KR101946841B1 - 톨 유사 수용체 작용제를 이용한 수지상 세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 수지상 세포 및 그 용도 - Google Patents

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권기웅
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Abstract

본 발명은 (1) 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제 (toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계; 및 (2) 분화 유도된 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 제조 방법과, 이에 의해 제조된 수지상 세포 및 그 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 제조되는 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있고, 이에 따라 투여되는 객체의 면역원성을 높임으로써 항암 효과를 발휘하여 항 종양 백신 또는 종양 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

톨 유사 수용체 작용제를 이용한 수지상 세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 수지상 세포 및 그 용도{METHOD FOR PREPARING DENDRITIC CELL USING TOLL LIKE RECEPTOR AGONIST, DENDRITIC CELL PREPARED THEREBY, AND USE THEREOF}
본 발명은 톨 유사 수용체 작용제를 이용한 수지상 세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 수지상 세포 및 그 용도에 관한 것이다.
수지상 세포(dendritic cell)는 강력한 항원제시세포(professional antigen presenting cells; APC)로 체내 면역 유도 및 면역 조절에 중요한 역할을 담당한다.
인체 내의 수지상 세포는 전체 백혈구의 0.3%에 불과하지만 항원과 접한 적이 없는 원시 T 세포(naive T cell)를 활성화시켜 일차면역반응(primary immune response)을 유도할 수 있으며, 항원특이적인 후천성 기억 면역을 유도할 수 있는 면역 세포이다. 수지상 세포가 강력한 항원제시세포로서 역할을 할 수 있는 것은 세포 표면에 조직적합항원(MHC; major histocompatibility complex I/II) 뿐만 아니라, CD80 및 CD86와 같은 보조자극인자(co-stimulatory molecules)와 ICAM-1와 같은 세포 부착 분자(adhesion molecule)가 높이 발현되어 있고 T 세포 활성화 관련 다양한 사이토카인(cytokine; 인터페론, IL-12, IL-18 등)을 다량 분비하기 때문이다.
이와 같이, 수지상 세포가 항원 특이적인 T 세포 활성을 효과적으로 유도 혹은 조절할 수 있기 때문에 오랫동안 암 또는 난치성 면역 질환의 치료제로 사용 가능성이 연구되어 왔다. 조직 또는 혈액에서 직접 분리한 수지상 세포나, 단핵구에서 분화시킨 수지상 세포를 항원으로 감작시킨 후 성숙화된 수지상 세포를 체내에 다시 주입하면, 강력한 항원 특이적 세포독성임파구(CTL; cytotoxic T lymphocyte)를 유도한다는 사실이 밝혀짐으로써, 암 또는 감염성 질환의 치료용 백신으로서 개발 가능성이 오래 전부터 검토되어왔다(Inaba, K. et al., 3. Exp. Med., 178:479, 1993; Inaba, K. et al., Int. Rev.Immunol., 6:197, 1990; Hsu, F. et al., Nature Med., 2:52, 1996).
이러한 초기 연구 결과를 바탕으로 암 치료용 수지상 세포 치료제의 임상 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있으며 다양한 암종에서 결과가 보고되고는 있으나, 아직은 단독 치료요법으로는 임상적 효과가 기대에 못 미치는 실정이다.
수지상 세포 치료제가 아직까지 성공하지 못하고 있는 가장 중요한 이유는 종양세포의 낮은 면역 원성과 암세포가 분비하는 면역억제물질에 기인한 것으로 알려져 있다. 이 경우 수지상 세포가 보다 강력한 항암 면역을 유도하여 종양세포의 낮은 면역 원성을 극복하고 종양세포의 면역 억제능을 뛰어넘을 수 있는 항암 면역을 유도할 수 있다면 치료 효과를 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 목적은 미접촉 T 세포(naive T cell)를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있는 면역원성 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 제조된 수지상 세포를 포함하는 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 발명자들은 골수 세포(bone marrow cells)에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리하여 유도된 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)에 성장인자를 처리하는 경우 미접촉 T 세포(naive T cell)를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있는 면역원성 수지상 세포가 유도되는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, (1) 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계; 및 (2) 분화 유도된 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명에서는 상기 (1) 단계로, 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제를 처리하는 경우 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)로의 분화를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist)"는 병원체(pathogen) 유래 보존된 분자적 물질로, PAMPs(Pathogen associated molecular patterns)일 수 있다. 여기서, 상기 병원체로는 그람-양성 박테리움, 그람-음성 박테리움, 균류 또는 바이러스가 될 수 있다. 또한, 상기 톨 유사 수용체 작용제는 손상되거나 또는 죽은 세포로부터 방출되는 내인성(endogenous) 분자들로, DAMPs(Damage associated molecular patterns)일 수 있다. PAMPs 또는 DAMPs는 TLR 신호를 통해 면역 응답을 개시하고 신호를 전달하기 위해 세포의 세포질 내에서 어댑터 분자들을 모으게 된다. 상기 톨 유사 수용체 작용제는 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 톨 유사 수용체와 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는 PAMPs 또는 DAMPs의 유도체가 될 수 있다. 상기 톨 유사 수용체 작용제인 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그 또는 유도체는 TLR 효능제의 아미노산의 최소한 30~99% 동일하며 톨 유사 수용체-중재에 의한 활성화를 유도하게 된다.
본 발명에서 상기 골수 세포에 처리되는 톨 유사 수용체 작용제로는 세포 내부에 존재하는 톨 유사 수용체(intracellular Toll like receptor)의 작용제인 것이 바람직하나, 세포 내부에 존재하는 톨 유사 수용체의 작용제 중에서도 특히 톨 유사 수용체 7의 작용제 및 톨 유사 수용체 9의 작용제 중 1종 이상인 것이 본 발명에서 목적하는 특성을 갖는 수지상 세포의 분화 유도를 위하여 더욱 바람직하다.
본 명세서에서 용어, "세포 내부에 존재하는 톨 유사 수용체(intracellular Toll like receptor)"는 톨 유사 수용체를 세포 내 분포를 기준으로 분류할 때 세포 내부에 존재하는 것으로, 그 종류로는 톨 유사 수용체 3(TLR3), 톨 유사 수용체 7(TLR7), 톨 유사 수용체 8(TLR8) 및 톨 유사 수용체 9(TLR9)가 속한다. 상기한 세포 내부에 존재하는 톨 유사 수용체의 활성은 엔도솜/리소좀 구간으로의 전위에 의존하며, 그 활성을 위하여 엔도리소좀(endolysosomes) 내 산성 환경이 필수적으로 요구된다(Nishiya et al., J Biol Chem 280, 37107-17 (2005); Gibbard et al., J Biol Chem 281, 27503-11 (2006); and Ranjith-Kumar et al., J Biol Chem 282, 7668-78 (2007)). 상기 전위는 톨 유사 수용체 작용제의 노출 후 소포체 단백질 UNC93b와의 결합 후에만 발생한다(Tabeta et al., Nat Immunol 7, 156-64 (2006); Kim et al., Nature 452, 234-8 (2008); Brinkmann et al., J Cell Biol 177, 265-75 (2007); Latz et al., Nat Immunol 5, 190-8 (2004); and Park et al., Nat Immunol 9, 1407-14 (2008)).
본 명세서에서 용어, "톨 유사 수용체 7(TLR7)"은 선천 면역(innate immune)의 감지 체계를 구성하는 인자 가운데 하나로, TLR7 단백질은 세포막(cellular membrane)에 묻혀 있으면서 특정 자극에만 반응한다. 일단 특정 자극을 통해 TLR7이 활성을 획득하고 나면 면역계의 방어 기작을 가동시키는 경로가 본격적으로 작동하기 시작한다. 상기 TLR7의 주요 작용제는 이미퀴모드(imiquimod)로, 이는 TLR7의 활성 자극을 유도하는 생화학 제제이다. 1997년 2월 27일 미국 FDA의 승인을 받은 면역 항진 제제로 항바이러스제로 사용되며 주로 피부 외용으로 사용되고 있다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 7의 작용제는 이미퀴모드, 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines), GS-9620, GSK-2245035, 레시퀴모드(resiquimod), DSR-6434, DSP-3025, IMO-4200, MCT-465, 3M-051, SB-9922, 3M-052, 림톱(rimtop), TMX-30X, TMX-202 RG-7863, RG-7795, R848, 7-티아-8-옥소구아노신(7-thia-8-oxoguanosine), 7-데아자구아노신(7-deazaguanosine), 7-알릴-8-옥소구아노신(7-allyl-8-oxoguanosine) 및 7-데자구아노신(7-dezaguanosine)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 7 작용제로는 미국 특허출원공개 제2012-0294885호, 국제 특허출원공개 제2012-066335호, 국제 특허출원공개 제2012-066336호, 국제 특허출원공개 제2015-168279호 및 국제 특허출원공개 제2015-168269호 등에 기술된 다양한 톨 유사 수용체 7 작용제를 제한없이 사용할 수 있다.
하지만, 본 발명에서 사용되는 톨 유사 수용체 7 작용제로는 상기 열거한 종류로 특별히 제한되지 않으며, 톨 유사 수용체 7에 결합하고 TLR7 면역 반응을 자극하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "톨 유사 수용체 9(TLR9)"은 병원균 인식 및 선천적인 면역성의 활성화에서 근본적인 역할을 하는 톨-유사 수용체(TLR) 계열의 단백질을 지칭하며, B 세포, 단핵구, 큰포식 세포 및 형질세포성 수지상 세포의 엔도솜 구획에서 주로 발견된다(문헌[Galluzzi et al., OncoImmunology, 1:5, (2012) 699-716)). 상기 TLR9의 주요 작용제는 비메틸화된 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드의 상승된 빈도에 대한 포유동물 대응물이 상이한 세균/바이러스 DNA이다. CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(또는 CpG ODN)는 시티딘 트라이포스페이트 데옥시뉴클레오티드("C") 및 이어서 구아니딘 트라이포스페이트 데옥시뉴클레오티드("G")를 함유하는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자이다. "p"는, 일부 ODN이 변형된 포스포로티오에이트(PS) 골격을 갖더라도, 연속적인 뉴클레오티드 사이의 포스포다이에스터 연결기를 지칭한다. 이들 CpG 모티프가 비메틸화된 경우, 톨 유사 수용체 9에 결합하고 TLR9 면역 반응을 자극한다(문헌[Weiner, GJ; et al, PNAS 94 (1997) 10833-7]).
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 9의 작용제는 비메틸화된 시토신-포스페이트-구아노신(CpG) 모티프를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드(CpG ODN)일 수 있지만, 이의 다양한 변형체 또한 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 9 작용제로는 CpG, C*pG, CpG*, 및 C*pG*로 구성된 군으로부터 선택된 모티프를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 CpG 모티프를 포함하는 올리고데옥시뉴클레오티드일 수 있다.
여기서 상기 C는 2'-데옥시시티딘이고, C*은 이의 유사체이며, G는 2'-데옥시구아노신이고, G*은 이의 유사체이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오사이드간 연결기일 수 있다. 본 발명에서 상기 C*은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된아라비노시티딘, 2'-O-치환된아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-하이드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 G*은 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2'치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 CpG ODN은 면역-자극성 활성이 상이한 클래스 A(또는 "D"), B(또는 "K") 및 C로 분류될 수 있다(문헌[Krug A. et al., 2001, Eur J Immunol, 31(7): 2154-63]). 클래스 A CpG ODN은 자연살해세포의 강한 자극제이고 pDCs으로부터 알파-인터페론의 분비를 유도하며, 클래스 B CpG ODN은 B 세포와 수지상 세포의 강한 자극제이고, 클래스 C CpG ODN은 상기 클래서 A와 클래스 B의 특성을 모두 가지고 있다(Klinman, Nat Rev Immunol 2004; 4: 249-59; Krieg Curr Oncol Rep 2004; 6: 88-95).
본 발명에서 상기 클래스 A CpG ODN(문헌[Xueqing Liang,et al, Blood. 2010 June 17; 115(24): 5041-5052])은 CpG ODN 2216, CpG ODN 1585, CpG ODN 2336, CpG ODN PB4 및 CpG ODN 1002로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 클래스 B CpG ODN은 CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CpG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN BW006, CpG ODN D-SL01, CpG-28, CpG-685(GNKG168; CpG ODN; 에스비아이 바이오텍), CpG-684 및 CpG-7909(CPG-ODN 2006, PF-3512676, 아가톨리모드)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 클래스 C CpG ODN은 CpG ODN 2395, CpG ODN M362 및 CpG ODN D-SL03으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 9 작용제는 IMO-2055(이데라)(3'-3'-연결된 구조 및 합성 CpR(R = 2'-데옥시-7-데아자구아노신) 모티프로 이루어진 ODN)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 9 작용제는 dSLIM(등록상표) 기술(이러한 기술은 국제 특허출원공개 제2001/07055호에 기술됨)을 기초로 하는 CpG 모티프-함유 원형 ODN을 기제로 하는 올리고데옥시뉴클레오티드일 수 있으나(예컨대, 국제 특허출원공개 제2012/085291호에 기술된 몰로겐으로부터의 MGN-1703), 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 9 작용제는 문헌[Smith & Wickstrom (1998) J. Natl. Cancer Inst. 90:1146-1154]에 기술되어 있는 천연 발생 작용제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 9 작용제로는 미국 특허출원공개 제2009/0053206호, 미국 특허출원공개 제2008/0292648호, 미국 특허출원공개 제2007/0105800호, 미국 특허출원공개 제2010/0016250호, 미국 특허출원공개 제2009/0041809호, 국제 특허출원공개 제2007/7047396호, 국제 특허출원공개 제2007/7047396호, 국제 특허출원공개 제2010/088395호, 국제 특허출원공개 제03/035695호, 국제 특허출원공개 제2012/085291호, 국제 특허출원공개 제1998/018810호, 국제 특허출원공개 제2005/042018호, 국제 특허출원공개 제2008/073959호, 국제 특허출원공개 제2009/018431호, 국제 특허출원공개 제2007/084237호 등에 기술된 다양한 톨 유사 수용체 9 작용제를 제한없이 사용할 수 있으며, 그 외에도 1 상/2 상 임상 시험을 거치고 있는 선택적인 톨 유사 수용체 9 작용제인 IMO-2055, IMO-2125 및 IMO-2134(이데라 파마슈티칼스) 또한 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 톨 유사 수용체 9 작용제로는 상기 열거한 종류로 특별히 제한되지 않으며, 톨 유사 수용체 9에 결합하여 톨 유사 수용체 9의 면역 반응을 자극하는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 10 ng/ml 내지 5000 ng/ml 또는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml의 양으로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제는 골수 세포의 분화 개시 이전, 분화 개시 시점 또는 분화 중에 1회 이상 처리할 수 있으나, 바람직하게는 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리한 후, 분화 중에 1회 이상 처리할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 골수 세포의 분화는 성장인자를 포함하는 배지에 상기 골수 세포를 접종하여 5일 내지 10일, 5일 내지 7일, 또는 6일 동안 배양하며 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 골수 세포의 분화 개시 이전에 1회 이상 처리하는 경우, 상기 작용제를 처리한 어느 일 시점으로부터 36시간, 바람직하게는 24시간 내에 상기 골수 세포에 성장인자를 처리하여 분화를 개시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리하는 경우, 톨 유사 수용체 작용제 및 성장인자가 첨가된 배지에 골수 세포를 배양하며 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 톨 유사 수용체 작용제를 골수 세포의 분화 중에 처리하는 경우, 분화 개시 시점으로부터 3일(72시간) 또는 5일(120시간) 이내에 1회 이상 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "분화 개시"라 함은 골수 세포의 배양 배지에 성장인자를 첨가하거나, 또는 성장인자를 포함하는 배지에 골수 세포를 접종하여 배양하는 공정을 의미할 수 있으나, 성장인자를 사용하여 골수 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.
본 발명에서 상기 성장인자로는 골수 세포(myeloid cells)의 자극제로서, 바람직하게는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)일 수 있다.
본 발명에서 상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml, 10 ng/ml 내지 100 ng/ml 또는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml의 양으로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (1) 단계로, 성장인자를 사용하여 골수 세포의 분화를 개시하는 시점과 분화 중에, 톨 유사 수용체 7 작용제 및 톨 유사 수용체 9 작용제 중 1종 이상을 처리하는 경우, 상기한 골수 세포로부터 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1+ 세포 표현형을 가지는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)가 유도될 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 톨 유사 수용체 7 작용제 또는 톨 유사 수용체 9 작용제를 처리하여 유도된 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포는, 그 외의 다른 종류의 톨 유사 수용체 작용제(예를 들면, 톨 유사 수용체 2 작용제, 톨 유사 수용체 8 작용제 등)를 처리하여 유도된 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포와는 달리 PDCA-1의 발현 수준이 높고, CD124의 발현 수준은 낮으며, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 인터페론-γ(IFN-gamma)로 자극 시 NOS2, 알기나제-1(arginase-1, Arg-1) 및 IL-10를 두드러지게 높은 수준으로 발현하는 특성을 가진다.
본 발명에서는 상기와 같이 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포가 얻어지면, 상기 (2) 단계로, 상기 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml, 10 ng/ml 내지 100 ng/ml 또는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml의 양으로 처리될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 성장인자는 12시간 내지 7일 동안 처리될 수 있고, 바람직하게는 24시간 내지 5일, 보다 바람직하게는 3일 내지 5일 동안 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 (2)의 단계로, CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1+ 세포 표현형을 가지는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리함에 따라 면역원성(immunogenic) 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 얻어진 수지상 세포는 세포 표현형으로 CD64 및 CD115의 발현 수준이 높고, 지질다당류와 인터페론-γ로 자극 시 IL-12p70, TNF-α, IL-6, IL-10 및 NO2의 발현 수준이 유의적으로 증가한다. 또한, 본 발명의 수지상 세포로 T 세포를 자극하는 경우 T 세포의 INF-γ의 분비능이 증가되고, 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도하여 면역원성을 높일 수 있다.
이러한 특성을 바탕으로, 본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기 수지상 세포를 포함하는 면역 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역 치료제는 면역 반응을 증가시키거나, 특정 질병, 감염 또는 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 면역 반응의 일부를 선택적으로 상승시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 수지상 세포를 포함하는 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
종양에 잠재성 항원이 풍부하고 이러한 종양이 수지상 세포에 의해 제시되면 면역원성을 갖는다는 사실에 기초하여, 본 발명에 따른 수지상 세포는 종양 예방을 위한 항종양 백신 또는 종양 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 수지상 세포를 통해 객체의 면역원성을 증가시킬 수 있으므로, 이를 통해 객체 내 종양의 증식 및/또는 전이를 예방 또는 억제할 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 수지상 세포 백신의 항원으로는 막투과 펩타이드와 결합할 수 있는 모든 항원으로, 불활성화 종양세포, 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 종양세포 관련 유전자, 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 유전자 재조합 방법에 의해 상기 항원을 수득하고자 하는 경우, 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지일 수 있으며, 공지된 서열의 전장을 이용할 수 있으나, 전장의 일부를 이용할 수도 있다. 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 클로닝하여 목적하는 항원이 발현되도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 항종양 백신은 일회 투여함으로써 수행되는 면역화 방법과 연속 투여함으로써 수행되는 면역화 방법을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에서 상기 면역 치료제는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
본 발명의 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 수지상 세포를 포함할 수 있다. 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물에 포함되는 수지상 세포의 함량(수)은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포 치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 예를 들면, 2x104 cells/ml ~ 8x10７cell/ml의 수지상 세포가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 치료 방법에서 본 발명의 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물은 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 피하 또는 피 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 골수 세포로부터 면역원성의 수지상 세포를 효과적으로 유도할 수 있어, 대량의 면역원성 수지상 세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 공급되는 면역원성 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있고, 이에 따라 투여되는 객체의 면역원성을 높임으로써 항암 효과를 발휘하여 항종양 백신 또는 종양 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 TLR 작용제를 처리하는 3가지 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+ 세포의 유도 여부를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 처리되는 TLR 작용제의 농도별 CD11c+ 세포 비율의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스 각각의 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 유도 여부를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스 각각의 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c, CD11b, Gr-1, F4/80, Ly6C, CD4, CD8α, CD103, PDCA-1, B220, NK1.1 및 CD49b의 표현형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에서 CD11c+, CD11b+, Gr-1+, F4/80+, Ly6C+, CD4+, CD8α+, CD103+, PDCA-1+, B220+, NK1.1+ 및 CD49b+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, Gr-1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, Gr-1+CD11b+CD11c-, Gr-1highCD11b+CD11c- 및 Gr-1intCD11b+CD11c- 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, LyG 및 LyC의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c-CD11b+LyG+LyC-, CD11c-CD11b+LyG+LyCint, CD11c-CD11b+LyG-LyCint 및 CD11c-CD11b+LyG-LyChigh 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스로부터 추출한 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c-CD11b+LyG+LyC-, CD11c-CD11b+LyG+LyCint, CD11c-CD11b+LyG-LyCint 및 CD11c-CD11b+LyG-LyChigh 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 NO2의 형성 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 NOS2 및 아르기나아제-1의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 분선한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 IL-10의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 아르기나아제-1(Arg-1) 및 iNOS의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 아르기나아제-1(Arg-1) 및 iNOS의 발현 수준과, Arg-1/iNOS의 발현 수준의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 있어서, CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 있어서, CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 TNF-α, IL-6, IL-12p70 및 IFN-β의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포 억제능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포의 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 Foxp3의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 조절 T 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포에 있어서 CD11c 및 MHC-Ⅱ의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 M-CSF 처리를 하여 유도된 세포에 있어서 CD11b 및 F4/80의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 M-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 F4/80+CD11b+ 세포의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 T 세포에 처리한 후 FSC, CD11c 및 F40/80의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 T 세포에 처리한 후 처리 비율에 따른 T 세포의 증식율의 변화와, IFN-γ 분비율의 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 도 34에서 'complete'는 완전 배지로, 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지를 의미하고, 'GM-CSF'는 GM-CSF가 첨가된 완전 배지를 의미한다.
도 35는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포에서 CD11c+ 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6+ 세포 유래 수지상 세포에서 CD11c, PDCA-1, CD115, CCR2, MHC-Ⅱ, CD64, CD11b 및 Ly6C의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6+ 세포 유래 수지상 세포에서 Ly6C+, MerTK+, CD11b+, CCR2+ 및 PDCA-1+ 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 수지상 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6+ 세포 유래 수지상 세포를 LPS 및/또는 IFN-γ로 자극하면서 TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p70 및 NO2의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 수지상 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6+ 세포 유래 수지상 세포를 LPS 및/또는 IFN-γ로 자극하면서 IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-5 및 IL-17A의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 수지상 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6+ 세포 유래 수지상 세포를 CD4 T 세포에 처리한 후 T 세포 증식능과 IFN-γ의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제의 처리
C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용하여 대퇴부 골수 세포(whole bone marrow cells)를 채취하였다. 채취한 골수 세포를 PBS로 세척한 후 적혈구 용혈 버퍼(Sigma Aldrich)를 사용하여 적혈구(red blood cells, RBCs)를 제거하였다. 상기 골수 세포를 6 웰 플레이트(1X106 세포/ml; 2 ml/웰)에 분주하고 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Lonza, Basel, Switzerland), 10% 우태아 혈청 (Lonza), 50 μM 머캅토에탄올 (Lonza), 0.1 mM 비필수 아미노산 (Lonza) 및 GM-CSF (20 ng/mL)로 보충된 완전-RPMI 1640 (c-RPMI 1640) 배지에서 5% CO2 분위기 및 37℃의 온도 조건 하에서 배양하였다. 단, 도 1에 나타낸 바와 같이, TLR2 작용제(Pam3CSK4), TLR3 작용제(poly I:C), TLR4 작용제(LPS, from Escherichia coli O111:B4), TLR7 작용제(이미퀴모드, R837) 및 TLR9 작용제(ODN1826) 각각을 50 ng/ml의 양으로 분화 개시 시점(1 method), 분화 개시 후 3일 째(2 method), 또는 분화 개시 시점과 분화 개시 후 3일 째(3 method)에 배지에 첨가하였다. 배양 3일 째에 웰에 골수 세포와 c-RPMI 1640 배지 1 ml를 추가하였다. 배양 6일 째에 세포를 수집하고, 플루오레세인(Fluorescein) 컨쥬게이트된 CD11c mAb로 염색하여 CD11c+ 세포의 비율을 측정하여 도 2 및 3에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제를 3 method로 처리한 경우 수지상 세포의 억제능이 강력하게 유도되었다. 또한, 3 method에 의하되 각 TLR 작용제의 처리 농도 별(TLR2 작용제 (Pam3) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR3 작용제 (Poly I:C) - 10, 100, 500 ng/ml; TLR4 작용제 (LPS) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR7 작용제 (Imiqumoid) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR9 작용제 (CPG:ODN) - 1, 10, 50 ng/ml) CD11c+ 세포 비율을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 처리되는 TLR 작용제의 농도 의존적으로 수지상 세포의 분화가 억제되는 것을 볼 수 있었다. 하지만, TLR3 작용제를 처리한 경우는 수지상 세포 분화 억제 효과가 관찰되지 않았다.
[실시예 2] 수지상 세포의 분화 억제와 MyD88의 관계 확인
추가적으로 수지상 세포 분화의 억제 효과가 MyD88 의존적으로 유도되는 지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스에 대하여 상기 실시예 1의 3 method와 동일한 방법으로 TLR 작용제를 처리하여 분화를 유도한 뒤, CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율을 측정하여 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5 및 6에서 보는 바와 같이, TLR3 작용제를 처리한 경우를 제외하고, TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하자 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율이 감소하였으나, MyD88를 넉아웃 시킨 경우 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율이 80% 이상 유지되어, 수지상 세포로의 분화가 유도됨을 볼 수 있었다.
이를 통하여 수지상 세포로의 분화는 MyD88 의존적으로 유도된다는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] TLR 자극에 의해 유도되는 세포의 표현형 분석
상기 실시예 1에서 3 method와 동일한 방법으로 골수 세포에 TLR 작용제를 처리하여 6일간 배양 후 수확된 세포의 표현형을 분석한 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 그 결과, TLR 자극으로 유도된 세포들은 수지상 세포의 표현형(CD11c, CD4, CD103, CD8a)은 모두 감소한 반면, Gr-1, Ly6C, CD11b의 발현은 높게 유도된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발현 양상을 통하여 골수 세포로부터 분화 유도된 세포가 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)임을 예측할 수 있었다.
단, TLR 작용제 중에서 특히 TLR7 작용제와 TLR9 작용제의 처리 시 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)의 마커인 PDCA-1가 높게 유도됨을 볼 수 있었지만, pDC의 다른 마커인 B220에는 별다른 차이를 보이지 않아 pDC가 유도된 것은 아님을 알 수 있었다.
이를 통하여 TLR2 작용제 및 TLR4 작용제와, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 시 서로 다른 종류의 MDSCs가 유도됨을 알 수 있었다.
[실시예 4] TLR 자극에 의해 유도된 MDSCs의 표현형 확인
상기 실시예 3에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 3 method에 따라 골수 세포에 TLR 자극을 가하여 분화 유도된 세포는 MDSCs임을 알 수 있었다. 한편, 상기 MDSCs의 아형은 단핵구(monocytic)-MDSC (M-MDSCs)와 과립구(Granulocytic)-MDSC (G-MDSCs)로 나눌 수 있는데, Gr-1high 세포는 대부분 G-MDSCs에 해당하고, Gr-1low은 M-MDSCs로 분류할 수 있다.
이에, Gr-1 항체를 이용하여 상기 실시예 1에서 3 method의 방법으로 6일간 배양 후 수확된 MDSCs에 대하여 Gr-1 발현 수준을 확인하여 도 9 및 10에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제와 TLR4 작용제에 의해 유도된 세포들은 Gr-1low한 MDSCs가 높게 유도되었으나, 반대로 TLR7 작용제와 TLR9 작용제로 유도된 세포들은 Gr-1high한 MDSCs가 높게 유도된 것을 확인할 수 있었다.
더 나아가, MDSCs의 정확한 아형을 분류하기 위하여, Ly6G와 Ly6C 항체를 이용해 그 발현 양상을 확인한 결과, 도 11 및 12에서 보는 바와 같이 TLR의 자극에 의하여 골수 세포로부터 G-MDSCs (X2 세포)와 M-MDSCs (X3 세포 및 X4 세포)가 유도되었고, 그 중에서도 M-MDSCs의 비율이 높았으나, TLR2 작용제와 TLR4 작용제 처리 시 Ly6Cint M-MDSCs (X3 세포)가, TLR7 작용제와 TLR9 작용제 처리 시 Ly6Chigh M-MDSCs (X4 세포)가 유도됨을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] MDSCs의 분화와 MyD88의 관계 확인
MDSCs 각 아형별 분화가 MyD88 의존적으로 유도되는지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스에 대하여 상기 실시예 1에서 3 method와 동일한 방법으로 수행한 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 Ly6G와 Ly6C의 그 발현 양상을 확인하였다(도 13). 그 결과, TLR2 작용제와 TLR4 작용제 처리 시 Ly6Cint M-MDSCs (X3 세포)가 유도되고, TLR7 작용제와 TLR9 작용제 처리 시 Ly6Chigh M-MDSCs (X4 세포)가 유도되는 것은 MyD88 의존적인 것임을 알 수 있었다.
[ 실시예 6] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도되는 분자적 파라미터
실시예 4에서 보는 바와 같이 골수 세포에 대하여 3 method의 TLR 자극에 의해 분화 유도된 세포가 M-MDSCs인지를 정확히 판단하기 위하여, M-MDSCs에서 유도되는 다양한 인자들을 분석하였다. 또한 이러한 분석에서 TLR2 작용제 및 TLR4 작용제에 의해서 유도되는 Ly6Cint M-MDSCs와, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제에 의해서 유도되는 Ly6Chigh M-MDSCs의 기능적 차이를 확인하기 위하여 TLR2-M-MDSC와 TLR9-M-MDSC를 MACS 시스템을 이용하여 분리하였다. 여기서 M-MDSCs의 활성을 유도하기 위하여 LPS와 IFN-γ를 24시간 처리하였다.
구체적으로, NO 키트를 이용하여 NO2의 형성 수준을, 웨스턴 블럿을 통해 NOS2 및 아르기나아제-1(Arginase-1)의 발현 수준을, ELISA를 통하여 IL-10의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 각각 도 14, 15 및 16에 나타내었다. 또한, FACS를 통하여 아르기나아제-1 및 iNOS의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 도 14 내지 18에서 보는 바와 같이, TLR2 작용제와 TLR9 작용제를 처리한 경우 모두에서 M-MDSCs 요소들이 유도됨을 확인할 수 있었지만, TLR9 작용제를 처리한 경우가 TLR2 작용제를 처리한 경우보다 훨씬 강력한 수준으로 유도됨을 확인할 수 있었다.
또한, TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 경우 유도된 M-MDSCs의 표현형을 확인하기 위하여 CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1의 다양한 마커의 발현 수준을 분석한 결과, 도 19 및 20에서 보는 바와 같이 CD115, F4/60 및 PDCA-1은 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs에서 높게 발현되었고, CD124는 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs에서 낮게 발현되었다.
추가적으로, TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 경우 유도된 M-MDSCs에 있어서 ELISA를 이용하여 염증성 사이토카인의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 도 21에 나타내었고, FACS를 이용하여 면역 억제 인자의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 22 내지 24에 나타내었다. 그 결과, TLR9 작용제 처리 후 유도된 M-MDSCs는 TLR2 작용제 처리 후 유도된 M-MDSCs 보다 활성화 되었을 때 염증성 사이토카인을 높은 수준으로 유도하였을 뿐만 아니라 다양한 면역 억제 인자 또한 높은 수준으로 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 7] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도된 M- MDSCs에 의한 T 세포의 증식 억제 및 조절 T 세포의 분화 확인
이하에서는 M-MDSCs의 또 다른 특징 중 하나는 T 세포의 증식 억제능과 조절 T 세포의 분화 유도를 확인하였다. 보다 상세하게는 OVA-pulsed DC와 OT-II 마우스의 CellTrace-labeled CD4 T 세포의 공배양(co-culture)을 통하여 T 세포를 활성화 시키고, 상기 실시예 1에서 3 method에 의해 분화 유도된 M-MDSCs를 추가한 뒤 T 세포 억제능을 확인하여 그 결과를 도 25 및 26에 나타내었고, Foxp3의 발현 수준을 확인하여 조절 T 세포의 비율을 확인해 그 결과를 도 27 및 28에 나타내었다.
도 25 내지 28에서 보는 바와 같이, 첨가되는 M-MDSCs의 수 의존적으로 T 세포의 증식은 억제하였고, Foxp3+ CD4 T 세포의 수는 증가하였으며, 특히 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs가 TLR2 자극 후 유도된 M-MDSCs 보다 T 세포의 증식 억제능과 조절 T 세포의 분화능이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 TLR9 작용제가 TLR2 작용제 보다 기능적으로 더욱 강력한 M-MDSCs를 유도함을 알 수 있었다.
[ 실시예 8] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도된 M- MDSCs로부터 수지상 세포와 큰포식 세포의 분화능 평가
상기 실시예 1에서 3 method에 따라 분화 유도된 M-MDSC 각각을 6-웰 플레이트(1X106 cells/ml; 2 ml/well)에 분주한 뒤 10% 우태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 20 ng/ml GM-CSF 또는 M-CSF가 보충된 cRPMI 1640에서 5일 동안 배양하고 세포를 수확하였다. 상기 배양으로 수지상 세포의 분화가 유도되었는지 확인하기 위하여 수지상 세포의 항-CD11c와 항-MHC-II를 염색 후 유세포분석기 FACSverse를 통하여 분석하여 그 결과를 도 29 및 30에 나타내었다. 또한, 상기 배양으로 큰포식 세포의 분화가 유도되었는지 확인하기 위하여 큰포식 세포의 항-CD11b와 항-F40/80으로 염색 후 유세포분석기 FACSverse를 통하여 분석하여 그 결과를 도 31 및 32에 나타내었다.
도 29 내지 32에서 보는 바와 같이, TLR9 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포와 큰포식 세포로 효과적으로 분화가 유도된 반면, TLR2 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs는 큰포식 세포로의 분화는 유도되었으나 수지상 세포로는 거의 분화가 되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
추가적으로 T 세포의 존재 하에서 상기 실시예 1의 3 method에 따라 분화 유도된 M-MDSCs 각각에 GM-CSF를 첨가하여 배양하며 T 세포의 증식 억제능과 수지상 세포로의 2차 분화 정도를 평가하였다. 그 결과 도 33 및 34에서 보는 바와 같이, TLR9 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는 GM-CSF 존재 시 T 세포 증식 억제능 및 IFN-γ 억제능이 현저하게 감소하였으나, TLR2 자극에 의해 유도된 M-MDSCs에서는 이러한 변화를 보이지 않고 지속적으로 T 세포 증식 억제 및 IFN-γ 억제능을 보여 주었다.
또한, 이러한 조건에서 CD11c의 2차 분화 정도를 확인한 결과 도 35에서 보는 바와 같이 TLR9 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는, TLR2 자극에 의해 유도된 M-MDSCs와는 달리 수지상 세포로 효과적으로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, TLR2 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs는 안정한 유지 기능을 가지고 있고, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포로의 2차 분화가 가능함을 알 수 있었다.
[ 실시예 9] TLR9 작용제에 의해 유도된 M- MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포와 큰포식 세포의 기능 분석
이하에서는 본 발명에서 상기 TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포의 특성을 다른 방법으로 분화된 수지상 세포와 비교 분석하였다.
수지상 세포의 In vitro 분화 방법으로는 골수 세포를 이용한 분화 방법과, Ly6C+ 세포를 통하여 분화하는 방법 등이 있다. 이에, 상기 골수 세포를 이용한 분화 방법으로, 마우스의 대퇴부 골수로부터 분리된 세포들을 상기 실시예 8에서의 수지상 세포 분화법과 같은 방법으로 5일 동안 배양하였다(Bone marrow derived Dendritic cells, BMDC). 또한 마우스의 대퇴부 골수에서 Ly6C MicroBeads를 통하여 Ly6C+ 세포들을 분리 후 위와 같이 배양하였다(Ly6C+-derived DC). 이러한 세포들은 5일 후 CD11c MicroBeads를 통하여 수지상 세포만 다시 분리 하였다(>90%).
상기한 방법으로 분리된 수지상 세포와, 상기 실시예 8에서 2차 분화된 수지상 세포의 표현형을 분석하여 그 결과를 도 36 및 37에 나타내었다.
또한, 상기한 3종의 수지상 세포 각각을 48-웰 플레이트(1X105 cells/ml) 내 cRPMI 1640 배지에 분주한 뒤 수지상 세포의 자극제로 LPS와 IFN-γ를 처리하여 각각의 수지상 세포가 유도하는 사이토카인의 발현 수준을 ELISA로 분석하였고, NO2의 형성 수준을 NO 키트로 분석하여 그 결과를 도 38 및 39에 나타내었다. 그 결과 TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 다른 방법으로 유도된 수지상 세포에 비하여 Th1 및 Th2 타입 세포의 분화에 중요한 IL-12p70 및 IL-10을 높은 수준으로 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
추가로, 본 발명에 따른 수지상 세포가 T 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 얻어진 3종의 수지상 세포를 OVA323-339 펩타이드로 1시간 자극시킨 후 OT-II 마우스로부터 분리된 CD4 T 세포와 1:5(DC:T 세포)의 비율로 3일간 공배양한 뒤, T 세포의 증식능과 IFN-γ의 발현 수준을 분석하였다. 도 40에서 보는 바와 같이, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 Ly6C+ 유래 수지상 세포보다 T 세포 증식능이 현저히 뛰어난 것을 볼 수 있었으며, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 다른 방법으로 분화된 수지상 세포에 비하여 Th1 세포에서 유도되는 IFN-γ가 매우 높은 수준으로 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 상기 TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. (1) 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제 (toll-like receptor agonist, TLR agonist)중 톨 유사 수용체 7의 작용제 또는 톨 유사 수용체 9의 작용제를 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계; 및
    (2) 분화 유도된 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 골수 세포의 분화 개시 이전, 분화 개시 시점 또는 분화 중에 1회 이상 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리된 후, 분화 개시 후 3일 이내에 1회 이상 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 작용제는 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 양으로 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (1) 단계는 골수 세포를 성장인자 및 톨 유사 수용체 작용제를 포함하는 배지에서 배양하며 수행되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 골수 세포의 분화는 성장인자를 포함하는 배지에 상기 골수 세포를 접종하여 5일 내지 10일 배양하며 수행되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 수지상 세포의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 양으로 첨가되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 골수유래 면역반응 억제세포는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)인, 수지상 세포의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포는 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1+의 표현형을 갖는, 수지상 세포의 제조 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)인, 수지상 세포의 제조 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 (2) 단계는 성장인자는 12시간 내지 7일 동안 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 양으로 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도하는, 수지상 세포의 제조 방법.
  17. 제1항, 제 4항 내지 제16항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 수지상 세포.
  18. 제17항의 수지상 세포를 유효 성분으로 포함하는 면역질환 치료용 약학조성물.
  19. 제17항의 수지상 세포를 유효 성분으로 포함하는 항종양 백신.
  20. 제17항의 수지상 세포를 유효 성분으로 포함하는 종양치료용 약학적 조성물.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030084826A (ko) * 2003-09-30 2003-11-01 국립암센터 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포, 이의 제조방법및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030084826A (ko) * 2003-09-30 2003-11-01 국립암센터 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포, 이의 제조방법및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2014, 10(11):3251-3260. *
Oncotarget. 2015, 6(32):33781-33790. *

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