KR101946572B1 - 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법과, 상기 방법에 의해 제조된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 이를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.
Description
본 발명은 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 제조방법과, 상기 방법에 의해 제조된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 이를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
면역 체계에 있어서 면역 반응과 면역 관용 반응은 상호 조화와 균형을 이루어야 한다. 과다 면역 반응이 일어나는 경우, 예를 들면, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병의 자가 면역 질환과 패혈증 및 과민성 알레르기 질환 등이 발생할 수 있으며, 이들은 사람의 생존과 삶의 질에 매우 큰 영향을 준다.
기존에는 수지상 세포가 면역 반응을 유도함에 있어서만 중요한 축으로 작용한다고 생각하였으나, 최근에는 면역 관용 반응에도 큰 기여를 한다는 사실이 알려짐에 따라 그에 대한 연구가 활발해지고 있다.
수지상 세포는 선천성 면역뿐만 아니라, 후천적인 인과에 의해 선택적으로 발생되는 획득 면역 조절에도 중추적인 역할을 담당하는 세포로서, 구체적으로는 T 세포에 외부에서 침입한 항원의 정보를 제시하는 기능을 수행하는 대표적인 항원 제시 세포의 일종이다.
또한, 상기 수지상 세포는 선천 면역과 후천 면역의 다리 역할을 하는 세포로, 면역 세포 중에서 원시 T 세포(naive T cells)의 프라이밍(priming)을 할 수 있는 유일한 세포에 해당한다. 이는 림프계 조직을 비롯하여 여러 조직의 각 조직 세포 간극에서 나뭇가지 모양으로 존재한다. 또한, 상기 수지상 세포는 최종적으로 분화된 세포로, 체내 전체 면역 세포의 1% 이하로 존재하지만, 단핵구나 대식세포에 비해 훨씬 강력하게 림파구의 활성을 유도할 수 있는 세포이며, 골수에서 기원해서 미성숙한 형태로 혈류를 거쳐 체내 모든 기관으로 이동할 수 있다. 이로 인해 수지상 세포는 각 조직 주변의 항원을 채집하여 림프 기관으로 이동해 T 림프구에 항원을 전달하여 T 세포 활성화에 중요한 역할을 담당할 수 있다.
이에 따라, 최근에는 상기 수지상 세포를 면역 백신 또는 면역 치료제로 사용하고 있으며, 상기 면역 백신이나 면역 치료제는 모두 부작용이 없이 안전하다고 알려져 다양한 질환에 대하여 그 사용이 확대되고 있는 추세이다.
한편, 상기 수지상 세포는 근원(origin), 표현형(phenotype) 및 기능(function) 등에 따라 다양한 부분 모집단(subpopulations)으로 구성된다. 구체적으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoide dendritic cells, pDC)의 경우 다양한 병원균 유래 자극에 대응하여 I형 IFN을 높은 수준으로 생산할 수 있다. 이들은 표면 표현형에 의해 일반적인 수지상 세포(conventional Dendritic cells, cDC)와 구별된다. 상기 pDC는 B220를 발현하고, CD11c는 낮은 수준으로 발현하는 반면, cDCs는 CD11c 및 CD11b를 높은 수준으로 발현하지만, B220는 발현하지 않는다. 상기 pDC 및 cDC는 모두 조화로운 면역 반응의 효과적인 자극제로 작용할 수 있도록, 미성숙 수지상 세포가 성숙되는 과정에 의해 얻어진다.
상기한 바와 같이, pDC는 DNA 바이러스나 단일 가닥 RNA 바이러스에 의해 감염 시 대량의 I형 IFNs를 분비함으로써 면역 세포를 활성화시켜 바이러스 감염의 방어에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히 항원을 제시할 수 있는 성숙한 수지상 세포(maturated DCs, mDCs)를 강력하게 활성화시켜 T 세포에 의한 항바이러스 반응을 증폭시키는데 일조한다. 하지만, 체내에서 pDC의 분화나 역할에 대한 연구는 다른 수지상 세포에 비하여 미미한 실정이다.
최근에는 자가 면역 질환 치료용 수지상 세포의 활용이 두드러지고 있다. 자가 면역 질환은 만성 질환으로 전세계적으로 수십억 명의 환자가 있는 것으로 추산되고 있는 주요 질환이다. 수지상 세포의 면역을 주관하는 특정 유전자의 발현 조절이나 면역 관용 유발 물질 발굴을 통해 일관성 있게 면역 관용성을 유지 혹은 강화시킨 면역 관용성 수지상 세포의 제조 기술이 시급히 요구되고 있다. 특히, pDC가 다양한 자가 면역 질환 또는 감염성 질환에서 중요한 역할을 할 것이라는 연구가 많이 이루어지고 있지만 면역 관용성 pDC를 제작하는 체계적이고 표준화된 분화 방법이 알려지지 않았다.
본 발명의 일 목적은 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 대량으로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어, 일관적으로 면역 관용성을 보이는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 이용하여 면역 세포 중에서도 조절 T 세포로의 분화를 유도하고 작동 T 세포의 활성을 억제할 수 있는 세포 치료제를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 발명자들은 미성숙 수지상 세포(dendritic cells)에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리한 후 분화를 개시하거나, 혹은 상기 미성숙 수지상 세포를 분화하는 과정 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하는 경우, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 유도되는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하는 단계를 포함하는, 면역 관용성 수지상 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "수지상 세포 (dendritic cell, DC)"는 항원을 세포 내부로 흡수하여 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 복합체 또는 MHC 클래스 Ⅱ 복합체와 함께 다양한 항원 샘플을 T 세포에 제시하는 전문적 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)를 의미한다. 또한 본 발명에서의 수지상 세포는 Steinman et al., Annual Rev. Immunol. 9:271-296, 1991 및 Banchereau and Steinman Nature 392:245-252, 1998.에 기재된 수지상 세포의 전형적인 표현형과 특성을 갖는 세포를 의미한다. 수지상 세포는 면역원성(immunogenic) 및 면역 관용성(tolerogenic) 항원 제시 세포를 모두 포함하며, 성숙도에 따라 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells; "imDC"), 준성숙 수지상 세포(semimature dendritic cells; "smDC") 및 성숙 수지상 세포(mature dendritic cells; "mDC")로 분류할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "미성숙 수지상 세포"는 수지상 세포의 초기 성숙 단계에 발견되는 것으로, 단핵구 세포의 표면 표현형인 CD14를 발현하지 않으며, 또한, 공동 자극 분자 CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 어느 하나가 성숙 수지상 세포에 비해 낮은 수준으로 발현된다.
본 명세서에서 용어, "준성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포의 특성의 일부를 상실하고, 성숙 수지상 세포의 표현형의 일부 특성을 갖는 수지상 세포로서, 부분적으로 또는 불완전하게 성숙된 형태 및 표현형적 특성을 나타내는 수지상 세포를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "성숙 수지상 세포"는 미성숙 수지상 세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상 세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 Ⅱ, CD40, CD54, CD80, CD86 및 CD274의 발현이 높고, 항염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포(syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 수지상 세포 사이토카인의 증가된 생성을 발생시키는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 성숙 수지상 세포는 전형적으로 CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다.
다만, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제가 처리되는 수지상 세포는 분화가 되지 않은 미성숙 수지상 세포인 것이 바람직하다. 여기서 상기 미성숙 수지상 세포는 원시적인 수지상 세포(naive dendritic cells)를 포함할 수 있고, 포유류의 골수 등으로부터 분리 및 획득된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 면역 관용성 수지상 세포는 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells)"란 수지상 세포의 한 부류(subset)로, 1958년 Dr. Lennert와 Dr. Remmele에 의하여 사람의 림프절에서 형질 세포(plasma cell)의 형태를 조직학적으로 발견함으로써 처음 알려졌지만 B 세포 특이적 마커 (immunoglobulin)를 발현하지 않는다는 사실이 알려지면서 플라즈마사이토이드 T 세포(Plasmacytoid T cells)로 명명되다가, T 세포의 공통적 마커인 CD3를 발현하지 않으면서 골수계 항원(myeloid lineage antigen)과 MHC 클래스 Ⅱ를 발현한다는 사실이 알려지면서 플라즈마사이토이드 단핵구(plasmacytoid monocyte)로 명명되었다. 그 후, 수지상 세포의 고유 성질인 동종 이계 혼합 림프구 반응(allerogenic mixed lymphocyte reaction, MLR)을 유도할 수 있는 능력이 확인됨에 따라 다시 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 명명되고 있으며, 간단히 'pDC'로 표기하기도 한다.
본 명세서에서 용어, "면역 관용성"이란 특정 항원에 대하여 면역 반응을 나타내지 않는 상태뿐만 아니라, 면역 반응을 억제하는 상태를 의미한다. 따라서, 본 발명에서, 상기 "면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포"는 IL-10 등과 같은 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하고, IL-12p70 및 TNF-α 등의 염증성 사이토카인의 분비는 억제하며, 최근 면역 관용 유도분자들로 알려진 인돌아민-2,3 디옥시제네이즈(indoleamine-2,3 dioxygenase, IDO) 분자 및 면역 관용 유도 세포의 표면 분자인 CCR9이 높은 수준으로 발현되어, 조절 T 세포(regulatory T cells)의 분화를 유도하고, 작동 T 세포(effector T cells)의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에서는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 상기 톨 유사 수용체 작용제를 처리함으로써 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 안정적으로, 그리고 대량으로 제조할 수 있다. 여기서, 상기 '분화 개시 이전'이라 함은, 미성숙 수지상 세포에 분화 유도용 인자를 처리하기 이전의 시점을 포함할 수 있다. 또한, 상기 '분화 중'이라 함은 상기 미성숙 수지상 세포에 분화 유도용 인자를 처리하는 시점으로부터 상기 분화 유도용 인자에 의하여 분화가 완료되기 이전까지의 시점을 의미한다. 바람직하게는 분화 유도용 인자를 처리하는 시점으로부터 상기 처리 후 7일 이내의 시기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는, 상기한 바와 같이 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에만 처리되면 구체적인 시점을 특별히 제한하지 않는다. 다만, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 분화 개시 시점으로부터 7일(168시간), 5일(120시간) 또는 3일(72시간) 이내에 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전에 처리하는 경우, 상기 작용제를 처리한 시점으로부터 36시간, 바람직하게는 24시간 내에 분화 유도용 인자를 사용하여 미성숙 수지상 세포의 분화를 개시할 수 있으나, 역시 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 상기 톨 유사 수용체 작용제를 1회 이상 처리할 수 있으며, 구체적인 처리 횟수를 특별히 제한하지 않으나, 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점으로부터 7일, 5일 또는 3일 이내에 상기 톨 유사 수용체 작용제를 적어도 1회 처리할 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전에 처리하는 경우, 상기 미성숙 수지상 세포에 대하여 톨 유사 수용체 작용제를 적어도 1회 처리한 뒤, 어느 일 처리 시점으로부터 36시간 또는 24시간 이내에 상기 미성숙 수지상 세포의 분화를 개시하고, 그 분화 중에 선택적으로 1회 이상 추가로 처리할 수 있다.
여기서, 상기 "분화 개시"라 함은 미성숙 수지상 세포의 배양 배지에 분화 유도용 인자를 첨가하거나, 또는 분화 유도용 인자를 포함하는 배지에 미성숙 수지상 세포를 접종하여 배양하는 공정을 의미할 수 있으나, 분화 유도용 인자를 사용하여 미성숙 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.
본 명세서에서 용어, "톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)"는 병원체(pathogen) 유래 보존된 분자적 물질로, PAMPs(Pathogen associated molecular patterns)일 수 있다. 여기서, 상기 병원체로는 그람-양성 박테리움, 그람-음성 박테리움, 균류 또는 바이러스가 될 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제는 손상되거나 또는 죽은 세포로부터 방출되는 내인성(endogenous) 분자들로, DAMPs(Damage associated molecular patterns)일 수 있다. DAMPs 또는 PAMPs는 TLR 신호를 통해 면역 응답을 개시하고 신호를 전달하기 위해 세포의 세포질 내에서 어댑터 분자들을 모으게 된다. 상기 톨 유사 수용체 작용제는 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 톨 유사 수용체와 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는 PAMPs 또는 DAMPs의 유도체가 될 수 있다. 상기 톨 유사 수용체 작용제인 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그 또는 유도체는 TLR 효능제의 아미노산의 최소한 30~99% 동일하며 톨 유사 수용체-중재에 의한 활성화를 유도하게 된다.
본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포에 처리되는 톨 유사 수용체 작용제의 종류는 특별히 제한하지 않으나, PAMPs 리간드인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 시그널을 경유할 수 있는 것이 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제로는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 하기 표 1에 나타낸 리간드 중 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, 수지상 세포의 톨 유사 수용체에 결합할 수 있는 것으로, MyD88 시그널을 경유할 수 있는 리간드라면 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제로 TLR2 작용제를 사용하는 경우, 그 보조 수용체(co-receptor)로 작용하는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 1종 이상을 추가로 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제의 구체적인 예시로는 하기 표 1에 나타낸 리간드일 수 있으나, 상기 TLR2 작용제의 보조 수용체로서 작용할 수 있는 리간드라면 특별히 제한하지 않는다.
| 리간드 | PAMPs(Pathogen Associated Ligands) | 리간드 유래 호스트 (Ligand natural host) |
합성 리간드 |
| TLR1 | 다양한 트리아실 리포펩티드(multiple triacyl lipopeptides) | 박테리아 | Pam3Cys-* |
| TLR2 | 다양한 글리코리피드(multiple glycolipids) | 박테리아 | CFA |
| 다양한 리포펩티드(multiple lipopeptides) | 박테리아 | Pam3, MALP2-** | |
| 다양한 리포프로테인(multiple lipoproteins) | 박테리아 | Pam2Cys** | |
| 리포테이코산(lipoteichoic acid) | 그람 양성 박테리아 | FSL-1 | |
| HSP 70, 또는 다른 열 충격 단백질(other heat shock proteins) | 숙주 세포(host cells) | Hib-OMPC | |
| 지모산(zymosan) (Beta- glucan) | 균류 (fungi) | ||
| 단백질 | 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) |
Rv1411c 단백질, ESAT-6, PE/PPE Protein, Rv0577 | |
| TLR3 | 이중 가닥 RNA(double stranded RNA) | 바이러스 | Poly (I: C); 저분자량 또는 고분자량 Poly (A: U) |
| TLR4 | 리포다당류(lipopolysaccharides, LPS); or IPS 유사체(MPLA) | 그람 음성 박테리아 | AGP |
| 열 충격 단백질 | 박테리아 및 숙주 세포 | MPLA | |
| 피브리노겐(fibrinogen) | 숙주 세포 | RC-529 | |
| 헤파린 황산 프레그먼트(heparin sulfate fragments) | 숙주 세포 | MDF2B | |
| 히알루론산 프레그먼트(hyaluronic acid fragments) | 숙주 세포 | CFA | |
| 니켈(nickel) | |||
| 다양한 오피오이드 약제(Various opoid drugs) | |||
| 단백질 | 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis) |
RpfE, RpfB, Rv2299c, HBHA | |
| TLR5 | 플라젤린(Flagellin) | 박테리아 | 플라젤린 |
| TLR6 | 다양한 디아실 리포펩티드(multiple diacyl lipopeptides) | 마이코플라즈마 (mycoplasma) |
FSL1-** Pam2Cys** MALP2-** |
| TLR7 | 바이러스 ssRNA(인플루엔자, VSV, HIV, HCV) | RNA 바이러스 | 구아노신 아날로그 (guanosine analogs); 이미다조퀴놀린 (imidazoquinolines) (e.g. 이미퀴모드(Imiquimod), Aldara ® R848, 레시퀴모드(Resiquimod)®), 록소리빈(loxoribine) |
| TLR8 | 작은 합성 화합물(small synthetic compounds); 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA) | RNA, 인간 및 바이러스 | 이미다조퀴놀린; 록소리빈; ssPolyU, 3M-012 |
| TLR9 | 비메틸화된 CpG 올리고뉴클레오티드 DNA(Unmethylated CpG Oligodeoxynucleotide DNA); DNA; dsDNA 바이러스(HSV, MCMV); 헤모조인(Hemozoin)(Plasmodium) | 박테리아, DNA 바이러스 | CpG-올리고뉴클레오티드, 합성된 다양한 서열들(e.g. CpG-ODN 2006, 1826, 2395) |
| TLR10 | |||
| TLR11 | 프로필린(Profilin) | 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) | |
| TLR12 | 프로필린(Profilin) | 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii) | |
| TLR13 | 박테리아 리보솜 RNA 서열 (bacterial ribosomal RNA sequence) "CGGAAAGACC" |
바이러스, 박테리아 | |
| * TLR1 및 TLR2에 의해 인식되는 리간드 ** TLR2 및 TLR6에 의해 인식되는 리간드 |
|||
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는 미생물, 바이러스, 식물 또는 동물 유래일 수 있고, 합성된 것일 수 있으며, 근원을 특별히 제한하지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 사용하여 수행될 수 있다. 여기서, 상기 분화 유도용 인자로는 FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)를 사용하는 것이 바람직하지만, 상기 미성숙 수지상 세포를 플라즈마사이토이드 수지상 세포 및 일반적인 수지상 세포(conventional plasmacytoid cells, cDCs)로의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.
또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 포함하는 배지에 상기 미성숙 수지상 세포를 배양하거나, 상기 미성숙 수지상 세포의 배양 배지에 상기 분화 유도용 인자를 첨가하며 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 선택적으로 상기 분화 유도용 인자는 상기 미성숙 수지상 세포를 분화하는 과정 중에 1회 이상 추가로 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)"는 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitors)를 활성화시켜 사이토카인 및 성장 인자로서의 기능을 수행하는 내인성 저분자에 해당한다.
또한, 본 발명에서 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 기간은 특별히 제한하지 않으며, 사용되는 배지의 종류 및 환경에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 7일 내지 10일 동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 8일 내지 9일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 미성숙 수지상 세포로부터 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리함으로써 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 면역 관용성을 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 분화 완료된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 활성화 시킴에 있어 사용되는 톨 유사 수용체의 종류는 특별히 제한하지 않으며, TLR1 작용제, TLR2 작용제, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR5 작용제, TLR6 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, TLR9 작용제, TLR11 작용제, TLR12 작용제 및 TLR13 작용제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 TLR9 작용제를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 공정을 통해 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이에 따라, 미성숙 수지상 세포를 이용하여 간단하고 용이한 공정을 통해 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 안정적으로 공급할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 방법으로 제조된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 얻어진 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 조절 T 세포의 분화를 유도하고 작동 T 세포의 활성은 억제하여 면역 반응을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어, "세포 치료제"란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포 치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 생체 내 면역 반응의 억제 혹은 면역 반응의 항진 등 면역 반응 조절을 위한 면역 세포 치료제이며, 두 번째는 조직 재생 혹은 장기 기능 회복을 위한 줄기세포 치료제인데, 본 발명에서 제공하는 세포 치료제는 상기 면역 세포 치료제일 수 있다.
본 발명에서 상기 세포 치료제는 조절 T 세포의 분화를 유도하거나 그 활성을 촉진하기 위하여 사용될 수 있고, 특히 면역 반응을 효과적으로 억제함에 따라 자가 면역 질환, 과민성 면역 질환 및 다양한 알러지 질환을 예방 또는 치료하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포 치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에서 상기 세포 치료제는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 세포 치료제는 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 세포 치료제에 포함되는 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 함량(수)은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포 치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 예를 들면, 2x104cells/ml ~ 8x10７cell/ml의 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법에서 본 발명의 세포 치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 피하 또는 피 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제는 자가 면역 질환, 과민성 면역 질환 또는 알러지 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제로 사용될 수 있다. 이러한 경우에 신체 부위에 따라, 그 제형이 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지 크림, 영양 크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다. 또한, 각 제형에 의한 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포 이외의 다른 성분들은 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 미성숙 수지상 세포로부터 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 얻어진 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 항염증성 사이토카인의 발현은 유도하고, 염증성 사이토카인의 발현은 억제하며, 조절 T 세포로의 분화를 촉진함에 따라 자가 면역 질환, 과민성 면역 질환 또는 알러지 질환 등을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미성숙 수지상 세포에 대하여 분화 유도용 인자(Flt3L-containing media) 및 톨 유사 수용체 작용제(TLRs agonists) 처리 방법의 설계도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 분리를 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 나타낸 것이다.
도 3의 (b)는 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 수 대비 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에서 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(non)에서 사이토카인 IL-10의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 4에서 본 발명의 일 실시예에 따라 미성숙 수지상 세포에 대하여 처리되는 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 시점에 따라 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80 및 CD86의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 6에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 IDO, CCR9 및 PD-L1의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9의 (a)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 (b)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 8에서 야생형 수지상 세포(WT) 및 TLR2 넉아웃 마우스에서 분리한 수지상 세포(TLR2-/-)의 Rv1411c 단백질과의 결합 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 9에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질(O.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml))의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 10에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80, CD86 및 면역 관용 유도 분자(IDO, CCR9 및 PD-L1)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 T 세포의 증식 정도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 IFN-gamma의 분비 양상을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15의 (a)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15의 (b)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 실시예 13에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC)에 의하여 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 배양한 후, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 실시예 14에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질 및 Pam3)의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLR agonist)와, 미처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Non)의 수를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
단, 도 1 내지 17에서 *은 P<0.05, **은 P<0.01, ***은 P<0.005를 의미한다.
도 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 분리를 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 나타낸 것이다.
도 3의 (b)는 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 수 대비 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에서 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(non)에서 사이토카인 IL-10의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 4에서 본 발명의 일 실시예에 따라 미성숙 수지상 세포에 대하여 처리되는 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 시점에 따라 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80 및 CD86의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 6에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 IDO, CCR9 및 PD-L1의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9의 (a)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 (b)는 실시예 7에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Pam3)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 8에서 야생형 수지상 세포(WT) 및 TLR2 넉아웃 마우스에서 분리한 수지상 세포(TLR2-/-)의 Rv1411c 단백질과의 결합 정도를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 9에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질(O.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml))의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 사이토카인(IFN-α, IFN-β, TNF-α, IL-12p70, IL-10)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 10에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서 MHC complex 분자, CD80, CD86 및 면역 관용 유도 분자(IDO, CCR9 및 PD-L1)의 발현 양상을 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 T 세포의 증식 정도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 11에서 T 세포와, 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 혼합 배양한 후 IFN-gamma의 분비 양상을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15의 (a)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15의 (b)는 실시예 12에서 T 세포에 대하여 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)를 처리한 후 조절 T 세포의 증식률을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 실시예 13에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질)의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(RVc1411c-pDC)에 의하여 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 배양한 후, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 실시예 14에서 본 발명의 일 실시예에 따라 톨 유사 수용체 작용제(Rv1411c 단백질 및 Pam3)의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLR agonist)와, 미처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Non)의 수를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
단, 도 1 내지 17에서 *은 P<0.05, **은 P<0.01, ***은 P<0.005를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
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실시예
1] 톨 유사 수용체 작용제의
플라즈마사이토이드
수지상 세포로의 분화 조절 효과
미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화가 유도되는지 확인하기 위하여, 도 1에 나타낸 설계도를 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포(3×106cell/웰)를 6-웰 플레이트에서 접종한 뒤, 10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ng/ml FLT3L을 포함하는 RPMI 1640 1ml를 첨가하여 배양 및 분화를 개시하였다. 분화 개시 후 3일째에 Pam3를 100 내지 500ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 개시 후 5일이 경과하였을 때 상기의 RPMI 1640 1ml를 추가적으로 보충해준 후 8일까지 배양하였다. 배양 후 얻어진 세포들을 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리였다(도 2). 상기 톨 유사 수용체 작용제의 처리가 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화에 영향을 끼칠 수 있기 때문에 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 특이적으로 유도되는 표면 발현 분자들을 8일째에 확인하여 그 결과를 도 3의 (a)에 나타내었다. 또한, 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우(TLRs-pDC)에 있어서, 초기 미성숙 수지상 세포의 수 대비 8일 경과 후 얻어진 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수의 비율을 측정하여 그 결과를 도 3의 (b)에 나타내었다. 단, 상기 톨 유사 수용체 작용제의 분화 조절 효과를 확인하기 위하여 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여도 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었고, 분화 효율에 있어서도 미처리한 경우와 차이가 발생하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
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실시예
2] 분리된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 자극 및 사이토카인의 분비 양상 확인
상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 사이토카인 분비 양상을 확인하기 위하여, 분리한 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종한 뒤 ODN1826 (1 μg/ml)을 처리하여 자극하였다. 24시간이 경과한 후 얻어진 상층액을 분리하고, 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 사이토카인 분비 양상을 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 일반적으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 I형 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70가 강력하게 유도되었다. 하지만, 톨 유사 수용체 작용제(0.5 μg/ml)를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 ODN1826으로 자극하자 그 발현 수준이 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 면역 억제성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)에서 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 미성숙 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포와는 달리 면역 관용성을 갖는 것을 알 수 있었다.
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실시예
3] 다양한 톨 유사 수용체 작용제의 처리에 따른
플라즈마사이토이드
수지상 세포에서의 IL-10 분비 양상 확인
다양한 톨 유사 수용체 작용제의 면역 관용성 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제로는 하기 표 2에 나타낸 리간드를 사용하였다. 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 상층액만을 분리하여 면역 억제성 사이토카인 IL-10의 분비 양상을 효소면역정량법으로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(non)로 나타내었다.
| Non | TLR2 작용제 | TLR3 작용제 | TLR4 작용제 | TLR7 작용제 | TLR9 작용제 |
| 미처리 | Pam3 | Poly I:C | LPS | 이미퀴모드 | CpG-ODN |
도 5에서 보는 바와 같이, 다양한 톨 유사 수용체 작용제 중 MYD88 시그널을 경유하는 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR8 작용제로 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포만이 ODN1826으로 자극하자 IL-10의 발현 수준이 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 MYD88 시그널을 경유하는 톨 유사 수용체를 처리하는 경우 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 유도되는 것을 알 수 있었다.
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실시예
4] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 시점에 따른
플라즈마사이토이드
수지상 세포에서의 사이토카인 분비 양상 확인
톨 유사 수용체 작용제의 처리 시점에 따른 면역 관용성 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제를 분화 개시 시점(0 day treatment), 분화 개시일로부터 3일이 경과하였을 때(3 day treatment) 처리하였다. 총 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후 상층액만을 분리한 뒤 사이토카인의 분비 양상을 효소면역정량법으로 확인하여 그 결과를 그 결과를 도 6에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(no-treatment, non)로 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제를 분화 개시 시점(0 day treatment) 또는 분화 개시일로부터 3일째(3 day treatment)에 처리한 경우 모두, 미처리한 경우(no-treatment)에 비하여 I형 인터페론 (IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70의 발현은 억제되고, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 현저히 증가한 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여 톨 유사 수용체 작용제를 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점, 즉 분화 유도용 인자인 FLT3L과 동시에 처리하여도, 분화 중에 처리한 경우와 마찬가지로 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화가 유도되는 것을 알 수 있었다.
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실시예
5] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 공동 자극 인자 및
MHC
분자의 발현 확인
플라즈마사이토이드 수지상 세포를 포함한 수지상 세포는 외부 항원 인지 시 T 세포를 활성화시키기 위하여 MHC 분자들을 통해 항원을 제시하고, CD80 및 CD86과 같은 공동 자극 인자를 발현하여 상호작용을 촉진시킨다.
이에 따라, 상기 실시예 1에서 분리한 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 ODN1826으로 자극한 후 24시간 동안 배양한 뒤 상기 세포 표면 분자들의 발현 수준을 확인하였다. 먼저 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 표면 인자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences), 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor® 710, ebioscience)와 세포 표면 분자들에 특이적인 항-CD80 (v450, BD Biosciences), 항-CD86 (APC, ebioscience), 항-MHC-I (PE, ebioscience) 및 항-MHC-II (APC-eFluor®780, ebioscience) 항체를 4℃에서 30분간 처리한 후 유세포 분석기 LSRFortessa x-20 (BD Biosciences)를 통하여 분석하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 공동 자극 인자인 CD86과 외인성 항원 제시를 하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 높은 수준으로 발현되었으나, 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 반응을 보이지 않거나 감소하는 특징을 보여 주었다. 한편, 또 다른 공동 자극 인자 중 하나인 CD80과 내인성 항원이나 교차 항원 제시를 하는 MHC 클래스 I 분자는 톨 유사 수용체 작용제로 처리되어 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)가 처리되지 않은 세포(pDC)보다 더 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
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실시예
6] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 면역 관용 유도 분자의 발현 확인
일반적인 수지상 세포는 항원 제시를 통하여 T 세포 반응을 일으켜 후천성 면역 반응을 활성화시키지만, 일부 면역 관용성 수지상 세포의 경우 T 세포의 반응을 억제한다고 보고되고 있다. 이러한 면역 반응의 억제는 최근 다양한 면역 관용 유도 분자들로 예를 들면, PD-L1 및 IDO의 유도를 통해 이루어진다고 보고되고 있다. 또한 CCR9+pDCs은 조절 T 세포의 강력한 유도를 통하여 다양한 면역관용 현상을 유도할 수 있다고 보고되고 있다.
따라서, 이하에서는 상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 면역 관용 유도 분자들의 발현을 확인하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) 및 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor®710, ebioscience)과 면역 관용 유도 세포 표면 분자들인 항-PD-L1(PE, ebioscience) 및 항-CCR9 (FITC, ebioscience)과 같은 세포 표면 인자 항체를 4℃에서 30분간 처리하였다. 또한, 세포 내에서 유도되는 IDO의 발현을 측정하기 위해 고정(fixation)/침투(permeabilization) (BD Bioscience)를 4℃에서 30분간 처리한 후 항-IDO (eFluor® 660, ebioscience)를 염색하고 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 이용하여 발현 수준을 분석한 뒤 그 결과는 도 8에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 톨 유사 수용체 작용제로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 경우, ODN1826으로 자극하자 CCR9 및 IDO 분자 모두 미처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 비하여 발현양이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었고, CCR9의 경우는 비자극시에도 미처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 비하여 높은 발현 양상을 보였다.
이를 통하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 시 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 면역 관용성을 갖는 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 분화 유도된 것을 알 수 있었다.
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실시예
7] 톨 유사 수용체 작용제가 처리된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 조절 T 세포 유도 능력 확인
면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Tolerogenic pDC)는 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg)로의 분화를 유도하고, 작동 T 세포(effector T 세포)의 활성이나 증식을 억제한다고 보고되고 있다.
따라서, 이하에서는 톨 유사 수용체 작용제를 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)에 의한 조절 T 세포(Foxp3+CD4+ T cells)의 증식 여부를 확인하였다. 구체적으로, 동종이형 마우스에서 분리 후 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포를 상기 실시예 1에서 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)와 5:1의 비율로 5일 동안 혼합 배양하였다. 단, 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포로는, ODN1826로 자극(ODN +)된 플라즈마사이토이드 수지상 세포와 미자극(ODN -)된 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 사용하였다. 5일 배양 후, 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience)를 4℃에서 30분 동안 처리하고 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼(Transcription Factor Staining Buffer)(ebioscience)를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후, 항-Foxp3 (PE, ebioscience)로 처리한 뒤 조절 T 세포로의 증식 여부를 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 확인한 결과를 도 9의 (a)에 나타내었고, 조절 T 세포의 증식률을 계산하여 그 결과는 도 9의 (b)에 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 경우 조절 T 세포의 증식을 유도하지 못하였고, ODN1826로 자극(ODN +)하자 오히려 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 톨 유사 수용체 자극제로 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(TLRs-pDC)의 경우 ODN1826로 자극한 경우(ODN +)가 미자극한 경우(ODN -)보다 조절 T 세포의 증식이 현저하게 유도된 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화되어 조절 T 세포로의 분화 또한 효과적으로 유도함을 알 수 있었다.
[
실시예
8]
Rv1411c
단백질의 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성 확인
기존 보고에 따르면 결핵균 유래 단백질들은 다양한 톨 유사 수용체에 결합할 수 있다는 보고가 있다. 따라서, 이하에서는 TLR2 넉아웃 마우스와 야생형 마우스의 골수에서 분화시킨 수지상 세포와 Rv1411c 단백질의 결합을 확인하여 Rv1411c 단백질의 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성을 확인하였다.
구체적으로, 마우스 골수를 분리하여 적혈구를 제거한 뒤, 수지상 세포의 분화를 위하여 10% FBS, 1% 항생제 및 100ng/ml의 GM-CSF (granulocyte-macrophage-colony stimulating factor)가 함유된 RPMI1640 배양액을 사용하여 8일간 배양하였다. 8일 배양 후 야생형 수지상 세포(WT)와 TLR2 넉아웃 마우스(TLR2-/-)에서 분리한 수지상 세포 각각에 5 μg/ml의 Rv1411c 단백질을 처리한 후 2시간 동안 간헐적으로 섞어주어 단백질의 결합을 용이하게 하였다. 이후 Rv1411c 단백질에 표지된 His분자에 항원-항체 특이성을 가지는 항체로 염색하여 유세포 분석기를 사용하여 결합 정도를 측정하고, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 야생형 수지상 세포(WT)에서는 TLR2 넉아웃 수지상 세포(TLR2-/-)에 비하여 Rv1411c 단백질과의 결합이 증가한 것으로 확인되었으나, TLR2 넉아웃 수지상 세포(TLR2-/-)에서는 Rv1411c 단백질을 처리하였음에도 불구하고 처리하지 않은 실험군과 동일한 결합 정도를 확인할 수 있었다.
이를 통하여 Rv1411c 단백질은 TLR2 수용체에 결합하며 TL2 작용제로서 활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
[
실시예
9]
Rv1411c
단백질의 면역 관용성
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 분화
유도능
확인
상기 실시예 1과 동일한 공정으로 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 분화를 유도하되, 톨 유사 수용체 작용제로는 상기 실시예 8에서 톨 유사 수용체 작용제로서의 활성이 확인된 Rv1411c 단백질(O.1 ㎍/ml, 0.5 ㎍/ml)을 사용하였다. 8일 배양 후 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리하였다. 분리된 세포(5×105cell/ml)를 48웰 플레이트에 접종하고, ODN1826 (1 μg/ml)으로 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 얻어진 상층액을 분리하여 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 사이토카인 분비 양상을 확인한 결과를 도 11에 그래프로 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c(0.1㎍/ml)-pDC, Rv1411c(0.5㎍/ml)-pDC)를 ODN1826으로 자극하자 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 강력하게 유도되는 I형 인터페론(IFN-α 및 IFN-β)과 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-12p70의 발현이 농도 의존적으로 급격하게 감소하는 것을 볼 수 있었고, 면역 억제성 사이토카인인 IL-10은 농도 의존적으로 그 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여, Rv1411c 단백질로 처리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포와는 다르게 면역 관용성을 갖는 것을 알 수 있었으며, 상기 Rv1411c 단백질의 처리 농도와 비례하여 면역 관용성의 정도 또한 증가하는 것을 알 수 있었다.
[
실시예
10]
Rv1411c
단백질을 처리하여 분화 유도된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 공동 자극 인자,
MHC
분자 및 면역 관용 유도 분자의 발현 확인
상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질로 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포에서 표면 분자 및 효소의 발현 양상을 확인하였다.
먼저 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 표면 인자 발현 영향을 분석하기 위하여, 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 특이적인 마커들인 항-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) 및 항-PDCA-1 (PerCP-eFluor® 710, ebioscience)와, 항-CD80 (v450, BD Biosciences), 항-CD86 (APC, ebioscience), 항-MHC-I (PE, ebioscience) 및 항-MHC-II (APC-eFluor®780, ebioscience), 항-PD-L1(PE, ebioscience) 및 항-CCR9 (FITC, ebioscience)과 같은 세포 표면 인자 항체를 4℃에서 30분간 처리하였다. 또한 세포 내에서 유도되는 IDO의 발현을 측정하기 위하여 고정(fixation)/침투(permeabilization) (BD Bioscience)를 4℃에서 30분 동안 처리한 뒤, 항-IDO (eFluor® 660, ebioscience)를 처리한 후 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 분석하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, ODN1826 자극 시 Rv1411c 단백질로 미처리된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에서는 공동 자극 인자인 CD86과 외인성 항원 제시를 하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자가 높은 수준으로 발현되는 반면, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)는 반응을 보이지 않거나 감소하는 특징을 볼 수 있었다.
반면, 또 다른 공동 자극 인자 중 하나인 CD80과 내인성 항원이나 교차 항원제시를 하는 MHC 클래스 I 분자의 경우는, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)보다 더욱 높은 수준으로 발현되는 것을 볼 수 있었다.
또한, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 경우, ODN1826으로 자극(ODN +) 시 PD-L1, CCR9 및 IDO 분자 모두, 미자극한 경우(ODN -)에 비하여 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, CCR9과 PD-L1의 경우는 미자극 시(ODN -)에도 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 비하여 높은 발현 양상을 나타내는 것을 볼 수 있었다.
[
실시예
11]
Rv1411c
단백질을 처리하여 분화 유도된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 T 세포의 활성 억제
면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체 내에서의 가장 중요한 특징은 T 림프구의 활성을 억제하는 것이다. 이에, 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포가 T 세포의 증식과 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 동종이형 마우스에서 분리하여 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포(1.5×105cell/well)를 1X의 PMA/Ionomycin (ebioscience)을 통하여 자극을 주었다. 이러한 PMA/Ionomycin의 처리는 T 림프구의 증식 속도를 증가시키며, 인터페론 감마(IFN-gamma)의 분비를 촉진시키게 된다. 이러한 반응들이 이루어질 때 T 세포와 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 비율이 1:5가 되도록 혼합하여 3일간 배양하였다. 3일 후, 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience), 항-CD8 (Percp-cy5.5, ebioscience)를 처리하고, 4℃에서 30분간 염색하였다. 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통하여 T 세포의 증식 정도를 분석하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 또한, 상기 3일 배양 후 얻어진 상층액을 분리한 뒤 효소면역정량법(ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent assay)을 통해 IFN-gamma의 분비 양상을 확인하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 단, Rv1411c 단백질의 처리 효과를 확인하기 위하여, Rv1411c 단백질이 미처리된 것으로, ODN1826로 자극(ODN +) 또는 미자극된(ODN -) 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 비교예(pDC)로 나타내었다.
도 13에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)와 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC) 모두 T 세포의 증식을 유도하였지만, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)보다 CD4+ T 세포에 대한 증식 유도 능력이 훨씬 낮게 관찰되었다.
또한, 도 14에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)가 미처리된 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)에 비하여 낮은 수준으로 IFN-gamma의 분비를 유도하는 것을 볼 수 있었다.
[
실시예
12]
Rv1411c
단백질을 처리하여 분화 유도된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 조절 T 세포 분화 조절
동종이형 마우스에서 분리 후 CellTrace (Invitrogen)로 염색한 T 세포를 상기 실시예 9에서 Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC) 또는 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)와 그 비율이 10:1, 5:1 또는 1:1이 되도록 하여 5일 동안 배양하였다. 단, 상기 플라즈마사이토이드 수지상 세포로는 ODN1826로 자극된 것(ODN +)과 미자극 된 것(ODN -)을 사용하였다. 배양 후 5일 째에, 세포들에 항-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience)로 4℃에서 30분간 처리하고 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 (ebioscience)를 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 그 후 항-Foxp3 (PE, ebioscience)를 염색하여 유세포 분석기 LSRFortessa x-20을 통해 조절 T 세포로의 증식 여부를 확인하였고, 그 결과는 도 15의 (a)에 나타내었다. 또한, 조절 T 세포의 증식률을 계산하여 그 결과는 도 15의 (b)에 나타내었다.
도 15에서 보는 바와 같이, 일반적인 플라즈마사이토이드 수지상 세포(pDC)의 경우 조절 T 세포의 증식을 유도하지 못하였고, ODN1826로 자극하는 경우 오히려 조절 T 세포의 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 경우 ODN1826로 자극하자(ODN +) 미자극한 경우(ODN -)보다 조절 T 세포의 증식을 현저하게 유도함을 확인할 수 있었으며, T 세포 대비 플라즈마사이토이드 수지상 세포(Rv1411c-pDC)의 비율이 증가할수록 조절 T 세포의 증식률 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화시켜 조절 T 세포의 증식 또한 효과적으로 유도함을 알 수 있었다.
[
실시예
13]
Rv1411c
단백질을 처리하여 분화 유도된
플라즈마사이토이드
수지상 세포에 의한 작동 T 세포의 활성 억제
조절 T 세포는 면역 관용 수지상 세포를 유도하고 다른 T 세포의 증식을 억제한다고 보고되고 있다. 따라서 이하에서는 상기 실시예 12에 따라 Rv1411c 단백질에 의해 분화 유도된 T 세포의 조절 T 세포로서의 활성을 확인하였다.
먼저 마우스의 비장을 분리한 후 적혈구를 제거한 뒤 자기세포분류시스템(MACS)을 사용하여 CD4+, CD25- 작동 T 세포를 분리해 낸 후 증식 정도를 알아보기 위하여 보라색 증식 염색제(violet proliferation dye)로 염색하였다. 이후 분화된 T 세포를 CD4+, CD25- 작동 T 세포와 함께 항 CD3e와 항CD28 항체로 코팅된 웰에서 2일 동안 배양하였다. 그 결과, CD25- 작동 T 세포 대비 프라이밍된 T 세포의 비율에 대하여 T 세포 증식능의 변화를 측정하여 도 16에 그래프로 나타내었다.
도 16에서 보는 바와 같이, Rv1411c 단백질을 처리하여 분화 유도된 플라즈마사이토이드 수지상 세포 중 ODN1826으로 자극된 세포(Rv1411c-pDC(ODN))에 의하여 유도된 T 세포만이 작동 T 세포의 분화 정도를 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따라 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리한 경우 면역 관용성을 활성화시켜 작동 T 세포의 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
[
실시예
14] 톨 유사 수용체 작용제의 처리 후 분화 유도된
플라즈마사이토이드
수지상 세포의 획득 수율
C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 인산화 완충 수용액(Phosphate buffer saline, PBS)으로 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포(5×105/웰)를 6-웰 플레이트에서 접종한 뒤, 10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨 및 250 ng/ml FLT3L을 포함하는 RPMI 1640 1ml를 첨가하여 배양 및 분화를 개시하였다. 분화 개시 후 3일째에 톨 유사 수용체 작용제로 Rv1411c 단백질과 Pam3를 100 내지 500ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 개시 후 5일이 경과하였을 때 상기의 RPMI 1640 1ml를 추가적으로 보충해준 후 8일까지 배양하였다. 배양 후 얻어진 세포들을 플라즈마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 이용하여 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 85% 이상의 순도로 분리였다. 분리된 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수(TLR agonist)를 측정한 결과를 도 17에 그래프로 나타내었다. 단, 톨 유사 수용체 작용제의 처리 효과를 확인하기 위하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하지 않은 경우를 비교예(non)로 나타내었다.
도 17에서 보는 바와 같이, 미성숙 수지상 세포의 분화 중에 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우(TLR agonist), 미처리한 경우(Non)와 비교하여 분화 유도되는 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 수가 현저히 증가함을 볼 수 있었다.
이를 통하여, 미성숙 수지상 세포의 분화 시 톨 유사 수용체 작용제를 처리한 경우, 대량의 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포를 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (22)
- 미성숙 수지상 세포를 플라즈마사이토이드 수지상 세포로 분화시키는 단계에 있어서,
상기 미성숙 수지상 세포에 TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)를 처리하는 단계를 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)의 생체 외 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 이전 또는 분화 중에 처리되어, 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포로의 분화를 유도하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 미성숙 수지상 세포의 분화 개시 시점으로부터 분화 완료 이전에 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 수지상 세포의 분화는 분화 유도용 인자를 사용하여 수행되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 분화 유도용 인자는 FMS-유사 티로신 키네이즈 3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3L)인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 분화 유도용 인자는 상기 미성숙 수지상 세포에 1회 이상 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 톨 유사 수용체 작용제는 상기 분화 유도용 인자와 동시에 상기 미성숙 수지상 세포에 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 톨 유사 수용체 작용제는 1회 이상 처리되는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 톨 유사 수용체 작용제는 MyD88(Myeloid differentiation primary response gene 88) 시그널을 경유하는 것인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR1 작용제 및 TLR6 작용제 중 적어도 하나를 추가로 더 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 분화 유도된 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 추가로 처리하여 면역 관용성을 활성화시키는 단계를 더 포함하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제14항에 있어서,
상기 면역 관용성을 활성화시키기 위하여 사용되는 상기 톨 유사 수용체 작용제는 TLR9 작용제인, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체외 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 톨 유사 수용체 작용제는 Pam3(트리팔미토일-S-글리세릴), Rv1411c 단백질, LPS(lipopolysaccharides), 이미퀴모드(Imiquimod) 및 CpG-올리고뉴클레오티드(CpG Oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)로 구성된 군에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체 외 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포는 조절 T 세포의 증식 유도 효과, 작동 T 세포 활성 억제 효과, IL-10 발현 증대 효과, IFN-α 발현 감소 효과, IFN-β 발현 감소 효과, IFN-γ 분비 억제 효과, TNF-α 발현 감소 효과, IL-12p70 발현 감소 효과, MHC 클래스 Ⅰ 분자 발현 증대 효과, MHC 클래스 Ⅱ 분자 발현 감소 효과, CD4+ T 세포 증식 억제 효과, CD80 발현 증대 효과, CD86 발현 감소 효과, CCR9 분자 발현 증대 효과 및 IDO 분자 발현 증대 효과로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 면역 관용성 플라즈마사이토이드 수지상 세포의 생체 외 제조방법.
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