JP5971921B2

JP5971921B2 - 抗原提示細胞の調製方法

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Publication number: JP5971921B2
Application number: JP2011235947A
Authority: JP
Inventors: 活夫野口; 恵里桑田; 敏雅只木
Original assignee: 活夫野口
Priority date: 2010-10-28
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: JP2012107007A

Description

本発明は、抗原提示細胞の調製方法に関する。また、該抗原提示細胞の調製方法によって調製された抗原提示細胞及びその利用方法に関する。さらに、抗原提示細胞活性化剤に関する。

がんをはじめとする難治性疾患の新たな治療法として、近年免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者本人の免疫細胞を取り出して活性化し、活性化した免疫細胞を患者本人に投与し、人工的に免疫を強化するという治療方法である。免疫細胞が疾病の原因となる細胞のみを特異的に傷害するため、また患者本人の細胞を用いるため、従来の抗癌剤治療に比べて格段に副作用が少ないという利点がある。このような免疫細胞療法の一つとして樹状細胞（以下、ＤＣとも記す）ワクチン療法がある。

ＤＣワクチン療法では、ＤＣに腫瘍抗原（ペプチド、蛋白質、腫瘍細胞のライセート等）を取り込ませる。腫瘍抗原を取り込んだＤＣは、細胞内で腫瘍抗原を分解し、その一部（エピトープ）を細胞表面に提示する。ＤＣワクチン療法とは、このようにして調製されたＤＣをがん患者の体内に投与することにより、腫瘍抗原に対する免疫反応を惹起し、がんを治療する方法である。

ＤＣワクチンをがん治療へ応用することを目的に種々の手法が試みられてきているが、さらなる効果増強が望まれており、担がん個体で有効な抗腫瘍免疫反応を誘導する為にはＤＣの免疫活性化能力を向上させるアジュバントの利用が有効と考えられている。

ＤＣの免疫活性化能力を向上させる効果を有するアジュバントとしてヌクレオチドを含む物質が知られている。例えば、ＣｐＧを含むＤＮＡはＴＬＲ９を介して抗原提示細胞を刺激することが知られており（例えば、非特許文献１）、２本鎖ＲＮＡはＴＬＲ３を介して抗原提示細胞を刺激することが知られており（例えば、非特許文献１）、ウラシルを含む一本鎖ＲＮＡはＴＬＲ７を介して抗原提示細胞を刺激することが知られている（例えば、非特許文献１、２）。しかし、これらはいずれも細菌やウイルス由来の核酸構造を認識するものであり、腫瘍を認識する反応ではない。さらに、リガンド自体が高分子のものであるため、安全性の評価が困難である。

ヌクレオチドを含む物質の効果としては、マウス新生児の餌にウリジン１リン酸（以下、ＵＭＰとも記す）を大量に含有させることでマウス新生児の免疫反応の活性化を誘導することが報告されている（例えば、非特許文献３、４）。しかし、抗原提示細胞への直接的効果や、特定の抗原に対する免疫応答を誘導する効果は記載されていない。

また特許文献１ではイノシン誘導体にアジュバント活性があることが報告されている。しかし、工業的に合成される化合物ではなく、生体内でも産生される（内因性の）ヌクレオチドの単量体そのものがアジュバントとしての効果を有することは報告されていない。そのような物質がアジュバントとしての活性を有することが明らかとなれば、高分子核酸や合成された薬剤とは異なり、安全性の観点から産業利用が格段に容易になると考えられる。

特表２００７−５００２１１号公報

山本雅裕、審良静男、実験医学２３：１５０６−１５１１（２００５）．ＤｉｅｂｏｌｄＳＳ．ｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ．，３６：３２５６−３２６７（２００６）．永淵真也、腸内細菌学雑誌２１：３０５−３１２（２００７）．Ｔ．Ｍａｓａｈｉｋｏｅｔａｌ．，ＪＡｎｉｍＳｃｉ．，８７：１０４２−１０４７（２００９）．

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＤＣワクチン療法をはじめとする免疫細胞療法において有用な、抗原提示細胞の免疫活性化能力を向上させることができる、アジュバントを用いた抗原提示細胞の調製方法を提供するものである。

本発明者らは、これらの課題を解決するため様々な研究を行った。その結果として、単量体のヌクレオチドを抗原提示細胞の調製時に共存させることによって、患者にＤＣワクチンを投与した際の免疫応答を向上させることを見出した。これらの知見によりヌクレオチドの単量体を用いたＤＣの調製方法を開発し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。

（１）ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ヌクレオチド存在下で、抗原提示細胞に抗原を取り込ませる抗原提示細胞の調製方法；
（２）前記抗原提示細胞が、樹状細胞であることを特徴とする（１）に記載の抗原提示細胞の調製方法；
（３）前記抗原提示細胞が、取り込ませた抗原を特異的に認識するＴｈ１細胞を刺激する機能を有することを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗原提示細胞の調製方法；
（４）前記ヌクレオチドが、リボヌクレオチドであることを特徴とする（１）〜（３）に記載の抗原提示細胞の調製方法；
（５）前記ヌクレオチドが、ヌクレオシド一リン酸であることを特徴とする（１）〜（４）に記載の抗原提示細胞の調製方法；
（６）前記ヌクレオチドが、ウリジン一リン酸またはアデノシン一リン酸であることを特徴とする（１）〜（５）に記載の抗原提示細胞の調製方法。
（７）（１）〜（６）に記載の調製方法によって調製された抗原提示細胞。
（８）（１）〜（６）に記載の調製方法によって調製された抗原提示細胞を含む医薬組成物；
（９）前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする（８）に記載の医薬組成物；
（１０）前記抗原提示細胞が患者の自己由来であることを特徴とする（８）又は（９）に記載の医薬組成物；
（１１）前記医薬組成物が、患者体内のＴｈ１細胞を活性化することを特徴とする（８）〜（１０）に記載の医薬組成物。

（１２）ヌクレオチドを有効成分とする抗原提示細胞活性化剤；
（１３）前記ヌクレオチドが、リボヌクレオチドであることを特徴とする（１２）に記載の抗原提示細胞活性化剤；
（１４）前記ヌクレオチドが、ヌクレオシド一リン酸であることを特徴とする（１２）又は（１３）に記載の抗原提示細胞活性化剤；
（１５）前記ヌクレオチドが、ウリジン一リン酸またはアデノシン一リン酸であることを特徴とする（１２）乃至（１４）に記載の抗原提示細胞活性化剤。

本発明の抗原提示細胞の調製方法により、抗原提示細胞の免疫活性化能力を向上させることができる。とりわけ、抗原提示細胞は、抗原特異的Ｔｈ１細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を活性化する能力が向上する。

図１は、マウスＴＲＰ−２抗原をＵＭＰと同時にマウスＤＣに導入すると、導入していないＤＣと比較してＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの産生量が有意に増強することを示している。また共培養よりエレクトロポレーションで導入した方がその効果が有意に高まることを示している。図２は、ＯＶＡをエレクトロポレーションでマウスＤＣに導入するとＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの産生量が有意に増強すること、そこにＵＭＰを同時に導入するとその効果がさらに有意に増強されることを示している。図３は、ＯＶＡをエレクトロポレーションでマウスＤＣに導入する際に、同時に添加するＵＭＰの効果が最大になる濃度を検討した結果を示している。図４は、図２、３と同様の実験系で、ウラシルを有するＵＭＰと、ＵＤＰ、ＵＴＰの効果を比較した結果を示している。ＵＭＰにおいて明らかな抗原特異的ＩＦＮ−γの産生量の増強が認められ、Ｔｈ１細胞に対する抗原特異的なアジュバント活性を有することが確認された。図５は、３名のヒト健常人ボランティアの末梢血由来のＤＣにおけるヌクレオチドのアジュバンド効果を示している。ヌクレオチドを添加しなかった場合に比べて、ヌクレオチドを添加した場合にＩＬ−２３産生増強が認められた。図６は、１名のヒト健常人ボランティアの末梢血由来のＤＣにおけるヌクレオチドのアジュバンド効果を示している。ヌクレオチドを添加しなかった場合に比べて、ヌクレオチドを添加した場合にＩＦＮ−γの産生増強が認められた。

以下、本発明を実施するための形態について説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、様々な態様で実施し得るものである。

まず、本発明の抗原提示細胞の調製方法について詳説する。本発明の抗原提示細胞の調製方法は、ヌクレオチドの存在下で、抗原提示細胞に抗原を取り込ませる抗原提示細胞の調製方法である。
抗原提示細胞とは、抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩに提示し、抗原特異的に作用する細胞（Ｔ細胞やＢ細胞等）を誘導する能力を有する細胞である。例えば、マクロファージや樹状細胞等があげられる。本明細書では抗原提示細胞として樹状細胞を用いる方法を説明する。

まず、樹状細胞の前駆細胞を取得するための試料を準備する。前記試料としては末梢血、骨髄液、臍帯血等があげられる。中でもヒトの場合、入手の容易さ、患者への負担の少なさを考慮すると末梢血を利用することが好ましい。末梢血の採血量は提供者の負担にならない程度を目安として、適宜設定することができる。採血する方法としては、真空採血管、採血バック等を用いた全血採取を利用することができる。採血した血液に、ヘパリンやクエン酸を加えることで、凝固が起こらないようにすることができる。
また、多量の細胞を取得する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核細胞を採取する方法を利用することができる。

次に、採取した試料から単核細胞を分離する。単核細胞には、樹状細胞の前駆細胞が含まれている。分離する方法としては、単核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いることができる。例えば、フィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配法を利用する方法が一般的である。なお、分離した単核細胞は血小板等を除去するために培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を用いて数回洗浄することが好ましい。

次に、分離した単核細胞から、樹状細胞の前駆細胞である単球（ＣＤ１４陽性細胞）を分離する。ＣＤ１４は単球に発現しているマーカーとして知られている。そのマーカーの性質を利用して、抗ＣＤ１４抗体マグネットビーズを用いたＭａｇｎｅｔＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を利用して、単球を回収することができる。この方法は、簡単でかつ単球の回収率が高い。
また、分離した単核細胞を培養フラスコに移し、３４〜３８℃、２〜１０％ＣＯ_２条件下で１時間以上培養すると、培養フラスコ底面（壁面）に細胞が付着する。この付着した細胞を樹状細胞の前駆細胞として用いることもできる。

得られた前駆細胞は、サイトカイン等で刺激することにより未成熟樹状細胞や成熟樹状細胞に分化させることができる。
培養を行うための培地としては、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン）、ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）、表皮角化細胞培地（ＫＢＭ、コージンバイオ株式会社）、イスコフ培地（ＩＭＥＭ、インビトロジェン）等、細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて、０．５％〜２０％の牛血清、牛胎児血清（以下、ＦＢＳとも記す）、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。

未成熟樹状細胞を得るには、樹状細胞の前駆細胞を、分化誘導因子を添加した培地で培養すればよい。未成熟樹状細胞を分化誘導する因子としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦとも記す）、インターロイキン４（以下、ＩＬ−４とも記す。他のインターロイキンについても同様に記す）、ステムセルファクター（以下、ＳＣＦとも記す）ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子α（以下、ＴＮＦ−αとも記す）等があげられる。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等を添加することが好ましい。特に、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を組み合わせて添加すると効率よく誘導することができる。分化誘導のための培養は、３４〜３８℃、好ましくは３７℃、２〜１０％ＣＯ_２、好ましくは５％ＣＯ_２条件下で、５〜７日間行うことが好ましい。

成熟樹状細胞を得るには、上記方法で得られた未成熟樹状細胞を、分化誘導因子を添加した培地で培養すればよい。成熟樹状細胞を分化誘導する因子としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＳＣＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、プロスタグランジンＥ_２（以下、ＰＧＥ_２とも記す）等があげられる。また、必要に応じてＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３等を添加することが好ましい。特に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＰＥＧ_２及びＴＮＦ−αを組み合わせて添加すると効率よく誘導することができる。また、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α及びＰＧＥ_２の組み合わせでも十分な成熟化が行える。成熟のための培養は、３４〜３８℃、好ましくは３７℃、２〜１０％ＣＯ_２、好ましくは５％ＣＯ_２条件下で、２〜３日間行うことが好ましい。

樹状細胞の前駆細胞として造血幹細胞（ＣＤ３４陽性細胞）を準備し、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＦＮ−α、ｆｌｔ−３リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、又はトロンボポエチンの中から１つ又は複数を組み合わせて培地に添加し、培養を行う方法でも樹状細胞が得られる。また、血液又は末梢血単核球からパーコール等の比重液を用いて、血液中にもともと存在する樹状細胞を回収することもできる。

抗原としては、がん又は感染症抗原蛋白質、がん又は感染症抗原ペプチド、病原性細胞のライセート（腫瘍組織又は腫瘍細胞、ウイルスに感染した感染症細胞又は病原性細菌の破砕物）等があげられる。また転写、翻訳により抗原を発現できるＤＮＡやｍＲＮＡも同様に利用することができる。

ヌクレオチドは、塩基、糖、リン酸が結合した化合物である。糖の部分がＤ−２−デオキシリボースである化合物をデオキシリボヌクレオチドといい、ＤＮＡを構成する成分である。また、糖の部分がリボースであるものをリボヌクレオチドといい、ＲＮＡを構成する成分である。リン酸の部分は、１つから３つのリン酸で構成されている。塩基の部分は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル等で構成されている。
本発明の抗原提示細胞の調製方法では、いずれのヌクレオチドでも用いることができるが、好ましくはリボヌクレオチド、さらに好ましくはヌクレオシド一リン酸である。特に、ＵＭＰやＡＭＰは優れた効果を示すことが確認されている。

ヌクレオチドは、抗原提示細胞に抗原を取り込ませる工程を開始する前または開始した後（取り込ませている工程中）に、抗原提示細胞の培養液又は懸濁液中に添加すればよい。

添加するヌクレオチドの量は、特に制限はされないが、溶液中の濃度が１０μＭ〜１０００μＭとなるように添加することが好ましい。

抗原提示細胞に抗原を取り込ませる方法としては、公知の方法であればいかなる方法を用いることもできる。例えば、共培養法やエレクトロポレーション法等があげられる。

共培養法とは、抗原提示細胞が有する貪食機能により抗原を取り込ませる方法である。抗原提示細胞と抗原とを同一容器に懸濁して、通常の培養条件で２時間以上培養することによって、抗原提示細胞に抗原を取り込ませることができる。

共培養により、本発明を実施する手順を例示する。
１．抗原提示細胞（患者由来樹状細胞等）、抗原、ヌクレオチドを準備する。
２．抗原提示細胞、抗原、ヌクレオチドを培地に懸濁する。
３．３７℃、５％ＣＯ_２条件下で一晩培養する。

エレクトロポレーション法とは、細胞に対して電気パルスを与えると一過的に原核・真核細胞の膜が破断する物理的原理を応用した抗原の導入方法である。例えば、細胞培養液中に抗原蛋白質等を添加した状態で、電気パルスを与えることにより、拡張した細胞膜の穴から細胞質内へ直接、抗原蛋白質等を取り込ませることができる。

エレクトロポレーションにより、本発明を実施する手順を例示する。
１．抗原提示細胞（患者由来樹状細胞等）、抗原、ヌクレオチドを準備する。
２．抗原提示細胞、抗原、ヌクレオチドをエレクトロポレーション用の溶液に懸濁する。
３．エレクトロポレーションにより、抗原提示細胞に抗原を取り込ませる。
４．細胞膜が安定するよう一定時間（一時間から一晩）培養する。

上記のような手順により抗原提示細胞を調製することができる。このようにして調製された樹状細胞は、抗原を取り込ませただけの抗原提示細胞に比べて、抗原特異的なＴｈ１細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を活性化する能力に優れている。

Ｔｈ１細胞は、ＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）のうち活性化刺激によりインターフェロンガンマ（以下、ＩＦＮ−γとも記す）を産生して細胞性免疫を増強させる細胞である。
抗原特異的なＴｈ１細胞とは、抗原提示細胞がクラスＩＩ分子で提示した抗原をＴ細胞受容体により認識して、活性化するＴｈ１細胞である。

本発明の抗原提示細胞の調製方法で調製した抗原提示細胞は、医学的に許容される溶媒（例えば、生理食塩水）に懸濁することで、医薬組成物として用いることができる。

医薬組成物を投与する方法として、例えば、静脈、皮下、皮内等への注射により注入する方法、点滴にして全身投与する方法、病変部近辺の動脈から注入する方法があげられる。

このとき、投与する抗原提示細胞が、投与を受ける患者自身に由来する細胞（自己由来の細胞）であれば、患者体内の免疫系に拒絶されることなく、その効果を発揮することができる。

体内に投与された抗原提示細胞は、リンパ節等に遊走して抗原特異的Ｔｈ１細胞を含むヘルパーＴ細胞や、キラーＴ細胞等を刺激する。活性化した抗原特異的Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−２やＩＦＮ−γを産生し、細胞性免疫を増強する。その結果、増幅したキラーＴ細胞（抗原特異的ＣＴＬ）等が病原細胞を傷害する。

次に、本発明の抗原提示細胞活性化剤について説明する。本発明の抗原提示細胞活性化剤は、ヌクレオチドを有効成分として含む抗原提示細胞活性化剤である。

ここで、抗原提示細胞活性化剤とは、ｉｎｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｔｒｏにおいて、抗原提示細胞と接触させた場合に、抗原提示細胞の有する機能を向上させる剤を意味する。

本発明の抗原提示細胞活性化剤は、ヌクレオチドを有効成分として含んでおり、抗原提示細胞の免疫応答を誘導する機能、とりわけ、取り込ませた抗原を特異的に認識するＴｈ１細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を活性化する機能が向上する。

本発明の抗原提示細胞活性化剤は、ヌクレオチドを生理的溶媒に添加することで調製することができる。生理的溶媒としては、例えばＰＢＳや生理的食塩水等が好ましい。

本発明の抗原提示細胞活性化剤を、ｉｎｖｉｔｒｏで使用する場合、抗原提示細胞を懸濁した溶液に、最終濃度が１０μＭ〜１０００μＭとなるように添加すればよい。

ｉｎｖｉｖｏで効果を発揮させる場合には、例えば、生理的食塩水とヌクレオチドで構成された本発明の抗原提示細胞活性化剤を静脈、皮下、皮内、所属リンパ節等への注射により注入する方法、点滴にして全身投与する方法、病変部近辺の動脈から注入する方法があげられる。

本発明の抗原提示細胞活性化剤を患者に投与することによって、患者体内の抗原提示細胞が活性化される。活性化された抗原提示細胞は、さらに患者体内のＴｈ１細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を活性化し、病態を改善させる。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。

以下に記載の手順により、可溶化した抗原蛋白質の提示におけるヌクレオチドのアジュバント効果を確認した。

＜マウスｒＴＲＰ−２の作製＞
実験で使用する組換え型マウスＴＲＰ−２（ｒＴＲＰ−２；配列番号１）を作製した。ｒＴＲＰ−２はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのＡＣＮｏ．Ｐ２９８１２に記載のアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端から５６残基目のグルタミン酸（Ｅ）から４７２残基目のセリン（Ｓ）までをコードするｃＤＮＡを単離した。単離したｃＤＮＡをｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し発現プラスミドとした（ｐＥＴ１９ｂ／ｍｄＴ）。ｐＥＴ１９ｂ／ｍｄＴで大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ：Ｎｏｖａｇｅｎ社、＃７１３５２−３）を形質転換し、蛋白質を発現させるとＮ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する組換え蛋白質が得られる。この組換え蛋白質はインクルージョンボディを形成し、不溶性であった。

この不溶性画分を８Ｍ尿素／ＰＢＳ／１０ｍＭＤＴＴ（ｐＨ８．０）に溶解させ、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｓｉａｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ニッケルアフィニィティー（ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム、ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｓｉａｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−５２４７−０１）とゲルろ過クロマトマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ２６／６０ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００ＨＲカラム、ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｓｉａｂｉｏｔｅｃｈ、＃１７−１１９６−０１）で部分精製を行った。精製したサンプルの溶媒を生理的な緩衝液に置換する為、ＰＢＳで透析したが、ほぼ全量のｒＴＲＰ−２が沈殿した。

＜ＤＣの調製＞
８週齢で購入したＣ５７ＢＬ／６の雄をＳＰＦ環境で飼育しておき、９週目以降に骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞を、０．２％マウス血清を含むＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、０８７−０１１２ＤＫ）培地で培養用フラスコに播種し、１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２１４−１４）と２０ｎｇ／ｍｌマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃３１５−０３）を添加して３７℃、５％ＣＯ_２下で一日培養し、翌日、同サイトカインを含む新鮮な同培地に交換した。培地を交換する際に浮遊している細胞は遠心分離により回収し、培養用フラスコに戻した。さらに一日おきに培地交換を行い、骨髄細胞の培養を開始してから９日目時点で浮遊している細胞を回収した。新鮮培地に懸濁して、１μｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加して１日培養し、浮遊している細胞を成熟ＤＣとして使用した。

＜ＤＣの調製とマウスの免疫＞
マウスｒＴＲＰ−２（不溶性）をＵＭＰ若しくはグアノシン一リン酸（以下、ＧＭＰとも記す）を添加して１０％グリセロールを含むＰＢＳで可溶化させた。可溶化させたマウスｒＴＲＰ−２を含むサンプルを、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）に添加（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｃｏ）、またはエレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｅｐ）で導入した。このとき、蛋白質溶液には１０μＭのヌクレオチドを添加した。エレクトロポレーション後一晩培養を継続し、マウスの免疫に使用した。これらのＤＣは１週間に１回、計３回、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝２）の腹腔に１×１０^６個ずつ投与した。最終免疫の６日後、各マウスから脾細胞を採取した。

＜混合リンパ球反応＞
この脾細胞から、ＣＤ４^＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ，ｍｏｕｓｅ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、＃１３０−０９０−８６０）を用いてネガティブセレクションによりＣＤ４^＋Ｔ細胞を得た。また上記と同様にＤＣに可溶化ｒＴＲＰ−２蛋白質を導入し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）とし、ＣＤ４^＋Ｔ細胞をｒｅｓｐｏｎｄｅｒにした混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の実験を行った。ＡＰＣ３×１０^５個：ＣＤ４^＋Ｔ細胞３×１０^６個を６ｍＬのＡＩＭ培地に懸濁して３日間培養した後、ＩＬ−２を１０Ｕ／ｍＬで添加してさらに一日間培養を行なった。培養後、３０００×ｇ、５分間、４℃で遠心し、培養上清を回収した。この培養上清中のＩＦＮ−γの濃度を、ＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡキット（ＰＩＥＲＣＥＥＮＤＯＧＥＮ、＃ＥＭ１００１）を用いて定量し、その結果を図１に示した。

図１のデータは、各群２匹ずつのマウスで行った平均値を示している（エラーバーはＳＤ）。抗原を添加していないＤＣのみ（ｍＤＣ）と正常マウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のみ（ＣＤ４^＋）ではＩＦＮ−γは検出されなかった。ＴＲＰ−２ペプチド（クラスＩ拘束性）をパルスしたＤＣとそれで免疫されたマウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＬＲ（ｐｅｐｔｉｄｅ）で産生されたＩＦＮ−γの量は、抗原を添加していないＤＣとそれで免疫されたマウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＬＲ（Ｃｏ−（―））、及び抗原を添加せずにエレクトロポレーション（Ｅｐ）の操作を行なったＤＣとそれで免疫されたマウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＬＲ（Ｅｐ−（―））で産生されたＩＦＮ−γ量と同等であり、ペプチドパルスＤＣではクラスＩＩへの抗原提示量は増加しないと判断された。一方、ＵＭＰ添加で可溶化したＴＲＰ−２蛋白質で共培養したＤＣとそれで免疫されたマウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＬＲ（Ｃｏ−Ｔ（Ｕ））では、Ｃｏ−（―）と比較して有意（Ｐ＝０．０１７）なＩＦＮ−γ産生量の増加が認められた。この差は、ＵＭＰ添加で可溶化したｒＴＲＰ−２蛋白質をエレクトロポレーションで導入したＤＣとそれで免疫されたマウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＬＲ（Ｅｐ−Ｔ（Ｕ））でさらに拡大され、共培養との比較でも有意（Ｐ＝０．０４５）に増加していた。この結果はＭＨＣクラスＩＩの抗原提示量が共培養よりもエレクトロポレーションの方が多くなっていることを示している。またＧＭＰ添加で可溶化したＴＲＰ−２蛋白質をエレクトロポレーションで導入したＤＣとそれで免疫されたマウス由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＭＬＲ（Ｅｐ−Ｔ（Ｇ））でもＥｐ−（―）よりも多くのＩＦＮ−γを産生する傾向が認められた。

以上の結果から、抗原蛋白質をＤＣに導入することで、ＭＨＣクラスＩＩからの抗原提示が行われ、ヘルパー１型Ｔ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞）を抗腫瘍免疫に誘導できることが確認された。

さらに、共培養法（Ｃｏ−Ｔ（Ｕ）とＣｏ−Ｔ（Ｇ））とエレクトロポレーション法（Ｅｐ−Ｔ（Ｕ）とＥｐ−Ｔ（Ｇ））のいずれの方法で抗原を取り込ませた場合でも、ＵＭＰを添加することで、ＩＦＮ−γの産生量が増加するという結果が得られた。従って、ＵＭＰは抗原提示細胞がＴｈ１細胞へ行う抗原提示に対し、アジュバント効果をもつと考えられた。尚、同一の培養上清中のＩＬ−４を測定したが、いずれの群にも差異は認められなかった。このことは、ヘルパー２型Ｔ細胞（Ｔｈ２細胞）の活性化には影響していないことを示している。

以下に記載の手順により、天然抗原蛋白質提示におけるヌクレオチドのアジュバント効果を確認した。

＜定性的確認＞
ＵＭＰのアジュバント効果を確認する目的で、抗原蛋白質をオブアルブミン（以下、ＯＶＡとも記す）に変更して、マウスを免疫することなしにｉｎｖｉｔｒｏのＭＬＲのみで実験を試みた。

予めＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞から成熟ＤＣを調製し、１０μＭＵＭＰを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｕ）、またはＵＭＰを含まないＰＢＳに２ｍｇ／ｍＬで溶解させたＯＶＡをエレクトロポレーションで導入した。より具体的には、これらのＯＶＡ溶液を細胞懸濁液の１／４容積加えて、エレクトロポレーション用キュベットに添加した。また陰性対照として、ＯＶＡを含まないＰＢＳを用いて同様にエレクトロポレーションしたＤＣも調製した。これらのＤＣを一晩静置しておき、翌日Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞から分取したＣＤ４^＋Ｔ細胞と、同様にＭＬＲ（ＤＣ：ＣＤ４^＋＝１×１０^５個：１×１０^６個／２ｍＬ）を行った（ｎ＝２）。ＩＬ−２添加後２日目に各培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ−γの産生量を定量した。

その結果を図２に示す。ＯＶＡを導入していないＤＣを用いてＭＬＲを行った群（Ｅｐ（−））と比較して、ＰＢＳに溶解させたＯＶＡを導入したＤＣを用いてＭＬＲを行った群（Ｅｐ−ＯＶＡ）では、有意な（Ｐ＝０．００７５）ＩＦＮ−γ産生量の増加が確認された。さらにＥｐ−ＯＶＡと比較して、ＰＢＳ−Ｕに溶解させたＯＶＡを導入したＤＣでＭＬＲを行った群（Ｅｐ−ＯＶＡ（Ｕ））ではさらにＩＦＮ−γの産生量が有意に（Ｐ＝０．０１６）増加しており、ヌクレオチドのアジュバント効果が確認された。

ｒＴＲＰ−２抗原を用いた試験では、Ｔｈ１のメモリー細胞が反応しているため、ＩＦＮ−γの産生が増加する可能性が考えられた。しかし、ＯＶＡ抗原を用いた試験では、メモリー細胞が関与していないことは明らかであるため、ＤＣがナイーブＴ細胞を刺激する際にもヌクレオチドはアジュバント効果を示すと理解された。

＜最適濃度の確認＞
ＯＶＡをＰＢＳ、または１、１０、１００、１０００μＭのＵＭＰを含むＰＢＳに溶解させ、実施例２と同様の実験を行った。ＥＬＩＳＡで定量したＩＦＮ−γ産生量の結果を図３に示す。

ＰＢＳのみでエレクトロポレーションを行ったＤＣを用いてＭＬＲを行った群（（−））と比較して、ＰＢＳにＯＶＡを溶解させた溶液でエレクトロポレーションを行ったＤＣを用いてＭＬＲを行った群（０）では、有意（Ｐ＝０．０２）にＩＦＮ−γの産生量が増加していた。１μＭのＵＭＰを含むＰＢＳにＯＶＡを溶解させた溶液を加えてエレクトロポレーションを行ったＤＣでＭＬＲを行った群（１）ではＵＭＰ無添加群（０）と差異が認められなかった。しかし、１０μＭのＵＭＰを含むＰＢＳにＯＶＡを溶解させた溶液を加えてエレクトロポレーションを行ったＤＣでＭＬＲを行った群（１０）では、（０）と比較してもさらに有意（Ｐ＝０．０４４）なＩＦＮ−γ産生量の増加が確認された。また、ＵＭＰの濃度は１０μＭ以上添加しても、ＩＦＮ−γの産生量のさらなる上昇は認められなかったことから、ＵＭＰの濃度は１０μＭで十分であると判断した。

＜リン酸基の数の影響＞
これまで、一リン酸のヌクレオチドを用いて実験を行ってきたが、天然のヌクレオチドでは、２リン酸及び３リン酸のヌクレオチドの存在が知られている。そこで、リン酸基の数がアジュバント効果に影響するのか確認することにした。
１０μＭのＵＭＰ、１０μＭのウリジン二リン酸（以下、ＵＤＰとも記す）または１０μＭのウリジン三リン酸（以下、ＵＴＰとも記す）を含むＰＢＳと、それらにＯＶＡを溶解させた溶液を実施例２と同様にＤＣのエレクトロポレーションに用いた。ＭＬＲ後にＥＬＩＳＡで測定した培養上清中のＩＦＮ−γ産生量の結果を図４に示す。

ＰＢＳを加えてエレクトロポレーションを行ったＤＣでＭＬＲした群（（−））と比較して、ＵＭＰ若しくはＵＤＰを含むＰＢＳを加えてエレクトロポレーションを行ったＤＣでＭＬＲを行った群（ＵＭＰ、ＵＤＰ）ではＩＦＮ−γの産生量に差異は認められなかった。一方、ＵＴＰを含むＰＢＳを加えてエレクトロポレーションを行ったＤＣでＭＬＲを行った群（ＵＴＰ）では有意（Ｐ＝０．０１２）なＩＦＮ−γ産生量の増加を認めた。また、ＰＢＳにＯＶＡを溶解させた溶液を加えてエレクトロポレーションを行ったＤＣでＭＬＲを行った群（ＯＶＡ）では（（−））よりもＩＦＮ−γの産生量が増加する傾向が認められ、ＵＭＰを含むＰＢＳにＯＶＡを溶解させた溶液を加えてエレクトロポレーションしたＤＣでＭＬＲした群（ＵＭＰ＋ＯＶＡ）では、（ＯＶＡ）群と比較しても有意（Ｐ＝０．０２７）なＩＦＮ−γ産生量の増加が確認された。このとき、ＵＴＰを含むＰＢＳにＯＶＡを溶解させた溶液を加えてエレクトロポレーションしたＤＣでＭＬＲした群（ＵＴＰ＋ＯＶＡ）は、（ＵＭＰ＋ＯＶＡ）群と同等のＩＦＮ−γ産生量であった。

本実験の結果から、ＵＴＰは抗原蛋白質を加えてなくても非特異的にＴｈ１細胞からＩＦＮ−γ産生を誘導してしまい、炎症や自己免疫疾患を発症させる可能性が危惧された。ＵＭＰでは抗原蛋白質を加えた場合にのみＴｈ１細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導するという結果が再現され、ＵＭＰのアジュバント効果の有用性を指示するものと判断された。ＵＤＰはＵＭＰとＵＴＰの中間的な性格を示すものと考えられた。

以下に記載の手順により、ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）でのアジュバント効果の検討を行った。

＜ＤＣ誘導培養の常法＞
ヒト健常人ボランティアの末梢血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社、＃：１１１４５４７）で密度勾配遠心し、単核球（ＰＢＭＣｓ）を得た。ＰＢＭＣｓから、ＭＡＣＳビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社、ＣＤ１４マイクロビーズ、＃１３０−０５０−２０１）で単球（ＣＤ１４^＋細胞）を単離した。ＣＤ１４⁻細胞群は一時的に凍結保存した。

単離したＣＤ１４^＋細胞は、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ社、＃０８７−０１１２ＤＫ）に懸濁し、終濃度５００Ｕ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＢＥＲＬＥＸ社）と５００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）を加えて培養を開始した。培養３日目に１／２量の培地を新鮮なものに交換した。培養５日目に得られる細胞を未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）として回収した。また、ｉＤＣを終濃度２５０Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、２５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−α（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）と１μｇ／ｍｌのプロスタグランジン（ＰＧＥ２：Ｓｉｇｍａ社、＃Ｐ６５３２）を加えたＡＩＭ−Ｖ培地で２日間培養することで得られる浮遊細胞を成熟ＤＣ（ｍＤＣ）として回収した。

＜ＩＬ−２３の産生量に対する効果確認＞
ＡＴＰは、ヒトＤＣのＰ２受容体を介してＩＬ−２３の再生を増加させるように活性化させ、産生されたＩＬ−２３は、メモリーＴ細胞を刺激して、ＩＦＮ−γを産生させるように働くことが知られている（ＭａｘＳｃｈｎｕｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００５）１０５：１５８２−１５８９．）。またＡＴＰは細胞膜上のＣＤ３９でＡＭＰに分解されて、ＡＭＰはさらにＣＤ７３でアデノシンに分解され、アデノシンはＡＴＰが活性化した細胞を静止させるように働くことが報告されている（ＦｒａｎｃｅｓｃｏＤｉＶｉｒｇｉｌｉｏｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００１）９７：５８７−６００．）。ところが、ＡＭＰが細胞を活性化することはこれまでに報告されていない。

このような背景から、ＡＴＰで知られているヒトＤＣへのＩＬ−２３産生刺激において、ヌクレオシド一リン酸であるＡＭＰとＵＭＰがそのような効果を示すのか、示すならばヌクレオシド三リン酸であるＡＴＰやＵＴＰとの比較でどのヌクレオチドの刺激が強いのかを比較検討することにした。

ＤＣ培養の５日目に、ＡＭＰ、ＡＴＰ、ＵＭＰまたはＵＴＰを夫々２０μＭまたは１ｍＭとなるように加え、同時に５μｇ／ｍｌとなるようにすべてにＯＶＡを加えて成熟化を行った。培養７日目に培養上清を回収して、ＩＬ−２３の産生量をＥＬＩＳＡ（ａｂｃａｍ社、ａｂ６４７０８）キットを利用して定量した。その結果を図５に示した。ヌクレオチドを添加しなかった場合に比べて、ヌクレオチドを添加した場合にＩＬ−２３産生の増強が認められた。ただし、高い効果を示すヌクレオチドの種類はサンプルによって異なっていた。３つのサンプルのうち、サンプル１では１ｍＭのＡＭＰを添加した場合に高いＩＬ−２３産生を示し、サンプル２及び３では２０μＭのＵＭＰを添加した場合にもっとも高いＩＬ−２３産生が認められた。この結果から、ヌクレオチド、特にヌクレオシド一リン酸でヒトＤＣを刺激することで、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化におけるアジュバント効果が得られる可能性が示された。

＜ＩＦＮ−γの産生に対する効果確認＞
凍結保存しておいたＣＤ１４⁻細胞群を解凍し、ＣＤ４^＋Ｔｃｅｌｌアイソレーションキット（＃１３０−０９６−５３３）でＣＤ４^＋Ｔ細胞を分取した。分取したＣＤ４^＋Ｔ細胞と、洗浄した培養７日目の各ＤＣを、ＣＤ４^＋Ｔ細胞：ＤＣの混合比を１０：１として１０％自己血清を含んだＡＩＭ−Ｖ培地（含、２０Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２）で混合培養を行った。混合培養開始から３日後に上清中に産生されているＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡキット（ＥＮＤＯＧＥＮ社、＃ＥＨ−ＩＦＮＧ）で定量した。その結果を図６に示した。

ヌクレオチドを添加しなかった場合に比べて、ヌクレオチドを添加した場合にＩＦＮ−γの産生増強が認められた。特に１ｍＭＡＭＰを添加した場合に最も高いＩＦＮ−γ産生が認められ、ヌクレオチドを添加しなかった場合と比較して有意に産生増強されていることが確認された（図中＊Ｐ＝０．０４２）。
この結果は、ＡＭＰでヒトＤＣを刺激するとＣＤ４^＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γを産生させる（Ｔｈ１細胞を活性化する）アジュバント効果が得られることを示唆するものである。

以上説明したように、本発明の抗原提示細胞の調製方法を用いることにより、抗原特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化する能力を有する抗原提示細胞を調製することが可能となる。この抗原提示細胞の性質を利用し、がんや感染症の治療に有効な医薬組成物を製造することができる。また、ヌクレオチドが抗原提示細胞を活性化する性質を有することから、抗原提示細胞活性化剤として利用することができる。抗原提示細胞活性化剤を利用することで、ｉｎｖｉｔｒｏにおいては抗原提示細胞の調製に利用することができる。ｉｎｖｉｖｏに投与した場合、抗原提示細胞の活性化を介して、患者の病態を改善する効果が期待される。

Claims

ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）存在下で、抗原提示細胞の樹状細胞に抗原を取り込ませる抗原提示細胞の調製方法。
前記抗原提示細胞が、取り込ませた抗原を特異的に認識するＴｈ１細胞を刺激する機能を有することを特徴とする請求項１に記載の抗原提示細胞の調製方法。
医薬の製造における、請求項１または２に記載の調製方法によって調製された抗原提示細胞の使用。
前記抗原提示細胞が患者の自己由来であることを特徴とする請求項３に記載の使用。
前記医薬が、患者体内のＴｈ１細胞を活性化することを特徴とする請求項３または４に記載の使用。
ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）またはアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を有効成分とする抗原提示細胞活性化剤であって、活性化した抗原提示細胞の樹状細胞がＩＬ−２３を産生する活性化剤。