JP2001026545A - 免疫応答活性化製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】腫瘍、主として大腸癌、胃癌などの消化器癌、
骨髄腫、腎臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌
もしくは子宮癌を治療するために、またはウィルス感染
症、主としてＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウィルスによる
慢性肝炎を治療するために、免疫応答を活性化する製剤
または系を創製すること。 【解決手段】腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−α
および抗原提示細胞を有効成分として含有する免疫応答
活性化製剤、ならびに腫瘍壊死因子−αおよびインター
フェロン−αと、抗原提示細胞とを別々の投与剤形にす
ることを含む、前記免疫活性化製剤の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、免疫応答を活性
化、 特に抗腫瘍免疫を増強する製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体は、生体内で異物（抗原）と認識さ
れたもの（必ずしも外来のものとは限らない）に働く一
連の生体防御機構と自他の認識機構に関わる免疫系を有
している。 免疫系は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）が産生する
抗体が抗原と反応する液性免疫系と、Ｔリンパ球（Ｔ細
胞）が活性物質を放出したり、直接抗原に働く細胞性免
疫系とに大別できる。このうち細胞性免疫系は、遅延型
過敏症の他、 細胞内寄生体、 ウィルス、腫瘍に対する免
疫応答、 移殖、ある種の薬物アレルギー、一部の自己免
疫疾患などに関与していると考えられ、各種のリンホカ
イン、モノカインによって反応が制御されている。 な
お、リンホカイン、モノカインは、細胞間相互作用を媒
介するタンパク質性因子であるサイトカイン（cytokin
e）に属する１群として扱われる。

【０００３】このような免疫機構において、 抗原提示細
胞（antigen presenting cell ；以下、ＡＰＣと略す）
は生体に侵入した異物の情報をＴ細胞やＢ細胞に伝え、
その活動を促す細胞である。これをきっかけに免疫系が
動き出す。ＡＰＣには、マクロファージ（貪食細胞）、
Ｂ細胞、肝臓のクッパー細胞、胸腺上皮細胞、骨髄由来
の樹状細胞（Dendritic cell；以下、ＤＣと略す）など
が包含される。

【０００４】ＡＰＣは異物を貪食した後、異物を細胞内
の小胞体内のプロテアーゼで分解する。ここで生じた抗
原性ペプチドは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）産
物と結合し、抗原提示細胞の膜表面に露出し、異物情報
としてＴ細胞に提示される。ＡＰＣはＭＨＣ遺伝子によ
りコードされるクラスＩとクラスＩＩの両方の糖タンパ
ク質を発現しているので、免疫応答開始のためにＣＤ４
陽性のＴ細胞とＣＤ８陽性のＴ細胞の両方に抗原ペプチ
ドを提示することができる。 免疫系の調整役であるＴ細
胞は、膜表面上のＴ細胞受容体で抗原ペプチドとＭＨＣ
抗原との複合体を認識・活性化して、生体防御反応を発
動する。

【０００５】なお、ＣＤ８陽性Ｔ細胞には細胞傷害性Ｔ
リンパ球（Cytotoxic T lymphocyte；以下ＣＴＬと略
す）が含まれ、 ＡＰＣの細胞表面に提示される抗原ペプ
チドのうちＣＴＬが認識可能な抗原ペプチドは、特にＣ
ＴＬエピトープと呼ばれる。

【０００６】通常、腫瘍細胞や異物であるウィルス感染
細胞などは上記免疫系により排除されるが、腫瘍細胞や
ウィルス感染細胞が生き残り増殖することにより生命に
重篤な影響を及ぼすことがある。したがって免疫応答を
活性化させることによりガンやウィルス感染を治療する
試みがなされている。ＡＰＣの一つであるＤＣを利用し
た免疫活性化法も例えば、 国際公開第95/34638号パンフ
レット、国際公開第98/01538号パンフレットで開示され
ている。

【０００７】一方、免疫応答を調節するリンホカインの
１つとして腫瘍壊死因子−α（tumor necrosis factor
−α; 以下、ＴＮＦ−αと略す）が知られている。 ＴＮ
Ｆ−αは活性化マクロファージなどが産生する代表的な
サイトカインの１種で、マクロファージを細菌（特にそ
の構成成分であるリポ多糖類）やウィルス、 寄生虫で刺
激したときに産生される。 もともと種々の固形がんに出
血性の壊死を起こすリンホカインとして同定されたもの
である。ＡＰＣの１つであるＤＣに及ぼす作用が知られ
ており、例えば、（１）顆粒球コロニーマクロファージ
刺激因子（granulocyte/macrophage colony-stimulatin
g factor；以下、ＧＭ−ＣＳＦと略す）との併用による
インビトロにおける造血幹細胞→ＤＣへの分化［Ｃ．コ
ウクス(C. Caux) ら、Nature, Vol.360, 258-261(199
2)］、（２）ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン−４との
併用によるインビトロにおける単球→ＤＣへの誘導（米
国特許 第５８４９５８９号）、（３）培養ＤＣに対す
る抗原提示能抑制作用［Ｆ．サルスト（F. Sallust）お
よびＡ．ランザベッキア（A. Lanzavecchia ）、ジャー
ナル オブ イクスペリメンタル メディスン（Journa
l of Experimental Medicine）、第１７９巻、第１１０
９〜１１１８頁（１９９４）］ などが挙げられる。 即
ち、ＴＮＦ−αはＤＣの成熟を誘導する一方、 外来性抗
原の提示によるＣＴＬ活性化能を低下させることが知ら
れている。

【０００８】その他のサイトカインの１つとして、リン
ホカイン、モノカインには属さないが、インターフェロ
ン−α（Interferon−α；以下、ＩＦＮ−αと略す）が
知られている。 ＩＦＮ−αは、生体内でリンパ球や線維
芽細胞などさまざまな細胞が生産する生理活性タンパク
で抗ウィルス作用や抗ガン作用などを示すインターフェ
ロンの主要サブタイプの１つである。ＩＦＮ−αは白血
球により産生され、 ウィルス感染または２本鎖ＲＮＡに
よってその産生が誘発されることが知られている。

【０００９】ＩＦＮ−αの免疫系細胞に対する作用とし
ては、インビボおよびインビトロの両方でナチュラルキ
ラー細胞の細胞傷害性（ＮＫＣＣ）を効果的に高めるこ
とが知られている（Trinchieri、1989年、Adv.Immunol.
47、187 〜376;Einhorn 、Blomgrenおよび Strander 、
1978年、Int.J.Cancer 22 、405 〜412;Friedmanおよび
Vogel 、1984年、Adv.Immunol.34、97〜140 ）。

【００１０】なお、抗原ペプチドを提示したＤＣを投与
することにより個体の免疫を活性化させる方法は、投与
される個体側の免疫系の状態によって活性化できない場
合が多い。 したがって、その回復を補助するアジュバン
トとして様々なサイトカインの併用が唱えられている。
例えば、国際公開第95/34638号パンフレットでは、ＧＭ
−ＣＳＦやインターロイキン−１２（Interleukin-1
2）、国際公開第98/01538号パンフレットではＴＮＦ、
ＩＦＮ−γなどをＤＣとともに投与する技術が開示され
ているが、いずれもその併用効果の確認はなされていな
い。 また上記２公報においては、ＩＦＮ−αの使用に関
する開示はなされていない。

【００１１】さらに免疫応答の活性化を目的としたサイ
トカインの使用については、例えば、国際公開第９５／
２４９２３号パンフレットに開示の技術が挙げられる。
該技術はＤＣではなく、熱ショックタンパク質（Ｈｓ
ｐ) ９０などのストレスタンパク質と病原体由来ペプチ
ドとの複合体によりＣＴＬを誘導する技術であり、ＣＴ
Ｌ誘導を更に増強させるため、 ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α
を含む公知サイトカインの他、 未知のサイトカインも使
用可能と記載されているが、 実際に増強効果があるかは
確認されていない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、例え
ば腫瘍、主として大腸癌、胃癌などの消化器癌、骨髄
腫、腎臓癌、白血病、メラノーマ、前立腺癌、乳癌もし
くは子宮癌を治療するために、またはウィルス感染症、
主としてＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウィルスによる慢性
肝炎を治療するために、免疫応答を活性化する製剤また
は系を創製することである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意検討し
た結果、ＡＰＣの一つであるＤＣの抗原提示を長期間安
定に維持させるために、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αとの併
用が有用であることを見出した。 さらに抗原ペプチドを
細胞表面に提示したＤＣを個体に投与する際、ＤＣ単独
投与では免疫応答の十分な活性化が起らなかった個体に
対して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αを併用することに
より免疫応答を活性化できることを見出し、本発明を完
成するに至った。

【００１４】即ち、本発明の要旨は、（１） 腫瘍壊死
因子−α、インターフェロン−αおよび抗原提示細胞を
有効成分として含有する免疫応答活性化製剤、ならびに
（２） 腫瘍壊死因子−αおよびインターフェロン−α
と、抗原提示細胞とを別々の投与剤形にすることを含
む、前記（１）記載の免疫活性化製剤の製造方法、に関
する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−
αおよび抗原提示細胞を有効成分として含有する免疫応
答活性化製剤を提供する。

【００１６】本発明において抗原提示細胞とは、抗原提
示能を有する細胞および抗原ペプチドを提示した抗原提
示細胞の両方を包含する。抗原提示能を有する細胞に
は、例えば抗原ペプチドとＨＬＡ分子との複合体をその
細胞表面に提示することが可能な、マクロファージやＢ
細胞、樹状細胞（ＤＣ：dendritic cells ）を始めとす
る白血球細胞が挙げられる。ＤＣは、細胞当り抗原提示
量が多く、また抗原提示に必要な細胞表面分子〔ＣＤ８
０、ＣＤ８６等のコスティミュラトリー・シグナル（ｃ
ｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ）分子等〕
の発現量も高いため、抗原提示能を有する細胞として特
に好適である。上記抗原提示能を有する細胞は、体外摘
出試料より調製することができる。例えばＤＣは、１）
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）より比重を利用した密度勾配
遠心分離やいくつかの細胞表面マーカー等を基に単離精
製してくる、２）単球よりＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４によ
り誘導してくる、３）ＣＤ−３４陽性細胞よりＧＭ−Ｃ
ＳＦ、ＴＮＦ−α、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）等のサイ
トカインで誘導してくる等いずれかの方法により調製す
ることができる。

【００１７】抗原ペプチドを提示した抗原提示細胞は、
前記抗原提示能を有する細胞に所望の抗原ペプチドを提
示させることにより調製したものである。提示させる抗
原ペプチドは、１種または２種以上であってもよい。こ
こで抗原ペプチドとしては、目的の治療に有効な免疫応
答を惹起可能なものであれば特に限定されない。例え
ば、現在までにＣＴＬエピトープとして同定された抗原
ペプチドとしては、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）−
１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、癌胎児性抗原（ＣＥ
Ａ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕの他、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ｐ５
３、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ｐｒｏｓｔａｔｉｃ
ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅなど多くの腫瘍抗原
由来のものがある。具体的な例としては、腫瘍抗原ペプ
チドとして同定されたＭＡＧＥ−３抗原ペプチド、ＭＡ
ＧＥ−１抗原ペプチド、ＣＥＡ抗原ペプチドおよびＨＥ
Ｒ２／ｎｅｕ抗原ペプチドから選択される少なくとも１
つの抗原ペプチドが挙げられる。これらの好適なアミノ
酸配列は、国際公開第９９／０３９７２号パンフレット
に記載されており、具体的には、ＭＡＧＥ−３抗原ペプ
チドとしては下記アミノ酸配列：Ile Met Pro Lys Ala
Gly Leu Leu Ile （配列番号：１）またはVal Ala Glu
Leu Val His Phe Leu Leu （配列番号：２）、ＭＡＧＥ
−１抗原ペプチドとしては下記アミノ酸配列：Asn Tyr
Lys His Cys Phe Pro Glu Ile （配列番号：３）、ＣＥ
Ａ抗原ペプチドとしては下記アミノ酸配列：Gln Tyr Se
r Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe （配列番号：４）また
はThr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu （配列番号：
５）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原ペプチドとしては下記アミ
ノ酸配列：Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu （配
列番号：６）が好ましく、腫瘍抗原ペプチドの中でも種
々の悪性腫瘍の腫瘍マーカーであるＣＥＡ値を低減可能
なペプチドという観点から、ＣＥＡ抗原ペプチドがより
好ましい。なお、これらの抗原ペプチドは、日本人その
他のアジア人種に比較的多く見られる型であるＨＬＡ−
Ａ２４に拘束性のペプチドである。これらの他、ＨＬＡ
−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３
５、ＨＬＡ−Ｂ４４などＭＨＣクラスＩ分子拘束性の抗
原ペプチドが同定されている。またＤＲ４、ＤＲ１３な
どのＭＨＣクラスII分子拘束性の抗原ペプチドが同定さ
れている。

【００１８】抗原ペプチドのさらなる例は、ウィルス抗
原由来のぺプチドであり、好ましくはヒト免疫不全ウィ
ルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝
炎ウィルス（ＨＢＶ）、パピローマウィルス（ＨＰ
Ｖ）、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）のコードす
るタンパク質由来の抗原ペプチドが挙げられる。例え
ば、ＨＩＶ−ｇａｇ由来のＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ３
５、ＨＬＡ−Ｂ４４拘束性のＣＴＬエピトープ、ＨＣＶ
ｃｏｒｅ、ＮＳ３由来のＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬ
エピトープが同定されており、これらの抗原ペプチドが
利用可能である。その他マラリア原虫由来のＣＴＬエピ
トープとなる抗原ペプチドも利用可能である。

【００１９】抗原提示能を有する細胞表面に抗原ペプチ
ドを提示させるには、例えば上記抗原提示能を有する細
胞と抗原ペプチドの少なくとも一つを混合後、必要に応
じて過剰量の抗原ペプチドを洗浄し、ＨＬＡ分子上に抗
原ペプチドを負荷させる方法が挙げられる。なお、上記
抗原提示能を有する細胞の調製方法における１）の方法
で調製した細胞のように、既にＨＬＡ分子上に本発明と
は無関係の抗原ペプチドを提示していると考えられる細
胞は、抗原ペプチドを負荷する前に酸処理などを行うこ
とにより、ＨＬＡ分子上に存在するペプチドを除去して
もよい。該抗原提示能を有する細胞は、単一の抗原ペプ
チドが負荷されていてもよいし、細胞１個当り数種類の
抗原ペプチドが負荷されていてもよい。また、別な方法
としては、抗原ペプチドのアミノ酸配列を含有するアミ
ノ酸配列からなるタンパク、また抗原ペプチドとなるア
ミノ酸配列をコードする核酸分子を外から加え、抗原提
示細胞に取り込ませ、抗原ペプチドを提示させることも
できる。さらに別な方法として、Ｂ細胞、ＣＤ３４陽性
細胞やＤＣに対して上記抗原ペプチドを提示させること
のできる発現ベクターにより該細胞を形質転換する方法
が挙げられる。なお、ＣＤ３４陽性細胞は形質転換後、
抗原提示細胞に分化させればよい。このようなベクター
としては、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＱＭｎｅｏ、ｐＣＥＰ４
等の市販のプラスミドに、組換えＤＮＡ技術によって細
胞表面に提示させたい抗原ペプチドの少なくとも１つを
コードする遺伝子を組込んだ、発現用プラスミドベクタ
ーが挙げられる。更に該発現ベクターは、細胞表面に提
示させたい抗原ペプチドの両端に細胞内で効率良くプロ
テアーゼの分解を受けるように適当なアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子が付加されていてもよい。更に、レトロ
ウィルスベクターやアデノウィルスベクターも好適に利
用される。

【００２０】抗原提示細胞は、非増殖性とすることが好
ましい。細胞を非増殖性とするためには、Ｘ線等の放射
線照射またはマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等
の薬剤による処理を行えばよい。

【００２１】本発明の免疫応答活性化製剤は、抗原提示
細胞の投与に続いて、腫瘍壊死因子−αおよびインター
フェロン−αの投与がなされるのに適した投与剤形であ
る。

【００２２】抗原提示細胞の量としては、個体に対して
免疫応答を活性化する限り特に限定されないが、１回の
投与量が１×１０³ 〜１×１０⁷ 個/kg となるのに適し
た投与剤形であることが好ましい。

【００２３】本発明の免疫応答活性化製剤に含有される
ＴＮＦ−αは、医薬品と同等以上の品質を有するものを
利用することができる。ＴＮＦ−αの量としては、個体
に対して免疫応答を活性化する限り特に限定されない
が、１回の投与量が１×１０³〜１×１０⁵ U/kgとなる
のに適した投与剤形であることが好ましい。

【００２４】本発明の免疫応答活性化製剤に含有される
ＩＦＮ−αは、市販の医薬品を好適に利用することがで
きる。ＩＦＮ−αの量としては、個体に対して免疫応答
を活性化する限り特に限定されないが、１回の投与量が
１×１０³ 〜１×１０⁵ IU/kg となるのに適した投与剤
形であることが好ましい。

【００２５】ここで、免疫応答を活性化するとは、投与
対象の個体がＣＴＬを誘導する能力をいう。免疫応答の
活性化は、例えば実施例５に記載のように、免疫応答活
性化製剤の投与後の個体由来のＰＢＭＣに関して試験管
内でＣＴＬの誘導活性を測定することにより、または実
施例２に記載のように、血清中の抗原タンパク質量の変
化を測定することなどにより調べることができる。

【００２６】なお、本発明の免疫応答活性化製剤に含有
される抗原提示細胞は、自己または非自己由来のもので
あってもよい。非自己由来の抗原提示細胞は、投与対象
の個体とＨＬＡの型が一致することが好ましい。

【００２７】本発明の免疫活性化製剤は、大腸癌、胃癌
などの消化器癌、骨髄腫、腎臓癌、白血病、メラノー
マ、前立腺癌、乳癌、子宮癌等の良性腫瘍もしくは悪性
腫瘍の新生物形成、またはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウ
ィルスによる慢性肝炎、ＡＩＤＳ等のウィルス感染症の
治療に用いられる。あるいは、各種の腫瘍抗原ペプチド
を提示した抗原提示細胞を用いることにより、腫瘍抗原
タンパク質を発現した悪性腫瘍の治療に好適に用いられ
る。抗原提示細胞がＤＣの場合の本発明の免疫活性化製
剤の投与方法は、下記のように例示することができる。

【００２８】まず、個体の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を
常法により分離して、モノサイト画分をＧＭ−ＣＳＦお
よびＩＬ−４で処理することにより試験管内でＤＣを調
製する。ＤＣの調製方法の具体例は、実施例１に記載さ
れている。調製したＤＣは、前記したように抗原ペプチ
ドを提示させてもよいし、提示させなくてもよい。

【００２９】前記ＤＣは、元の個体の(autologous)体内
に戻すこともできるし、ＨＬＡの型の一致する別の個体
の(allogenic) 体内に戻すこともできる。個体への投与
方法は、皮下、皮内または静脈内注射等で行なう。投与
回数は、通常、２〜３週間毎であり、所望の効果が得ら
れるまで繰り返す。

【００３０】次に、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αを個体
に投与する。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αは、同時に投
与してもよいし、別々に投与してもよい。個体への投与
方法は、通常、静脈内注射、皮下注射等で行なう。投与
時期は、第１回目の抗原提示細胞投与の後であり、投与
当日および／または投与後１〜１４日の間に投与するの
が好ましい。投与回数は、通常、週に１〜５回、好まし
くは週に２〜３回である。

【００３１】本発明の免疫活性化製剤は、他の薬剤と併
用してもよいが、免疫抑制的に働く薬剤との併用は好ま
しくない。

【００３２】本発明の免疫活性化製剤は、抗原提示細胞
投与後に、アジュバントとしてＴＮＦ−αおよびＩＦＮ
−αを併用するような剤形をとるので、抗原提示細胞の
成熟化、それに伴うリンパ節への移行および抗原提示能
を長期間安定に維持することができる。さらに、抗原提
示細胞を個体に投与する際、該細胞単独投与では免疫応
答の十分な活性化が起らなかった個体に対して、ＴＮＦ
−αおよびＩＦＮ−αを併用することにより免疫応答を
活性化することができる。

【００３３】また、本発明は、前記ＴＮＦ−αおよびＩ
ＦＮ−αと、抗原提示細胞とを別々の投与剤形にするこ
とを含む、免疫活性化製剤の製造方法を提供する。抗原
提示細胞は、前記のように調製した後、細胞の保存に適
した培地、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水に懸
濁した投与剤形にする。細胞の保存に適した培地として
は、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培
地が一般的である。また該培地または緩衝液には血清ア
ルブミン等を安定化の目的で添加してもよい。抗原提示
細胞の濃度は、細胞１種類当り１０³ 〜５×１０⁶ 個／
ｍｌ、好ましくは１０⁴ 〜１０⁶ 個／ｍｌである。ＴＮ
Ｆ−αおよびＩＦＮ−αは、前記した市販の医薬または
医薬品と同等以上の品質を有するものを抗原提示細胞と
は別の投与剤形にする。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−α
は、別々の投与剤形にしてもよいし、同一の投与剤形に
してもよい。ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの投与剤形
は、注射に適した剤形であれば特に限定されない。ＴＮ
Ｆ−αの濃度は、１×１０⁴ 〜１×１０⁷ U/ml、好まし
くは１×１０⁵ 〜１×１０⁶ U/mlである。ＩＦＮ−αの
濃度は、１×１０⁴ 〜１×１０⁷ IU/ml 、好ましくは１
×１０⁵ 〜１×１０⁷ IU/ml である。

【００３４】すなわち本発明は、上記新生物、ウィルス
感染などの、免疫応答活性化を必要とする疾病の治療剤
を提供するものである。換言すれば、本発明は抗原提示
細胞とＴＮＦ−α、ＩＦＮ−αとを、抗原提示細胞の投
与の後にＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αを投与できるよう
に作製された、免疫応答を活性化するための投与剤を提
供するものである。

【００３５】

【実施例】以下実施例により本発明をさらに具体的に説
明するが、本発明は、これらの実施例により限定される
ものではない。

【００３６】実施例１ ＣＥＡペプチドを負荷した抗原
提示細胞（樹状細胞）の調製、投与およびその効果 ＨＬＡ−Ａ２４陽性の癌患者（ステージIVの進行消化器
癌または肺癌患者）それぞれより成分採血を行い白血球
画分を集め、さらに以下の分離方法に従ってＰＢＭＣを
分離した。すなわち、採血液をりん酸緩衝生理食塩水
（PBS)で約２倍に希釈し、フィコール−パック（Ficoll
-Paque）分離液（ファルマシア社製）上に重層し、400
×g で20分間室温で遠心分離した。中間層のＰＢＭＣを
ピペットで回収、洗浄して保存液［８% ヒト血清アルブ
ミン（HSA)入りCP−１（極東製薬社製）］に懸濁した状
態でバイアルに約５×10⁷ 個づつ分注し、液体窒素中に
保存した。以下の実験においては、これら保存ＰＢＭＣ
より必要量を用時融解して用いた。

【００３７】各患者の保存ＰＢＭＣを、融解後、細胞濃
度が4 ×10⁶ 個/ml となるように５％ヒトAB型血清を含
むRPMI培地（5H-RPMI ）に懸濁し、細胞懸濁液25mlずつ
を２本のT-75フラスコに入れた。1.5 時間37℃のCO₂ イ
ンキュベーター内で培養後、非接着細胞を除き、ＧＭ−
ＣＳＦを1000U/mlおよびＩＬ−４を1000U/ml含む5H-RPM
I を20ml加え、37℃のCO₂ インキュベーター内で培養し
た。７日後に、浮遊細胞を回収した。接着細胞について
は細胞解離バッファー（ギブコ社製）にて回収し5H-RPM
I で洗浄後、浮遊細胞と合わせた。回収した樹状細胞
（以下、ＤＣ）約１×10⁷ 個をＣＥＡペプチド（アミノ
酸配列：TYACFVSNL ）（配列番号：５）40μg/mlを含む
1% HSA入りPBS （2 ml）に懸濁し室温で４時間放置し
た。以後このように調製したＤＣ懸濁液をＤＣワクチン
と呼ぶ。上記ＤＣワクチンの調製ならびにＤＣワクチン
の患者への皮下および皮内への投与を２または３週毎に
繰り返した。各投与２週間後に採血し、血清中のＣＥＡ
量（ng／ml）をモニターした。その結果を表１に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】表１より、いずれの患者においても緩やか
ではあるがＣＥＡ値が上昇していき、顕著なＣＥＡ値の
減少する症例はなかった。

【００４０】実施例２ ＣＥＡペプチドを負荷した樹状
細胞の投与後ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物の投与、
およびその効果 実施例１記載と同様の方法で、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の患
者（ステージIVの進行消化器癌または肺癌患者）由来の
ＰＢＭＣよりそれぞれＤＣワクチンを調製し、各患者に
投与した。ＤＣワクチンの投与は２週間おきに行った。
第１回目のワクチン投与日から、週に２回、ＴＮＦ−α
（２−3 ×10⁶ Ｕ）（林原生物化学研究所）とＩＦＮ−
α（２−3 ×10⁶ ＩＵ）（持田製薬）の混合物を静脈内
に投与した。ワクチン投与前（またはＴＮＦ−αとＩＦ
Ｎ−αの混合物の投与前）およびその後の血清中のＣＥ
Ａ量を測定した。その結果を表２に示す。

【００４１】

【表２】

【００４２】表２より、４症例中２症例（F27 、F37 ）
においてＣＥＡ値の上昇抑制または減少が観察された。
特に、F37 では顕著であった。

【００４３】実施例３ ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合
物での処理によるＤＣの細胞表面分子の変化 実施例１と同様の方法でＰＢＭＣよりT-25フラスコ（4
×10⁶ 個/ml を10ml入れた）で調製した接着細胞を、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦとＩＬ−４の存在下５日間培養した後、ｒＴ
ＮＦ−α（ジェンザイム社製、最終濃度500 U/ml）、ｒ
ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物（最終濃度：ｒＴＮＦ
−α 500 U/ml、ＩＦＮ−α 500 IU/ml ）を添加し、
更に３日間培養し、各処理ＤＣを調製した。対照とし
て、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４のみの存在下で８日間培養
して得られたＤＣを用いた。その後、各ＤＣを回収し、
表面マーカー（class I, class II, CD80, CD83, CD86
）の発現量をそれぞれの分子に対する抗体（ベクトン
ディキンソン社製）およびFITC標識２次抗体（ベクトン
ディキンソン社製）を用いて標識し、フローサイトメー
ターで測定して、各細胞表面マーカー陽性細胞の割合を
求めた。その結果を表３に示す。また、回収した各処理
ＤＣの一部を5H-RPMI （ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４のいず
れも含有しない）培地に懸濁し、更に３日間培養後細胞
を回収し、表面マーカー（class I, class II, CD80, C
D83, CD86 ）をフローサイトメーターで測定して、各細
胞表面マーカー陽性細胞の割合を求めた。その結果を表
４に示す。

【００４４】

【表３】

【００４５】

【表４】

【００４６】表３より明らかなように、ＴＮＦ−αまた
はＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物で処理したことによ
り、コスティミュラトリー・シグナルを与えるリガンド
であるCD80、CD86の発現が増大すると共に、成熟ＤＣの
マーカーであるCD83の発現も増加した。ところが、表４
に示すように、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４の存在しない条
件に置くと、ＴＮＦ−α単独で処理したＤＣはCD80、CD
86、CD83いずれも発現量が低下したのに対し、ＴＮＦ−
αとＩＦＮ−αの混合物で処理したＤＣはCD83の発現が
低下したが、ＴＮＦ−α単独処理細胞に比べて高い発現
を維持しており、またCD80の発現は逆に増加した。この
ことはＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物がＤＣの抗原提
示能を長時間維持させていることを示している。

【００４７】次に、調製した各処理ＤＣの抗原提示能を
アロ混合リンパ球反応により測定した。即ち、8 日目に
回収した各処理ＤＣ（０、 3.7×10³ 、7.5 ×10³ 、1.
5 ×10⁴ 個／ウェル）と、異なるドナー由来のＰＢＭＣ
をナイロンウールカラムを通過させて得られたＴ細胞リ
ッチなエフェクター細胞（1.5 ×10⁵ 個／ウェル）とを
混合し、4 日間培養後、³ H-チミジンを加え、その後培
養を続け、24時間後に細胞を回収し、チミジンの取り込
み量を液体シンチレーションカウンターで測定した。そ
の結果を表５に示す。

【００４８】

【表５】

【００４９】表５の結果より、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−α
の混合物で処理して得られたＤＣは、他の方法で得られ
たＤＣより高い抗原提示能を有していた。以上のことよ
り、ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物が生体内で高い抗
原提示能を有するＤＣを長時間維持させていることが示
された。

【００５０】実施例４ ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合
物による腫瘍細胞の変化 ＣＥＡ陽性の胃癌細胞MKN45 （ＪＣＲＢ ０２５４）を
ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物（最終濃度各々10、10
0 、1000 U/ml および10、100 、1000 IU/ml）を含む１
０％ ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地と共に２日間培養した。そ
の後、細胞を回収し、上記のＣＥＡペプチドを認識して
MKN45 胃癌細胞を傷害するＣＴＬ（Int.J. Cancer, 80,
92-97, 1999 ）と１：１の割合で混合して一晩培養
後、ＣＴＬより放出されるＩＦＮ−γの量を市販のELIS
A キットで定量した。対照として、100U/ml のＩＦＮ−
γで２日間培養したMKN45 細胞およびＩＦＮ−γ無添加
で培養したMKN45 細胞を、同様に前記ＣＴＬと混合培養
した。その結果を表６に示す。

【００５１】

【表６】

【００５２】表６より明らかなように、ＴＮＦ−αとＩ
ＦＮ−αの混合物は、従来知られているＩＦＮ−γより
強い抗原提示誘導能がある。即ち、ＴＮＦ−αとＩＦＮ
−αの混合物を投与することにより、標的細胞がＣＴＬ
による認識を受け易くなること、更に実施例３に示した
ように、抗原提示細胞に対しても腫瘍抗原を強く提示さ
せることができることから、より効率よくＣＴＬが誘導
されてくる可能性が示唆される。

【００５３】実施例５ ＰＢＭＣからのＣＴＬ誘導 個体F27 より、ＤＣワクチン投与前、およびＤＣワクチ
ン投与後さらにＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物投与を
開始して１週間後に成分採血し、実施例１と同様の操作
でＰＢＭＣを分離した。このＤＣワクチン投与前および
ＴＮＦ−αとＩＦＮ−αの混合物投与後のＰＢＭＣのそ
れぞれについて下記の方法でＣＴＬ誘導を実施した。

【００５４】（１）ＤＣの調製 保存ＰＢＭＣを、融解後、細胞濃度が2 ×10⁶ 個/ml と
なるように5H-RPMI に懸濁し、細胞懸濁液10mlをT-25フ
ラスコに入れた。37℃で1.5 時間放置後、非接着細胞を
除き、ＧＭ−ＣＳＦを1000U/mlおよびＩＬ−４を1000U/
ml含む5H-RPMIを10ml加え、37℃のCO₂ インキュベータ
ー内で培養した。７日後に、浮遊細胞を回収した。接着
細胞については細胞解離バッファーにて回収して5H-RPM
I で洗浄後、浮遊細胞と合わせた。回収した細胞につい
て3x10⁶ 個/ml となるように、ペプチド40μg/ml、β₂
ミクログロブリン３μg/mlを含む1% 牛血清アルブミン
-PBSに懸濁し、20℃の恒温槽中４時間放置した。反応
後、Ｘ線照射（5500Rad ）を行い細胞濃度が１×10⁵ 個
/ml となるように5H-RPMI に懸濁した。

【００５５】（２）エフェクター細胞の調製 保存ＰＢＭＣを、融解後、細胞濃度が２×10⁷ 個/ml と
なるように４℃の1%ヒトAB血清を含むPBS （以下1H-PB
S）に懸濁した。２×10⁷ 個のＰＢＭＣに対して1H-PBS
で洗浄した抗CD8 抗体を結合したビーズ（Dynabeads M4
50、ダイナル社製）を140 μl 加えた。４℃で１時間反
応後、非接着細胞を除いた。非接着細胞を除いた後、最
初に用いた細胞数として１×10⁸ 個に対して0.9ml の1H
-PBSに懸濁し、0.1ml の細胞解離用ビーズ（DETACHaBEA
Ds、ダイナル社製）を加えた。室温で１時間混和後、解
離した細胞を回収して1H-PBSで洗浄した。洗浄した細胞
を２×10⁶ 個/ml となるように5H-RPMI に懸濁し、上記
（１）で調製したＤＣ懸濁液と等量ずつ混和した。この
懸濁液に最終濃度10ng/ml となるようにＩＬ−７を加
え、48ウェル培養プレートの各ウェルに0.5ml ずつ分注
し、37℃のCO₂ インキュベーター内で培養した。翌日、
10ng/ml のIL-10 を含む5H-RPMI を50μl 加えた。

【００５６】１週間後に各ウェルの培養上清を除き、細
胞を0.5ml の5H-RPMI に懸濁した。この懸濁液を、下記
（３）のように調製した抗原提示細胞を含むプレートに
加え、再刺激した。翌日、IL-10 を終濃度10 ng/mlとな
るように添加し、更に２日おきに、培養上清を半量除
き、20 U/ml のIL-2を含む5H-RPMI を等量加え、１週間
37℃のCO₂ インキュベーター内で培養した。同様の再刺
激を更に３回行い、細胞を回収し、エフェクター細胞と
した。このエフェクター細胞を5H-RPMI に懸濁し、下記
（４）の方法で細胞傷害活性を測定した。ただし、エフ
ェクター細胞は各ウェルの培養上清を除き1ml の5H-RPM
I に懸濁しエフェクター細胞懸濁液として用いた。後述
のTISI(+) 細胞に対して細胞傷害性を示したウェルにつ
いて、抗CD3 抗体または抗原刺激に用いた各ペプチドを
用いてエフェクター細胞を増殖させた。増殖した細胞を
5H-RPMI に懸濁し下記（４）の方法で細胞傷害活性を測
定した。

【００５７】（３）再刺激用抗原提示細胞の調製 融解後のＰＢＭＣにＸ線照射（5500Rad ）を行い、細胞
濃度を４×10⁶ 個/mlに調製し48ウェル培養プレートに
0.5ml/ウェルずつ分注し、CO₂ インキュベーター内で1.
5 時間培養した。その後、非接着細胞を吸引除去し、さ
らに各ウェルをRPMI1640で洗浄して非接着細胞を除い
た。ペプチド20μg/ml、β₂ ミクログロブリン３μg/ml
を含む1 ％HSA 入りPBS を0.25 ml/ウェルずつ分注し、
CO₂ インキュベーター内で培養した。２時間後に上清を
吸引除去し5H-RPMI で１回洗浄し、プレートの各ウェル
に残った細胞を再刺激用抗原提示細胞として使用した。

【００５８】（４）ＣＴＬによる細胞傷害活性の測定 細胞傷害活性測定のための標的細胞として、HLA-A24 を
発現しているＥＢＶトランスフォームＢ細胞であるTISI
（WSNO 9042 ）を用いた。TISI細胞を測定前日にペプチ
ド10μg/mlを含む培地（以下、TISI(+) と表記）、また
は含まない培地（以下、TISI(-) と表記）中で一晩培養
した。測定当日、各５×10⁶ 個のTISI(+) 、TISI(-) 細
胞を含む培養液に200 μCiのNa₂ ⁵¹CrO ₄ を添加して37
℃で１時間⁵¹Cr標識し、その後10％FCS 含有RPMI1640培
養液で洗浄した。96ウェル培養プレートの各ウェルに前
記（２）のエフェクター細胞懸濁液を100 μl/ウェルず
つ分注しておき、これに１×10⁴ 個の⁵¹Cr標識TISI細胞
および３×10⁵ 個のK562細胞（混入するNK細胞による非
特異的傷害活性を除くため）を含む100 μl の細胞懸濁
液を加えた。400 ×g で１分間遠心分離後、37℃のCO₂
インキュベーター中に５時間放置した。その後各ウェル
の培養液上清100 μl を採取し、ガンマカウンターを用
いて、遊離した⁵¹Cr量を測定した。

【００５９】特異的細胞傷害活性は以下の計算式に従っ
て算出した。 特異的細胞傷害活性（％)=（各ウェルの測定値−最小放
出値) ／（最大放出値−最小放出値) ×100 ただし、最小放出値は標的細胞およびK562細胞のみ入っ
ているウェルの⁵¹Cr量であり、標的細胞からの⁵¹Crの自
然遊離量を示す。また、最大放出値は、標的細胞に界面
活性剤トリトンX-100 を加えて細胞を破壊した際の⁵¹Cr
遊離量を示している。TISI(-) 細胞と比較してTISI(+)
細胞に対して20％以上高い特異的細胞傷害活性を示した
エフェクター細胞が含まれているウェルの割合を、ペプ
チド特異的な細胞傷害性を示すＣＴＬの頻度とした。そ
の結果を表７に示す。

【００６０】

【表７】

【００６１】表７より、ＩＦＮ−αとＴＮＦ−αの混合
物投与後のＰＢＭＣから、ＤＣワクチン投与前より多く
の抗原ペプチド特異的な細胞傷害性を示すエフェクター
細胞（ＣＴＬ）が得られることが明らかとなった。

【００６２】

【発明の効果】本発明により、腫瘍壊死因子−α、イン
ターフェロン−αおよび抗原提示細胞を有効成分として
含有する免疫応答活性化製剤、ならびにその製造方法が
提供される。本発明の免疫応答活性化製剤は、投与後に
抗原提示細胞を長期間安定に維持することができる。さ
らに、抗原提示細胞を個体に投与する際、該細胞単独投
与では免疫応答の十分な活性化が起らなかった個体に対
して、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αを併用することによ
り免疫応答を活性化することができる。

【００６３】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Agent for Immunoresponse Activation <130> TS-11-003 <160> 6

【００６４】 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

【００６５】 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

【００６６】 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

【００６７】 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

【００６８】 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

【００６９】 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/555 Ｃ０７Ｋ 14/525 Ａ６１Ｋ 37/02 14/555 37/66 Ｇ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 川嶋 一郎 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 糠谷 育衛 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 伊藤 剛 京都市左京区山端壱町田町８−80 ローズ マンション修学院401号 (72)発明者 上田 祐二 京都市左京区山端大城田町20 ライオンズ マンション修学院701号 (72)発明者 山岸 久一 滋賀県大津市稲葉台３−６ Ｆターム(参考） 4B065 AA94X AC14 AC20 BD39 CA24 CA44 4C084 AA24 BA44 CA26 CA36 DA22 DA25 MA02 NA05 ZB091 ZB092 ZB261 ZB331 ZC751 4C087 AA01 AA02 CA21 MA02 NA05 ZB09 ZB26 ZB33 ZC75 4H045 AA30 BA15 CA41 DA86 EA22 FA71

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−
   αおよび抗原提示細胞を有効成分として含有する免疫応
   答活性化製剤。
2. 【請求項２】 抗原提示細胞が樹状細胞である請求項１
   記載の免疫応答活性化製剤。
3. 【請求項３】 抗原提示細胞が抗原ペプチドを提示して
   いる請求項１または２記載の免疫応答活性化製剤。
4. 【請求項４】 抗原提示細胞の投与に続いて、腫瘍壊死
   因子−αおよびインターフェロン−αの投与がなされる
   のに適した投与剤形である、請求項１〜３いずれか記載
   の免疫応答活性化製剤。
5. 【請求項５】 腫瘍壊死因子−αおよびインターフェロ
   ン−αを同時に投与するのに適した投与剤形である請求
   項１〜４いずれか記載の免疫応答活性化製剤
6. 【請求項６】 腫瘍壊死因子−αの１回投与量が１×１
   ０³ 〜１×１０⁵ U/kgとなるのに適した投与剤形である
   請求項１〜５いずれか記載の免疫応答活性化製剤。
7. 【請求項７】 インターフェロン−αの１回投与量が１
   ×１０³ 〜１×１０ ⁵ IU/kg となるのに適した投与剤形
   である請求項１〜６いずれか記載の免疫応答活性化製
   剤。
8. 【請求項８】 抗原提示細胞の１回投与量が１×１０³
   〜１×１０⁷ 個/kgとなるのに適した投与剤形である請
   求項１〜７いずれか記載の免疫応答活性化製剤。
9. 【請求項９】 抗原ペプチドが癌胎児性抗原由来の細胞
   傷害性Ｔ細胞エピトープである請求項３〜８いずれか記
   載の免疫応答活性化製剤。
10. 【請求項１０】 新生物形成またはウィルス感染の治療
    に用いられる、請求項１〜８いずれか記載の免疫活性化
    製剤。
11. 【請求項１１】 癌胎児性抗原を発現した悪性腫瘍の治
    療に用いられる、請求項１〜９いずれか記載の免疫活性
    化製剤。
12. 【請求項１２】 腫瘍壊死因子−αおよびインターフェ
    ロン−αと、抗原提示細胞とを別々の投与剤形にするこ
    とを含む、請求項１〜１１いずれか記載の免疫活性化製
    剤の製造方法。