ES2263806T3

ES2263806T3 - Procedimiento para la maduracion de celulas dendriticas y una vacuna.

Info

Publication number: ES2263806T3
Application number: ES02758675T
Authority: ES
Inventors: Malcolm Adams; Cyril Donninger
Original assignee: BIOCLONES Pty Ltd
Current assignee: BIOCLONES Pty Ltd
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2002-08-08
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2022-08-08
Also published as: CA2457322A1; DE60209915D1; WO2003014335A1; EP1417300B1; CA2457322C; US20040253722A1; US7981673B2; MXPA04001152A; EP1417300A1; GB0119346D0; AU2002324255B2; ZA200401842B; DE60209915T2; ATE320481T1; JP2004538000A; DK1417300T3; BR0212016A

Abstract

Un método para producir células dendríticas maduras in vitro, comprendiendo el método la etapa de: cultivar las células dendríticas inmaduras en presencia de un polímero de RNA de doble hebra (dsRNA) de alto peso molecular específicamente configurado.

Description

Procedimiento para la maduración de células dendríticas y una vacuna.

Esta invención se refiere a un método para madurar células dendríticas humanas, a un método para potenciar la producción de interleuquina 12 (IL 12) a partir de células dendríticas maduras y a una vacuna que contiene células dendríticas maduras que producen niveles potenciados de IL 12.

Se ha establecido que los linfocitos de células T (CTL) CD8+ citotóxicos pueden reconocer y destruir células tumorales que presentan antígeno tumoral sobre la superficie celular junto con moléculas del MHC (complejo principal de histocompatibilidad) clase I ^{(1)}. Sin embargo, en la mayoría de los pacientes que están diagnosticados de cáncer, la respuesta inmunitaria celular del paciente no está suficientemente activada en respuesta a antígenos tumorales, y por lo tanto el cuerpo del paciente es incapaz de destruir adecuadamente las células tumorales y así defenderse de la extensión adicional del cáncer. Por lo tanto, los pacientes pueden ser tratados con quimioterapia o terapia de radiación, ambas de las cuales pueden destruir indiscriminadamente las células normales y pueden provocar efectos secundarios tóxicos significativos en el paciente. Si la respuesta inmunitaria celular pudiera ser suficientemente activada por antígenos tumorales, entonces sería posible que el cuerpo del paciente fuera capaz de erradicar las células tumorales por sí mismo, sin los efectos secundarios no deseables asociados con tipos convencionales de tratamiento del cáncer.

Por lo tanto, existe una necesidad de activar terapéuticamente el sistema inmunitario celular de un paciente con cáncer de modo que responda a antígenos asociados con tumores.

Las células dendríticas están entre las células que presentan antígeno más poderosas para excitar tanto células T (CTL) citotóxicas CD8+ como respuestas de cooperadores T (Th1) CD4+ ^{(2)}. Son capaces de capturar y procesar antígenos y migrar a los nódulos linfáticos regionales para inducir respuestas de células T CD8+ ^{(2)}. Tienen la capacidad de presentar cruzadamente antígenos exógenos en el contexto de moléculas del MHC clase I presentes sobre la superficie celular ^{(3)}. Estas características reunidas permiten a las células dendríticas presentar antígeno de una manera que es capaz de excitar respuestas de células T tanto CD8+ como CD4+, proporcionando una base lógica para el uso de células dendríticas como una vacuna celular. Sin embargo, para esto es necesario tener células dendríticas disponibles en números suficientes y en un estado cargado con antígeno funcionalmente óptimo.

Estudios en múridos han apoyado las capacidades inmunizantes de células dendríticas derivadas de la médula ósea propagadas in vitro con GM-CSF e interleuquina 4 (IL4), e impulsadas con los epítopos asociados a tumores definidos para CTL pertinentes ^{(4, \ 5)}. Estos estudios han demostrado que las células dendríticas excitadas con péptidos antigénicos asociados a tumores definidos son capaces de erradicar tumores establecidos que expresan los antígenos tumorales apropiados. Se ha mostrado que estas respuestas antitumorales mediadas por células dendríticas en modelos animales dependen de respuestas de cooperadores T CD4+ (MHC clase II) así como CD8+ (MHC clase I) y también de la producción de lifonquinas Th1 ^{(5)}.

Estos estudios en animales han conducido a un número de experimentos clínicos en seres humanos de fase I que usan células dendríticas autólogas maduras e inmaduras cargadas con antígenos tumorales. Por ejemplo Nestle y otros ^{(6)} han tratado a 16 pacientes con melanoma metastático con células dendríticas derivadas de monocitos GM-CSF/IL 4 inmaduras desarrolladas en suero de ternero fetal. Se observó respuesta clínica en 5 de 16 pacientes habitualmente duradera (2 respuestas completas y 3 respuestas parciales) con metástasis en la piel, los tejidos blandos, el pulmón y el páncreas. Las células dendríticas derivadas de monocitos impulsadas con péptidos específicos para el tumor MAGE-3 y maduradas con TNF-\alpha inducían de forma similar respuestas en 6 de 11 pacientes con metástasis de piel, nódulos linfáticos, pulmón e hígado ^{(7)}. Se observó una expansión significativa de células T CD8+ específicas para MAGE-3 HLA A1 en 6 de 11 pacientes y la respuesta de metástasis de piel se asoció con un infiltrado de células T CD8+.

También se ha reunido una evidencia que apoya la eficacia de células dendríticas como agentes inmunoterapéuticos a partir de experimentos clínicos que implican pacientes con cánceres metastáticos procedentes de otros tipos de tumores primarios. La inmunización con células dendríticas preparadas a partir de la fusión de monocitos alogeneicos y células tumorales autólogas, y maduradas con TNF-\alpha, fue satisfactoria para inducir respuestas inmunitarias celulares en 7 de 11 pacientes con carcinoma de células renales metastático, incluyendo 4 remisiones completas ^{(8)}. Se han empleado células dendríticas inmaduras GM-CSF/IL 4 impulsadas con antígeno de membrana prostático P1 y P2 en 37 pacientes con cáncer de próstata avanzado. Se observaron una respuesta completa y 10 respuestas parciales (> 50% de reducción en el nivel de PSA o una resolución significativa en una exploración ósea) ^{(9)}. En una serie de 9 pacientes ^{(10)} con cáncer cervical avanzado que eran tratadas con células dendríticas GM-CSF/IL 4 inmaduras impulsadas con CTL específicos para HPV específicos de lisado de tumor positivo a HPV 16 alogeneicos, se demostró respuesta en sangre periférica en 2 de 2 pacientes evaluables (HPV 16+ HLA 002*) después de la vacunación. En un paciente, la frecuencia de HPV 16E7 (11-20) ascendía hasta 2,2% según se detectaba mediante tetrámeros de clase 1 y en el otro paciente el ensayo de IFN-\gamma ELISPOT revelaba una respuesta específica a 4 epítopos de CTL derivados de HPV 16 E6 y 7, 1 semana y 2 meses, respectivamente, después de la vacunación. En uno de 4 pacientes HPV 16 + evaluables también se observaba una respuesta de cooperadores T específica. La inmunidad de células T que se detectaba mediante ELISPOT se correlacionaba con la respuesta DTH a lisado tumoral y estos pacientes seguían un resultado clínico favorable (NED de enfermedad 18 meses o más después de la resección de metástasis pulmonar, enfermedad estable durante 3 meses o más después de la progresión).

Por lo tanto, es factible inducir respuestas de clase I y cooperadores T específicas clínicamente pertinentes en pacientes con metástasis procedentes de una variedad de tipos de cáncer usando células dendríticas derivadas de monocitos impulsadas con una variedad de antígenos asociados a tumores. Sin embargo, actualmente no existe consenso con respecto a la definición del fenotipo inmunológicamente activo, la dosis, la ruta y el método de carga para la inmunización óptima del cáncer con células dendríticas ^{(11)}.

Parece que las células dendríticas maduras son propensas a ser más eficaces para presentar antígenos y activar la respuesta de CTL y cooperadores T que las células dendríticas inmaduras ^{(2)}. Aunque se han observado respuestas anticancerosas clínicas después de la inmunización con células dendríticas inmaduras, es probable que en estos pacientes las células dendríticas puedan haber sido maduradas en algún punto in vivo por un estímulo todavía no definido. Las células dendríticas adquieren normalmente antígenos de tejidos periféricos en su estado inmaduro. La maduración se caracteriza por la regulación a la baja de su capacidad de adquisición de antígeno, la expresión incrementada de MHC y moléculas coestimulantes sobre sus superficies, el nivel elevado de su producción de IL 12 por ellas y la expresión alterada de receptores de quimoquina ^{(12)}.

Así, un medio para la maduración deliberada de células dendríticas in vitro antes de su uso para la vacunación puede ofrecer la ventaja de un fenotipo con una capacidad migratoria óptima a nódulos linfáticas para excitar células T en los nódulos linfáticos, una capacidad de producción de linfoquina Th1 ^{(13)} óptima así como un estado funcional es-
table que es menos susceptible a las influencias tolerogénicas asociadas con el cáncer, tales como interleuquina 10 ^{(14)}.

Crítica para si las células T son activadas o energizadas mediante interacción con células dendríticas parece ser la naturaleza de la "activación" o "señal de peligro", que puede ser inducida por patógenos o puesta en marcha por factores liberados por células estresadas, dañadas o necróticas según fue propuesto originalmente por Matzinger ^{(15)}. Sin embargo, la naturaleza de la "activación" o "señal del peligro" óptima todavía tiene que definirse, aunque los datos in vitro parecen sugerir que cualquiera que sea su naturaleza final, requiere que sea capaz de inducir la maduración de células dendríticas y la producción de IL 12 por las células dendríticas, dos propiedades que son importantes para la respuesta óptima de células T CD8+.

DNA bacteriano, ligando CD40, agentes proinflamatorios tales como LPS, infecciones virales, CpG-oligodesoxinucleótidos y proteínas de choque térmico pueden todos iniciar la maduración de células dendríticas ^{(16-19)}. También se sabe que linfoquinas tales como TNF-\alpha e interferones tipo 1 inducen la maduración reversible de las células dendríticas ^{(20-21)}. En contraste, el sobrenadante de monocitos (medio derivado de monocitos) activados parece ser un agente incapaz de inducir un estado de maduración estable, pero es difícil estandarizar su calidad para uso clínico ^{(22)}. Para la aplicación inmunoterapéutica clínica de células dendríticas, parece ser ideal un fenotipo de células dendríticas estables que produzca altos niveles de IL 12 biológicamente activa.

Se ha encontrado que poli [I]:poli [C] (poli(ácido riboinosínico):poli(ácido ribocitidílico)), un dsRNA (RNA de doble hebra) sintético, induce un fenotipo maduro estable con altos niveles de expresión de CD86 y el marcador de maduración CD83. El fenotipo maduro se retiene durante 48 horas después de la retirada de citoquina y estas células dendríticas maduras producen altos niveles de IL 12 y bajos niveles de IL 10 ^{(23)}. La activación de células dendríticas con un estímulo microbiano (por ejemplo, CpG-oligonucleótidos) y una gama de estímulos bacterianos en ausencia de una señal derivada de células T parece ser suficiente para liberar niveles significativos de IL 12 ^{(24)}. Bajo estas condiciones, las células dendríticas regulan al alza la expresión de CD40 y la reticulación subsiguiente de CD40 puede dar como resultado una producción más potenciada de IL 12 ^{(24)}. La noción de que la producción óptima de p70 de IL 12 por células dendríticas implica sinergia entre la reticulación de CD40 y la estimulación microbiana es compatible con estudios in vitro en seres humanos que demuestran que la interacción entre células T y células que presentan antígeno no es suficiente para producir altos niveles de producción de IL 12 a no ser que se usen estímulos microbianos y/o citoquinas como adyuvantes, o, alternativamente, la producción de IL 12 es inducida por la interacción de las células dendríticas con las células T ^{(25-26)}. Estos datos resaltan la importancia de los estímulos bacterianos en la producción de altos niveles de IL 12 por células dendríticas. Además, estos datos sugieren que la potencia de mABs de CD40 ^{(27-29)} podría aumentarse mediante la coadministración de un adyuvante bacteriano apropiado en la imunoterapia.

Para la aplicación inmunoterapéutica clínica existe una necesidad de un estímulo atóxico y de calidad clínica capaz de inducir a las células dendríticas a producir niveles máximos de IL 12 cuando las células dendríticas se usan como una vacuna celular. Alternativamente, el estímulo debe ser capaz de aplicarse como un adyuvante sistémico potencial a una vacuna, lo que requiere la promoción de un efecto Th1. Poli [I]:poli [C] en dosis de hasta 75 mg/m^{2} intravenosamente, así como sus diversos derivados estables (principalmente complejos de dsRNA con polilisina o celulosa) se probaron en los 1970 y 1980 en un número de experimentos contra el cáncer de fase 1 y 2. Sin embargo, estos experimentos tuvieron que abandonarse debido a los efectos tóxicos de poli [I]:poli [C], que incluían choque, fallo renal y coagulopatías y reacciones de hipersensibilidad ^{(30-32)}.

Modificaciones en las características estructurales de poli [I]:poli [C] mediante la introducción de bases desapareadas (uracilo y guanina) ha dado como resultado dsRNAs únicos, denominados "dsRNAs específicamente configurados" o "dsRNAs desacoplados" ^{(33)}. Estas regiones parecen acelerar la hidrólisis de dsRNA y reducir la toxicidad en seres humanos ^{(34)}, mientras que retienen la capacidad para promover la síntesis de interferones. Ampligen® (poli [I]:poli [C_{12}U]) es uno de tales dsRNA sintéticos que contienen regiones regularmente presentes de desacoplamiento (sin unión de hidrógeno) a lo largo de la cadena de dsRNA helicoidal. Ampligen® ejerce actividad inmunorreguladora, actividad antiviral contra virus de RNA y DNA y actividad antiproliferativa de células tumorales in vitro e in vivo ^{(33)}.

La experiencia clínica con Ampligen® actualmente totaliza más de 300 pacientes. No se ha observado evidencia de toxicidad para los órganos limitativa de la dosis, incluyendo toxicidad hematológica, hepática o renal y Ampligen® (poli [I]:poli [C_{12}U]) se prepara bajo condiciones GMP para uso clínico ^{(34)}.

El término "configurado específicamente", según se usa aquí, pretender referirse a un RNA de doble hebra que contiene regiones presentes regularmente de bases desacopladas. Como no existen enlaces de hidrógeno entre las bases desacopladas, la doble hélice está debilitada. Por lo tanto, la semivida del dsRNA se reduce debido a que se degrada más fácilmente y rápidamente, haciendo al dsRNA menos tóxico para seres humanos y animales.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para producir células dendríticas maduras in vitro, comprendiendo el método la etapa de:

: cultivar las células dendríticas inmaduras en presencia de un polímero de RNA de doble hebra (dsRNA) de alto peso molecular específicamente configurado.

El polímero de dsRNA de alto peso molecular específicamente configurado puede seleccionarse del grupo que comprende poli [I]:poli [C_{x}U]; poli [I]:poli [G_{x}U]; poli [A]:poli [U_{x}C]; poli [A]:poli [U_{x}G]; poli [U]:poli [A_{x}C]; poli [U]:poli [I_{x}U]; poli [C]:poli [G_{x}A]; poli [C]:poli [G_{x}U]; poli [G]:poli [C_{x}A] y poli [G]:poli [C_{x}U], donde x es de media un número de 3 a 40, y preferiblemente de 6 a 20. Más preferiblemente, el polímero de dsRNA es poli [I]:poli [I_{12}U], que está disponible comercialmente bajo el comercial Ampligen®, o poli [C]:poli [I_{12}U]. Típicamente, el polímero de dsRNA es poli [I]:poli [C_{12}U].

El peso molecular del dsRNA es típicamente de 100 a 2500 kDa y preferiblemente de 300 a 1500 kDa. Las células dendríticas inmaduras pueden aislarse de un cuerpo de ser humano o animal y pueden cultivarse a partir de células mononucleares de sangre periférica.

El método para producir las células dendríticas maduras puede activar las células dendríticas maduras para producir p70 de IL 12 durante más de 19 horas, y preferiblemente durante más de 43 horas.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para producir células dendríticas que presentan antígeno maduras in vitro, incluyendo el método las etapas de:

: exponer células dendríticas inmaduras a un antígeno; y

: madurar las células dendríticas de acuerdo con el procedimiento substancialmente según se describe anteriormente.

El antígeno puede ser un antígeno de cáncer, por ejemplo un antígeno asociado a tumor. El antígeno puede ser alternativamente un antígeno derivado de un parásito, virus o microorganismo de ser humano.

Las células dendríticas inmaduras pueden exponerse al antígeno durante un tiempo suficiente para inducir a las células dendríticas a capturar y procesar el antígeno.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para elaborar una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria celular en un cuerpo de un ser humano o un animal, incluyendo el método las etapas de:

: exponer células dendríticas inmaduras a un antígeno in vitro hasta que un número suficiente de las células dendríticas se convierte en células que presentan antígeno;

: madurar las células dendríticas inmaduras de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente; e

: incluir las células dendríticas maduras que presentan antígeno en una formulación farmacéuticamente aceptable.

El antígeno puede ser un antígeno asociado al cáncer o puede derivarse se un parásito, virus o microorganismo de ser humano o animal.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una vacuna que incluye células dendríticas maduras que presentan antígeno producidas mediante el método substancialmente que se describe anteriormente.

La vacuna puede ser para usar en un método para tratar a un paciente con cáncer o diagnosticado con un virus, un parásito o un microorganismo.

La vacuna puede incluir además un diluyente, excipiente o agente auxiliar adecuado.

La vacuna también puede incluir un adyuvante bacteriano o sistémico adecuado.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención se proporciona un método para tratar el cáncer en el cuerpo de un ser humano o un animal, incluyendo el método las etapas de:

: cultivar células dendríticas inmaduras con un antígeno asociado al cáncer substancialmente como se describe anteriormente a fin de producir células dendríticas que presentan antígeno tumoral;

: madurar las células dendríticas de acuerdo con un procedimiento substancialmente como el descrito anteriormente; e

: inyectar el cuerpo del ser humano o el animal con las células que presentan antígeno.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención se proporciona un método para tratar un parásito, un virus o un microorganismo en el cuerpo de un ser humano o un animal, incluyendo el método las etapas de:

: cultivar células dendríticas inmaduras con un antígeno asociado al parásito, el virus o el microorganismo substancialmente como se describe anteriormente a fin de producir células dendríticas que presentan antígeno;

Descripción de la invención

La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a las Figuras 1 y 2.

En las figuras:

la Figura 1 muestra el espectro de longitud de onda UV para poli [C]:poli [I_{12}U];

la Figura 2 muestra el espectro de longitud de onda UV para poli [I]:poli [C_{6}U];

la Figura 3 muestra el espectro de longitud de onda UV para poli [I]:poli [C_{24}U];

la Figura 4 muestra el efecto de poli [I]:poli [C] y Ampligen® sobre células dendríticas derivadas de monocitos inmaduras según se determina mediante la clase II y CD83;

la Figura 5 muestra los efectos sobre la expresión de CD83 y clase II de células dendríticas procedentes de individuos sanos tratados con poli [I]:poli [C_{6}U], poli [I]:poli [C_{24}U] y poli [C]:poli [I_{12}U]; y

la Figura 6 muestra la influencia de los agentes de maduración poli [I]:poli [C] y Ampligen® sobre células dendríticas y el transcurso del tiempo de la producción de p70 de IL 12 mediante células dendríticas.

Métodos y Materiales Fuente de células dendríticas

Las células mononucleares de sangre periférica se obtuvieron usando leucoforesis. Las células dendríticas se cultivaron a partir de células mononucleares de sangre periférica adherentes (usando el método de Romani modificado) en medio AIM-V (GIBCO) libre de suero en presencia de 1000 UI/ml de GM-CSF (Novartis) y 1000 UI/ml de IL 4 (Pharmingen) durante de 6 a 7 días. Una población de células dendríticas inmaduras se recogió y se dividió en dos partes alícuotas iguales. Una parte alícuota se trató con un agente de maduración. Las células se dejaron en cultivo a 37ºC durante dos días más.

Caracterización inmunofenotípica de la diferenciación de células dendríticas

El análisis citométrico de flujo de la diferenciación de células dendríticas se realizó en FACScan (Becton Dickinson) usando anticuerpos monoclonales conjugados a fluoresceína para CD14, CD1a, CD80, CD86, CD40, CD54, CD83, clase I y clase II.

Puntos finales de la maduración de células dendríticas:

a): La producción de IL 12 se ensayó usando un ensayo de estuche de ELISA para p70 de IL 12 (R&D Systems). El ensayo emplea el inmunoensayo enzimático cuantitativo tipo sándwich diseñado para medir IL 12 en sobrenadantes de cultivo celular.

b): CD83 y la regulación al alza de la expresión de clase II y CD86 se determinaron usando citometría de flujo.

Fuente de agentes de maduración

a): Poli [I]:poli [C] se obtuvo de Sigma Ltd (UK);

b): Ampligen® (poli [I]:poli [C_{12}U]) se obtuvo de Bioclones (Pty) Limited, Sudáfrica;

c): Otros polímeros de dsRNA de alto peso molecular específicamente configurados se prepararon como se describe posteriormente.

Procedimiento para fabricar configuraciones de polímeros

Se sintetizaron moléculas de RNA de una sola hebra (ssRNA) mediante polimerización enzimática de difosfatos de nucleótido usando la enzima polinucleótido fosforilasa (EC 2.7.7.8) aislada de Microccocus luteus. En el caso de RNAs de una sola hebra configurados específicamente, que contenían más de un nucleótido, los polímeros se sintetizaron usando las relaciones molares indicadas de los difosfatos de nucleótido respectivos. Las relaciones exactas en el polímero final se determinaron a continuación.

Las moléculas de RNA de una sola hebra que se sintetizaban (poli [C_{6}U], poli [C_{24}U] y poli [I_{12}U]) se listan en la Tabla 1.

TABLA 1 Configuraciones de RNA de una sola hebra

Configuración de ssRNA	Partida Nº	Fos. Total	Endotoxina
Poli [I]	990420R	2,5
Poli [C_{6}U]*^{(4 . 5:1)}	20020610F	2,8	0,044
Poli [C_{24}U]*^{(21 . 6:1)}	20020610G	3,1	0,044
Poli [C]	20020527E	2,8	0,991
Poli [I_{12}U]	20020603E	2,4	0,031

* relación de masas = \frac{relación \ deseada - 1.2324}{1.0536}

\begin{minipage}[t]{155mm} La relación de NDP se ha corregido usando la fórmula precedente. La fórmula se basa en determinaciones históricas de la incorporación de CDP y UDP en polímeros de ssRNA mediante polinucleótido fosforilasa. \end{minipage}

Los RNAs de una sola hebra se sintetizaron usando polinucleótido fosforilasa a 0,4 unidades/ml en un tampón que contenía Tris 0,1 M, pH 9,0, urea 0,3 M, MgCl_{2} 7,5 mM y EDTA.Na_{2} 0,5 mM y los difosfatos de nucleósido (NDPs) respectivos en las proporciones correctas hasta una concentración final de 23,5 mM. La polimerización se llevó a cabo a 22-24ºC durante de 22 a 40 horas, dependiendo del polímero. Durante este tiempo, las muestras en procesamiento se retiraron para determinar la incorporación de NDP al polímero mediante HPLC. También se tomaron medidas de viscosidad en momentos específicos. Al final de la polimerización (normalmente determinado por el grado de incorporación de difosfato de nucleótido), la solución que contenía polímero se concentraba tres veces usando un aparato Millipore Minitan que contenía una membrana de separación de peso molecular nominal 100.000. Se añadieron a continuación Tris, SDS y fenol a la solución y se agitaron durante intervalos de 3 x 60 segundos. La solución se centrifugó a continuación a 5000 rpm en un rotor Beckman JA10 y la capa fenólica inferior se retiró. Se añadieron a continuación fenol, Tris y SDS y el procedimiento se repitió tres veces. Después de la extracción de fenol, el polímero se precipitó a continuación con etanol refrigerado después de añadir KCl hasta una concentración de 0,5 M. El precipitado de polímero se redisolvió y se precipitó una segunda vez. El segundo precipitado de polímero se disolvió en agua y se diafiltró, en primer lugar frente a un tampón de EDTA para retirar cualesquiera metales pesados y a continuación frente a acetato potásico, y finalmente frente a 10 volúmenes de agua, antes de filtrarse a través de un filtro de 0,22 \mum y liofilizarse.

\newpage

Análisis de ssRNA

Cada partida de ssRNA se analizó como sigue:

Tamaño

Las moléculas se trasladaron en electroforesis en gel de agarosa para proporcionar una estimación del tamaño con propósitos de adaptarlas con la hebra complementaria. Todas las muestras se compararon con un material de poli C_{12}U estándar (Número de Partida RU040105) con un coeficiente de sedimentación medio de 6,8 S y un peso molecular medio numérico de 500.000 según se determinaba mediante dispersión de luz multiangular. Basándose en la movilidad de las muestras en la electroforesis en gel de agarosa, los ssRNAs mayor y menor se seleccionaron para ultracentrifugación analítica en una ultracentrífuga analítica Beckman XLA. El mayor polímero, poli C, tenía un coeficiente de sedimentación medio de 8,9 S y el menor, poli I_{12}U, tenía un coeficiente de sedimentación medio de 5,3 S. Se esperaba que todos los polímeros restantes estuvieran dentro de este intervalo de tamaño.

Equivalentes molares

Los equivalentes molares se determinaron midiendo fósforo total. Este valor se usó para determinar la masa de polímero requerida para alcanzar una concentración de polímero de 8 mM durante la reasociación (es decir, 8 mM con respecto al fósforo [1 fósforo = 1 monómero]. También se determinó el fósforo inorgánico para asegurar la determinación exacta del fósforo orgánico.

Características espectrales

Se registró una gráfica de la longitud de onda UV como un medio de identificación y también como una determinación de la hipocromicidad durante la reasociación del polímero de doble hebra.

Relaciones de bases

Los polímeros se digirieron enzimáticamente hasta los nucleótidos incorporados y se trasladaron en HPLC para demostrar la pureza de las bases y también las relaciones de bases de esos polímeros con una incorporación deliberada de más de una base en la monohebra.

Endotoxina

La endotoxina se determinó usando los métodos Cape Cod LAL (ya que la endotoxina puede inducir ella misma la maduración de células dendríticas, era importante que los polímeros estuvieran esencialmente libres de endotoxina).

Reasociación de dsRNA

La reasociación se realizó en tampón de Ampligen® que contenía fosfato sódico 10 mM (pH 7,4), cloruro sódico 150 mM y cloruro magnésico 1 mM. Los polímeros se disolvieron hasta 8 mM con respecto al fósforo orgánico total a 50ºC y se reasociaron mezclando volúmenes iguales de las soluciones de ssRNA complementario respectivas, calentando hasta 65ºC durante 10 minutos y a continuación enfriando hasta temperatura ambiente. El material se filtró a continuación a través de un filtro de 0,22 \muM y se introdujo en viales para flujo laminar.

Análisis de dsRNA Espectral

Se tomaron muestras de las dos soluciones de ssRNA preparadas para reasociación así como el dsRNA reasociado y se determinó el perfil de longitudes de onda UV (Figuras 1 a 3). El desplazamiento hipocrómico (generalmente a la absorbancia máxima del ssRNA) se evaluó como una indicación de la reasociación.

Endotoxina

La endotoxina del dsRNA se determina usando el ensayo Cape Cod LAL.

Concentración

Se supuso que la concentración era equivalente a la concentración de partida de las entidades de ssRNA.

TABLA 2 Análisis de dsRNA

Configuración de dsRNA	Partida Nº	Endotoxina (EU/ml)	Concentración	Hipocromicidad
Poli [C]: Poli [I_{12}U]	20020626C	4	8 mM (2,5 mg/ml)	0,77
Poli [I]: Poli [C_{6}U]	20020626D	1	8 mM (2,5 mg/ml)	0,88
Poli [I]: Poli [C_{24}U]	20020626E	1	8 mM (2,5 mg/ml)	0,79

El desplazamiento hipocrómico reducido obtenido para poli [I]:poli [C_{6}U] puede explicarse por la frecuencia incrementada del desacoplamiento de uridina en el RNA de doble hebra, que dará una proporción superior de RNA de una sola hebra en la cadena de ssRNA en comparación con un polímero más completamente apareado en las bases tal como poli [I]:poli [C_{12}U] o poli [I]:poli [C_{24}U].

Estudios experimentales (a) Comparación de efectos de maduración de células dendríticas de Ampligen® y otros polímeros de dsRNA específicamente configurados de alto peso molecular y poli [I]:poli [C] sobre células dendríticas derivadas de monocitos inmaduras

Una comparación directa de poli [I]:poli [C_{12}U], poli [C]:poli [I_{12}U], poli [I]:poli [C_{6}U], poli [I]:poli [C_{24}U] y poli [I]:poli [C] como los agentes de maduración para células dendríticas derivadas de monocitos humanos, según se determina por cambios en el fenotipo de la superficie celular, se efectuó usando análisis de FACS.

Se generaron células dendríticas inmaduras cultivando células mononucleares de sangre periférica sometidas a leucoforesis en presencia de GM-CSF e IL 4 durante siete días. El estímulo de maduración se introdujo en el cultivo durante 48 horas en una condición de cultivo uniforme, utilizando poli [I]:poli [C] en una prueba y poli [I]:poli [C_{12}U], poli [C]:poli [I_{12}U], poli [I]:poli [C_{6}U] y poli [I]:poli [C_{24}U] en otras pruebas. Usando análisis de FACS, se determinó el fenotipo de las células dendríticas maduras (Figuras 4 y 5). Las células dendríticas maduras se identificaron como fuertemente positivas para CD83 (una glicoproteína expresada predominantemente sobre la superficie de células dendríticas maduras). Las moléculas de clase II también se regulaban al alza en comparación con células dendríticas inmaduras (no tratadas). No se observó evidencia de toxicidad celular a los niveles de dosis probados.

(b) Comparación del transcurso del tiempo de poli [I]:poli [C] y Ampligen® (y otros polímeros de dsRNA específicamente configurados de alto peso molecular) sobre la maduración de células dendríticas y la producción de IL12

Se aislaron células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad. Se cultivaron células adherentes durante 6 días en presencia de IL 4 y GM-CSF. Las células se recogieron después de caracterización inmunofenotípica (inmaduras) y se recultivaron en medio libre de suero en presencia de IL 4 y GM-CSF. Se prepararon tres placas separadas de las células como sigue:

: placa uno - sin tratamiento

: placa dos - poli [I]:poli [C] (100 \mug/ml);

: placa tres - poli [I]:poli [C_{12}U] (250 \mug/ml).

Siete horas después de la adición del agente de maduración, el medio de cultivo se retiró de cada placa y se añadió medio reciente sin el agente de maduración. Esto se repitió a intervalos de tiempo y la producción de IL 12 se determinó sobre cada sobrenadante de cultivo recogido.

Resultados Efecto de maduración

Los resultados del análisis de FACS que comparan poli [I]:poli [C_{12}U], poli [C]:poli [I_{12}U], poli [I]:poli [C_{6}U], poli [I]:poli [C_{24}U] y poli [I]:poli [C] como agentes de maduración para células dendríticas derivadas de monocitos humanos se resumen y se ilustran en las Figuras 4 y 5.

En comparación con las células dendríticas no tratadas, poli [I]:poli [C], Ampligen®, poli [C]:poli [I_{12}U], poli [I]:poli [C_{6}U] y poli [I]:poli [C_{24}U] producían un nivel significativamente mayor de expresión de los dos marcadores, asociándose una respuesta de amplitud superior con Ampligen®, poli [C]:poli [I_{12}U], poli [I]:poli [C_{6}U] y poli [I]:poli [C_{24}U].

Producción de IL 12 (p70)

A lo largo del transcurso del tiempo estudiado, las células dendríticas no tratadas no producían IL 12 detectable mediante la técnica de ELISA específica. El poli [I]:poli [C] y el Ampligen® no mostraban producción de IL 12 a las 4 horas. Sin embargo, ambos producían niveles significativos e igualmente altos de IL 12 a las 19 horas. El nivel de IL 12 era subsiguientemente inferior a las 27 horas y continuaba cayendo a las 43 horas. La disminución global en el nivel de producción en cada punto temporal era más notable con poli [I]:poli [C] en comparación con Ampligen®.

Los resultados muestran por primera vez la capacidad de Ampligen® para provocar tanto la maduración fenotípica de células dendríticas como la activación de la producción de IL 12 en estas células. También se muestra que Ampligen® tiene una mayor capacidad para madurar células dendríticas en comparación con poli [I]:poli [C]. Por otra parte, la producción de IL 12 inducida por Ampligen® parece estar apoyada por un período más prolongado en comparación con el asociado con poli [I]:poli [C].

Los hallazgos globales indican que Ampligen®, con su perfil clínico atóxico, posee un potencial significativo como un agente para provocar la maduración de células dendríticas y la activación de la producción de IL 12, dos atributos que se cree que son importantes en la excitación y la inducción óptimas de la respuestas de células T citotóxicas específicas de antígeno por células dendríticas excitadas con antígeno. Por otra parte, como Ampligen® se fabrica en una calidad clínica y tiene un perfil clínico atóxico, es adecuado para usar junto con células dendríticas que están destinadas para usar en una vacuna.

Puede producirse una vacuna para estimular la respuesta inmunitaria celular en pacientes diagnosticados con cáncer. En el método para producir la vacuna, células dendríticas inmaduras se exponen a los antígenos asociados a tumor del paciente para producir células dendríticas inmaduras que presentan antígeno tumoral. Las células dendríticas que presentan antígeno se maduran a continuación en presencia de Antigen® mediante el método descrito anteriormente y a continuación se incluyen en una formulación farmacéutica en forma de una vacuna. La vacuna puede inyectarse a continuación en el paciente, con lo que se espera que las células dendríticas maduras migren a los nódulos linfáticos regionales del paciente para inducir una respuesta de CTL.

El solicitante cree que poli [I]:poli [C_{12}U], poli [C]:poli [I_{12}U], poli [I]:poli [C_{6}U] y poli [I]:poli [C_{24}U] son representativos de las clases de polímeros de dsRNA de alto peso molecular específicamente configurados, y a partir de los resultados mostrados ha de esperarse que otros polímeros de dsRNA de alto peso molecular específicamente configurados también sean adecuados para madurar células dendríticas. Ejemplos de tales polímeros de dsRNA de alto peso molecular específicamente configurados son poli [I]:poli [C_{x}U]; poli [I]:poli [G_{x}U]; poli [A]:poli [U_{x}C]; poli [A]:poli [U_{x}G]; poli [U]:poli [A_{x}C]; poli [U]:poli [I_{x}U]; poli [C]:poli [G_{x}A]; poli [C]:poli [G_{x}U]; poli [G]:poli [C_{x}A] y poli [G]:poli [C_{x}U], donde x es de media un número de 3 a 40, preferiblemente de 6 a 20, y los dsRNAs tienen de media un peso molecular de 100 a 2500 kDa, y preferiblemente de 300 a 1500 kDa.

Referencias

1. Zinkemagel RM, Doherty PC. MHC - restricted cytotoxic T cell studies on the biological role of polymorphic major transplantation antigens determining T - cell restriction specitcity, function and responsiveness. Adv Immunol 1979; 27: 51-177.

2. Banchereau J, Steinman RM. DC and the control of immunity. Nature 1998; 392: 245-252.

3. Carbone FR, Kurts C, Bennett SR y otros. Cross presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today 1998; 19 (8): 368-373.

4. Mayodormo I, Zorina, T, Storkus WJ, Zitvogel, L, Cettuzzi C, Falo LD, Melief C, Ildstad ST, Kast WM, Deleo AB. Bone marrow - derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic anti-tumour immunity. Nature Medicine 1995; 1 (12): 1297-1302.

5. Zilvogel L. Mayordomo JI, Tjandrawan T y otros. Therapy of murine tumors with tumor derived peptide pulsed dendritic calls: dependence on T cells, 87 costimulation and Th 1 associated cytokines. J exp Med 1996; 183:87-97.

6. Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M y otros. Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate pulsed DC. Nat Med 1988: 4:328

7. Thumer B. Haendle I, Roder CD y otros. Vaccination with Mage-3A1 peptide pulsed mature monocyte derived DC expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage 4 melanoma. J Exp Med 1999; 190: 54-59.

8. Kugler A, Stuhler G, Walden P, et al. Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumour cell - dendritic cell hybrids. Nat Med 2000; 6: 332-336.

\newpage

9. Murphy GP, Tjoa BA, Simmons SJ y otros. Phase 11 prostate cancer vaccine trial: report of study involving 37 patients with disease recurrence following primary treatment. Prostate 1999; 39:54-59.

10. Adams M de Jong A. Navabi H, Lippetz C, B Jasani, B, Man S, Fiander A, R Bailey Wood, van der Burg SH, A Burner Evans AS, Mason M. In vivo induction of HPV 16 specific (CTL) and T helper cell responses in patients with advanced cervical cancer using autologous dendritic cells (DC) pulsed with autologous or allogeneic tumour lysate as a potential anti-cancer vaccine. In preparation.

11. Zitvogel L, Angevin E, T Tursz. Dendritic cell - based immunotherapy of cancer. Annals of Oncology 2000; 11 (suplemento 3); 199-205.

12. Steinman R.M. Dendritic cells. In Fundamental Immunology (Paul, W.E., Ed) 1999; Lippinscott - Raven pp. 547.573.

13. Dhodapkar MV, Steinman RM, Sapp M, Desai H, Fossella C, Krasovsky J, Donahoe SM, Dunbar PR, Cerundolo V, Nixon DF. Rapid generation of broad T cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J Clin Invest 1909; 104; 173-80.

14. Steinbrink K, Jonuleit H, Moller. Schuler G, Knop J, Enk AH. Interleukin 10 treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen specific anergy in CD8 + T cells resutting in failure to lyse tumour cells. Blood 1999; 93(5):1634-42.

15. Matzinger P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 991-1045.

16. Sparwasser T, Koch ES, Vabulas RM, Heeg K, GB, Lipford GB, Ellwart JW, H Wagner. Bacterial DNA and immunostimulatory CpG oligonucleotides trigger maturation and activation of murine dendritic cells. Eur J Immunol 1998 28:2045.

17. Ridge JP, Dirosa F, Matzinger P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4 (+) T helper and a T - Killer cell. Nature 1998: 393: 474.

18. Cella M, An Engering A, V PinetV, Pieters J, Lanzavecchia A, Inflamatory stimuli induce accumulation of MHC class II complexes on dendritic cells. Nature 1997; 388: 782.

19. Basu S y otros. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins which deliver partial maturation signal to dendritic cells and activates the NF - kappa B pathway. Int Immunol. 2000; 12, 1539-1408.

20. Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrphage colony stimulating factor plus inteileuhin 4 and down regulated by tumor necrosis factor. J Exp Med 1994; 179:1109.

21. Luft T, Pang KC, Thomas E. Hertzog P, Hart DNJ, Trapani, J Cebon J. Type 1 IFNs enhance the terminal differentiation of dendritic cells. J immunol 1998; 161:1947.

22. Romani N. D Reider D, Heuer M, Ebner S, E Kampgen E, Eibl B. Neidefwieser D. Schuler G. Generation of mature dendritic cells from human blood: An improved method with special regard to clinical applicability J Immunol Methods 1996; 196: 137.

23. Verijk RW, Mutis M, Esendam B, Kamp J, Melief JM, Cees, Brand A, Goulmy E. Polyribosinasinic Potyribocytidlic (Poly I:C) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. Journal of Immunology 1999; 163:57-61.

24. Schulz O, Edwards AD, Schito M, Aliberti J, anickasingham S. Sher A, Reis e Souza C (2000) CD40 triggering of heterodimeric IL-12 p70 production by dendritic cells in vivo requires a microbial priming signal. Immunity 2000; 13: 453-462.

25. Hilkens CM, Kalinski P, de Boer M. Kapsenberg M. Human dendritic cells require exogenous interleukin-12-inducing factors to direct the development of naïve T-helper cells toward the Th1 phenotype. Blood 1997; 90:1920-1926.

26. Sniggers A, Kalinski P: CM Hilkens CM, Kapsenberg ML High level IL12 production by human dendritic cells requires two signals. Int. Immunol 1998; 10: 1593-1598.

27. Diehl L. den Boer AT, Schoenberger SP, van der Voort El. TN Schumacher TN. Metief CJ, Offringa R, Toes RE. CD40 activation in vivo overcomes peptide - induced peripheral cytotoxic T-lymphocyte tolerance and augments anti-tumour vaccine efficacy. Nat. Med 1999; 5: 774-779.

\newpage

28. French RR. Chan HT, Tutu AL. Gleennie MJ. CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that eradicates lymphoma and bypasses T cell help. Nat Med 1999; 5: 548-553.

29. Sotomayor EM, Borello I, E Tubb E, FM Rattis FM, Bien H, Lu Z, S Fein S, Schoenberger S, Levitsky Hl. Conversion of tumor specific CD4+ tolerance to T - cell priming. Through in vivo ligation of CD40. Nat Med 1999; 5: 780-787.

30. Robinson RA, De Vita VT, H Levy HB, Baron S, Hubbard SP, Levine AS. Brief communication A Phase 1-11 Trial of multiple - Dose Polynboinosinic - Polyribocytidylic acid in patients with leukaemia or solid tumors J Natl Cancer Inst 1976: 57:599-602.

31. Krown SE. Friden GB Khansur T y otros. T y otros. Phase 1 trial with interferon inducer Polyl: C/poly-L-lysine (poly ICL). J IFN Res 1983; 3:281-90.

32. Levy HB. Riley FL.Utilisation of stabilised forms of polynucleotides. In: Cane PE, Carter WA Eds. Handbook of experimental pharmacology. 1984 Berlin: Springer Verlag pp. 515-33.

33. Strayer DR, Carter WA, Brodsky I, Dheyney P, Petersen D, Salvato P, Thompson C, Loveless M, Shapiro DE. Elsasser W, Gillespie DHA. Controlled clinical trial with specifically configured RNA drug Poly (I): Poly (C12 U), in Chronic Fatigue Syndrome Clinical Infectious Diseases 1994; 18 (Supl 1): S 88-95.

34. Ampligen® poly [I]: poly [C12 U] Clinical Investigators Brochure Bioclones (Pty) Ltd 1998.

Claims

1. Un método para producir células dendríticas maduras in vitro, comprendiendo el método la etapa de:

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polímero de dsRNA de alto peso molecular específicamente configurado se selecciona del grupo que consiste en poli [I]:poli [C_{x}U]; poli [I]:poli [G_{x}U]; poli [A]:poli [U_{x}C]; poli [A]:poli [U_{x}G]; poli [U]:poli [A_{x}C]; poli [U]:poli [I_{x}U]; poli [C]:poli [G_{x}A]; poli [C]:poli [G_{x}U]; poli [G]:poli [C_{x}A] y poli [G]:poli [C_{x}U], donde x es de media un número de 3 a 40.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que x es un número de 6 a 20.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polímero de dsRNA se selecciona del grupo que consiste en poli [I]:poli [C_{12}U] y poli [C]:poli [I_{12}U].

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el peso molecular del dsRNA es de 100 a 2500 kDa, preferiblemente de 300 a 1500 kDa.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células dendríticas inmaduras aisladas de un cuerpo de un ser humano o un animal se cultivan a partir de células mononucleares de sangre periférica.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que activa las células dendríticas maduras para producir p70 de IL 12 durante más de 19 horas, y preferiblemente durante más de 43 horas.

8. Un método para producir células dendríticas que presentan antígeno maduras in vitro, que incluye las etapas de:

: exponer células dendríticas inmaduras a un antígeno; y

: madurar las células dendríticas de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el antígeno es un antígeno de cáncer.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos derivados de un parásito, virus y microorganismo de ser humano o animal.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que las células dendríticas inmaduras se exponen al antígeno durante un tiempo suficiente para inducir a las células dendríticas a capturar y procesar el antígeno.

12. Un método para elaborar una vacuna para inducir una respuesta inmunitaria celular en un cuerpo de un ser humano o un animal, incluyendo el método las etapas de:

: madurar las células dendríticas inmaduras de acuerdo con un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; e

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígenos asociados a cáncer y antígenos derivados de un parásito, virus y microorganismo de ser humano o
animal.

14. Una vacuna que incluye células dendríticas maduras que presentan antígeno producidas mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

15. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, para usar en un método para tratar a un paciente diagnosticado con cáncer, un virus, un parásito o un microorganismo.

16. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 14 ó 15, que incluye además un diluyente, excipiente, agente auxiliar, o adyuvante bacteriano o sistémico adecuado.

17. El uso de un polímero de RNA de doble hebra (dsRNA) de alto peso molecular específicamente configurado en un método para elaborar un medicamento para usar en un método para tratar el cáncer en un cuerpo de ser humano o animal, incluyendo el método las etapas de:

: cultivar células dendríticas inmaduras con un antígeno asociado a cáncer a fin de producir células dendríticas que presentan antígeno tumoral; y

: madurar las células dendríticas en presencia del dsRNA de alto peso molecular específicamente configurado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

18. El uso de un polímero de RNA de doble hebra (dsRNA) de alto peso molecular específicamente configurado en un método para elaborar un medicamento para usar en un método para tratar un parásito, virus o microorganismo en un cuerpo de ser humano o animal, incluyendo el método las etapas de:

: cultivar células dendríticas inmaduras con un antígeno asociado a un parásito, virus o microorganismo a fin de producir células dendríticas que presentan antígeno; y

19. El uso de un polímero de RNA de doble hebra de alto peso molecular específicamente configurado de acuerdo con las reivindicaciones 17 ó 18, en el que el polímero se selecciona del grupo que consiste en poli [I]:poli [C_{6}U], poli [I]:poli [C_{24}U] y poli [C]:poli [I_{12}U].