MXPA03007503A

MXPA03007503A - Un metodo de terapia de celulas para el tratamiento de tumores.

Info

Publication number: MXPA03007503A
Application number: MXPA03007503A
Authority: MX
Inventors: A Peterson Per
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2004-10-15
Also published as: IL219223A0; HK1058485A1; WO2002065992A2; EP2016930A3; EA200300815A1; BR0207399A; CA2438754A1; US20090305418A1; EP2016930B1; CA2698079C; ATE396691T1; ES2306771T3; WO2002065992A3; JP2012097117A; DE60226853D1; US20030077248A1; KR100971266B1; CA2438754C; EP2848255B1; HUP0402656A2

Abstract

Las respuestas de la celulas T son a menudo disminuidas en humanos con un sistema inmune comprometido. Nosotros hemos desarrollado un metodo para aislar, estimular y expandir precursores de linfocito T citotoxico nuevos (pLTC) a efectores especificos de antigeno, capaz de lisar a celulas de tumor in vivo; este protocolo ex vivo produce efectores completamente funcionales; las celulas que presentan antigenos artificiales (CPAA; Drosophila melanogaster) transfectadas con moleculas clase I HLA humana y accesorias definidas, son usadas para estimular las celulas T CD8+ tanto de donadores normales y pacientes de cancer; las moleculas clase I expresadas en una alta densidad en la superficie de las celulas de Drosophila son vaciadas, seguidas para un cargado eficiente de peptidos multiples que resultan en la generacion de respuestas policlonales reconociendo celulas de tumor que endogenamente expresan los peptidos especificos; las respuestas generadas son robustas, especificas de antigeno y reproducibles si el epitope de peptido es un inmunogeno definido; este sistema de expresion de antigeno artificial puede ser adaptado para tratar mas canceres en una mayoria significante de la poblacion.

Description

UN METODO DE TERAPIA DE CELULAS PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cáncer continúa siendo uno de los mayores problemas de salud, a pesar de significativos progresos hechos en el área de tratamiento. Los regímenes de tratamiento estándar de quimioterapia, terapia de radiación, intervención quirúrgica y combinaciones de las tres, a menudo fallan para producir una curación de larga duración. En muchos casos, el paciente de cáncer habiendo sido sometido al tratamiento, con frecuencia recae en la condición de la enfermedad después de algún período de tiempo, exacerbando más el problema, está la severidad de estos regímenes de tratamiento del paciente. Otro factor de complicación del desarrollo de un tratamiento de cáncer es que se ha encontrado que el cáncer es causado no por un único agente biológico, sino preferiblemente por una combinación de agentes y factores. A diferencia de la mayoría de los tratamientos médicos donde un agente o evento causativo único es el foco del tratamiento, la terapia de cáncer requiere dirigirse a una pluralidad de factores biológicos. En años recientes, la investigación ha sido dirigida al desarrollo de terapias de cáncer que utilizan el sistema inmune del mismo paciente. Una aproximación de tal es la inmunoterapia adoptiva. La inmunoterapia adoptiva requiere usar las células del mismo paciente para generar linfocitos T citotóxicos (LTC) para tratar un tumor o células cancerosas. Sin embargo esta técnica en gran parte continúa sin resultar como un régimen de tratamiento clínico viable para pacientes humanos. Por otro lado del problema de identificación de epítopes propios con los cuales inmunizar los LTC, la tecnología actual no provee un método de presentación de un número suficiente de epítopes diferentes a CPA con el propósito de dirigir adecuadamente los antígenos múltiples al tratamiento efectivo del cáncer. La presente invención cumple con las necesidades no satisfechas, así como provee otros beneficios.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee una célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn) capaz de presentar hasta diez o más diferentes péptidos simultáneamente, los métodos de producción de CPAnn, los métodos de uso de las CPAnn para el tratamiento del cáncer.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1. Esta figura es una representación de la interacción entre las células CD8*, también conocidas como linfocitos T citotóxicos con células que presenta antígenos o células objetivo, en este caso células de tumor. Figura 2, Paneles A y B.- Esta figura es una representación gráfica de dos paneles de los mecanismos de cifosis mediada por linfocitos. Figura 3.- Esta figura muestra el resultado de un experimento donde varios péptidos diferentes fueron probados en un ensayo de competición para identificar enlazadores de péptido que pueden ser usados para cargar péptidos múltiples en células Drosophila expresando moléculas clase I humanas vacías. Figura 4, Paneles A, B y C- Esta figura muestra el resultado de un experimento donde tres péptidos de melanoma fueron probados para la capacidad de elevar los LTC cuando son adicionados como epítopes simples sobre células Drosophila. En un único donador, la actividad de LTC fue provocada para cada uno de los péptidos cuando se adicionaron solos a las tres diferentes preparaciones de Drosophila. La especificidad de la repuesta fue comparada con el péptido HBc de control, un enlazador de alta afinidad. Figura 5, Paneles A, B y C- Esta figura muestra los resultados de una serie de experimentos donde hasta cuatro péptidos diferentes fueron adicionados a las células de Drosophila simples. La actividad de LTC en cada uno de los péptidos representados fue vista después de un protocolo de simulación de tres semanas y es representado gráficamente en esta figura. Figura 6, Paneles A, B y C- Esta figura muestra la actividad de LTC después de tres diferentes protocolos de simulación in vitro primarios. Figura 7, Paneles A y B.- Esta figura compara la capacidad de las células Drosophila contra las células dendríticas para provocar respuestas LTC a un epítope de péptido simple siguiendo los protocolos de simulación estándar. Figura 8.- Esta figura muestra que las células dendríticas exhibiendo fenotipos ya sea maduros o inmaduros no fueron tan eficientes como las células de Drosophila en la elección de respuestas LTC específicas cuando los péptidos definidos fueron usados para pulsar las células. Figura 9, Paneles A, B y C- Esta figura muestra la actividad de LTC generada por un donador simple a tres diferentes protocolos de simulación in vitro, que presenta cuatro péptidos. Figura 10.- Esta figura muestra la actividad de LTC generada a diez (10) péptidos cargados, en combinación, a las células Drosophila. Figura 11 .- Esta figura muestra la capacidad de enlazamiento de los péptidos HER-2 (826, 835, 861 y 863) sobre las células Drosophila transfectadas con la molécula clase I HLA-A2.1 humana. Figura 12.- Esta figura demuestra la respuesta anti-péptido y anti-tumor para células de efector específico ART- . Las células T2 fueron cargadas con péptido MART-1 o un control negativo (HBc). Malme 3M es una línea de melanoma, Malme3 es una línea de célula no de tumor. Figura 13, Paneles A y B.- Esta figura muestra la tinción tetramérica de las células efector CD8 específicas HER-2 de dos donadores diferentes. Figura 14.- Esta figura revela la respuesta anti péptido para las células efector HER-2 evaluadas sobre las células T2 cargadas de péptido. Figura 15.- Paneles A, B, C, D.- Esta figura demuestra la exterminación mejorada de una línea de célula de tumor de ovario (HTB-77) cuando es transfectada con HLA-A2.1. Figura 16.- Esta figura muestra la exterminación mejorada de una línea de célula de cáncer de mama (HTB-133) cuando es transfectada con HLA-A2.1. Figura 17.- Esta figura muestra que el pre-tratamiento IFN es requerido para demostrar lisis de la línea de célula de tumor HRB-77/A2.1. Figura 18, Paneles A y B - Esta gráfica demuestra que la expresión de la superficie de HLA-A2 y HER-2 no es afectada con la inducción de INF en las dos líneas de célula (HTB-77 y HTB-77/A2.1 ). Figura 19 - Esta gráfica muestra cuales niveles de ARNm de proteína son elevados en las células HTB-77/A2.1 después de una inducción con IFNy.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee un método para tratamiento de un sujeto con cáncer que comprende: a. preparación de una linea de célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn), en donde la CPAnn es capaz de presentar hasta alrededor de quince diferentes moléculas de péptido que están asociadas con cáncer, preferiblemente alrededor de diez diferentes moléculas de péptido, simultáneamente donde cada péptido es alrededor de seis a doce aminoácidos en longitud, preferiblemente alrededor de ocho a diez aminoácidos en longitud y en un rango de concentración de alrededor de 10nM a 100 M; b. cosechar células CD8* del sujeto o un donador apropiado; c. estimular las células CD8* con la línea de célula CPAnn; d. adicionar las células CD8* al medio que contiene una citocina, tal como, lL-2, lL-7 o medio de crecimiento acondicionado (MCA), preferiblemente, IL-2 o IL-2 e IL-7 en combinación; e. mezclar monocitos de sangre periférica no suspendida, los monocitos de sangre periférica agotados de CD-8 son recolectados del sujeto o un donador apropiado con alrededor de 10 a 50 g/ml de un péptido; f. irradiación de la suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación- necesaria para prevenir la proliferación de estas células en la suspensión, tal como una dosis en el rango de alrededor de 3,000 a 7,000 rads, preferiblemente alrededor de 5,000 rads, alternativamente, la suspensión de linfocito de sangre periférica puede ser tratada con agentes citostáticos incluyendo, pero no limitando a, mitomicin C; g. aislar los monocitos de sangre periférica adherente; h. cargar los monocitos de sangre periférica adherente con alrededor de 10ng/rnl a 10 g/ml de cada péptido; i. combinar las células CD8* con los monocitos de sangre periférica adherente en una relación de alrededor de diez células CD8* a un monocito de sangre periférica; j. opcionalmente estimular la suspensión combinada de células CD8* y monocitos de sangre periférica por alrededor de seis a siete días; k. opcionalmente estimulación de la suspensión de células CD8* y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en el medio; 1. opcionalmente ensayando la suspensión CD8* para actividad LTC apropiada, y opcionalmente ensayando para pureza LTC, esterilidad y contenido de endotoxina; y m. inoculando al sujeto con la suspensión CD8*. Otra modalidad de la presente invención provee un método para tratamiento de un sujeto con cáncer que comprende: a. preparación de una línea de célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn), en donde CPAnn es capaz de presentar hasta alrededor de quince diferentes moléculas de péptido que están asociadas con cáncer, preferiblemente alrededor de diez péptidos, simultáneamente donde cada péptido es de ocho a diez aminoácidos en longitud; b. cosechar células CD8* del sujeto; c. estimulando las células CD8* con la línea de célula CPAnn por alrededor de seis a siete días; d. estimular las células CD8* con IL-2 e IL-7 en el medio; e. mezclando monocitos de sangre periférica recolectados del sujeto con alrededor de 20 g/ml de cada péptido; f. irradiación de la suspensión de monocitos de sangre periférica agotada de CD8 con alrededor de 5,000 rads de radiación-?; g. aislar los monocitos de sangre periférica adherente; h. cargar los monocitos de sangre periférica adherente con alrededor de 10ug/ml del epítope; i. combinar las células CD8* con los monocitos de sangre periférica adherente en una relación de alrededor de diez células CD8* a un monocito de sangre periférica; j. estimulación de la suspensión combinada de células CD8* y monocitos de sangre periférica por alrededor de seis a siete días; k. estimulación de la suspensión de células CD8* y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en el medio; I. ensayar la suspensión CD8* para actividad LTC apropiada, pureza, esterilidad y contenido de endotoxina; y m. inocular al sujeto con la suspensión CD8*. Otra modalidad de la presente invención provee un método para tratamiento de un sujeto con melanoma que comprende: a. preparación de una línea de célula que presenta antígeno que no aparecen naturalmente (CPAnn), en donde CPAnn es capaz de presentar hasta alrededor de quince diferentes moléculas de péptido que están asociadas con melanoma, preferiblemente alrededor de diez péptidos, simultáneamente donde cada péptido es de ocho a diez aminoácidos en longitud; b. cosechar células CD8* del sujeto; c. estimular las células CD8* con la línea de célula CPAnn por alrededor de seis a siete días; d. estimular las células CD8* con IL-2 e IL-7 en el medio; e. mezclar monocitos de sangre periférica recolectados del sujeto con alrededor de 20 g/ml de cada péptido el CPAnn puede estar presente; f. irradiación de la suspensión de monocito de sangre periférica agotada de CD8 con alrededor de 5,000 rads de radiación-?; g. aislar los monocitos de sangre periférica adherente; h. cargar los monocitos de sangre periférica adherente con alrededor de 10ug/ml del epítope; i. combinar las células CD8* con los monocitos de sangre periférica adherente en una relación de alrededor de diez células CD8* a un monocito de sangre periférica; j. estimulación de la suspensión combinada de células CD8* y monocitos de sangre periférica por alrededor de seis a siete días; k. estimulación de la suspensión de células CD8* y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en el medio; I. ensayando la suspensión CD8* para actividad LTC apropiada, pureza, esterilidad y contenido de endotoxina; y m. inoculando al sujeto con la suspensión CD8*.

Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento de melanoma en donde la CPAnn presenta los siguientes péptidos, Tirosinasa369-377> Tirosinasa207-216> 9PI OO209-217! 9Pl 00i54-i62i MART-127.35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, C-Iectin8-16, Pec602o-29, y Pec6025-33- Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento de una enfermedad o condición de enfermedad que resulta en una respuesta inmune insuficiente o inadecuada que está normalmente asociada con moléculas HLA de Clase I, en donde el tratamiento elimina células infectadas o transformadas que ha demostrado que se logra por LTC. Otra modalidad de la presente invención es un método de tratamiento de una enfermedad o condición de enfermedad que resulta en una respuesta inmune insuficiente o inadecuada que está normalmente asociada con moléculas HLA de Clase I, en donde las células infectadas o transformadas que han sido mostradas para ser susceptibles a eliminación por LTC son tratadas por el método que comprende: a. preparación de una línea de célula que presenta antígeno que no aparecen naturalmente (CPAnn), en donde la CPAnn es capaz de presentar hasta alrededor de quince diferentes moléculas de péptido que están asociadas con la enfermedad o condición de enfermedad, preferiblemente alrededor de diez diferentes moléculas de péptido, simultáneamente donde cada péptido es alrededor de seis a doce aminoácidos en longitud, preferiblemente alrededor de ocho a diez aminoácidos en longitud y en un rango de concentración de alrededor de 10nM a 100 M; b. cosechar células CD8* del sujeto o un donador apropiado; c. estimulando las células CD8* con la línea de célula CPAnn; d. adicionar las células CD8* al medio que contiene una citocina, tal como, IL-2, IL-7 o MCA, preferiblemente, IL-2 o IL-2 e IL-7 en combinación; e. mezclar los monocitos de sangre periférica no suspendida, o alternativamente, los monocitos de sangre periférica agotados de CD-8 recolectados del sujeto o un donador apropiado con alrededor de 10 a 50 g/ml de un péptido; f. irradiación de la suspensión de monocito de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación-? necesaria para esterilizar todos los componentes en la suspensión, excepto los monocitos de sangre periférica deseada, tal como una dosis en el rango de alrededor de 3,000 a 7,000 rads, preferiblemente alrededor de 5,000 rads, alternativamente; g. aislando los monocitos de sangre periférica adherente; h. cargar los monocitos de sangre periférica adherente con alrededor de 0ng/ml a 10 g/ml de cada péptido; i. combinar las células CD8* con los monocitos de sangre periférica adherente en una relación de alrededor de diez células CD8* a un monocito de sangre periférica; j. opcionalmente estimulación de la suspensión combinada de células CD8* y monocitos de sangre periférica por alrededor de seis a siete días; k. opcionalmente estimulación de la suspensión de células CD8* y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en el medio; I. opcionalmente ensayando la suspensión CD8* para la actividad LTC apropiada, y opcionalmente ensayando para pureza LTC, esterilidad y contenido de endotoxina; y m. inoculando al sujeto con la suspensión CD8*. La presente invención provee una célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn) derivada de las células Drosophila melanogaster transfectadas con ADN codificando HLA clase I humana, enlazando, y co-estimulando moléculas para expresión, en donde la CPAnn es capaz de presentar hasta quince diferentes moléculas de péptido, preferiblemente diez moléculas de péptido. Otra modalidad de la presente invención provee una CPAnn que presenta péptidos que son asociados con varias funcionas deseadas que mejoran el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, en adición a péptidos asociados con la enfermedad o condición de enfermedad siendo tratada, la CPAnn puede presentar péptidos asociados con moléculas accesorias tales como, antígenos de la función de linfocitos (LFA- , LFA-2 y LFA-3), molécula de adhesión intercelular 1 (MAIC-1), factores co-estimulantes de células T (CD2, CD28, B7) mejorando la adhesión célula-célula o transducción de señales de activación de célula adicionales. Otra modalidad de la presente invención provee una CPAnn que presenta péptidos que están asociados con varios tipos de cáncer. Por ejemplo, los péptidos asociados o derivados de un polipéptido relacionado con cáncer de pecho, tal como HER-2/neu, pueden ser presentados con péptidos asociados o derivados de un polipéptido relacionado con melanoma, tal como, ART-1 , 0 MAGE. Otra modalidad de la presente invención provee un método para producción de células que presentan antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn) capaz de presentar hasta diez diferentes moléculas de péptido simultáneamente, el método comprendido de los pasos: a. preparación de una línea de célula de insecto de huevos de DrosophHa melanogaster, alternativamente preparación de una línea de célula de insecto para expresión de moléculas Clase I CHP humanas y moléculas de adhesión co-estimulantes; b. crecimiento de las células de insecto en un medio que es apropiado para células de insecto de crecimiento, preferiblemente Medio de DrosophHa de Schneider™; c. hacer un plásmido pRmHa-3 de un vector de expresión pRmHa-1 , donde el plásmido pRmHa-3 incluye un promotor de metalotioneína, secuencias de consenso de respuesta de metal y un gen de deshidrogenasa de alcohol soportando una señal de poliadenilación aislada de DrosophHa melanogaster, d. insertar en el plásmido pRmHa-3 ADN complementario de HLA clase I humano A2.1 , B7.1 , B7.2, MAIC-1 , microglobulina -2 y LFA-3, caracterizado porque A2.1 puede ser substituido con cualquier secuencia de ADN clase I; e. transfección de las células de insectos con un plásmido phshneo y el plásmido pRmHa-3 conteniendo ADN complementario; y f. creación de la CPAnn por contacto de las células de insecto con CuS04 para inducir la expresión de los genes transfectados en las células de insectos. Las células de insectos de la presente invención están crecidas en medios apropiados para células de insecto de crecimiento, de aquí en adelante referenciadas como "medio de crecimiento de insecto". Los medios de crecimiento de insecto están comercialmente disponibles por numerosos vendedores, tales como, Medio de Drosophila de Schneider, Medio de Insecto de Grace, y Medio de Insecto de TC-100. Alternativamente, el medio de crecimiento de insecto puede ser preparado por alguien experto ordinario en la técnica. Típicamente el medio incluirá componentes necesarios para promover y sustentar el crecimiento de células de insectos, tales como, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, y fosfato de sodio), carbohidratos de varios aminoácidos y especies químicas (Imogene Schneider, Exp. Zool. (1964) 156 (1 ): 9g. 91 ). Alternativamente, el medio también puede incluir vitaminas, minerales, y otros componentes que ayudan en el crecimiento de las células de insecto. La siguiente es una lista de abreviaturas y definiciones usadas en la presente especificación.

Abreviaturas CPA Células que presenta antígenos CD8* Células T CD8* LTC Linfocito T Citotóxico E Efector Fas También conocido como CD95, epítope en células T MAIC Molécula de adhesión intracelular IL Interleucina CELA Células exterminadoras de linfocina activada AFL Antígenos de función Linfocito CHP Complejo de histocompatibilidad principal. CPAnn Célula que presenta antígeno que no aparecen naturalmente. PN Proteína nuclear CMSP Célula mononuclear de sangre periférica. SSAF Solución Salina Amortiguada de Fosfato RCP Reacción en cadena de polimerización RPMI Roswell Park Memorial Institute RWJPRI El R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute T Objetivo RCT Receptor antígeno de célula T LIT Linfocitos de infiltración de tumor La siguiente es una lista de abreviaturas usadas en la presente especificación para varios epítopes de péptidos. Los residuos de aminoácido individual están identificados de conformidad a un código de letra única que es fácilmente conocido y usado por aquellos expertos ordinarios en el arte.

Aminoácido Abreviaturas 3 Letras 1 Letra Alanina ala A Valina val V Leucina leu L Isoleucina ile I Prolina pro P Fenilalanina phe F Triptofano tyr W Metionina met M Glicina giy G Serina ser S Treonina thr T Cisteína cys C Tirosina tyr Y Asparagina asn N Glutamina gln Q Ácido aspárticop asp D Ácido glutámico glu E Lisina lys K Arginina arg R Histidina his H Abreviaturas de Epítope de Péptido Como se usa en la presente el término "tirosinasa 369-377" o "tirosinasa369-377" se refiere a la secuencia de aminoácido YMNGTMSQV (SEQ ID ??. ). También incluido dentro de esta definición está el péptido de la secuencia Y DGTMSQV (SEQ ID NO: 2), la cual resulta de un evento post- traduccional que modifica el residuo de aminoácido "N" de secuencia YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1 ) a "D" resultando en la secuencia de aminoácido de YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 2) (Skipper y colaboradores, J. Exp. Med. ( 996) 83:527-534). Como se usa en la presente el término "tirosinasa 207-216" o "tirosinasa207-2i6" se refiere a la secuencia de aminoácido FLPWHRLFLL (SEQ ID NO:3). Como se usa en la presente el término "gp100 209-217" o "gp100209-2i7n se refiere a la secuencia de aminoácido ITDQVPFSV (SEQ ID NO:4). Como se usa en la presente el término "gp100 154-162" o "gp100i54-i62" se refiere a la secuencia de aminoácido KTWGQYWQV (SEQ ID NO:5). Como se usa en la presente el término "MART-1 27-35" o "MART-I 27-35" se refiere a la secuencia de aminoácido AAGIGILTV (SEQ ID NO:6). Como se usa en la presente el término "HER-2/neu 789-797" o "HER-2/neu789-797" se refiere a la secuencia de aminoácido CLTSTVQLV (SEQ ID NO:7). Como se usa en la presente el término "HER-2/neu 369-377" o "HER-2/neu369-377" se refiere a la secuencia de aminoácido KIFGSLAFL (SEQ ID NO:8). Como se usa en la presente el término "C-lectina 8-16" o "C- lectín8-i6" se refiere a la secuencia de aminoácido KMASRSMRL(SEQ ID NO:9). Como se usa en la presente el término "Pec60 20-29" o "Pec602o-29" se refiere a la secuencia de aminoácido ALALAALLW (SEQ ID ??.? 0). Como se usa en la presente el término "Pec60 25-33" o "Pec6025- 33" se refiere a la secuencia de aminoácido ALLWDREV (SEQ ID NO:1 ). Como se usa en la presente el término "CD8 péptido 59-70" o "CD8 péptido59-7o" se refiere a la secuencia de aminoácido AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO:12).

Términos y Definiciones Como se usa en la presente, el término "inmunoterapia adoptiva" se refiere a la administración de linfocitos T de donador o autólogos para el tratamiento de una enfermedad o condición de enfermedad, caracterizada porque la enfermedad o condición de enfermedad resulta en una respuesta inmune insuficiente o inadecuada que está normalmente asociada con moléculas HLA Clase I. La inmunoterapia adoptiva es un tratamiento apropiado para cualquier enfermedad o condición de enfermedad donde la eliminación de células infectadas o transformadas ha sido demostrado que se logra por LTC. Por ejemplo, la enfermedad o condiciones de enfermedad incluyen pero no están limitadas a cáncer y/o tumores, tales como, melanoma, cáncer de próstata, mama, colo-rectal, estómago, garganta y cuello, pancreático, cervical, de ovario, hueso, leucemia y pulmón; infecciones virales, tales como, hepatitis B, hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana; infecciones bacteriales, tales como, tuberculosis, leprosis y listerosis, e infecciones paracíticas tales como malaria. Como se usa en la presente, el término "B7.1" se refiere a una molécula co-estimulante asociada con células que presentan antígenos. Como se usa en la presente, el término "BCNU" se refiere a carmustina, también conocido como, 1 ,3-bis(2cloroetil)-1-nitrosourea. Como se usa en la presente, el término "BSE" se refiere a encefalitis espongiforme bovina. Como se usa en la presente, el término "CD" se refiere a grupos de diferenciación, linfocitos T (originalmente), linfocitos B, monocitos, macrófagos, y granulocitos agrupados por epítopes de antígeno y función. Como se usa en la presente, el término "DTIC" se refiere a dacarbazina, 5(3,3-dimetil-1 -tríazeno)-imidazol-4-carboxamida. Como se usa en la presente, el término "ex vivo" o "terapia ex vivo" se refiere a una terapia donde los materiales biológicos, células típicamente, son obtenidas de un paciente o una fuente alterna apropiada, tal como, un donador apropiado, y son modificadas, tal que las células modificadas pueden ser usadas para tratar una condición patológica la cual será mejorada por el suministro a largo plazo o constante del beneficio terapéutico producido por las células modificadas. El tratamiento incluye la reintroducción de los materiales biológicos modificados, obtenidos ya sea del paciente o de la fuente alterna, dentro del paciente. Un beneficio de terapia ex vivo es la capacidad para proveer al paciente el beneficio del tratamiento, sin exponer al paciente a efectos colaterales no deseados del tratamiento. Por ejemplo, las citocinas son a menudo administradas a pacientes con cáncer o infecciones virales para estimular la expansión de los LTC del paciente. Sin embargo, las citocinas a menudo causan el comienzo de síntomas como la gripa en el paciente. En un procedimiento ex vivo, las citocinas son usadas para estimular la expansión de los LTC fuera del cuerpo del paciente, y el paciente se evita la exposición y los efectos laterales consecuentes de las citocinas. Alternativamente bajo situaciones apropiadas, o condiciones, donde es apropiado y donde el sujeto puede derivar el beneficio, el sujeto puede ser tratado concurrentemente con dosificación de bajo nivel de interferón ?, interferón y/o lL-2. El efecto esperado de los interferones es posible para sensibilizar las células del tumor a lisis por LTC específico de antígeno, y el efecto del IL-2 es posible para mejorar la persistencia de LTC específico de antígeno. Como se usa en la presente, el término "HEPES" se refiere a la solución amortiguadora de N-2-hidroxietilpiperazina-N'2-etanosulfónica. Como se usa en la presente, el término "HLA-A2.1" se refiere a una molécula Clase I HLA encontrada en aproximadamente 45% de Caucásicos. Como se usa en la presente, el término "MART-1" o "(melanoma antígeno reconocido por Células-T-1" se refiere a un antígeno asociado a melanoma. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácido, así como varias características de este antígeno están desglosadas en Patente de EUA No. 5,994,523, concedida en noviembre 30, 1999 titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; Patente de EUA No. 5,874,560, concedida en febrero 23, 1999 titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; Patente de EUA No. 5,844,075, concedida en diciembre 1 , 1998 titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods". En particular, la Patente de EUA No. 5,994,523 desglosa las secuencias de aminoácido y ácido nucleico de longitud completa de MART-1 en la Figura 1 como SEQ ID NO:1 , y SEQ ID NO:2, respectivamente. La Figura 1 antes mencionada está aquí incorporada por referencia. Como se usa en la presente, el término "MAGE" se refiere a un antígeno asociado a melanoma. El aminoácido y secuencias de ácido nucleico, así como varias características de este antígeno están desglosadas en la Patente de EUA No. 6,140,050, concedida en octubre 31 , 2000 titulada "Methods for Determining Breast Cáncer and Melanoma by Assaying for a Plurality of Antigens Associated Therewith"; Patente de EUA No. 5,759,783 concedida en junio 2, 1998 titulada "Method of Screening for Cáncer by Detecting Messenger RNA for a MAGE-XP Gene"; y Patente de EUA No. 5,662,907, concedida en Septiembre 2, 1997 titulada "Induction of Anti-Tumor Cytotoxic T Lymphocytes in Humans Using Synthetic Peptide Epitopes." Como se usa en la presente, el término "MPC-10" se refiere a un concentrador de partícula magnética.

Como se usa en la presente, el término "células NK" se refiere a células exterminadoras naturales. Como se usa en la presente, el término ???3" se refiere a ORTHOCLONE OKT3, muromonab-CD3, anticuerpo monoclonal anti-CD3. Como se usa en la presente, el término "TAP-1 ,2" se refiere a Transportador Asociado con Procesamiento-1 ,2 de Antígeno. Como se usa en la presente, el término "células Th" se refiere a células T Auxiliadoras, CD4+. Como se usa en la presente, el término "tirosinasa" se refiere a una proteína asociada con melanoma (Bnchard y colaboradores, J. Exp. Med. (1993) 178:489-495; Robbins y colaboradores, Cáncer Res. (1994) 54:3124-3126). Patente de EUA No. 5,843,648, concedida en Diciembre 1 , 1998 titulada "P15 and Tyrosinase Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods" desglosa péptidos antigénicos y ácidos polinucleicos asociados relacionados a tirosinasa en la Figura 7, Paneles A a D, la figura antes mencionada incorporada aquí por referencia. Patente de EUA No. 5,487,974, concedida en enero 30, 1996 titulada "Method for Detecting Complexes Containing Human Leukocyte Antigen A2 (HLA-A2) Molecules and a Tyrosinase Derived Peptide on Abnormal Cells" desglosa un péptido adicional que está asociado con tirosinasa y melanoma en el Ejemplo 9, en la cuadro 3, la antes mencionada está incorporada aquí por referencia. Como se usa en la presente, el término "gp 00" se refiere a un antígeno de melanoma reconocido por linfocitos de infiltración de tumor (LIT).

Los LIT que reconoce gp100 están asociados con rechazo de tumor in vivo (Bakker y colaboradores, J. Exp. Med. (1994) 179:1005-1009; Kawakami y colaboradores, J. Immunol. (1995) 54:3961-3968). Los péptidos antigénicos relacionados a gp100 están desglosados en la Patente de EUA No. 5,994,523, concedida en noviembre 30, 1999 titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; Patente de EUA No. 5,874,560, concedida en febrero 23, 1999 titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; Patente de EUA No. 5,844,075, concedida en diciembre 1 , 1998 titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods". En particular, la Patente de EUA No. 5,994,523 desglosa las secuencias de ácido nucleico y aminoácido relacionadas a GP 00 en las Figuras 4 y 5, respectivamente. También se desglosan los péptidos antigénicos derivados de las secuencias de aminoácido, Incluyendo aquellas identificadas como SEQ ID Nos: 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, y 41. Todas las Figuras 4 y 5 antes mencionadas, y los péptidos identificados por SEQ ID NOs están incorporados aquí por referencia. Como se usa en la presente, el término "melanoma" se refiere a, pero no está limitado a, melanomas, melanomas metastáticos, melanomas derivados de ya sea melanocitos o melanocitos relacionados a células nevus, melanosarcomas, melanocarcinomas, melanoepiteliomas, melanoma de distribución superficial in situ de melanoma, melanoma nodular, melanoma maligno lentigo, melanoma lentigino acral, melanoma invasivo o síndrome de melanoma y mole atípica familiar (M-MAF). Tales melanomas en mamíferos pueden ser causados por anormalidades cromosomales, crecimiento degenerativo y trastornos desarrollados, agentes mitogénicos, radiación ultravioleta (UV), infecciones virales, expresión de tejido inapropiada de un gen, alteraciones en la expresión de un gen, y presentación sobre una célula, o agentes carcinogénicos. Los melanomas antes mencionados pueden ser diagnosticados, valorados o tratados por métodos descritos en la presente invención. Como se usa en la presente, el término "C-lectina" se refiere a un péptido de la secuencia que ha sido encontrada para ser asociada con cáncer de ovario. Como se usa en la presente, el término "Complejo de histocompatibilidad principal" o "CHP" es una designación genérica que quiso abarcar los sistemas de antígeno de histo-compatibilidad descritos en diferentes especies incluyendo los antígenos de leucocito humano (ALH). Como se usa en la presente, los términos "epítope", 'építope de péptido", "péptido antigénico" y "péptido inmunogénico" se refieren a un péptido derivado de un antígeno capaz de causar una respuesta inmune celular en un mamífero. Tales péptidos también pueden ser reactivos con anticuerpos de un animal inmunizado con los péptidos. Los péptidos pueden ser alrededor de cinco a veinte aminoácidos en longitud preferiblemente alrededor de ocho a quince aminoácidos en longitud, y más preferiblemente alrededor de nueve a diez aminoácidos en longitud.

Como se usa en la presente, el término "Pec60" se refiere a un péptido de la secuencia que ha sido encontrada para ser asociada con cáncer de ovario y mama. Como se usa en la presente, el término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tiene una secuencia de residuo de aminoácido substancialmente idéntica a las secuencias de la presente invención, específicamente mostradas aquí en la cual uno o más residuos han sido conservadoramente substituidos con un residuo funcionalmente similar y el cual muestra los aspectos funcionales de la presente invención como se describió aquí. Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo (hidrofóbico) no polar tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otros, la substitución de un residuo (hidrofílico) polar por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la substitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la substitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico u otro. Como se usa en la presente, el término "substitución conservadora" también incluye el uso de un residuo derivado en lugar de un residuo no derivado. Como se usa en la presente, el término "derivado químico" se refiere a un polipéptido objeto que tiene uno o más residuos químicamente derivados por reacción de un grupo lateral funcional. Ejemplos de las moléculas derivadas incluyen por ejemplo, aquellas moléculas en las cuales los grupos amino libres han sido derivados para formar clorohidratos de amina, grupos sulfonil to!ueno-p, grupos carbobenzoxi, grupos butiloxicarbonil-t, grupos de cloroacetilo o grupos de formilo. Los grupos de carboxiio libres pueden ser derivados para formar sales, y ésteres de etilo y metilo u otros tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden ser derivados para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno imldazol de histidina puede ser derivado para formar N-im-bencilhistidina. También incluidos como derivados químicos están aquellas proteínas o péptidos que contiene uno o más aminoácidos ocurriendo naturalmente derivados de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede ser substituida por prolina; 5-hidroxilisina puede ser substituida por lisina; 3-metilhistidina puede ser substituida por histidina; la homoserina puede ser substituida por serina; y la ornitina puede ser substituida por lisina. Las proteínas o polipéptidos de la presente invención también incluyen cualquier polipéptido que tiene una o más adiciones y/o eliminaciones o residuos relativos a la secuencia de un polipéptido cuya secuencia está codificada y es la correspondiente a la secuencia nucleica de la presente invención, cuando la actividad necesaria es mantenida. Como se usa en la presente, el término "HER-2/neu" se refiere a un oncógeno, el cual expresa o sobre expresa, una o más membranas asociadas, proteínas oncógenas como receptores. Entre los tipos de cáncer que pueden ser encontrados para ser asociados con expresión o sobre expresión de HER-2/neu están ciertos cánceres de mama, estómago, ovario, colon y gándulas salivarías. El oncógeno HER-2/neu es un miembro de la familia de cinasa de proteína tirosina de oncógenos y comparte un alto grado de homología con el receptor de factor de crecimiento epidérmico (RFCE). Se ha demostrado que el HER-2/neu juega un rol en el crecimiento y/o diferenciación de la célula. El HER-2/neu aparenta inducir malignidades a través de mecanismos cuantitativos que resultan de expresión incrementada o desrregulada de un producto de gen esencialmente normal. La Patente de EUA No. 6,075,122, concedida el 13 de junio de 2000, titulada "Inmune Reactivity to HER-2/neu Protein for Diagnosis and Treatment of Malignancies in Which the HER-2/neu Oncogene is Associated" desglosa los péptidos que provocan las respuestas de la célula T CD8* en la columna 12, línea 31 a la columna 13, línea 7, identificada de conformidad a los números de SEQ ID están incorporados aquí por referencia. El HER-2/neu(p185) es el producto de proteína del oncógeno HER-2/neu. El gen HER-2/neu está amplificado y la proteína HER-2/neu está sobre expresada en una variedad de cánceres incluyendo cáncer de mama, ovario, colon, pulmón y próstata. El HER-2/neu está relacionado a transformación maligna. Se encontró en el 50% a 60% de carcinoma in situ ductal y 20% a 40% de todos los cánceres de mama, así como una fracción substancial de adenocarcinomas elevando en los ovarios, próstata, colon y pulmón. El HER-2/neu está intimamente asociado no solamente con el fenotipo maligno, sino también con la agresividad de la malignidad, siendo encontrado en una cuarta parte de todos los cánceres de mama invasivos. La sobreexpresión de HER-2/neu está correlacionada con una pobre prognosis en ambos tipos de cáncer de mama y ovario. El HER-2/neu es una proteína de transmembrana con una masa molecular relativa de 185 kd que es de aproximadamente 1255 aminoácidos (aa) en longitud. Esta tiene un dominio enlazador extracelular (DEE) de aproximadamente 645 aa, con 40% de homología al receptor de factor de crecimiento epidermal (RFCE), dominio sujetador de transmembrana altamente hidrofóbico (DTM), y un dominio citoplásmico carboxiteminal (DC) de aproximadamente 580 aminoácidos con 80% de homología a RFCE. La investigación en desarrollo involucrando oncógenos ha identificado por lo menos cuarenta oncógenos operativos en células malignas y responsables para, o asociadas con, transformación. Los oncógenos han sido clasificados en grupos diferentes basados en la función putativa o localización de sus productos de genes (tales como la proteína expresada por el oncógeno). Los oncógenos se cree que son esenciales para ciertos aspectos de fisiología celular normal. El cáncer continúa siendo uno de los mayores problemas de salud, a pesar de significativos progresos hechos en el área de tratamiento. Los regímenes de tratamiento estándar de quimioterapia, terapia de radiación, intervención quirúrgica y combinaciones de las tres, a menudo fallan para producir una curación de larga duración. En muchos casos, el paciente de cáncer habiendo sido sometido al tratamiento, con frecuencia recae en la condición de la enfermedad después de algún periodo de tiempo, exacerbando más el problema, está la severidad de estos regímenes de tratamiento del paciente. En el caso de melanoma, una curación para melanoma metastático no se ha logrado usando quimioterapia convencional. Rangos de respuesta de 35% a 50% han sido reportados con el régimen Dartmouth de quimioterapia de combinación (DTIC, cis-platina, BCNU y tamoxifen), pero la duración de supervivencia ha continuado en seis a diez meses. Altos grados de remisión han sido reportados para quimioterapia agresiva de "intensidad de dosis alta" y repleción de hematopoyesis con transplantes de médula de hueso autóloga. No obstante, la duración media de supervivencia fue corta, aproximadamente cuatro meses. Rosenberg y colaboradores han intentado usar la infusión de linfocitos activados como un tratamiento para varios tipos de cáncer. Inicialmente, las células exterminadoras activadas por linfocina (ELA) y después los linfocitos de infiltración de tumor (LIT) activados ex vivo con IL-2 fueron usados, pero la evidencia para la eficacia es ambigua. En efecto, las pruebas clínicas controladas han fallado para demostrar una ventaja para el uso de células activadas ex vivo sobre administración directa de IL-2 a pacientes. Así, los beneficios de la terapia ELA y LIT son marginales, y los efectos laterales son típicamente tan severos que muchas pruebas han sido descontinuadas prematuramente. Estudios en modelos de tumor de ratón han demostrado que la inmunoterapia adoptiva, inmunización in vivo de células T específicas para un antígeno(s) de tumor, es muy eficaz con toxicidad mínima. Un obstáculo principal para la aplicación de esta estrategia al tratamiento de tumores humanos es la identificación de antígenos inmunogénicos que deja las células de tumor susceptibles a destrucción mediante linfocito T citotóxico (LTC). El aislamiento de las células T reactivas de tumor de pacientes de melanoma ha llevado a la identificación de algunos de los antígenos de tumor (epítopes) contra los cuales los LTC están diseccionados. Estos incluyen tirosinasa (Brichard y colaboradores, J. Exp. Med. (1993) 178:489-495; Robbins y colaboradores, Cáncer Res. (1994) 54:3124-3126), MART 1 /Melan A (Kawakami y colaboradores, J. Exp. Med. (1994) 180:347-352), gp 100 (Bakker y colaboradores, J. Exp. Med. (1994) 179:1005-1009; Kawakami y colaboradores, J. Immunol. (1995) 154:3961-3968) y MAGE (Gauajer y colaboradores, J. Exp. Med. (1994) 179:921 -930). De estas, la triosinasa y MART-1 están cercanamente expresadas umversalmente en melanomas y así son la selección lógica para inmunoterapia adoptiva. En años recientes, mejoramientos significativos en supervivencia en el orden de varios años han sido notados en una pequeño porcentaje de pacientes de melanoma sometidos a terapia inmunológica. Esta incluye inmunoterapia específica activa con "vacunas de cáncer" así como el uso de refuerzos no específicos del sistema inmune tales como citocinas, como IL-2, interferón- e interferón-?. Sin embargo, el beneficio de las citocinas está reducido por efectos laterales que a menudo acompañan su uso, tales como, náuseas, y fiebre. Las células T Citolíticas (CD8*) son la línea principal de defensa contra infecciones virales. Los linfocitos CD8* reconocen específicamente y exterminan a las células hospedadoras que están infectadas por un virus. Teóricamente, debe ser posible aprovechar el sistema inmune para combatir otros tipos de enfermedades incluyendo cáncer. Sin embargo, pocos procedimientos in vitro/ex vivo han estado disponibles para activación específicamente de los LTC. La identificación de antígenos de melanoma claves, antes mencionados y un método para activación in vitro específica de los LTC descrita abajo ahora permite probar el concepto de inmunoterapia adoptiva de melanoma metastático. Todas las células T nuevas requieren dos señales para activación para provocar una respuesta inmune. Para linfocitos CD8* (LTC), la primera señal, que imparte especificidad, consiste de la presentación a la célula CD8* de un fragmento de péptido inmunogénico (epítope) del enlace de antígeno al complejo (HLA) CHP Clase I presente en la superficie de las células que presenta antígeno (CPA). Este complejo está reconocido específicamente por un receptor antígeno de célula T (RCT), el cual comunica la señal intracelularmente. El enlace al receptor de célula T es necesario pero no suficiente para inducir la activación de célula T, y usualmente no llevará a la proliferación de células o secreción de citocinas. La activación completa requiere una segunda señal(es) co-estimulantes, estas señales además sirven para mejorar la cascada de activación. Entre las moléculas co-estimulantes sobre células que presentan antígenos, B7 y moléculas de adhesión a célula (integrinas) tales como MAIC-1 asiste en este proceso por enlace a CD28 y LFA-1 , respectivamente, en la célula T. Cuando la célula CD8* ¡nteractúa con una célula que presenta antígeno llevando un péptido inmunogénico (epítope) enlazado por una molécula clase I CHP en la presencia de interacciones de la molécula co-estimulante apropiadas, la célula CD8* se vuelve una célula T citolítica completamente activada. La exterminación de células mediante linfocitos involucra una secuencia de eventos biológicos empezando con el enlace de la CD8+LTC a una célula objetivo (tumor) soportando antígenos por medio del proceso de reconocimiento descrito arriba para activación de células T. La interacción entre células CD8+ y células que presentan antígenos o células objetivo - (tumor) -como se describió arriba está representada en la Figura 1. La interacción inicia con el enlace del antígeno en asociación con una molécula Clase I CHP sobre la célula objetivo o CPA al receptor de antígeno de célula T (RCT). Las moléculas accesorias tales como antígenos de la función linfocito (AFL- , AFL-2 y AFL-3), molécula de adhesión intracelular 1 (MAIC-1 ), los factores co-estimulantes de célula T (CD2, CD28, B7) mejoran la adhesión célula-célula o transluce señales de activación de célula adicional. Después de la interacción célula-célula, el LTC extermina la célula objetivo a través de la acción de mediadores citolíticos solubles (las perforinas y granzimas almacenadas en gránulos citoplásmicos en la célula T) y una molécula de superficie de LTC (ligando Fas). Después del ataque citolítico, las células objetivo mueren por necrosis (perforación de membrana y destrucción orgánica) o apoptosis (condensación de cromatina, fragmentación de ADN y formación de vesículas (blebbing) en la membrana). Los mecanismos de citólisis mediante linfocitos están representados gráficamente en la Figura 2. En el Panel A de la Figura 2, después del enlace a la célula objetivo, los gránulos citoplásmicos en el LTC son fácilmente reorientados hacia la célula objetivo por liberación de gránulos conteniendo perforina y granzimas en el espacio intercelular. Estas enzimas proteolíticas forman poros en la membrana del plasma de la célula objetivo llevando a necrosis celular. En el panel B, después del enlace a la célula objetivo, el nivel de la expresión del ligando Fas en el LTC incrementa. La interacción del ligando Fas y el receptor Fas sobre la célula objetivo lleva a apoptosis. Las proteasas tales como CPP32 y otras relacionadas a enzima convirtiendo IL-1b (ECI) han sido implicadas en la inducción de apoptosis. Es posible usar células que presenta antígeno ocurriendo naturalmente, por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, células de tumor análogas para activación de CD8+ in vitro. Sin embargo, la eficiencia de la activación siguiendo esta aproximación es baja. Esto es debido a que las moléculas de Clase I de CPA nativas contienen muchos otros tipos de epítopes de péptidos al lado de epítopes de tumor. La mayoría de los péptidos son derivados de proteínas de célula inocua normal, resultando en una dilución del número de CPA nativas activas que actualmente podrían ser efectivas contra un tumor (Allison y colaboradores, Curr. Op. Immunol. (1995)7:682-686).

Una aproximación más directa y eficiente a este problema es específicamente para células CD8+ activas solamente con aquellos epítopes relevantes para combatir una enfermedad específica, (tal como, cáncer) o antígenos específicos de tumor (tai como antígenos específicos de melanoma). A este final, es creada una célula que presenta antígeno artificial por expresión de moléculas Clase I CHP en células de Drosophila melanogaster (mosca de fruta). Puesto que la Drosophila no tiene un sistema inmune, los transportadores de péptido TAp-1 ,2 involucrados en la carga de epítopes de péptido en moléculas de clase I están ausentes. Como resultado, las moléculas clase I aparecen en la superficie de la célula de Drosophila como vasos vacíos. Por incubación de estas células de Drosophila transfectadas con péptidos exógenos que enlazan a las moléculas de clase I, tal como, epítopes específicos de cáncer o tumor, incluyendo pero no limitando a, epítopes específicos de melanoma, esto es posible que ocurra en todas las moléculas de clase I con el mismo péptido. La expresión de alta densidad de moléculas clase I conteniendo un péptido único en estas CPA de Drosophila permite la generación de células T CD8+ citotóxicas ¡n vitro las cuales son completamente específicas para el péptido de antígeno. Los métodos y procedimientos para la preparación de células Drosophila están enseñados en la Patente de EUA No. 5,529,921 , concedida en junio 25, 1996 titulada "ln Vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect Cells Expressing Human Class I CHP and 2-Microglobulin", y Patente de EUA No. 5,314,813, concedida en mayo 24, 1994 titulada "Drosophila Cell Lines Expressing Genes Encoding CHP Class I Antigens And 2-Microglobulin and Capable of Assembling Empty Complexes and Methods of Making Said Cell Lines". En particular, la Patente de EUA No. 5,529,921 desglosa en la columna 26, línea 56 a la columna 28, línea 22 varios métodos de separación y/o enriquecimiento de cultivos de células precursoras. Adicionalmente, esta característica elimina la necesidad para estimulación in vivo del sistema inmune con alta dosis de varias citocinas. Resultando de esa manera en un tratamiento que previene los efectos laterales causados por las citocinas. Alternativamente bajo situaciones apropiadas, o condiciones, donde es apropiado y donde el sujeto puede resultar beneficiado, el sujeto puede ser tratado concurrentemente con dosificación de bajo nivel de interferón- , interferón-?, y/o IL-2. Al eliminar la necesidad para estimulación in vivo con citocinas se provee un mejoramiento a la calidad del cuidado del paciente. Los regímenes del tratamiento que incluyen la administración de citocinas a pacientes a menudo resultan en el desarrollo de síntomas como gripa en el paciente, así como náusea, vómito y fiebre. Estas reacciones laterales generalmente no amenazan la vida, aunque una reacción particularmente severa ocurriendo en un paciente quien está ya en una condición débil puede resultar en una situación de poner en riesgo la vida. Otra consideración es el impacto adverso que las reacciones laterales tienen en la aceptación del paciente y cumplimiento de un régimen de tratamiento beneficioso alterno. Removiendo la necesidad de estimulación in vivo con citocinas resulta en un régimen de tratamiento que mejora la comodidad del paciente, y provee el tratamiento clínico con un método efectivo de tratamiento que más probablemente lo cumplirá. La utilidad de este método para inmunoterapia adoptiva de tumores ha sido demostrada en ratones usando células de Drosophila transfectadas como células CPA y CD8+ de la línea 2C del receptor de célula T (RCT) transgénico de ratones. En este sistema, las células 2C CD8+ purificadas son altamente responsivas a péptidos in vitro presentados por células de Drosophila transfectadas-(Ld) Clase I CHP también portando las moléculas co-estimulantes B7-1 y MAIC-1. Las células de Drosophila transfectadas como una sonda para definición de los requerimientos mínimos para estimulación no preparada de células T CD8+ (Cai y colaboradores, P. N. A. S. USA (1996) 93:14736-14741 ). Alternativamente, cuando son usadas células de bazo de ratón separadas como respondedoras en lugar de células 2C purificadas, la necesidad de moléculas co-estimulantes no aplica. En este caso, las células CD8+ en la población del bazo reciben co-estimulación "espectadora" de las células B activadas. Utilizando este descubrimiento, ha sido posible mostrar que las células de Drosophila transfectadas-(Ld) Clase l CHP están disponibles para inducir células de bazo de ratón DBA/2 normales para responder in vitro a los péptidos específicos de tumor de mastocitoma P815 singénico en la ausencia de linfocinas adicionadas. La inyección LTC en los ratones DBA/2 portando el mastocitoma P815 lleva a regresión rápida del tumor (Sun y colaboradores, Immunity (1996) 4:555-564).

De acuerdo con el procedimiento, las células de bazo de ratón DBA/2 normales fueron cultivadas in vitro con células de Drosophila transfectadas-(Ld) Clase I CHP cargadas con péptido P1A.35-43, un epítope específico de tumor de la línea de célula mastocitoma P815 derivada de DBA 2. Los linfocitos cosechados de los cultivos después de cinco días demuestran una fuerte actividad de linfocito T citotoxico (LTC) hacia las células de tumor P815 in vitro, pero fallan al lisar P1024, una línea de célula mutante de P815 que no expresa P1A.35-43, como se mostró en la Figura 3, Panel A. Cuando estos LTC fueron inyectados en ratones DBA/2 previamente inoculados con células P815 tres días antes, los tumores crecieron desenfrenadamente durante la primera semana, pero fueron subsecuentemente eliminados en la próxima semana, como se mostró en la Figura 3, Panel B. La especificidad fue demostrada por la ausencia de cualquier efecto sobre el crecimiento de P815 cuando los LTC fueron inmunizados in vitro contra un antígeno irrelevante, tal como, péptido de nucleoproteína viral, como se mostró en la Figura 3, Panel B. En resumen, las células de Drosophila transfectadas-(Ld) Clase I del complejo de histocompatibiiidad principal indujeron a las células de bazo de ratón DBA/2 normales a responder a péptidos específicos de tumor de mastocitoma P815 singénico in vitro en la ausencia de linfocinas adicionadas. La inyección de estos LTC en ratones DBA/2 portando mastocitoma P815 llevó a la regresión rápida del tumor (WoJfeJ y colaboradores, J. Exp. Med. (1993) 178:489-495).

Estudios Humanos In Vitro Los LTC humanos de sujetos saludables fueron inmunizados in vitro contra tirosinasa. Siguiendo solamente la estimulación primaria con células de Drosophila, lisis específica de células JY portando tirosinasa fue evidente en todos los efectores LTC a las relaciones objetivo JY probadas. Los LTC específicos de Tirosinasa de sujetos saludables fueron inducidos usando el protocolo de estimulación completa/re-estimulación y probados en su capacidad de exterminar la línea de célula de melanoma Malme 3M. Con una o dos excepciones posibles, la actividad específica de LTC contra Malme 3M fue inducida en todos los donadores a un grado variable. Para la mayor parte, la reactividad hacia células de tumor Malme 3 de control fue mínima. Las células de pacientes de melanoma también fueron inmunizadas in vitro contra el epítope de tirosinasa para generar LTC de actividad y especificidad similar a aquellas derivadas de voluntarios saludables. El uso de cualquier sistema de célula que presenta antígeno (CPA) natural, o artificial, para generar linfocitos T citotóxicos in vitro es limitada por las características del antígeno que estos sistemas son capaces de generar. Los siguientes sistemas CPA han sido utilizados para generar LTC de antígeno específico a epítopes únicos: 1 ) células dendríticas humanas (DC) pulsadas con péptidos definidos; 2) células mononucleares de sangre periférica (CMSP) las cuales han sido conducidas a linfoblastos y pulsadas con péptidos; 3) las líneas de célula linfoblastoide (LCL) donde los péptidos naturales son agotados de los ácidos y cargados con los péptidos de interés; 4) las células de Drosophila diseñadas para expresar moléculas clase I vacías; y células 3T3 de Ratón transfectadas con moléculas co-estimulantes y de clase I humanas (J. B. Latouche and M. Sadelain, Nature Biotech (2000) 18:405-409). Las células dendríticas (DC) son consideradas el sistema de célula que presenta antígeno primario en humanos debido a su amplia aplicación en la presentación de células de antígeno primarias. Las proteínas propias o externas son procesadas dentro de una DC. Los epítopes de péptido resultantes son presentados por moléculas HLA, y son transportados a la superficie del DC. Sin embargo, se encontró que las DC no podrían generar consistentemente in vitro, los LTC dirigidos contra cuatro diferentes péptidos. Esto podría haber provisto LTC que tiene actividad correspondiente a cada uno de los cuatro péptidos. En adición, también se encontró que el fenotipo de la DC en el tiempo de pulsación del péptido, maduro o inmaduro, no causó efecto en el resultado. Alternativamente, la estimulación de la célula Drosophila usualmente resultó en los LTC dirigidos contra hasta diez diferentes tipos de péptidos. Esto provee los LTC que están activos para cada uno de los diez péptidos. La capacidad de las células Drosophila y DC para provocar las respuestas de LTC fueron evaluadas, inicialmente a un epítope de péptido único, siguiendo los protocolos de estimulación estándar para cada uno. Con el propósito de comparar las DC y las células de Drosophila transfectadas. Las DC inmaduras fueron generadas por cultivo de una semana de monocitos autólogos en la presencia de IL-4 y G -CSF. Las DC maduras fueron obtenidas de las DC inmaduras por adición de TNF al medio de cultivo veinticuatro horas antes a la cosecha. Las DC (inmaduras y maduras) fueron cosechadas, pulsadas con péptidos y mezcladas con células CD8 purificadas siguiendo el procedimiento utilizado para la estimulación de células CD8 y células de Drosophila pulsadas de péptido. Se encontró que las células de Drosophila son generalmente mejores estimulantes que las DC cuando se evaluaron para epítope de péptido de tirosinasa 689, como se mostró en la Figura 7. Además, las DC demostraron tanto para los fenotipos inmaduros o maduros (Figura 8) no ser tan eficientes como las células de Drosophila en la provocación de las respuestas de LTC específicas cuando son usados los péptidos definidos para pulsar las CPA. Esto es particularmente sorpresivo, debido al dominante rol jugado por las DC en el sistema inmune. Un estudio de comparación con un donador fue realizado, como se mostró en la Figura 9. La exterminación específica fue generada contra cuatro diferentes péptidos cuando se usaron células de mosca como estimuladores mientras las DC inmaduras resultaron en exterminación específica marginal y las DC maduras resultaron en exterminación específica contra solamente uno de los cuatro péptidos usados para estimulación.

Preparación de Línfocitos Citotóxicos Las células CD8+ aisladas de las muestras de leucaferesis por selección positiva con anticuerpo anti-CD8 están estimuladas contra cuatro diferentes péptidos asociados a melanoma presentados por células de Drosophila expresando moléculas Clase I (HLA-A2.1), B7.1 , MAIC-1 , LFA-3 y B7.2. Las células CD8+ están re-estimuladas por dos redondeos con monocitos autólogos cargados con el epítope de péptido en la presencia de IL-2 e IL-7. Los LTC no son expandidos específicamente con OKT3 e IL-2. La actividad de LTC es medida contra las células Malme 3M y la pureza de las células T CD8+ es evaluada por citometría de flujo. Los procesos y protocolos de producción están hechos de conformidad con las buenas prácticas de laboratorio y buenas prácticas de manufactura. "Buenas Prácticas de Laboratorio" y "Buenas Prácticas de Manufactura" son estándares de prácticas de laboratorio y producción las cuales están conjuntadas por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos, y son fácilmente conocidas para aquellos expertos en la técnica. Los LTC son monitoreados para identidad, viabilidad, actividad de LTC, esterilidad, y contenido de endotoxina. Un listado de epítopes péptidos apropiados para uso en los métodos de la presente invención para tratar cánceres de mama y ovario está mostrado en el siguiente cuadro 1. Es fácilmente apreciable para aquellos expertos ordinarios en la técnica que una amplia vanedad de epítopes de péptido en adición a aquellos listados en el siguiente cuadro 1 también pueden ser apropiados para uso en los métodos de la presente invención para tratar cánceres de mama y ovario, con tal que tales péptidos sean epítopes de célula T.

CUADR0 1 Epítopes Restringidos HLA-A2.1 Identificados para Antíqenos Asociados con Tumor como Objetivos para Cáncer de Mama y de Ovario.

CEA Carcinoembriónico Ag 571-579 879 CAP-1 YLSGANLNL (SEQ ID NO:21 ) G250 245-262 912 HLSTAFARV (SEQ ID NO:36) Los siguientes ejemplos se proveen con el propósito de ilustrar la presente invención, pero no limita la presente invención el contenido de los ejemplos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Producción de Células que presentan Antígeno de Drosophila.

La línea de célula S2 de Schneider es preparada de huevos de melanogaster de Drosophila (Oregon-R) de conformidad con los procedimientos publicados y se ha depositado con el American Type Culture Collection (CRL10974). Las células S2 crecieron en un medio de Drosophila de Schneider comercial complementado con 10% de suero bovino fetal. El vector plásmido pRmHa-3 para expresión de CHP Clase I y proteínas co-estimulantes en células S2 fue derivado del vector de expresión pRmHa-1 construido como se describió en la literatura. Este contiene un promotor de metalotioneína, secuencias de consenso de respuesta de metal y un gen de alcohol deshidrogenasa portando una señal de poliadenilación aislada de la Drosophila melanogaster.

Fueron preparados ADN complementarios para transfección como sigue HLA-A2.1 y -2 microglobulina: RCP por transcripción inversa de células K562 usando cebos derivados de la secuencia publicada. B7.1 : RCP por transcripción inversa de células K562 usando cebos derivados de la secuencia publicada. MAIC-1 : RCP por transcripción inversa de células K562 usando cebos derivados de la secuencia publicada. B7.2: RCP por transcripción inversa de células HL-60 (ATCC CCL240) usando cebos derivados de la secuencia publicada. LFA-3: RCP por transcripción inversa de células HL-60 (ATCC CCL240) usando cebos derivados de la secuencia publicada. Los ADN complementarios fueron insertados individualmente en el vector pRmHa-3. Las células S2 fueron transfectadas con una mezcla de ADNs deplásmidos de HLA-A2.1 , B7.1 y MAIC- y el plásmido phshneo usando el método de precipitación de fosfato de calcio. Las células transfectadas estables fueron seleccionadas por cultivo en medio de Schneider conteniendo geneticina. Veinticuatro horas antes de uso, la expresión de los genes transfectados fue inducida por adición de CuS04. El nivel de expresión fue evaluado por citometría de flujo usando anticuerpos anti-HLA-A2.1 , Anti-B7.1 y anti-MAIC-1. La expresión HLA por más de 30% de las células es necesaria para activación in vitro eficiente de linfocitos CD8+.

Aislamiento de Células CD8+ Humanas Las células CD8* son aisladas de muestras de leucaferesis por selección positiva usando el procedimiento de aislamiento de Dynabeadas™ (Dynal). Un anticuerpo monoclonal de ratón CD8 anti-humano (50 g/ml en globulina gama humana [Gammagard®]) es adicionado a las células lavadas en SSAF de Dulbecco complementado con 1 % de albúmina de suero humano (Baxter-Hyland) y 0.2% de citrato de Na. Después de la incubación permanece a 4o C por cuarenta y cinco minutos con mezclado suave, las células son lavadas y re-suspendidas en la misma solución amortiguadora conteniendo perlas magnéticas de Dynal (Dynabeads™) recubiertas con IgG de anti-ratón de oveja en una relación de gota a célula de 1 :1. Las células y las gotas son colocadas en un tubo estéril y mezcladas suavemente a 4o C por cuarenta y cinco minutos. Al final de este período de tiempo, las células enlazadas a anticuerpos son removidas magnéticamente usando el separador MPC-1® de conformidad con las instrucciones del fabricante (Dynal). La disociación del complejo perla-célula CD8 es lograda por incubación a 37° C por cuarenta y cinco minutos en la presencia de pépt¡do5g- 0 CD8 (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO: 12). Las perlas libres son removidas magnéticamente y las células CD8 son contabilizadas y analizadas por citometría de flujo para evaluar la pureza. La recuperación de células CD8* es típicamente mayor del 80%. El cuadro 1 resume la composición de célula de catorce preparaciones de CD8+ separadas de preparaciones de CMSP humanas normales por selección positiva con anticuerpo anti-CD8.

CUADRO 2 Purificación de Células CD8+ por Selección Positiva Analizada por Citometría de Flujo.

Estimulación Primaria. Las células S2 de Drosophila transfectadas son incubadas en medio de Schneider (células 106/ml) complementado con 10% de suero fetal de becerro y CuS04 por veinticuatro horas. Las células son cosechadas, lavadas y resuspendidas en medio X-press de Insecto (Bio Whittaker) conteniendo 100 g/ml de tirosinasa369-377 humana. Después de la incubación a 27° C por tres horas, las células son mezcladas con células CD8+ en una relación de 1 :10 en un medio RPMI (Gibco) complementado con 10% de suero análogo. La mezcla de célula es incubada por cuatro días a 37° C durante los cuales las células de Drosophila mueren. En el día cinco, son adicionados IL-2 (20 U/ml) e IL-7 (30 U/ml) para expandir selectivamente la población de LTC específica de tirosinasa.

Re-Estimulación. Las CMSP agotadas de CD8, congelados, autólogos, obtenidos al mismo tiempo de la leucaferesis, son descongelados, lavados y re- suspendidos en una concentración de 106 células/ml en medio RPMI conteniendo 10% de suero autólogo, (como una fuente de microglobulina 2) y 20 g/ml de tirosina369-377- Seguido de la irradiación-? (5,000 rads), las • células son incubadas a 37° C por dos horas. Las células no adherentes son removidas por lavado con SSAF de Dulbecco. Los monocitos adherentes son cargados con el epítope de tirosinasa por incubación por 90 minutos en medio RPMI de solución amortiguadora de Hepes conteniendo 10% de suero autólogo y 10 g/ml de tirosinasa369-377. El sobrenadante es removido y la suspensión de célula CD8+ activada de Drosophila (3 x 106 células/ml en medio RPMI con 10% de suero autólogo) es adicionada en una relación de 10 células CD8+ a 1 monocito adherente. Después de tres o cuatro días de cultivo a 37° C, son adicionados IL-2 (20 U/ml) e IL-7 (30 U/ml) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de LTC específica de tirosinasa.

Expansión No Específica. Las células efectoras son expandidas no específicamente por cultivo de ellas en un medio RPMI complementado con suero autólogo, anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT®3), IL-2 y CMSP autólogas ¡rradiadas-?.

Ensayos Para Actividad y Pureza Ensayo de LTC Las células Malme 3M son usadas como células objetivo en un ensayo liberando 51Cr. Las células Malme 3 M 5 x 106 en medio RPMI conteniendo 4% de suero de becerro fetal, 1% de solución amortiguadora de HEPES y 0.25% de gentamicina son etiquetadas a 37° C por una hora con 0.1 mCi 51Cr. Las células son lavadas cuatro veces y diluidas a 105 células/ml en RPMI con 10% de suero bovino fetal (HyClone). En una placa microtituladora de 96 pozos, son combinados 100 I de LTC efector y 100 I de péptido cargado, células objetivo Malme 3M etiquetadas con 51Cr en relaciones de 100:1 , 20:1 y 4:1 (efectonobjetivo). Las células K562 son adicionadas en una relación de 20:1 (K562:Malme 3M) para reducir la Iisis antecedente de célula exterminadora natural. La Iisis no específica es evaluada usando la línea de célula de fibroblasto HLA-A2.1 de no tumor, Malme 3. Los controles para medir la liberación espontánea y liberación máxima de 51Cr están incluidos en duplicado. Después de la incubación a 37° C por seis horas, las placas son centrifugadas y los sobrenadantes contabilizados para medir el 51Cr liberado. El por ciento de Iisis específico es calculado usando la siguiente ecuación: cpm de muestra - cpm de liberación espontánea x 00 cpm de liberación máxima - cpm de liberación espontánea Citometría de Flujo. Las células CD8+, antes y después de la activación in vitro, fueron analizadas para un número de marcadores de superficie de célula usando anticuerpos monoclonales fluorescentes y análisis de FACS. Los resultados de un protocolo de activación típica usando células de un donador saludable están mostrados en el cuadro 3.

CUADRO 3 Análisis de Citometría de Flujo de Células CD8+ Activadas In Vitro.

En adición a la actividad y pureza, las preparaciones de LTC serán ensayadas por esterilidad y contenido de endotoxina.

Reactivos Líneas de Célula ATCC: American Type Culture Collection EJEMPLO 2 Prueba de Infusiones de Célula T Citotoxica contra Meianoma Propósito de la Prueba. Este ejemplo muestra la efectividad de las infusiones de Célula T citotoxica en el tratamiento de meianoma como se evaluó de conformidad con los factores siguientes: 1.- seguridad y tolerancia de los LTC autólogos re-infundidos después de inmunización in vitro; 2.- cinética de los LTC infusos en la circulación sistémica factorizando en la limitación del análisis de dilución; 3.- disposición del cuerpo completo de los LTC por radioescintografía; 4 - composición de la célula de nodulos con biopsla por inmunohistología (células LTC, TH, NK, B); y 5.- regresión de lesiones medibles y duración de respuesta durante dos meses.

Poblaciones de Pacientes. La eligibilidad para el tratamiento requiere de pacientes que tienen histológicamente documentado, meianoma maligno no receptivo que fue medible o evaluable, y el halotipo HLA-A2. La evaluación del pretratamiento incluyó la evaluación radiológica del cerebro por MRI o barrido CT, el barrido CT del pecho y abdomen, y el examen físico, especialmente de la piel y los ganglios. El número total de pacientes tratados fue de quince (nueve masculinos y seis femeninos). Los rangos de edades desde 33 a 75 años con un promedio de 58 años. El promedio de duración de la enfermedad metastática fue de 1.5 años. Se realizó una prueba de piel de pretratamiento para determinar si existió un estado de anergía en 14/15 pacientes con 5/14 pruebas negativas para todos los siete de los antígenos comunes evaluados. Los pacientes fueron monitoreados para el haplotipo HLA-A2 por análisis de FACS con un anticuerpo monoclonal específico HLA-A2 (BB7.2). La subcategoría fue realizada por análisis de RCP. Todos, excepto uno de los pacientes, fueron HLA-A*0201 , la excepción (paciente 08) fue HLA-A*0205.

Tratamiento con los LTC Autólogos Generados Ex Vivo Quince pacientes fueron tratados bajo este protocolo clínico. Todos los pacientes recibieron, por lo menos una infusión única de los LTC autólogos. El número de ciclos y la dosis de las células administradas a cada paciente están resumidas en el cuadro 1. El número de células generadas in vivo fueron dependientes de los factores relacionados del paciente tales como los números de las CMSP aisladas del procedimiento de aféresis y el número de células T CD8+ presentes en cada preparación de CMSP. Puesto que todas las células generadas in vitro fueron re-infundidas en el donador, las dosis administradas a cada paciente fueron variadas necesariamente. En un intento para normalizar la dosis entre pacientes, se registró un marcador de "potencia" calculada para cada dosis. El valor fue obtenido por multiplicación del número total de células por la actividad lítica obtenida con las células objetivo cargadas de péptido. Las dosis de células T infundidas están en el rango de un mínimo de 4x107 (paciente 08) a un máximo de 3.2x109 (paciente 13). Los pacientes fueron anotados en un segundo, tercero o cuarto ciclo de tratamiento basado en su estatus clínico al final de cada ciclo. El número de C SP obtenidas de las muestras de aféresis tendió a ser menor en pacientes sometidos a ciclos adicionales, especialmente si el inicio del ciclo subsecuente era cercano al final del ciclo previo. Esto se atribuyó a la linfopenia persistente debida al IFN -2b administrada durante el ciclo previo. El número total de células T CD8+ nuevas aisladas fue dependiente de su porcentaje en cada una de las preparaciones de CMSP. El porcentaje de células T CD8+ varió entre 8% a 31% entre los pacientes. El factor de expansión obtenido también contribuyó a los números de célula final y estuvo en el rango desde 0.1-6.0 veces. El procedimiento para generación de los LTC ex vivo se enseñó en la Especificación y Ejemplo 1 , arriba.

Regulación de Antíqenos Asociados a Melanoma v Clase I en Respuesta a IFN -2b. En un intento por mejorar la capacidad de los LTC específicos de antígeno para lisar células de melanoma in vivo, se administraron dosis bajas de IFN -2b por cinco días consecutivos antes de la infusión del LTC, y tres veces semanalmente por unas cuatro semanas adicionales. Una manera de medir una respuesta in vivo a la citocina es evaluar las biopsias obtenidas en puntos de tiempo seriales por análisis inmunohistoquímicos para tinción positiva con anticuerpos específicos. Las biopsias seriales fueron obtenidas en un paciente con lesiones en la piel múltiples (paciente 04) para evaluación de ambas expresiones de clase I y antígeno. Las biopsias que indicaron la expresión Clase I y MART-1 fueron débilmente positivas antes de cualquier tratamiento (biopsia A). Siguiendo cinco días de inyecciones subcutáneas de 0 U/m2, se notó un incremento dramático en estos dos marcadores (biopsia B). Para tirosinasa y gp100, la tinción inmunohistoquímica fue de negativa a débilmente positiva, respectivamente en las muestras de pretratamiento (biopsia A). Después de la dosis de IFN de cinco días inicial, y trece tratamientos adicionales, la expresión de estos antígenos últimos fue incrementada en las muestras de tejido manchadas (biopsia C).

Especificidad Antigénica de los LTC Generados Ex Vivo. Los LTC generados para todos los pacientes fueron evaluados en el día de liberación contra objetivos T2 cargados de péptidos, una línea de célula de melanoma HLA-A2 (Malme3M) y una línea de melanoma autóloga, si el material de biopsia estaba disponible para establecer una línea. Cada dosis de células preparada fue evaluada en su actividad citolítica. Las células T2 cargadas de péptido, que presenta ya sea cada uno de los péptidos solos, o todos los cuatro péptidos simultáneamente, fueron usadas para determinar la especificidad de la respuesta de LTC generada para cada paciente. La capacidad para lisis de las células portando antígeno, asociadas a melanoma, expresadas endógenamente fue evaluada con una línea coincidente de HLA-A2 o una línea de tumor autólogo. En adición a la actividad citolítica, la especificidad del antígeno fue evaluada con un método establecido para detección de producción de interferon gamma intracelular, hecho en respuesta a unos estímulos de péptidos específicos. Los LTC generados al final del protocolo ex vivo fueron evaluados por este método. El por ciento de células específicas para cada uno de los péptidos fue registrado individualmente. El número total de células específicas en cada cultivo de CD8 en bruto del paciente 13 fue calculado por adición de cada una de las especificidades del péptido detectada en la población de células T. Un incremento en el número total de células específicas podría ser detectado con cada uno de los ciclos de tratamiento exitosos.

Detección de Células CD8 y CD4 Infiltrando en Biopsias de Tumor Post Terapia de LTC. Las muestras de biopsia previas de todos los pacientes, durante y después del tratamiento podrían haber sido ideales. Sin embargo, las condiciones experimentales permitieron muestras de biopsia de solamente un número limitado de pacientes. El tejido de tumor fue obtenido de cinco de los quince pacientes enrolados en el estudio. En dos pacientes (pacientes 08 y 13) las muestras de biopsia estuvieron disponibles en cinco y seis semanas después de la terapia de células T, respectivamente. El examen de las muestras de tejido reveló la presencia de infiltración de ambas células CD8 y CD4. Una de las muestras de tumor fue tomada de una lesión de piel en la región occipital del cuero cabelludo, la cual incrementó en tamaño en el tiempo del seguimiento del examen, cuatro semanas después de una segunda infusión de células T. La biopsia reveló necrosis del tejido que fue infiltrado pesadamente con linfocitos. La otra biopsia fue de la cabeza de un hueso de fémur, removido durante la cirugía de reemplazo de la cadera. La lesión de piel del paciente 08 fue fuertemente positiva (4+) para ambos una clase I general, y un marcador HLA-A2 específico. La tirosinasa y gp100 fueron débilmente positivos (1+ y 2+, respectivamente), mientras que el MART- fue negativo en este mismo ejemplo. Las regiones de la biopsia del paciente 13 también fueron necróticas, con más tinción heterogénea; las poblaciones distintas de células de tumor careciendo de expresión de la molécula HLA-A2.1 , y una o más de las MAA. Sin embargo, las regiones de tejido intactas revelaron fuerte clase I (4+), y todos los antígenos asociados de melanoma. Las infiltraciones linfocíticas en esta última muestra aparentaron rodear los nodulos del tumor mejor que la infiltración profunda de ellos. Sin embargo, el más alto porcentaje de células asociadas directamente con el tumor fueron células CD8. La carencia de muestras de biopsia de pretratamiento de ambos de estos pacientes previno una confirmación de tipos similares de células de infiltración en las muestras de tejido anterior al tratamiento.

Barridos CT Posteriores a Terapia de Célula T Confirman una Respuesta Objetiva. Los barridos fueron parte del pretratamiento mostrando el criterio y el postratamiento siguiendo el examen. El paciente 10 recibió una única infusión de 8x108 LTC (7/27/99) cinco semanas después del barrido de pretratamiento (6/23/99). Cuando un barrido CT del pecho fue repetido un mes después de la infusión (8/27/99), fue notado un decrecimiento dramático en el lado de una lesión de pulmón. Similarmente, el paciente 14 se sometió a un barrido de CT de pecho como parte del proceso de enrolado (9/10/99), tres semanas y media antes de una primera infusión con células 6.6x 08 (10/5/99). Un barrido CT seguido (1/7/99), un mes después de una segunda infusión con células .5x108, reveló reducción dramática en tres lesiones separadas. El paciente 13 también tuvo una respuesta objetiva como se midió en barridos CT previos y posteriores. La adenopatía paratraqueal fue de 7,8cm2 (estudio previo) a 4.4cm2 después del ciclo I, y desapareció siguiendo el ciclo II.

La Presencia de un Estado Anérqico No Impide la Capacidad para Generar los LTC o Prevenir una Respuesta Clínica. La mayoría de los pacientes tratados bajo este protocolo han recibido intervención médica previa. Se realizó una prueba de piel de pretratamiento para determinar si una respuesta anérgica a un panel de siete antígenos comunes se relacionó ya sea con una incapacidad para generar LTC ex vivo, o previene una respuesta clínica documentada. La capacidad para generar LTC ex vivo no se relaciona con los resultados de la prueba de piel de pre-tratamiento del paciente. Debe ser notado que los pacientes 03 y 04 (ambas respuestas mezcladas) repitieron las pruebas de piel antes de iniciar el segundo ciclo y se mantuvieron anérgicos.

EJEMPLO 3 Generación de LTC HEr-2/neu Específicos Capaces de Lisís de las Células de Tumor de Mama y Ovario Estuvimos interesados en la aplicación de nuestra tecnología de generación de LTC a otros tipos de tumores para determinar si todas las formas de cáncer podían ser destinadas con este planteamiento. El HER-2/neu es un proto-oncógeno con homología a EGFR que es amplificada y sobre-expresada en muchos tipos de cáncer humano, en su mayoría adenocarcinomas de mama, ovario y colon. A menudo está asociado con enfermedad agresiva y puede ser un indicador de una prognosis pobre. Se ha estudiado en varias pruebas clínicas como un objetivo posible para estos tipos de cáncer. A principios de los 1990 los epítopes de péptido restringidos HER-2/neu HLA-A2.1 fueron identificados ya sea por algoritmos de enlazamiento de péptidos asistidos por computadora o mediante proyección de los LTC aislados de ascitos de pacientes de cáncer de ovario (Cuadro 3).

CUADRO 3 Péptidos HER-2/neu Restr¡nqidos-HLA-A2.1 Todos los péptidos fueron sintetizados, dando un número de identificación (PRI#) y evaluados en la capacidad para generar LTC ex vivo utilizando el mismo método que empleamos para epítopes de péptido célula T asociados con melanoma. Las células CD8 fueron aisladas de donadores normales para determinar la capacidad para generar rutinariamente LTC ex vivo con células de Drosophila cargadas con epítopes de péptido LTC conocidos. Los péptidos 826, 835, 861 y 863 tuvieron la más alta frecuencia de generación de LTC (Cuadro 4).

CUADRO 4 Frecuencia de Generación de LTC HER-2/neu en Donadores Normales Mientras que las células de Drosophila transfectadas tienen una capacidad única para presentar hasta diez diferentes epítopes de péptido (Figura 10), nosotros seleccionamos los cuatro péptidos 826, 835, 861 y 863 debido a la frecuencia de generación de LTC para estos péptidos ex vivo. Estos cuatro diferentes péptidos HER-2 representan debilidad para enlazadores moderados para la molécula HLA-A2.1 presentada en la superficie de las células Drosophila transfectadas. Nosotros tendimos a incluir enlazadores A2 que son débiles, ya que nuestra experiencia con los péptidos asociados a melanoma sugiere que los enlaces clase I débiles generalmente generan LTC potentes los cuales reconocen las células de tumor, si es necesario ellos representan epítopes de célula T nativas. La mayoría de las proteínas asociadas a tumor que nosotros destinamos son antígenos de ellas mismas y como tal podría esperarse tener la alta afinidad para la molécula clase l que es vista con péptidos virales. Los enlazadores bajos a moderados generalmente generan LTC que lisan las células del tumor muy eficientemente. Esto se demostró con el péptido MART-1 el cual es un enlazador de afinidad baja sobre las células Drosophila (Figura 3), aunque representa un epítope que rutinariamente genera LTC potentes capaces de lisar células (T2) objetivo cargadas de péptido, o más importantemente, células de melanoma (Malme 3M) (Figura 12). El HER-2/neu es un miembro de la familia de EGF-R, y funciona como un receptor de factor de crecimiento. La proteína HER-2 es expresada durante el desarrollo fetal en humanos. En adultos, la proteína es débilmente detectable en células epiteliales de muchos tejidos normales. En células normales el gen HER-2 está presente como una copia única. La amplificación del gen y/o la sobre-expresión de la proteína asociada han sido identificadas en muchos tipos de cáncer humano incluyendo mama, ovario, uterino, estómago y adenocarcinoma del pulmón. Las diferencias de la secuencia entre HER-2 y el receptor EGF-R están anotadas en el cuadro 5. Tres de los cuatro péptidos HER-2 que nosotros hemos evaluado tienen tres o más cambios de aminoácidos entre las dos proteínas. Un cambio de aminoácido único es suficiente para discriminar entre las dos proteínas.

CUADRO 5 her-2/NEU contra EGF-R Una vez que los LTC han sido generados después del protocolo de estimulación ex vivo de cuatro semanas, nosotros evaluamos si las células específicas de péptido estaban presentes usando moléculas tetraméricas HLA-A2.1 preparadas con los péptidos de inmunización. Como se demostró en la Figura 3, la capacidad para generar LTC específicos de péptidos fue dependiente del donador. En el Panel A (donador 261), el donador hizo una fuerte respuesta de LTC al péptido 835 (37.55%). En el Panel B (donador 262), los LTC específicos de péptido pueden ser detectados con ambas moléculas tetraméricas 835 y 861 (3.6% y 15.1 %, respectivamente). Esto soporta el uso de péptidos múltiples para garantizar los LTC específicos de péptidos en el final del protocolo de estimulación. Este protocolo ex vivo permite generar LTC específicos múltiples relativamente con facilidad.

Respuestas de Anti-Péptido y Anti-Tumor. Después de la finalización del protocolo ex vivo completo, los LTC generados fueron evaluados para especificidad de antígeno. Para generar los LTC, en el Día 0 las células de Drosophila fueron cargadas con una combinación de los cuatro péptidos HER-2. Al final del protocolo de estimulación ex vivo de cuatro semanas, el cultivo CD8 en bruto fue evaluado para especificidad de antígeno. Las células cargadas con cada uno de los péptidos de inmunización fueron usadas como células objetivo. En la Figura 14, se representa una respuesta típica. El cultivo en bruto contiene especificidad para cada uno de los cuatro péptidos HER-2. La respuesta antitumor fue evaluada sobre una línea de célula de tumor de ovario (ATCC; HTB-77). Cuando una línea de célula objetivo no está restringida-HLA-A2.1 , nosotros transfectamos la línea de célula para tener un sistema de ensayo +/-. Cuando HLA-A2.1 fue transfectado en la línea HTB-77, se notó una exterminación mejorada por las células efector CD8 (Figura 15, Paneles A a D). Los efectores específicos HER-2, que representan los péptidos individuales fueron evaluados para confirmar la presentación de cada uno de los epítopes de péptido en su línea de célula de tumor. También fue evaluada una línea de célula de adenocarcinoma de mama (ATCC;HTB-131 ), transfectada con HLA-A2.1 en la capacidad para demostrar lisis de tumor con los efectores de péptido específicos HER-2. Los LTC específicos para el péptido 861 podrían lisar esta línea de célula de tumor cuando es transfectada con HLA-A2.1 (Figura 16).

Tratamiento de IFNy Requerido para Lisis de Célula de Tumor. La línea de célula HTB-77/A2.1 requiere un pretratamiento con IFNy para demostrar lisis de péptido específico. Las células fueron tratadas con 500U/ml de IFNy (actividad específica de 25ng/m() por veinticuatro horas previas a la iniciación del ensayo de liberación de 51Cr. En la Figura 7, la adición del IFNy resultó en lisis mejorada de la línea de célula transfectada HLA-A2.1. Para determinar el efecto de esta dosis de IFNy en la expresión de la superficie de ambos HLA-A2.1 y HER-2, se realizó un análisis FACS para determinar los niveles de estas moléculas después de inducción tanto de veinticuatro y veintiocho horas. Los paneles A y B de la Figura 8 representan los resultados de los análisis FACS. En el Panel A, no hubo mejoramiento de la molécula HER-2 sobre la superficie de las células HTB-77 veinticuatro y veintiocho horas después de la inducción con IFNy. En las células HLA-A2.1 transfectadas, ni HER-2 ni HLA-A2.1 demostraron un incremento en el nivel de superficie de expresión después de un protocolo de tratamiento similar. Lo que se notó fue un incremento en el nivel de expresión de TAP-1 , así como HLA-D y -DR, Catepsina S y D y Caspasa 5, cuando los niveles de ARNm fueron evaluados por análisis de microplaquetas de ADN de microarreglo (Figura 19). Esto podría explicar por qué hay una exterminación mejorada de las células HTB-77/A2.1 en la presencia de IFNy. Una regulación de esta molécula particular podría resultar en procesamiento más eficiente de la molécula HEr-2, permitiendo mejor presentación de los péptidos de interés.

Péptidos. Los péptidos sintéticos fueron hechos por química de Fmoc estándar usando un sintetizador de péptidos (Gilson Company, Inc.) Todos los péptidos fueron purificados a pureza >95% por HPLC fase inversa sobre una columna C-8. La pureza e identidad fueron estabilizadas usando un espectrómetro de masa con ionización de electrorociado. Los péptidos asociados a Melanoma incluyeron; péptido 819 fue MART- específico (AAGIGILTV SEQ ID NO:6), 817 y 853 fueron ambos péptidos gp100 (ITDQVPFSV SEQ ID TO:4 y KTWGQYWQV SEQ ID NO:5, respectivamente), los péptidos específicos de tirosinasa fueron 689 y 792, con 792 que representa la versión modificada post transnacional (YMDGTMSQV SEQ ID NO:2) de la secuencia nativa (YMNGTMSQV SEQ ID NO:1 ) representada por el péptido 689. Los péptidos 826 (CLTSTVQLV SEQ ID NO:7) y 835 (KIFGSLAFL SEQ ID NO:8) representaron secuencias HER-2/neu de los dominios intracelulares y extracelulares, respectivamente de la proteína p185. Las Pec6020 (ALALAALLVV SEQ ID NO:10) Pec6025 (ALLWDREV SEQ ID NO:11 ) fueron secuencias traslapadas que representan una proteína mucinosa detectada en líneas de tumor de ovario. La C-Iectina también fue una proteína detectada en líneas de célula de tumor de ovario y un péptido de su secuencia (C-lectin8) está representado por KMASRSMRL SEQ ID NO:9.

Ensayo de Citotoxicidad ln Vitro Los ensayos de liberación de 51 Cr Estándar fueron realizados para determinar el reconocimiento de la célula efector LTC de epítopes de péptido asociados a melanoma cargados en células T2. Las células T2 3x106 cosechadas se crecieron en (medio) RPMI + 10% de FBS. Se adicionó 0.1 mCi de 51Cr y se incubó a 37° C en un baño de agua. Las células etiquetadas fueron adicionadas a 10ml de 4% de lavado (RPMI + 4%FBS) y formaron peletizados, se lavaron dos veces adicionales, y re-suspendieron en medio a una concentración final de 0.2x106/mL para registrar la actividad de espontáneo contra células lisadas de detergente. Las células fueron pulsadas con los péptidos apropiados en 20 g/mL por treinta minutos. Se adicionaron 50 L a cada placa de 96 pozos conteniendo cada una células efector CD8 a 10, 2 0.4 y 0.08x106/mL, las cuales se incubaron a 37° C por seis horas, se giró y cosechó el sobrenadante.

Citometría de Flujo y Tinción de Tetrámero. Las células fueron etiquetadas con FITC- o PE conjugados con anticuerpos monoclonales por incubación a 4° C por 30 minutos en solución amortiguadora FACS (1 % BAS, 0.02% NaN3 en SSAF), seguido por un lavado en la misma solución amortiguadora. Las células fueron fijadas en 0.5% de formaldehído previamente a la adquisición de datos y análisis sobre un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) con su software CelIQuest. La tinción no específica fue medida con el mismo anticuerpo secundario usado para etiquetar anticuerpos primarios purificados, o un isótopo coincidente de control cuando los anticuerpos primarios se etiquetaron directamente. La tinción tetramérica fue realizada con moléculas tetraméricas HlVgag específicas HLA-A2.1 (Beckman Coutler) albergando la secuencia SLYVTVATL SEQ ID NO:43 como un control negativo. Los tetrámeros específicos HER-2 se hicieron con las secuencias de péptidos CLTSTVQLV (826 SEQ ID NO:7), KIFGSLAFL (835 SEQ ID NO:8), o VMAGVGFSPYV (861 SEQ ID NO:16). Se usaron los complejos de péptido HLA-A2.1 tetramérico etiquetado PE en conjunto con anticuerpos monoclonales (BD Phar agin) CD8a anti-humano etiquetados-isotiocianato fluorescente (FITC) para manchar las células T CD8+ específicas de epítope como se describió en el inserto del empaque. Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo de dos colores en un Becton Dickinson FACScan, y las células T CD8+ que abren fueron examinadas por tinción con complejos de péptido HLA-A2.1 tetramérico.

EJEMPLO 4 Generación de LTC Específicos de Mama y Ovario Adicionales con Este Protocolo de Estimulación Ex Vivo Hemos demostrado la capacidad para generar respuestas de LTC a todos los epítopes de péptido restringidos HLA-A2.1 conocidos para varios antígenos de tumor de diferentes orígenes de tumor. Nuestros estudios iniciales se enfocaron en melanoma donde nosotros fuimos capaces de demostrar respuestas clínicas objetivas en pacientes tratados con LTC específicos para cuatro diferentes epítopes de péptido específicamente para MART- , gp100 y las proteínas asociadas a melanoma de tirosinasa [Richards y colaboradores, Amer. Soc. Clin. Oncol., San Francisco, California (2001 , Mayo)]. Para extender la capacidad de formular los LTC a otros antígenos de tumor presentes en un amplia variedad de otros tipos de cáncer, hemos seleccionado secuencias publicadas y novedosas de antígenos de tumor común para varios tipos de tumor diferentes. Estas incluyen AES, MUC-1 , CEA, FBP, C-Lectina, NY-ESO- , Pec60, CA-125, AGE-3, telomerasa y G250. El cuadro 7 describe estos antígenos, la frecuencia de expresión y los tipos de cáncer, que ellos expresan. La frecuencia de respuesta de estos péptidos con nuestro protocolo de estimulación ex vivo está listada en el cuadro 6.

CUADRO 6 Frecuencia de Respuesta de Epítopes de Péptido de Mama v Ovario en Donadores Normales.

CUADRO 6 Descripciones de Antíqenos de Tumor Antíqeno Descripción CA-125 Antigeno de Cáncer 125 es un marcador de célula epitelial expresado por tumores de ovario y algunas líneas de célula de ovario. Alrededor del 85% de pacientes de cáncer de ovario tienen un CA125 de suero incrementado y es por lo tanto comúnmente usado como un suero marcador de tumor. (Cáncer Letters (1999, Oct.) 145(1 -2)pg.133-141 ) MUC-1 Mucina es una glicoproteína de transmembrana expresada en ambos epitelios normal y maligno. La forma sub-glicosilada de MUC-1 sobreexpresada en la superficie de la célula de muchos adenocarcinomas humanos tales como cáncer de mama y ovario, así como malignidades hematológicas incluyendo mieloma múltiple y linfoma de célula- B. (Blood ( 999, ¡unió) 93(12) pg. 4309-43 7) G250 Un antígeno asociado a carcinoma de célula renal expresado en 85% de RCC pero no en tejido de riñon normal. Es idéntico ai antígeno asociado de tumor MA/CAIX el cual está expresado en alrededor de 50% de los cánceres de mama invasivos. (Cáncer Research (1999, Nov.);59(21 ) pg.5554-5559) FBP Proteína de enlazamiento de folato es un receptor involucrado en el transporte de folato. Está sobre-expresado en más del 90% de los tumores de ovario y del 20-50% de los cánceres de mama. (Anticancer Research (1999 Jul-Aug)19(4B)pg. 2907-2916) HER-2/neu Un proto-oncógeno (HER-2) codificando una proteína de transmembrana similar en secuencia y estructura a EGF-R. El HER-2/neu está sobre-expresado tanto como 200 pliegues sobre tejido normal en tumores de mama y de ovario. También se ha identificado en célula renal y carcinomas de pulmón. (J. Exp. Med. (1995, Junio) Vol. 181 , pg. 2109-2117) NY-ESO-1 Un antígeno de cáncer de testículos encontrado en el 30% de los cánceres de mama, próstata y ovario, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer y melanoma de cabeza y cuello. Los pacientes que tienen cánceres con tumores expresando este antígeno usualmente circulación de anticuerpos contra este. (J. Immunology (2000) vol. 165 pg. 948-955) CEA El antígeno carcínoembriónico es un antígeno asociado a tumor expresado frecuentemente en tumores epiteliales (colon, mama, pulmón). Los niveles de CEA en el suero pueden relacionarse con etapas de enfermedad y es usado para tratamiento de monitoreo y recurrencia de la enfermedad. (Human Immunology (1998) vol. 59 pg. 1-14) MAGE-3 Un antígeno de cáncer de testículo en 70-80% de lesiones de melanoma metastático y líneas de célula. Es un miembro de la familia de proteínas de melanoma asociado o MAGE. En adición. El MAGE-3 se ha encontrado en 20-60% de tumores epiteliales (colon, mama, pulmón, carcinomas gástricos). (Human Immunology (1998) vol. 59 pg. 1-14) AES El amino mejorador de proteína dividida es parte de un conjunto de receptores transcripcionles codificados por el Mejorador de genes dividos. Este antígeno de tumor fue identificado en linfocitos asociados a tumor de tumores de ovario y mama. (Molecular Immunology (1998) 35(17)pg.1121-1133) HTR La telomerasa (hTR) es un tipo especializado de transcriptasa inversa (hTRT o hTERT) que cataliza la síntesis y extensión del ADN telomérico. La actividad de esta enzima es elevada en alrededor de 90% de todos los tumores humanos incluyendo cánceres de mama, tiroides, vejiga, cerviz, próstata, colon, páncreas y estómago. (Cáncer Research (2001 , Dec) 61 (23) pg. 8366-8370)

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn) derivado de las células de Drosophila melanogaster transfectada con ácido nucleico que expresa moléculas HLA Clase I, moléculas enlazadoras, y moléculas co-estimulantes, en donde dicha CPAnn es capaz de presentar hasta quince diferentes moléculas de péptido que están codificadas por el ácido nucleico simultáneamente. 2.- La célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente CPAnn de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la CPAnn es capaz de presentar hasta diez diferentes moléculas de péptidos simultáneamente. 3.- La célula que presenta antígenos que no aparecen naturalmente CPAnn de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la CPAnn está que presenta las siguientes diez moléculas de péptidos simultáneamente, Tirosinasa369-377, Tirosinasa2o7-216, gp100209-2i7. gp100i54- 62, MART- 27-35. HER-2/neu789-797, HER-2/neu369-377, C-lectina8-i6, Pec602o-29, y Pec6025-33. 4 - Un método para producción de células que presenta antígenos que no aparecen naturalmente (CPAnn) capaz de presentar hasta quince moléculas de péptido simultáneamente, dicho método comprende los pasos: a. preparación de una línea de célula de insecto de huevos de Drosophila melanogaster, b. crecimiento de las células de insecto en un medio que es apropiado para células de insecto de crecimiento, preferiblemente Medio de Drosophila de Schneider™; c. hacer un plásmido pRmHa-3 de un vector de expresión pRmHa-1 , donde el plásmido pRmHa-3 incluye un promotor de metalotioneína, secuencias de consenso de respuesta de metal y un gen de deshidrogenasa de alcohol soportando una señal de poliadenilación aislada de Drosophila melanogaster, d. insertar en el plásmido pRmHa-3 ADN complementario de HLA clase I humano A2.1 , B7.1 , B7.2, MA1C-1 , microglobulina -2 y LFA-3, en doned A2.1 puede ser substituido con cualquier secuencia de ADN clase I; e. transfectación de las células de insectos con un plásmido phshneo y el plásmido pRmHa-3 contiene ADN complementario; y f. creación de la CPAnn por contacto de las células de insecto con CuS04 para inducir la expresión de los genes transfectados en las células de insectos. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la CPAnn es capaz de presentar hasta diez péptidos. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la línea de célula de insecto está preparada por células de crecimiento por doce días, seleccionando células deseadas con péptidos que son capaces de identificar las células deseadas, y expandiendo las células deseadas con OKT3 e IL-2. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque los péptidos capaces de identificación de las células deseadas son tetrámeros. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque las moléculas del péptido del paso (a) son seleccionadas de los péptidos que tiene una secuencia de aminoácido establecida en adelante en SEQ ID NO:1 hasta 42.