CN113444688B - 用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导方法及组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养、免疫细胞抗病毒抗肿瘤领域，具体公开了一种用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导方法及组合物，该人树突状细胞诱导组合物包括由聚肌胞苷酸（polyI:C）和重组人白细胞介素1β（IL‑1β）组成的成熟人树突状细胞诱导组合物和由粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子（GM‑CSF）、重组人白细胞介素4（IL‑4）和干扰素β（IFN‑β）组成的不成熟人树突状细胞诱导组合物，通过基于该人树突状细胞诱导组合物的人树突状细胞诱导方法诱导培养3天，获得培养周期短、聚集性强、具有很强的诱导异体初始CD4+T细胞和CD8+T细胞功能的、可诱导抗原特异性CD8+T细胞的DC。并且利用该方法可大大缩短培养周期，获得高度功能性DC，作为临床细胞疫苗抗病毒、抗肿瘤的前期基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养、免疫细胞抗病毒抗肿瘤领域，特别涉及用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导方法及组合物。
背景技术
1人DC在适应性免疫应答中的作用
树突状细胞（DC）是人体功能最强的专职抗原提呈细胞，连接了固有免疫和适应性免疫。DC通过向抗原特异性T细胞递呈病原体来源的抗原来启动适应性免疫应答，在适应性免疫应答和自身耐受中起核心作用。DC为异质性群体，分为传统型DC(cDC)、浆细胞样DC(pDC)、单核细胞来源DC(moDC)、朗格汉斯细胞(LNs)。正常情况下DC处于未成熟和无功能状态，在外周组织中巡逻，利用先天免疫受体（包括Toll样受体）识别病原体，识别病原体后激活并迅速成熟，表现为共刺激分子CD80、CD86上调，促炎细胞因子TNF-α、IL-12上调。成熟后的DC迁移能力增强，以趋化因子上调为特征，迁移至引流淋巴结，充当抗原提呈细胞，通过主要组织相容性复合物(MHC)将抗原提呈给T细胞。DC的激活和成熟是驱动初始T细胞启动和效应分化的至关重要的条件；在DC活化不足的情况下，抗原呈递可能导致T细胞无反应并促进免疫耐受。因此寻找合适的DC刺激剂，使其充分分化成熟是激活机体适应性免疫应答的第一步。
2快速DC诱导方法研究现状
人DC通常只占血液造血细胞的不到1%，很难直接用于体外诱导抗原特异性CD8+T细胞。目前多数方法是从人外周血单个核细胞（PBMC）中分选，培养使其分化为成熟DC，该方法首次报道于1994年，是DC的经典培养体系：从人PBMC中分选出CD14+细胞，用GM-CSF和白介素4（interleukin-4, IL-4）培养5天获得不成熟DC，加成熟因子再培养1-2天，便可以获得成熟DC。为了缩短培养时间，后续又陆续报道了多种快速培养方法：有学者从人外周血分离CD14+细胞，用GM-CSF和IL-4培养24h后加入促炎介质（IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2）再培养24小时，或在培养时同时加入促炎介质培养48小时，可以得到与传统DC相比，表型、功能相近的DC。也有报道使用GM-CSF、IL-4联合IFN-α培养60h也可以诱导DC，这种DC能够促进T细胞增殖，诱导抗原特异性T细胞。还有研究报道了使用IFN-β或IL-4培养CD14+细胞5天，再加入TNF-α刺激后培养2天，获得的DC高表达CD11c和CD83，具有更强的促进异体CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的能力。还有学者报道人外周血 CD14+单核细胞在 IL-4 和 IFN-β 存在下培养 24h，然后添加鈅孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）或者 LPS 继续培养48h可以获得成熟DC（简称为4B-DC）。和传统培养的DC比较，4B-DC高表达抗原提呈分子（MHCclass I 和 MHC class II）和共刺激分子（CD80和CD86）。4B-DC具有更强的刺激同种异体CD8+T淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ的功能，可诱导流感特异性CD8+T细胞。
3人DC在肿瘤免疫疗法中的研究现状
DC激活T细胞的功能使其应用于肿瘤免疫疗法，即DC疫苗——在体外产生的自体DC与装载肿瘤抗原并注射回患者体内的免疫治疗，旨在增强患者本身对肿瘤的免疫反应。其优势在于低毒性风险，具有免疫原性，可激活其他免疫调节细胞的能力，如在抗癌机制中激活T细胞以外的自然杀伤细胞(natural killer, NK)细胞。1995年，Porgador等的临床前研究首次提出了使用自体骨髓衍生的树突状细胞进行可行的疫苗接种选择，为后期体外培养骨髓来源DC诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞奠定理论基础。但直到O'Neill等学者报道了成熟的moDC体外培养体系，装载有肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)的moDCs才真正被用于临床干预。目前已经成功诱导机体抗肿瘤免疫反应的DC培养平台有GM-CSF联合IL-4培养的moDC，GM-CSF、FLT3-L和TNF培养的CD34+干细胞，接种了自体单核细胞来源的多肽和keyhold limpet血青素(KLH)的pDC。大多数实验选择的是最容易取材于临床的CD14+外周血单核细胞来源的DC。1995年至2004年，第一批临床试验测试了GM-CSF 联合IL-4培养的moDC，以多种方式装载肿瘤抗原，用于促进肿瘤抗原特异性抗肿瘤T细胞免疫。根据已知的黑色素瘤的免疫原性，以及共同的肿瘤抗原如MART-1/Melan-A和gp100在黑色素瘤患者中进行了许多测试。作为DC疫苗早期试验的还有B细胞淋巴瘤，近年研究的疾病有急性髓细胞性白血病、骨髓瘤。试验对象大都是选择经过标准护理治疗后的晚期癌症患者，单次DC注射后，在接种疫苗的患者最快7天便可以检测到肿瘤特异性CD8+ T细胞反应。近年的DC疫苗研究取得了重要进展。Beatriz等使用质谱分析证实HLA-A*02:01在人类黑色素瘤中表达新抗原，错义突变是患者新抗原的来源之一，DC疫苗在晚期黑色素瘤患者中显示出新的HLAⅠ类限制性新抗原，接种DC疫苗拓宽了抗肿瘤免疫的抗原广度和克隆多样性。Duane等用强效抗原如破伤风/白喉(Td)类毒素对疫苗位点进行预处理，可以显著提高肿瘤抗原特异性DC的淋巴结归巢性和有效性。Yoshinari等使用热休克蛋白70 mRNA转染DC治疗丙型肝炎病毒相关肝细胞癌，诱导出具有肿瘤杀伤活性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其疗效和安全性为后续的临床试验奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导方法及组合物，基于该组合物的用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导方法诱导培育DC具有很强的功能性，诱导异体初始CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖，能够诱导抗流感病毒特异性T细胞和肿瘤特异性T细胞，培养时间短，从而克服传统培养方法周期长，诱导免疫应答的能力相对较弱的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导组合物，其包括：人树突状细胞诱导组合物和不成熟人树突状细胞诱导组合物；成熟人树突状细胞诱导组合物由聚肌胞苷酸（polyI:C）和重组人白细胞介素1β（IL-1β）组成；不成熟人树突状细胞诱导组合物由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、重组人白细胞介素4（IL-4）和干扰素β（IFN-β）组成。
优选的，上述技术方案中，polyI:C使用浓度为20μg/ml，IL-1β使用浓度为10ng/ml。
优选的，上述技术方案中GM-CSF使用浓度为50ng/ml，IL-4使用浓度为10ng/ml，IFN-β使用浓度为5×103U/ml。
优选的，上述技术方案中，用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导组合物还包括基础培养基，所述基础培养基由90%RPMI-1640培养基和10%胎牛血清组成。基础培养基由90%RPMI-1640培养基和10%胎牛血清组成。
本发明提供了一种基于人树突状细胞诱导组合物的人树突状细胞诱导方法，包括如下步骤：
S1.获取外周血单个核细胞；
S2.用基础培养基重悬外周血单个核细胞，并计数；
S3.调整外周血单个核细胞悬液中外周血单个核细胞浓度；
S4.在外周血单个核细胞悬液中加入不成熟人树突状细胞诱导组合物诱导培养，获得不成熟DC悬液；
S5.在不成熟DC悬液加入人树突状细胞诱导组合物诱导培养，获得成熟DC。
进一步，上述技术方案中，步骤S1具体操作内容为：
（1）使用采血用品和肝素钠抗凝管获取十八岁以上人体10ml外周血；
（2）准备生物安全柜和相关无菌操作用品；
（3）取同等体积1×PBS，将血液和PBS在离心管中充分混匀；
（4）分别向两个15ml的离心管中加入4ml LymphoprepTM淋巴细胞分离液，将10ml血液和PBS混合液沿管壁缓慢注入一15ml离心管，共两管；淋巴细胞分离液和混合液要有分层，离心：1500rpm,20min,离心调节升速4,降速4；
（5）配置CD14+细胞分选缓冲液：含有2mM EDTA和2%自体血浆的PBS；
（6）向两支新的15ml离心管中各加入9ml缓冲液，回收人单个核细胞，和缓冲液混匀，离心：1500rpm，5min；
（7）弃上清，将两管细胞合成一管，用10ml缓冲液重悬细胞，轻轻混匀，离心：1500rpm，5min；
（8）弃上清，用10ml缓冲液重悬，细胞计数，离心：1000rpm，8min；
（9）弃上清，用100μl缓冲液重悬，转移至分选管，重复操作一次；
（10）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中的-抗人CD14抗体30μl，室温孵育10min；
（11）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中磁珠30μl，室温孵育3min；
（12）准备EasySepTM 分选磁铁，分选管中加至2.5ml 缓冲液，将分选管放入磁铁，室温孵育3min，将上清吸出；
（13）将步骤（11）再重复两次，最后一次结束后将分选管从磁铁中取出。
优选的，上述技术方案中，步骤S3中外周血单个核细胞浓度调整至8×105~106/ml。
进一步，上述技术方案中，步骤S4中诱导培养具体为37℃，5％CO2饱和湿度的孵育箱培养48小时。
进一步，上述技术方案中，步骤S5中诱导培养具体为37℃，5％CO2饱和湿度的孵育箱培养24小时。
进一步，上述技术方案中，还提供了一种人树突状细胞诱导方法制备的抗病毒抗肿瘤的成熟的人树突状细胞。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明人树突状细胞诱导方法和传统培养方法相比，该培养方法下的DC具有很强的功能性，表现为诱导异体初始CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖。
2.本发明人树突状细胞诱导方法能够诱导抗流感病毒特异性T细胞和肿瘤特异性T细胞，可作为临床细胞疫苗抗病毒、抗肿瘤的前期基础。
3.本发明人树突状细胞诱导方法培养时间短，本发明人树突状细胞诱导培养2天获得不成熟DC，加成熟刺激后24小时即可获得成熟DC；传统DC培养方法培养5天获得不成熟DC，加成熟刺激后48小时获得成熟DC。
附图说明
图1本发明人树突状细胞诱导培养方法培养的DC和传统方法培养DC诱导异体初始CD4+T细胞增殖的比较图。
图2本发明人树突状细胞诱导培养方法培养的DC和传统方法培养DC诱导异体初始CD8+T细胞增殖的比较图。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 成熟DC诱导培养
（1）使用采血用品和肝素钠抗凝管获得无疾病十八周岁以上志愿者10ml外周血。
（2）准备生物安全柜和相关无菌操作用品。
（3）取同等体积1×PBS，将血液和PBS在离心管中充分混匀。
（4）分别向两个15ml的离心管中加入4ml LymphoprepTM淋巴细胞分离液，将10ml血液和PBS混合液沿管壁缓慢注入一15ml离心管，共两管。淋巴细胞分离液和混合液要有分层。离心：1500rpm,20min,离心调节升速4,降速4。
（5）配置CD14+细胞分选缓冲液：含有2mM EDTA和2%自体血浆的PBS。
（6）向两支新的15ml离心管中各加入9ml缓冲液，回收人单个核细胞，和缓冲液混匀。离心：1500rpm，5min。
（7）弃上清，将两管细胞合成一管，用10ml缓冲液重悬细胞，轻轻混匀，离心：1500rpm，5min。
（8）弃上清，用10ml缓冲液重悬，细胞计数。离心：1000rpm，8min。
（9）弃上清。用100μl缓冲液重悬，转移至分选管，重复操作一次。
（10）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中的-抗人CD14抗体30μl，室温孵育10min。
（11）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中磁珠30μl，室温孵育3min。
（12）准备EasySepTM 分选磁铁，分选管中加至2.5ml 缓冲液，将分选管放入磁铁，室温孵育3min，将上清吸出。
（13）将步骤（11）再重复两次，最后一次结束后将分选管从磁铁中取出，用1ml基础培养基重悬细胞，计数。
（14）将细胞浓度调整至8×105-106/ml ，48孔板种板，每孔500μl细胞悬液。
（15）每孔加入GM-CSF（50ng/ml）、IL-4(10ng/ml)、IFN-β（5×103U/ml）,用37℃、5％CO2饱和湿度的孵育箱培养48小时，获得不成熟DC。
每孔加入polyI:C（20μg/ml）和IL-1β（10ng/ml），在37℃、5％CO2饱和湿度的孵育箱培养24小时，获得成熟DC。
实施例2 与传统成熟DC培养方法比较
1.传统方法成熟DC培养
（1）使用采血用品和肝素钠抗凝管获得无疾病十八周岁以上志愿者10ml外周血。
（2）准备生物安全柜和相关无菌操作用品。
（3）取同等体积1×PBS，将血液和PBS在离心管中充分混匀。
（4）分别向两个15ml的离心管中加入4ml LymphoprepTM淋巴细胞分离液，将10ml血液和PBS混合液沿管壁缓慢注入一15ml离心管，共两管。淋巴细胞分离液和混合液要有分层。离心：1500rpm,20min,离心调节升速4,降速4。
（5）配置CD14+细胞分选缓冲液：含有2mM EDTA和2%自体血浆的PBS。
（6）向两支新的15ml离心管中各加入9ml缓冲液，回收人单个核细胞，和缓冲液混匀。离心：1500rpm，5min。
（7）弃上清，将两管细胞合成一管，用10ml缓冲液重悬细胞，轻轻混匀，离心：1500rpm，5min。
（8）弃上清，用10ml缓冲液重悬，细胞计数。离心：1000rpm，8min。
（9）弃上清。用100μl缓冲液重悬，转移至分选管，重复操作一次。
（10）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中的-抗人CD14抗体30μl，室温孵育10min。
（11）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中磁珠30μl，室温孵育3min。
（12）准备EasySepTM 分选磁铁，分选管中加至2.5ml 缓冲液，将分选管放入磁铁，室温孵育3min，将上清吸出。
（13）将步骤（11）再重复两次，最后一次结束后将分选管从磁铁中取出，用1ml基础培养基重悬细胞，计数。
（14）将细胞浓度调整至8×105-106/ml ，48孔板种板，每孔500μl细胞悬液。
（15）每孔加入GM-CSF（50ng/ml）和IL-4(10ng/ml),在37℃、5％CO2饱和湿度的孵育箱培养5天，获得不成熟传统型DC。
（16）每孔加入polyI:C（20μg/ml）和IL-1β（10ng/ml），用37℃、5％CO2饱和湿度的孵育箱培养48小时，获得成熟传统型DC。
2.实施例1中DC培养方法培养的DC（G4B-DC）和传统方法培养DC（G4-DC）诱导异体初始CD4+T细胞增殖的比较
G4B-DC 和G4-DC与人外周血同种异体初始CD4+T细胞分别按照1：2，1：10，1：50的比例共培养。CFSE标记初始CD4+T细胞，种板于96孔U底板，细胞在含有20U/ml IL-2的RPMI1640培养基中培养6天。第7天使用流式细胞术检测CFSE标记的初始CD4+T细胞增殖情况，结果如图1所示，图中两Donor A和Donor B分别表示取不同人外周血重复实验结果，由图可知本发明DC培养方法培养的DC（G4B-DC）诱导异体初始CD4+T细胞增殖较为突出，并且效果稳定，传统方法培养DC（G4-DC）诱导异体初始CD4+T细胞增殖较弱。
3.实施例1中DC培养方法培养的DC（G4B-DC）和传统方法培养DC（G4-DC）诱导异体初始CD8+T细胞增殖的比较
G4B-DC 或G4-DC与人外周血同种异体CD8+T细胞分别按照1：2，1：10，1：50的比例共培养。CFSE标记CD8+T细胞，种板于96孔U底板，细胞在含有20U/ml IL-2的RPMI1640培养基中培养6天。第7天使用流式细胞术检测CFSE标记的CD8+T细胞增殖情况，结果如图2所示，图中两Donor A和Donor B分别表示取不同人外周血重复实验结果，由图可知本发明DC培养方法培养的DC（G4B-DC）诱导异体初始CD8+T细胞增殖较为突出，并且效果稳定，传统方法培养DC（G4-DC）诱导异体初始CD4+T细胞增殖较弱。
综上所述，通过人树突状细胞诱导方法诱导培养3天，获得培养周期短、聚集性强、具有很强的诱导异体初始CD4+T 细胞和CD8+T细胞功能的、可诱导抗原特异性CD8+T细胞的DC。并且利用该方法可大大缩短培养周期，获得高度功能性DC，作为临床细胞疫苗抗病毒、抗肿瘤的前期基础。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导组合物，其特征在于，包括：成熟人树突状细胞诱导组合物和不成熟人树突状细胞诱导组合物；所述成熟人树突状细胞诱导组合物由聚肌胞苷酸和重组人白细胞介素1β组成；所述不成熟人树突状细胞诱导组合物由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4和干扰素β组成；所述聚肌胞苷酸使用浓度为20μg/ml，所述重组人白细胞介素1β使用浓度为10ng/ml；所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子使用浓度为50ng/ml，所述重组人白细胞介素4使用浓度为10ng/ml，所述干扰素β使用浓度为5×103U/ml。
2.根据权利要求1所述的一种用于抗病毒抗肿瘤的快速人树突状细胞诱导组合物，其特征在于，所述组合物还包括基础培养基，所述基础培养基由90%RPMI-1640培养基和10%胎牛血清组成。
3.一种基于权利要求2所述人树突状细胞诱导组合物的人树突状细胞诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.获取外周血单个核细胞；
S2.用基础培养基重悬外周血单个核细胞，并计数；
S3.调整外周血单个核细胞悬液中外周血单个核细胞浓度；
S4.在外周血单个核细胞悬液中加入不成熟人树突状细胞诱导组合物诱导培养，获得不成熟DC悬液；
S5.在不成熟DC悬液加入成熟人树突状细胞诱导组合物诱导培养，获得成熟DC。
4.根据权利要求3所述的人树突状细胞诱导方法，其特征在于，所述步骤S1具体操作内容为：
（1）使用采血用品和肝素钠抗凝管获取十八周岁以上人体10ml外周血；
（2）准备生物安全柜和相关无菌操作用品；
（3）取同等体积1×PBS，将血液和PBS在离心管中充分混匀；
（4）分别向两个离心管中加入4ml LymphoprepTM淋巴细胞分离液，将10ml血液和PBS混合液沿管壁缓慢注入一离心管，共两管；淋巴细胞分离液和混合液要有分层，离心：1500rpm，20min，离心调节升速4，降速4；
（5）配置CD14+细胞分选缓冲液：含有2mM EDTA和2%自体血浆的PBS；
（6）向两支新的15ml离心管中各加入9ml缓冲液，回收人单个核细胞，和缓冲液混匀，离心：1500rpm，5min；
（7）弃上清，将两管细胞合成一管，用10ml缓冲液重悬细胞，轻轻混匀，离心：1500rpm，5min；
（8）弃上清，用10ml缓冲液重悬，细胞计数，离心：1000rpm，8min；
（9）弃上清，用100μl缓冲液重悬，转移至分选管，重复操作一次；
（10）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中的-抗人CD14抗体30μl，室温孵育10min；
（11）加入EasySepTMCD14阳性分选试剂盒中磁珠30μl，室温孵育3min；
（12）准备EasySepTM分选磁铁，分选管中加至2.5ml缓冲液，将分选管放入磁铁，室温孵育3min，将上清吸出；
（13）将步骤（11）再重复两次，最后一次结束后将分选管从磁铁中取出。
5.根据权利要求3所述的快速人树突状细胞诱导方法，其特征在于，所述步骤S3中外周血单个核细胞浓度调整至8×105~106/ml。
6.根据权利要求3所述的人树突状细胞诱导方法，其特征在于，所述步骤S4中诱导培养具体为37℃，5%CO2饱和湿度的孵育箱培养48小时。
7.根据权利要求3所述的人树突状细胞诱导方法，其特征在于，所述步骤S5中诱导培养具体为37℃，5%CO2饱和湿度的孵育箱培养24小时。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110706316.2A CN113444688B (zh) | 2021-06-24 | 2021-06-24 | 用于抗病毒抗肿瘤的人树突状细胞诱导方法及组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
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