bis 2.500 kDa und vorzugweise 300 bis 1.500 kDa aufweisen.
BEZUGNAHMEN

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Claims

Ein Verfahren zur Herstellung reifer dendritischer Zellen in vitro, welches folgenden Schritt enthält: Kultivierung der unreifen dendritischen Zellen in der Gegenwart eines spezifisch konfigurierten doppelsträngigen RNA (dsRNA)-Polymers mit hohem Molekulargewicht.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das spezifisch konfigurierte dsRNA-Polymer mit hohem Molekulargewicht aus der Gruppe, die aus poly[I]:poly [C_xU]; poly [I]:poly [G_xU]; poly [A]: poly [U_xC]; poly [A]:poly [U_xG]; poly [U]:poly [A_xC]; poly [U]:poly [I_xU]; poly [C]:poly [G_xA]; poly [C]:poly [G_xU]; poly [G]:poly [C_xA]; und poly [G]:poly [C_xU] besteht, ausgewählt wird, wobei x im Durchschnitt eine Zahl von 3 bis 40 ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei x eine Zahl von 6 bis 20 ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das dsRNA-Polymer aus der Gruppe, die aus poly [I]:poly [C₁₂U] und poly [C]:poly [I₁₂U] besteht, ausgewählt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Molekulargewicht der dsRNA von 100 bis 2.500 kDa, vorzugsweise von 300 bis 1.500 kDa reicht.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die aus einem menschlichen oder tierischen Körper isolierten unreifen dendritischen Zellen von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut kultiviert werden.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, welches die reifen dendritischen Zellen aktiviert, um IL 12 p70 für mehr als 19 Stunden, und vorzugsweise für mehr als 43 Stunden herzustellen.
Ein Verfahren zur Herstellung reifer Antigen-präsentierender dendritischer Zellen in vitro, welches die folgenden Schritte enthält: unreife dendritische Zellen werden einem Antigen ausgesetzt; und die dendritischen Zellen werden gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 gereift.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Antigen ein Krebs-Antigen ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei das Antigen aus der Gruppe, die aus Antigenen besteht, die von einem menschlichen oder tierischen Parasiten, Virus und Mikroorganismus abgeleitet sind, ausgewählt wird.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die unreifen dendritischen Zellen dem Antigen ausreichend lange ausgesetzt werden, um die dendritischen Zellen zu veranlassen, das Antigen aufzunehmen und zu verarbeiten.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Induzierung einer zellulären Immunantwort in einem menschlichen oder tierischen Körper, welches die folgenden Schritte enthält: unreife dendritische Zellen werden einem Antigen in vitro ausgesetzt, bis eine ausreichende Anzahl der dendritischen Zellen zu Antigen-präsentierenden Zellen wird; die unreifen dendritischen Zellen werden gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 gereift; und die Antigen-präsentierenden reifen dendritischen Zellen werden in eine pharmazeutisch geeignete Formulierung eingebracht.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Antigen aus der Gruppe, die aus krebsbegleitenden Antigenen und Antigenen, die von einem menschlichen oder tierischen Parasiten, Virus und Mikroorganismus abgeleitet sind, besteht, ausgewählt wird.
Ein Impfstoff, der Antigen-präsentierende reife dendritische Zellen enthält, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 hergestellt wurden.
Ein Impfstoff gemäß Anspruch 14 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren für einen Patienten, bei dem Krebs, ein Virus, Parasit oder Mikroorganismus diagnostiziert wurde.
Ein Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, der außerdem einen geeigneten Verdünner, Arzneimittelträger, Hilfsstoff oder bakteriellen oder systemischen Zusatzstoff enthält.
Die Verwendung eines spezifisch konfigurierten doppelsträngigen RNA (dsRNA)-Polymers mit hohem Molekulargewicht in einem Verfahren zur Herstellung eines in einem Krebsbehandlungsverfahren in einem menschlichen oder tierischen Körper zu verwendenden Medikaments, welches die folgenden Schritte enthält: Kultivieren unreifer dendritischer Zellen mit einem krebsbegleitenden Antigen zur Herstellung Tumorantigen-präsentierender dendritischer Zellen; und Reifen der dendritischen Zellen in der Gegenwart der spezifisch konfigurierten dsRNA mit hohem Molekulargewicht gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Die Verwendung eines spezifisch konfigurierten doppelsträngigen RNA (dsRNA)-Polymers mit hohem Molekulargewicht in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Parasiten, Virus oder Mikroorganismus in einem menschlichen oder tierischen Körper, welches die folgenden Schritte enthält: Kultivieren unreifer dendritischer Zellen mit einem Parasiten-, Virus- oder Mikroorganismus-begleitenden Antigen zur Herstellung Antigen-präsentierender dendritischer Zellen; und Reifen der dendritischen Zellen in der Gegenwart der spezifisch konfigurierten dsRNA mit hohem Molekulargewicht gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Die Verwendung eines spezifisch konfigurierten doppelsträngigen RNA-Polymers mit hohem Molekulargewicht gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei das Polymer aus der Gruppe, die aus poly [I]:poly [C₆U]; poly [I]:poly [C₂₄U], und poly [C]:poly [I₁₂U] besteht, ausgewählt wird.