JP2017530723A

JP2017530723A - 樹状細胞の製造方法、これにより製造された樹状細胞及びその用途

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Publication number: JP2017530723A
Application number: JP2017526028A
Authority: JP
Inventors: ユンイ; ヨンモクキム; ソヨンキム; スンスハン; ヨンスペ
Original assignee: ジェイダブリュクレアジェンインコーポレイテッド
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2017-10-19
Anticipated expiration: 2035-07-28
Also published as: DK3176258T3; US20170196955A1; KR101518972B1; ES2796299T3; US10478479B2; EP3176258A4; EP3176258B1; JP6602377B2; EP3176258A1; CN106604989B; WO2016018053A1; CN106604989A

Abstract

本発明は、樹状細胞の製造方法、これにより製造された樹状細胞及びその用途に関し、具体的には、未成熟樹状細胞の成熟化段階で細胞膜透過能を有するペプチドと結合した抗原を細胞に処理し抗原に感作させることを含む樹状細胞の製造方法、前記方法により製造された樹状細胞及びその免疫治療剤、抗腫瘍ワクチン用途又はこれを含む腫瘍治療用の薬剤学的組成物に関する。

Description

本発明は、樹状細胞の製造方法、これにより製造された樹状細胞及びその用途に関し、具体的には、未成熟段階ではなく成熟化段階の樹状細胞に細胞膜透過能を有するペプチドと結合した抗原を処理することで抗原提示能が向上した樹状細胞の製造方法、前記方法により製造された樹状細胞及びその免疫治療剤、抗腫瘍ワクチン用途又はこれを含む腫瘍治療用の薬剤学的組成物に関する。

樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）は、強力な抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｓ；ＡＰＣ）であり、体内の免疫誘導及び免疫調節に重要な役割を担当する。

人体内の樹状細胞は、全白血球の０．３％に過ぎないが、抗原と接したことのないナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅＴｃｅｌｌ）を活性化させて一次免疫反応（ｐｒｉｍａｒｙｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導することができ、抗原特異的な後天性記憶免疫を誘導することができる兔疫細胞である。樹状細胞が強力な抗原提示細胞としての役割を果たせることは、細胞の表面に組織適合抗原（ＭＨＣ；ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘＩ／ＩＩ）だけでなく、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような共刺激因子（ｃｏ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）とＩＣＡＭ‐１のような細胞接着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）が高く発現しており、Ｔ細胞活性化に係る様々なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ；インターフェロン、ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１８など）を多量分泌するためである。

このように、樹状細胞が抗原特異的なＴ細胞活性を効果的に誘導あるいは調節できることから、がん又は難治性免疫疾患の治療剤としての使用可能性が長期間研究されて来た。組織又は血液から直接分離した樹状細胞や、単球から分化した樹状細胞を抗原に感作させた後、成熟化した樹状細胞を体内にまた注入すると、強力な抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を誘導することが明らかになり、がん又は感染性疾患の治療用ワクチンとしての開発可能性がずいぶん前から検討されて来た（Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔａｌ．，３．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４７９，１９９３；Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１９７，１９９０；Ｈｓｕ，Ｆ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．，２：５２，１９９６）。

かかる初期の研究結果に基づいて、がん治療用の樹状細胞治療剤の臨床研究が全世界にわたり活発に行われており、様々ながん腫から結果が報告されているものの、単独の治療療法としては、臨床効果が最初の期待にはまだ及んでいない。

樹状細胞治療剤がいまだに成功していない最も重要な理由は、腫瘍細胞の低い免疫原性とがん細胞が分泌する免疫抑制物質に起因すると知られている。この場合、樹状細胞がより強力な抗がん免疫を誘導することで腫瘍細胞の低い免疫原性を解消し、腫瘍細胞の免疫抑制能を乗り越える抗がん免疫を誘導することができれば、治療効果を大幅に向上させることができる。かかる背景下で、本出願の発明者らは、鋭意研究の結果、未成熟段階ではなく成熟化段階の樹状細胞にＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅ，Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔａｌ．ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ．３１２（８）：１２７７‐８８，２００６）のように細胞膜透過能を有する機能性ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）を抗原と結合した組み換え抗原を感作させる場合、リンパ節移動能、Ｔ細胞増殖能、細胞傷害性Ｔリンパ球誘導能などが、既存の樹状細胞に比べて著しく向上した樹状細胞を製造し、これを用いた免疫治療剤、腫瘍の予防又は治療用の組成物を提供することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、細胞傷害性Ｔリンパ球誘導能及び機能が向上した樹状細胞の製造方法、前記製造方法により製造された樹状細胞及びこれを含む抗腫瘍ワクチン又は腫瘍治療用の薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明は、成熟化因子を処理して培養した樹状細胞に細胞透過能を有するペプチドと結合した抗原を感作させる段階を含む樹状細胞の製造方法を提供する。

本発明は、前記製造方法により製造された樹状細胞を提供する。

本発明は、前記樹状細胞を含む免疫治療剤を提供する。

本発明は、前記樹状細胞を含む抗腫瘍ワクチンを提供する。

本発明は、前記樹状細胞を含む腫瘍治療用の薬剤学的組成物を提供する。

本発明の一実施により製造された未成熟樹状細胞に細胞透過能を有するペプチドを未成熟段階からＯ／Ｎ（２０時間）処理したものと同一抗原を成熟化の過程中に収穫の４時間前に処理した樹状細胞の移動能を測定した結果を示す図である。図１ａの樹状細胞培養液でＩＬ‐１２濃度を分析した結果を示す図である。図１ａの樹状細胞と自己Ｔ細胞との共培養の際にＴ細胞の増殖能分析の結果を示す図である。図１ｃの培養液でＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果を示す図である。本発明の一実施例により抗原感作時間を異ならせて製造した樹状細胞により誘導された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の数を分析した結果を示す図である。実施例（図２ａ）の実施中に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する過程で培養液に分泌されたＩＦＮ‐γの濃度を分析した結果を示す図である。実施例（図２ａ）で製造されたＣＴＬ（ｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌ）の細胞毒性活性を調査した結果を示す図である。実施例（図２ｃ）でＣＴＬ（ｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌ）と標的細胞（ｔａｒｇｅｔ細胞）との共培養の際に培養液に分泌されたＩＦＮ‐γの濃度を分析した結果を示す図である。実施例（図２ａ）の過程で誘導されたＣＴＬの抗原特異性をＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴで分析した結果を示す図である。本発明の一実施例により製造された樹状細胞の表現型の分析結果を示す図である。樹状細胞にＣＴＰ（細胞質残留性細胞膜透過ペプチド）結合有無抗原をＯ／Ｎ（２０時間）あるいは収穫の４時間前に感作する際に樹状細胞の表現型を分析した結果を示す図である。実施例（図４ａ）の樹状細胞を自己Ｔ細胞と共培養の際に培養液でのＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果を示す図である。実施例（図４ａ）の樹状細胞でＣＴＬを誘導してＣＤ８ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞を分析した結果を示す図である。実施例（図４ａ）の樹状細胞でＣＴＬを誘導する過程中に上澄み液でのＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果を示す図である。実施例（図４ａ）の樹状細胞で誘導したＴ細胞の抗原特異的免疫反応をＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴで分析した結果を示す図である。実施例（図４ａ）の樹状細胞により誘導されたＴ細胞のうちｇｒａｎｕｌｅ（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ）を発現するＣＤ８ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞をｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ染色法で調査し試験した結果を示す図である。未成熟（ｉｍＤＣｓ）樹状細胞及び成熟した（ｍＤＣｓ）樹状細胞がＲｈｏｄａｍｉｎｅで標識された抗原（ＣＴＰ‐ＰＳＡ又はＸ‐ＰＳＡ）を捕捉する程度を比較分析した結果である。ＣＴＰ‐抗原処理時間に応じて樹状細胞の免疫活性を比較分析した結果であり、ＣＴＰ‐ＧＰＣ３処理方法を図式化した図である。ＣＴＰ‐抗原処理時間に応じて樹状細胞の免疫活性を比較分析した結果であり、各樹状細胞と自己Ｔ細胞との共培養の際に培養液でのＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で分析した結果を示す図である。

他に定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野において熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野において周知のものであり、通常使用されるものである。

従来の樹状細胞の製造方法は、成熟化樹状細胞の抗原取込（ｕｐｔａｋｅ）能が未成熟細胞に比べて非常に低いため、樹状細胞が成熟化する前の段階に抗原を伝達する方法を活用した（韓国特許出願公開第２００４‐００２５６９０号参照）。また、このときに伝達される抗原の種類は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、がん細胞又は組織のライセート（ｌｙｓａｔｅ）、死滅又はアポトーシス誘導されたがん細胞、組み換えタンパク質及び短鎖ペプチドを樹状細胞に直接処理するか、樹状細胞との共培養、電気穿孔法、リポフェクタミンなどの方法を用いて樹状細胞に抗原を伝達した。特に、電気穿孔法の場合、伝達細胞に応じて形質導入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）において大きな差があり、電気穿孔２４時間培養後、高い細胞生存率を示しているものの、低い細胞回収率を示している。リポソームのような脂質小胞体を用いる抗原伝達方法もまた、形質導入効率と物理化学的不安定性が低く、乳化安定性と捕集効率が低く、溶媒を除去する工程が必要であるため、製造工程が複雑で、製造コストが高くなるなどの、様々な問題点を有している。

本発明は、樹状細胞に成熟化因子を処理して培養する中に、細胞透過ペプチドと結合した組み換え抗原を培養液に単純処理することで、樹状細胞の抗原捕捉能がなくても抗原が細胞膜を通過し細胞質に残留し、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）により生成されたペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）がＭＨＣＩに載せられて体内に投与される際に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性を非常に効果的に誘導することができる。また、全長タンパク質も使用できることから、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）とは異なり、ＨＬＡ制限がなく、本発明に係る製造方法は、樹状細胞治療剤として広く活用することができる。機能的な面においても従来の短鎖ＣＴＬペプチドを活用して製造された樹状細胞に比べて、全長タンパク質の様々なＣＴＬｅｐｉｔｏｐｅに対して免疫を誘導することができ、より強力な治療効果を期待することができる。

本出願の発明者らは、未成熟樹状細胞を抗原に感作させて成熟樹状細胞を製造した従来の方法とは異なり、未成熟樹状細胞を成熟化因子の存在下で培養して成熟化させた後、細胞膜透過ペプチドと結合した抗原を使用して樹状細胞を感作する場合、従来の未成熟樹状細胞に抗原を処理して得られる樹状細胞に比べて、移動能が向上し、樹状細胞の再刺激の際にＩＬ‐１２分泌能が向上し、Ｔ細胞との共培養の際にＴ細胞増殖力が向上し、Ｔｈ１反応性が増加し、細胞傷害性Ｔリンパ球誘導能が向上するなどを見出した。

かかる結果は、成熟樹状細胞が抗原捕捉過程を経ることなく、細胞内に流入された抗原をすぐ分解して提示することから、ＭＨＣ‐ペプチドの結合状態でペプチドの損失が減少し、Ｔ細胞にすぐ伝達され、抗原特異的反応がより強力に誘導されることに判断される。

本出願の明細書において使用される用語「樹状細胞」とは、抗原を細胞の内部に取込み、これを処理して抗原又は抗原から来由したペプチドをＭＨＣクラスＩ複合体又はＭＨＣクラスＩＩ複合体とともに提示するプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌ）を意味する。樹状細胞は、兔疫性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）抗原提示細胞及び免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）抗原提示細胞をいずれも含んでおり、成熟度に応じて未成熟樹状細胞（ｉｍｍａｔｕｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；「ｉｍＤＣ」）と成熟樹状細胞（又は成熟化された樹状細胞と併用）（ｍａｔｕｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；「ｍＤＣ」）とに分類する。

本明細書における用語「未成熟樹状細胞」とは、成熟初期段階で発見されるものであり、成熟樹状細胞と同様、ＣＤ１４のような細胞表面マーカーを発現せず、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３又はＣＤ４０を低い水準で発現し、ＣＤ１ａ及びＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ１を通常の水準で発現する樹状細胞を意味する。かかる表面形質マーカーの水準は、本発明の実施例によっても確認することができ、本発明に係る実施例の条件下では、ＣＤ８０、ＣＤ８３が未成熟樹状細胞では約２０％以下の水準であり、特に、代表的な成熟化マーカーであるＣＤ８３の発現が１０％未満と確認された。未成熟樹状細胞の分化は、様々な信号を受容して開始され、かかる分化は、受容される信号の組み合わせに応じて完全分化又は部分的分化に至る。未成熟樹状細胞は、発現される炎症性サイトカインの水準が低いため、Ｔ細胞と接触してもＴ細胞を活性化することができない。

本明細書における用語「成熟樹状細胞」とは、未成熟樹状細胞が成熟化して形成された細胞を意味し、Ｂ細胞及びＴ細胞活性に関与する細胞表面マーカー、例えば、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ‐ＤＲ）、細胞接着因子（ＣＤ５４、ＣＤ１８、ＣＤ１１）、共同刺激因子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３又はＣＤ４０）が未成熟樹状細胞に比べて高い水準又は相対的に増加した水準で発現する細胞を意味し、典型的に成熟樹状細胞は、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４を高い水準で発現する。例えば、本発明の一実施例において、未成熟樹状細胞を成熟化因子の存在下で培養することで樹状細胞の成熟化を誘導した場合、ＣＤ８３、ＣＤ８０の発現比率が著しく増加することを確認することができた。また、成熟樹状細胞は、炎症誘発サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）を放出し、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｒｅａｃｔｉｏｎ）でナイーブ同種異系Ｔ細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃＴｃｅｌｌｓ）及び同種同系Ｔ細胞（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃＴｃｅｌｌｓ）の増殖の増加及び／又はその他の免疫反応関連サイトカインの発現分泌が増加したことを特徴とする。

本発明の製造方法において、抗原は、細胞膜透過ペプチドと結合した組み換え抗原形態で樹状細胞に感作され、例えば、２４時間以下の感作時間で処理することで、本発明に係る樹状細胞を感作することができ、好ましくは、１２時間以下、より好ましくは８時間以下の間に処理することで、本発明に係る樹状細胞を感作することができる。かかる抗原感作時間は、抗原の種類及び未成熟樹状細胞の成熟化程度に応じて調節してもよい。抗原の最小感作時間は、例えば、１時間以上、又は３時間以上であることが好ましいが、これもまた抗原の大きさ、種類、感作する細胞の数のような抗原感作された樹状細胞の培養方法に応じて調節してもよい。

前記抗原の処理時点としては、未成熟樹状細胞を培養して成熟化の進行中又は成熟化が完了して成熟樹状細胞を収集又は収穫する前であれば、抗原の処理時点は特に制限されないが、例えば、成熟化因子の処理後、１時間〜４８時間内、２時間〜４８時間内、６時間〜４８時間内、１２時間〜４８時間内、１時間〜４０時間内、２時間〜４０時間内、６時間〜４０時間内、１時間〜２４時間内、２時間〜２４時間内、６時間〜２４時間内、又は１２時間〜２４時間内であり得る。

上述の範囲内の時間の間に成熟化した後、抗原を処理する場合、抗原特異的なＴｈ１免疫及びＣＴＬ誘導能を強化する効果を得ることができるが、上述の範囲を逸脱すると、樹状細胞が成熟化段階を逸脱し、機能が弱化（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）する問題があり得る。

また、上述の未成熟細胞の成熟化を誘導する培養時間は、培養条件に応じて変更してもよく、樹状細胞の成熟化過程で発現量が増加するＣＤ８０、ＣＤ８３、又はＣＤ４０のような細胞表面マーカーを基準として抗原処理時点を決定することができる。例えば、前記ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ４０発現水準が未成熟樹状細胞に比べて約５０％以上、好ましく約６０％以上増加した樹状細胞であってもよい（図３）。かかる成熟化水準が達成できる場合、培養時間は上述の条件により限定されない。

一つの実施例において、前記細胞膜透過能を有するペプチドは、タンパク質輸送ドメイン、例えば、ＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅ、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド）、ＨＰ４、Ｈｐｈ‐１、Ｍｐｈ‐１、Ｓｉｍ‐２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、Ｐｅｐ‐１（ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＰＴＤ‐５、Ｒ９（ａｒｇｉｎｉｎｅ）及び７Ｒドメインを含むペプチドからなる群から選択される一つ以上であってもよい。これにより、細胞膜透過能に優れ、且つ細胞質に残留するペプチドと抗原を結合することで細胞傷害性Ｔリンパ球誘導能が向上した強力な樹状細胞ワクチンを製造することができる。

上記のペプチドのうち、前記細胞質残留性細胞膜透過ペプチドは、細胞膜透過に必要な適する時間が経過した後、タンパク質分解酵素（例：トリプシン、キモトリプシン及びサブチリシン）で処理した後にも細胞膜透過現象を示すことから、タンパク質分解酵素の処理に影響を受けることなく細胞膜を透過することができる。

例えば、前記細胞質残留性細胞膜透過ペプチドは、配列番号１‐１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、好ましくは、配列番号１‐６、８‐１０及び１３‐１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり、より好ましくは、配列番号１‐２及び１３‐１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。

前記ペプチドと抗原の結合は、当業界において公知の分子間結合の形態であれば適用可能であり、例えば、ペプチドと抗原の共有結合又は特定のリンカーを用いたペプチドと抗原のコンジュゲーションの形態に結合され得る。

前記細胞質残留性細胞膜透過ペプチドに共有結合する抗原は、細胞質残留性細胞膜透過ペプチドのＮ‐末端又はＣ‐末端に結合することができる。共有結合方法は、抗原の種類に応じて、当業界において公知の方法を用いて実施してもよく、例えば、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド‐タンパク質をエンコードする遺伝子をクローニング及び細胞内発現させることで得ることができる。また、細胞質残留性細胞膜透過ペプチドの輸送能及び細胞質残留性、並びに生物学的活性分子の活性を妨げないリンカー、例えば、Ｎ‐スクシンイミジルヨードアセテート、Ｎ‐マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、１，５‐ジフルオロ‐２，４‐ジニトロベンゼン、ビスジアゾベンジジン、３，３‐ジチオ‐ビス‐（スルホスクシンイミジル‐プロピオネート）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどが用いられてもよく、これに限定されない。一方、抗原が細胞質残留性細胞膜透過ペプチドから分解された時にのみ活性を示す場合には、リンカーは生体内で切断可能なものを使用する。例えば、カルボン酸エステル及び／又はジスルフィド結合を有する結合剤が用いられ得る。

かかる細胞膜透過ペプチド、例えば、細胞質残留性細胞膜透過ペプチドが結合した抗原で成熟樹状細胞を処理する際、細胞膜透過ペプチドが結合していない対照群に比べて透過力が著しく向上し、抗原の取込（ｕｐｔａｋｅ）効率が増加し、樹状細胞の移動能、ＩＬ‐１２、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮ‐γの生成が著しく増加したことを確認することができた。かかる結果は、従来の樹状細胞において抗原感作は成熟化の前に行われなければならないという結果とは反対のものであり、本発明により最初立証されたものである。

前記未成熟樹状細胞の成熟化のために培養中に処理される成熟化因子は、例えば、インターロイキン‐１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１β；ＩＬ‐１β）、インターロイキン‐６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐６；ＩＬ‐６）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ‐α；ＴＮＦ‐α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ‐γ）、プロスタグランジンＥ‐２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２；ＰＧＥ２）、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ‐４３２）、ポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）及びこれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択される１種以上であってもよく、これに制限されるものではない。前記成熟化因子は、同時にあるいは時間差を置いて処理されてもよく、例えば、１０分〜２４時間の間隔を置いて処理されてもよく、好ましくは、８時間〜２４時間の間隔を置いて処理されてもよく、より好ましくは、１５時間〜２２時間の間隔を置いて処理されてもよい。本発明の一実施例では、ＯＫ‐４３２の場合、他の成熟化因子と時間差を置いて処理されており、かかる時間差は、ＯＫ‐４３２が抗原に感作されて非特異的免疫反応が誘導されることを防ぐためである。かかる目的の他にも樹状細胞の効果的な成熟化を誘導するために成熟化因子間の処理時点は調節可能である。

場合に応じて、樹状細胞の前駆細胞の未成熟樹状細胞への分化誘導に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる一般的な培地を使用してもよく、例えば、血清が含有された培地だけでなく、無血清培地を用いてもよい。例えば、血清（例えば、ウシ胎児血清、ウマ血清及びヒト血清）が含有された培地である。本発明において利用可能な培地は、例えば、ＲＰＭＩシリーズ（例えば、ＲＰＭＩ１６４０）、Ｅａｇｌｅｓ’ｓＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ，Ｅａｇｌｅ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１３０：４３２（１９５９））、α‐ＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭＥＭ、１９９培地、ＣＭＲＬ１０６６、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ１２、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物、Ｗａｙ‐ｍｏｕｔｈ’ｓＭＢ７５２／１、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ及びＭＣＤＢシリーズを含むが、これに限定されるものではない。また、無血清培地としては、Ｘ‐ＶＩＶＯシリーズ（Ｘ‐ＶＩＶＯ１５、Ｘ‐ＶＩＶＯ１０など）、ＣｅｌｌＧｒｏなどを用いてもよい。前記培地には、他の成分、例えば、抗酸化剤（例えば、β‐メルカプトエタノール）が含まれ得る。

場合に応じて、本発明に係る製造方法は、未成熟樹状細胞の培養の際、成熟化因子以外にもｍＴＯＲ阻害剤をさらに処理してもよい。

本出願の発明者らは、ｍＴＯＲ阻害剤をさらに処理して製造された成熟樹状細胞でサイトカインＩＬ‐１２及びＩＦＮ‐γの発現が増加することは言うまでも無く、がん予防モデルにおいて免疫誘導能の増加を示すだけでなく、がん治療モデルにおいて優れた抗がん効果を発揮できることを見出した。

前記ｍＴＯＲ阻害剤としては、ｍＴＯＲＣに直接結合して阻害するか、ｍＴＯＲＣの分解サイトのＡＴＰと競争的に阻害するために作用する如何なる形態の阻害剤でも含み得るが、例えば、ラパマイシン、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＮＶＰ‐ＢＥＺ２３５、ＳＦ‐１１２６、ＸＬ‐７６５、ＰＫＩ‐５８７、ＰＦ‐０４６９１５０２、ＰＫＩ‐４０２、ＯＳＩ‐０２７、ＡＺＤ‐８０５５、ＰＰ‐２４２、ＰＰ‐３０、ｔｏｒｉｎ‐１、ＷＹＥ‐１２５１３２、ＷＡＹ‐６００、ＷＹＥ‐６８７、ＷＹＥ‐３５４、ＫＵ‐００６３７９４及びパロミド‐５２９からなる群から選択されるいずれか一つであってもよく、これに制限されるものではない。

この中でも、本出願の発明者らは、ラパマイシンを処理して成熟化した成熟樹状細胞が、ＩＬ‐１２の発現が増加し、ＩＦＮ‐γが関与するＴｈ１免疫反応を向上させるだけでなく、細胞傷害性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー細胞を増加させ、これらの活性を向上させることができることを見出した。

前記ｍＴＯＲ阻害剤は、所望の細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導能及び機能が向上した成熟樹状細胞が得られる程度の濃度で処理してもよく、例えば、１〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度、好ましくは、１〜４５０ｎｇ／ｍＬの濃度で処理されてもよい。前記ｍＴＯＲ阻害剤の中でも特にラパマイシンの場合、１〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度で処理することが好ましい。上述の範囲内の濃度で処理すると、ＩＬ‐１２及びＩＦＮ‐γの発現増加、細胞傷害性Ｔリンパ球増殖及び活性増加の効果を発揮することができるが、１０ｎｇ／ｍＬの濃度を超えると、Ｔ細胞増殖の減少する傾向が現れ得る。

かかる製造方法により、細胞透過能が著しく向上し、且つ細胞傷害性Ｔリンパ球誘導能に優れ、ＩＦＮ‐γとＩＬ‐１２など、様々なサイトカインの分泌能が増加した樹状細胞を製造することができる。何よりも、前記製造方法により製造された樹状細胞は、抗原特異的ながん細胞の死滅を強力に誘導する結果を示す（図２参照）。

かかる結果に基づいて向上した免疫誘導能の向上及びこれに基づく優れた抗がん効果を発揮することができることを見出し、本発明は、前記製造方法により製造された樹状細胞、これを含む免疫治療剤、抗腫瘍ワクチン又は腫瘍治療用組成物を提供する。

他の観点において、本発明は、上述の製造方法により製造された樹状細胞である。本発明に係る樹状細胞は、以下の特性を示すことができる。
（ｉ）ケモカイン反応性移動能の増加；
（ｉｉ）前記樹状細胞を再刺激する際にＩＬ‐１２分泌能の増加；
（ｉｉｉ）前記樹状細胞でＴ細胞を刺激する際にＴ細胞のＩＮＦ‐γの分泌能の増加；
（ｉｖ）前記樹状細胞でＴ細胞を刺激する際にＴ細胞の細胞傷害性の増加；又は
（ｖ）樹状細胞で細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する際に細胞傷害性Ｔリンパ球の増加
（ｖｉ）樹状細胞と共培養する際に抗原特異的な機能性Ｔ細胞の増加

かかる特性に基づいて、本発明は、さらに他の観点において前記樹状細胞を含む免疫治療剤に関する。本発明に係る免疫治療剤は、免疫反応を増加させるか、特定の疾病、感染又は疾患の治療又は予防に好ましい免疫反応の一部を選択的に上昇させることができる。

これに基づき、本発明は、前記樹状細胞を含む抗腫瘍ワクチン又は腫瘍治療用の薬剤学的組成物に関する。

腫瘍に潜在性抗原が豊富で、かかる腫瘍が樹状細胞により提示されると免疫原性を有するという事実に基づき、本発明に係る樹状細胞は、腫瘍の予防のための抗腫瘍ワクチン又は腫瘍治療剤として使用され得る。本発明に係る樹状細胞により客体の免疫原性を増加させることができ、これにより客体中の腫瘍の増殖及び／又は転移を予防又は抑制することができる。

前記抗腫瘍ワクチンに使用可能な抗原は、例えば、肝がん又は前立腺がん特異抗原であってもよく、これに制限されるものではない。前記肝臓がん特異抗原は、例えば、ＡＦＰ（ａｌｐｈａ‐ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ‐３（ｇｌｙｐｉｃａｎ‐３）、ＭＡＧＥ‐１（Ｍｅｌａｎｏｍａ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ１）であるか、前立腺がん特異抗原は、例えば、ＰＣＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）又はＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）であってもよく、これに制限されるものではない。

本発明に使用可能な樹状細胞ワクチンの抗原としては、膜透過ペプチドと結合可能なすべての抗原であり、不活性化腫瘍細胞、遺伝子組み換え方法により製造された腫瘍細胞関連遺伝子、ペプチド又はタンパク質を含むことができる。遺伝子組み換え方法により前記抗原を取得しようとする場合、前記抗原をエンコードするヌクレオチド配列は公知のものであってもよく、公知の配列の全長を用いてもよく、全長の一部を用いてもよい。前記抗原をエンコードするヌクレオチド配列をベクターにクローニングし、所望の抗原が発現するようにしてもよい。

本発明に係る抗腫瘍ワクチンを、一回投与することで行われる免疫化方法と、連続投与することで行われる免疫化方法をいずれも含むことができる。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、投与時間及び投与経路のような要因に応じて多様に処方されてもよく、投与量による深刻な毒性（Ｇｒａｄｅ３以上）は報告されていないため、製造の方法及び収率に応じて多くの部分が決定される。一方、本発明の薬剤学的組成物の皮内投与量又は皮下投与量は、好ましくは、１回当り０．１×１０^７〜１０×１０^７細胞である。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法により、薬剤学的に許容される賦形剤を用いて製剤化することで単位容量形態に製造される。この際、剤形は、細胞凍結用溶液又は緩衝溶液に懸濁する形態であってもよく、安定化剤をさらに含んでもよい。本発明の一実施例による樹状細胞は、抗原感作の後に凍結させ、必要に応じて解凍して使用してもよい。本発明の一実施例による樹状細胞に対して３〜９ヶ月間安定性の評価を行っており、凍結保管によって樹状細胞の機能及び安定性に留意の変化が発生しないことを確認することができた。

本発明の薬剤学的組成物は、非経口で投与しており、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与などで投与することができる。

以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものに解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって明らかである。

実施例１：自己由来樹状細胞の製造（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ）
（１）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から未成熟樹状細胞の分化（ＰＢＭＣ→ｉｍＤＣ）
健康な個体の血液単核細胞に対して、室温のＦｉｃｏｌｌ‐ｐａｑｕｅＰｌｕｓ（Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ‐ｆｒｅｅｇｒａｄｅ）を使用した密度勾配遠心分離（ＤｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行って赤血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）、顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）、血漿などが除去された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集した。

前記末梢血単核細胞を取り、遠心分離して細胞を収穫し、細胞を所定の濃度で自己血漿が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、細胞培養装置に入れて培養した。凍結されたＰＢＭＣを使用する場合には、解凍してＨＢＳＳ溶液又は無血清培地で洗浄して使用することができる。

末梢血単核細胞からの単球の分離は、動物細胞培養装置の通常の材質であるプラスチックに対する吸着性（ｐｌａｓｔｉｃａｄｈｅｒｅｎｃｙ）を利用して実施した。単球が、細胞培養装置の底部の材質であるプラスチックに対する吸着性（ｐｌａｓｔｉｃａｄｈｅｒｅｎｃｙ）が非常に高いため、培地に懸濁した末梢血単核細胞を３７℃で培養した後、浮遊細胞（ｎｏｎａｄｈｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓ）を培地とともに除去することで、選択的に患者の単球細胞が全体血液細胞数の８０％以上に調整された分画としての接着された細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔｃｅｌｌ）を得た。

単球から樹状細胞の分化を誘導する樹状細胞分化培地としては、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）混合物（Ｅ．ｃｏｌｉ発現ヒト組み換えタンパク質であるＩＬ‐４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐４、ＪＷＣｒｅａＧｅｎｅ、最終濃度：３００ｎｇ／ｍＬ以下）とＧＭ‐ＣＳＦ（ＪＷＣｒｅａＧｅｎｅ、最終濃度：１００ｎｇ／ｍＬ以下）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。

（２）未成熟樹状細胞
培養を開始してから３日後、底部から離れて浮遊する細胞を収集し、数えた後、所定の量ずつ培養容器に移し、成熟化の準備をした。一部の細胞を取り、細胞表面で発現する様々なマーカー［ＨＬＡ‐ＤＲ（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５５８１２）、ＨＬＡ‐ＡＢＣＢＤ，Ｃａｔ＃５５５５５２］、ＣＤ４０（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５５５８８）、ＣＤ８０（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５７２２７）、ＣＤ８６（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５５６５７）及びＣＤ８３（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５６８５５）］の発現量をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により分析した。

（３）未成熟樹状細胞の成熟化誘導（ｉｍＤＣ→ｍＤＣ）
前記（２）の未成熟樹状細胞の成熟化を誘導した。すなわち、樹状細胞の成熟化を誘導するために、ＴＮＦ‐α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ‐α；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃３００‐０１Ａ、１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１β；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃２００‐０１Ｂ、１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐６；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ＃２００‐０６、１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＧＥ_２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２；ＳＩＧＭＡ＃Ｐ０４０９、１μｇ／ｍＬ）を所定の比率で入れた。この培地には、また、樹状細胞成熟化及び活性化因子として細胞性免疫誘導因子としてＴＬＲ（ｔｏｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）信号物質として知られているＰｏｌｙＩＣ（ＳＩＧＭＡ＃Ｐ０９１３、最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）とＩＦＮ‐γ（ＬＧ生命科学製、最終濃度：３０〜１０００Ｕ／ｍＬ）を所定の濃度で添加した。また、さらに、ｍＴＯＲ阻害剤であるｒａｐａｍｙｃｉｎ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ＃ＳＣ‐３５０４）を５〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培地に添加した。

上述の成熟化因子の存在下で、未成熟樹状細胞を１２時間〜４８時間培養した後、ピシバニール（ＯＫ‐４３２）（医薬品、Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ、ＪＷ中外製薬製、最終濃度：１〜２μｇ／ｍＬ）とがん特異的免疫反応のためにがん特異的抗原（ＣＴＰ‐ＧＰＣ‐３_{３３‐５５９}；５〜１０μｇ／ｍＬ、ＪＷＣｒｅａＧｅｎｅ）を所定の濃度でそれぞれの培養容器に処理し、３時間〜７時間培養した。浮遊細胞を最終治療剤として収集して２回洗浄し、細胞凍結安定化剤［ＤＭＳＯを含むヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）又はヒト血漿］に懸濁して原液を完成した。

比較例１：自己由来樹状細胞の製造（Ａｇ‐Ｏ／Ｎ）
未成熟樹状細胞に成熟化因子と抗原を同時に処理しており、抗原を処理した時点以外は、前記実施例１と同じ方法で樹状細胞を製造した。

試験例１：ＣｒｅａＶａｘ‐ＨＣＣ自己由来樹状細胞の生物学的及び免疫学的活性の比較
実施例１（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ；抗原感作を成熟化の最後の段階である細胞収穫４時間前に遂行）及び比較例１（Ａｇ‐Ｏ／Ｎ抗原感作を未成熟段階で成熟化因子処理とともに遂行）の樹状細胞を製造する際に成熟化の過程後、各樹状細胞の移動能と培養液に分泌されたＩＬ‐１２の量を測定し、図１ａと図１ｂに示しており、末梢血細胞から分離したＴ細胞と前記実施例１及び比較例１の樹状細胞を共培養の際にＴｃｅｌｌの増殖とＩＦＮ‐γを測定し、それぞれ図１ｃと図１ｄに示す。この際、抗原としては、ＧＰＣ‐３（配列番号１５）を用いた。

図１ａによると、実施例１による樹状細胞の移動能が、比較例１より約１．５倍増加したことを確認することができる。

具体的に、最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬになるようにＭＩＰ‐３β（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．＃３６１‐ＭＩ‐０２５）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に処理し、孔径（ｐｏｒｅｓｉｚｅ）８．０のトレンスウェル（Ｃｏｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３４２２）の下部チャンバに０．６ｍＬ入れ、５×１０^４の成熟化した樹状細胞を上部チャンバに入れて１２０分間３７℃で反応した。次に、ＭＩＰ‐３βにより下部チャンバに移動した樹状細胞を数え、最初に入れた細胞の数から移動した細胞の割合を計算した。陰性対照群としては、ＭＩＰ‐３βを処理していない培地を使用し、他の方法は同様に行った。

また、ＩＬ‐１２とＩＬ‐１０の量を測定するために、抗原の処理及び成熟化の過程で樹状細胞が分泌した培養液でＩＬ‐１２とＩＬ‐１０をＥＬＩＳＡ方法で分析した。実験方法は、ＥＬＩＳＡｋｉｔの提供会社のマニュアル（ＩＬ‐１２；ＢＤ，Ｃａｔ．＃５５５１８３、ＩＬ‐１０；ＢＤＣａｔ．＃５５５１５７））に準じて行った。実験結果を図１ｂに示す。

図１ｂによると、実施例１による樹状細胞の再刺激培養液でのＩＬ‐１２分泌量が比較例１より２０％ほど高いことを確認することができる。これは、本発明の一実施例による樹状細胞がＴ細胞と反応する際に、より効果的にＴｈ１免疫反応を誘導することを示唆する。

また、Ｔ細胞の増殖を測定するために、凍結されたヒトの末梢血から分離した単核細胞からｎａｉｖｅｐａｎＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（ＭＡＣＳ，Ｃａｔ．＃１３０‐０９７‐０９５）を用いてＴ細胞を分離した。凍結解凍後、樹状細胞とＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，ｃａｔ．＃ＭＯＰ‐Ｃ‐１１５７）で染色したＴ細胞を１：１０の割合で混合し、５日間培養した。ＣＦＳＥ染色過程は、１×１０^６／ｍＬの濃度でＴ細胞を懸濁した後、ＣＦＳＥを最終濃度が１０μｍになるように入れた後、０．１％のＨＳＡ／ＰＢＳｂｕｆｆｅｒで３７℃、１５分間反応した。ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、１×１０^５Ｔ細胞と１×１０^４個の抗原感作した成熟樹状細胞を９６ウェルプレートにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅして５日間培養した。培養後、細胞は収集してＦＡＣＳ分析を行っており、増殖した細胞はＣＦＳＥ^{ｌｏ（ｗ）}部分で分析し、実験結果を図１ｃに示す。

図１ｃによると、実施例１による樹状細胞のＴ細胞の増殖が比較例１で製造した樹状細胞のＴ細胞の増殖より２４％ほど高いことを確認することができる。

自己Ｔ細胞と樹状細胞を５日間培養した後、培養液でＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ（ＢＤＣａｔ．＃５５５１４２）方法で分析した。その結果を図１ｄに示す。

図１ｄによると、実施例１による樹状細胞をＴ細胞とともに培養した培養液でのＩＦＮ‐γ分泌量が、比較例１で製造した樹状細胞とＴ細胞を培養した培養液でのＩＦＮ‐γ分泌量より約２倍ほど増加したことを確認することができる。

試験例２：自己由来樹状細胞の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導活性の試験
実施例１（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ）、比較例１（Ａｇ‐Ｏ／Ｎ）樹状細胞と末梢血細胞（ＰＢＭＣ）から分離した自己Ｔ細胞を反応させて細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導した。この際、抗原としては、ＧＰＣ‐３を用いた。樹状細胞の製造に使用された同じヒトの末梢血細胞からｎａｉｖｅＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（ＭＡＣＳ，Ｃａｔ．＃１３０‐０９７‐０９５）を用いてＴ細胞を分離した。成熟した樹状細胞と分離されたＴ細胞を１：１０（４×１０^５：４×１０^６）の割合で混合し、６〜７日間培養した。１次刺激したＴ細胞は収集して抗原に感作した樹状細胞と同一の割合（１：１０）で再刺激を行った。培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＡＢｓｅｒｕｍ）は、培養２日〜３日ごとに新たな培地を添加するか交換して適切な培養環境を提供した。最初の刺激の際、ＩＬ‐７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．＃２００‐０７）を５ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、２回目の刺激からは培養２日〜３日までＩＬ‐７を同一濃度で処理しており、その後にはＩＬ‐２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｒｖａｔｉｓ）を５０Ｕ／ｍＬの濃度で処理した。抗原‐感作した樹状細胞で２〜３回繰り返してＴ細胞を刺激して誘導したＣＴＬに対してＣＴＬ細胞数の確認（図２ａ）とＣＴＬの活性試験（細胞傷害性、図２ｂ）を分析した。すなわち、ＣＴＬ誘導過程中にＴ細胞と樹状細胞の共培養の際に刺激の翌日、上澄み液の一部を取り、ＩＦＮ‐γ分泌量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。その結果を図２ｂに示す。

細胞傷害性の標的細胞としては、ＨＬＡｔｙｐｅが一致し、抗原（ＧＰＣ３）を発現するＨｅｐＧ２細胞株を使用した。標的細胞とエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌ（ＣＴＬ））は、それぞれ１：０、１：１、１：５、１：１０又は１：２０で混合して２０〜２４時間培養した後、培養液はＩＦＮ‐γを測定するために冷凍保管し、プレートは１０％のｆｏｒｍａｌｉｎで１時間固定した。次に、０．４％のクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ）２００μＬを各ウェルに入れて３０分間染色した後、３回プレートを洗浄し、プレートを室温で乾燥させた。乾燥後、８０％のメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）を１００μＬずつ添加して２０分間反応させた後、５７０ｎｍで吸光度を測定して細胞傷害性を確認した（図２ｃ）。また、標的細胞とエフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌ（ＣＴＬ））を１：０．５、１：１、１：５で混合し、２０〜２４時間培養した後、培養液を用いてＩＦＮ‐γ分泌量をＥＬＩＳＡ分析により測定した（図２ｄ参照）。

図２ａ〜２ｄによると、実施例１による樹状細胞を用いて誘導した細胞傷害性Ｔリンパ球の数が、比較例１による樹状細胞を用いて誘導した細胞傷害性Ｔリンパ球の数よりも２倍以上増加し、培養液でのＩＦＮ‐γ分泌量も２倍以上増加し、細胞傷害性は１．５倍以上、共培養の際に培養液でのＩＦＮ‐γ分泌量が著しく増加することを確認することができる。

また、ＧＰＣ‐３抗原をそれぞれの樹状細胞により誘導された活性Ｔ細胞に対して抗原特異的免疫反応を確認するために、実施例１（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ）、比較例１（Ａｇ‐Ｏ／Ｎ）樹状細胞で誘導したＣＴＬの抗原特異性をＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴ（ＢＤ，Ｃａｔ．＃５５１８４９）で分析した。具体的に、抗原特異性を確認するために、抗原を処理又は処理していない２種の樹状細胞を製造しており、この際、非特異的な反応を減少させるためにピシバニール（ＯＫ‐４３２）を処理していない樹状細胞を準備した。誘導された活性Ｔ細胞１×１０^４個と３×１０^３個の樹状細胞を３：１の割合で１８〜２４時間細胞培養装置で培養した後、キット（ｋｉｔ）で提示する方法にしたがってＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。分析の際、抗原を処理していない樹状細胞との反応時に測定されたスポット数を除去し、その結果を図２ｅに示した。

図２ｅによると、実施例１による樹状細胞で誘導した活性Ｔ細胞の抗原特異性が３０％以上増加したことを確認することができる。

試験例３：自己由来樹状細胞の細胞表面表現型
未成熟樹状細胞及び実施例１（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ）、比較例１（Ａｇ‐Ｏ／Ｎ）樹状細胞の表現型を分析するために、樹状細胞をＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋０．１％のｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ＋１％ＦＢＳ）に懸濁してＦＡＣＳｔｕｂｅ当たり３〜５×１０^４ｃｅｌｌｓに準備した。この際、抗原としてはＧＰＣ‐３を用いた。次に、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＨＬＡ‐ＡＢＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３に対するＦＡＣＳａｎｔｉｂｏｄｙ［ＨＬＡ‐ＤＲ（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５５８１２）、ＨＬＡ‐ＡＢＣＢＤ，Ｃａｔ＃５５５５５２］、ＣＤ４０（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５５５８８）、ＣＤ８０（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５７２２７）、ＣＤ８６（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５５６５７）及びＣＤ８３（ＢＤ，Ｃａｔ＃５５６８５５）］３μＬを添加して４℃で２０分間反応させた。反応後、ＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、細胞表現型の分析を行った。成熟した樹状細胞の表現型であるＨＬＡ‐ＤＲ、ＨＬＡ‐ＡＢＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３に対する発現を確認した。その結果を図３及び表１に示す。

図３によると、未成熟樹状細胞ではＣＤ８０、ＣＤ８３の発現が低い一方、実施例１及び比較例１のように未成熟樹状細胞に成熟化因子を処理して成熟化した樹状細胞では、ＣＤ８０／ＣＤ８３の発現が未成熟樹状細胞に比べて著しく増加したことを確認することができ、成熟化の水準は、抗原感作時期の差によってそれほど変化しないことを確認することができた。

試験例４：ＣＴＰ有無による樹状細胞の機能の評価
試験例１、試験例２、試験例３の方法によりＣＴＬを誘導し、ＣＴＰ有無による機能評価を実施した。ＣＴＰがあればＣＴＰ‐Ａｇと表記し、ＣＴＰのない抗原の場合、Ｘ‐Ａｇと表記した。この際、抗原としては、ＧＰＣ‐３を用いた。樹状細胞表現型を確認した結果を図４ａに示す。自己Ｔ細胞と実施例１又は比較例１による樹状細胞を５日間共培養した後、培養液でのＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で分析し、その結果を４ｂに示す。ＣＴＬを誘導してＣＤ８ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞を分析して図４ｃに示し、上澄み液でのＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で測定し、図４ｄに示す。ＧＰＣ‐３抗原を感作したそれぞれの樹状細胞により誘導された活性Ｔ細胞に対して抗原特異的免疫反応をＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳＰＯＴにより分析し、その結果を図４ｅに示す。

図４ａ〜４ｅによると、成熟化因子を処理した後、細胞収穫４時間前に細胞膜透過ペプチドに結合した抗原に樹状細胞を感作させる場合と、細胞膜透過ペプチドが結合していない抗原に感作させた場合とを比較すると、両群の樹状細胞の表現型にはそれほど変化がなかったが（図４ａ）、Ｔ細胞の共培養の際にＩＦＮ‐γ発現量が５倍以上増加し（図４ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数も２倍以上増加し（図４ｃ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示すＩＦＮ‐γ発現も３０％以上増加し（図４ｄ）、ＥＬＩＳＰＯＴ数は５倍以上増加（図４ｅ）したことから、同じ条件で同じ抗原で樹状細胞を感作しても細胞膜透過ペプチドに結合した抗原に感作された樹状細胞の免疫誘導能が著しく向上したことを確認することができた。

細胞毒性活性試験の一環として、活性Ｔ細胞が標的細胞と接した時に分泌するｇｒａｎｕｌｅ（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ）発現を確認するために、ｉｎｔｒａ‐ｃｅｌｌｕｌａｒｓｔａｉｎｉｎｇを行った。具体的に、刺激後、ＣＴＬを取得して洗浄した後、標的細胞（ＨｅｐＧ２）：ＣＴＬを１：２０の割合で入れ、この際、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ，Ｃａｔ＃）を細胞培養液２００μＬ当たり０．１４μＬをともに添加して３７℃で４〜５時間刺激した。細胞を収集し洗浄した後、Ｆｃ受容体遮断（Ｆｃｒｅｃｅｐｔｏｒｂｌｏｃｋｉｎｇ）のために１０％のヒト血清（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ）を含むＰＢＳを入れて４℃で１５分間培養した後、ＣＤ３（ＢＤ，Ｃａｔ．＃５５５３３５）、ＣＤ４（ＢＤ，Ｃａｔ．＃５５５３４６）、ＣＤ８（ＢＤ，Ｃａｔ．＃５５５３６７）で４℃で２０分間細胞表面の抗原に対して染色した。Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ，Ｃａｔ．＃５５４７１５）２５０μＬで４℃で２０分間反応させた後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、ｇｒａｎｚｙｍｅＢ（ＢＤ，Ｃａｔ．＃５６１１４２）を３０〜５０分間染色して洗浄した後、フローサイトメトリー装置で分析した。その結果を図４ｆに示す。

図４ｆによると、活性Ｔ細胞の細胞毒性活性を確認できるｇｒａｎｕｌｅ（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ）の発現は、細胞膜透過ペプチドが結合した抗原を感作する際に２倍以上増加したことを確認することができ、細胞膜透過ペプチドが結合された抗原を未成熟樹状細胞に処理することよりも成熟化因子を処理してから処理したときに、ｇｒａｎｕｌｅ（ＧｒａｎｚｙｍｅＢ）がより高く発現することを確認した。

試験例５：ＣＴＰ有無による樹状細胞の抗原取込能（ｕｐｔａｋｅａｂｉｌｉｔｙ）
未成熟樹状細胞及び実施例１（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ）の成熟樹状細胞の抗原取込能を確認するために、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識された抗原（ＰＳＡ抗原、配列番号１６）の取込能を分析した。また、この際、未成熟又は成熟樹状細胞の抗原取込能を確認するために最も一般的に使用するＤｅｘｔｒａｎ‐ｕｐｔａｋｅａｓｓａｙをともに行った。ローダミンで標識された抗原の製造は、以下のように準備した。先ず、ＮＨＳ‐Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）をＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した後、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質と混合して１時間反応した。沈殿物は、遠心分離して除去し、反応していないＮＨＳ‐Ｒｈｏｄａｍｉｎｅはゲルろ過クロマトグラフィー（ｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＧＥ、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ‐２５、１７‐００３３‐０２）を使用して除去した。標識されたタンパク質は、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、１２００ｓｅｒｉｅｓ）を使用してＥｘ／Ｅｍ＝５５２／５７５ｎｍで確認しており、タンパク質定量は、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ、８４５３ｓｅｒｉｅｓ）で２８０／５５５ｎｍで吸光度を測定して計算した。

具体的に、実施例１の未成熟樹状細胞の培養条件と同様に培養しており、培養３日目未成熟樹状細胞（１×１０^５ｃｅｌｌ）及び培養４日目抗原を感作していない成熟樹状細胞を取得し遠心分離した後、それぞれ１００μＬの樹状細胞培養液に懸濁してＦＡＣＳｔｕｂｅに入れた。このうち、陰性対照群として使用される細胞は予め氷に３０分程度放置して細胞をａｒｒｅｓｔした。ローダミン蛍光接合されたＣＴＰ‐ＰＳＡとＸ‐ＰＳＡ（ＣＴＰのないＰＳＡ）を２０μｇ／ｍＬの濃度で１時間処理した後、細胞を洗浄してフローサイトメトリーを行った。分析結果は、蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の中央値（ｍｅｄｉａｎ）に分析し、その結果を図５に示す。

また、試験に使用した未成熟樹状細胞と成熟樹状細胞の抗原取込能の一般的な差を再度検証するために、ＦＩＴＣ蛍光接合されたデキストラン（ｄｅｘｔｒａｎ）（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．＃ＦＤ‐４０Ｓ）を１０μＬずつ処理し、３７℃で、陰性対照群は４℃で１時間反応させた。ＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋０．１％のｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ＋１％のＦＢＳ）で洗浄した後、ＦＡＣＳ分析プログラムであるＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ）プログラムでヒストグラム（Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）分析を行ってＸ軸にＦＬ‐１を指定した単一蛍光ヒストグラムを得た。この際、陰性蛍光標準試料の９７％が存在する領域を陰性蛍光地域として設定するように線形区画分割を実施しており、この状態で区画別のｒｅｇｉｏｎｓｔａｔｅｓを行って検体の単一陽性蛍光（Ｄｅｘｔｒａｎ‐ＦＩＴＣ＋表現型）区画比率を得て分析した。その結果を図５に示す。

図５によると、未成熟樹状細胞の場合、細胞膜透過ペプチドと抗原が結合したか否かに関係なく抗原が樹状細胞内によく伝達されるが、成熟化樹状細胞では、細胞膜透過ペプチドと結合した抗原がより効果的に細胞中に伝達されることを再度確認することができた。すなわち、本発明は、成熟化時期での抗原感作及び抗原に結合した細胞膜透過ペプチドにより、樹状細胞内への抗原伝達が著しく増加し、これにより樹状細胞の機能が著しく増加することを立証したものである。

試験例６：ＣＴＰ‐抗原処理時期による樹状細胞の機能の評価
実施例１（Ａｇ‐ＢＨ４ｈ；１６ｈ）、比較例１（Ａｇ‐Ｏ／Ｎ；０ｈ）を含み成熟化因子処理時点から成熟化樹状細胞の収穫時点までＣＴＰ‐ＧＰＣ３を細分化し、図６ａのように処理した。図６ａに記載の実験方法は、実施例１の樹状細胞の製造方法と抗原処理時期における差のみが存在し、それ以外の培養条件は同様に適用した。成熟化因子処理時点後、時間別（０、２、４、８、１２、１６、１８、１９．５時間）にＣＴＰ‐ＧＰＣ３を５μｇ／ｍＬで感作しており、成熟化因子処理時点から２０時間の時点にすべての細胞を収集した。この際、抗原処理時点が０時間は前記Ｏ／Ｎと同じ表現であり、１６時間の時点はＢＨ４ｈと同じ表現である。自己Ｔ細胞と樹状細胞を５日間培養した後、培養液でのＩＦＮ‐γをＥＬＩＳＡ方法で分析し、その結果を図６ｂに示す。

図６によると、ＣＴＰ‐抗原処理時間が長い場合（成熟化因子処理後、０、２、４、８時間に抗原処理した場合）と非常に短い時間（成熟化因子処理後、１９．５時間に抗原処理した場合）の抗原処理は相対的に低い水準のＩＦＮ‐γを示すため、樹状細胞の免疫活性機能にそれほど役立たないと考えられた。一方、成熟化因子の処理後、１２時間〜１８時間の時点にＣＴＰ‐Ａｇを感作した樹状細胞は、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ‐γを多量分泌することで免疫活性が増加したことを確認することができる。

本発明の樹状細胞の製造方法によれば、細胞透過能が著しく向上し、且つ細胞傷害性Ｔリンパ球誘導能に優れ、ＩＦＮ‐γＩＬ‐１２など、様々なサイトカインの分泌能が増加した樹状細胞を製造することができる。本発明の方法により製造された樹状細胞は、免疫誘導能の増加を示すだけでなく、優れた抗がん効果を発揮することができ、抗腫瘍ワクチン又は腫瘍治療用組成物に有効に使用することができる。

Claims

成熟化因子を処理して培養した樹状細胞に細胞透過能を有するペプチドと結合した抗原を感作させる段階を含む、樹状細胞の製造方法。
前記細胞膜透過能を有するペプチドは、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＴＰ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
前記成熟化因子は、インターロイキン‐１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１β；ＩＬ‐１β）、インターロイキン‐６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐６；ＩＬ‐６）、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ‐α；ＴＮＦ‐α）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ‐γ）、プロスタグランジンＥ‐２（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ２；ＰＧＥ２）、ピシバニール（Ｐｉｃｉｂａｎｉｌ；ＯＫ‐４３２）、ポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）、ｍＴＯＲ阻害剤及びこれらの二つ以上の組み合わせからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、ＮＶＰ‐ＢＥＺ２３５、ＳＦ‐１１２６、ＸＬ‐７６５、ＰＫＩ‐５８７、ＰＦ‐０４６９１５０２、ＰＫＩ‐４０２、ＯＳＩ‐０２７、ＡＺＤ‐８０５５、ＰＰ‐２４２、ＰＰ‐３０、ｔｏｒｉｎ‐１、ＷＹＥ‐１２５１３２、ＷＡＹ‐６００、ＷＹＥ‐６８７、ＷＹＥ‐３５４、ＫＵ‐００６３７９４及びパロミド‐５２９からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンであることを特徴とする請求項３に記載の製造方法。
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、１〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度で処理することを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
前記ラパマイシンは、１〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で処理することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
前記成熟化因子処理後１〜４８時間に抗原感作させることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
前記抗原感作は８時間以下の間行うことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ４０の発現水準が、未成熟樹状細胞に比べ６０％以上増加した時、樹状細胞に抗原を感作させることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
請求項１〜１０の中何れか一項に記載の方法により製造された樹状細胞。
請求項１１に記載の樹状細胞を含む免疫治療剤。
請求項１１に記載の樹状細胞を含む抗腫瘍ワクチン。
請求項１１に記載の樹状細胞を含む腫瘍治療用の薬剤学的組成物。