CN117441678A - 一种过继转移寻常型天疱疮动物模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建过继转移寻常型天疱疮动物模型的方法，该方法使用TLR激动剂活化供体细胞，疫苗抗原为桥粒黏蛋白3，免疫佐剂为TLR激动剂。在初次免疫/加强免疫后，提取Dsg3 –/– 小鼠淋巴细胞作为供体细胞，过继转移至Rag2 –/– 小鼠，在第14天Rag2 –/– 小鼠开始表现出与寻常型天疱疮相似的表型，包括体重减轻、多处皮肤水疱、表皮脱落、溃烂、口腔和消化道黏膜水疱、血清中出现自身抗体等症状，同时还观察到组织学检查中的表皮棘层松解和抗体沉积等寻常型天疱疮样改变。本方法降低了免疫反应诱导过程中调节性T细胞的比例，减少了供体细胞的用量，因此更适合用于大规模筛选和评估天疱疮药物治疗效果。这为寻常型天疱疮的新型疗法提供了重要的研究工具。

Description

一种过继转移寻常型天疱疮动物模型的方法
技术领域
本发明属于疾病动物模型构建方法技术领域，具体涉及一种过继转移寻常型天疱疮的动物模型的构建。
背景技术
天疱疮(pemphigus)是一类自身抗体介导的、严重时危及生命的自身免疫性皮肤病，包括寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)、落叶型天疱疮(pemphigus foliaceus)、副肿瘤性天疱疮(paraneoplastic pemphigus)等[1,2]。PV患者体内存在自身反应性浆细胞，它们分泌自身抗体与皮肤表皮层细胞表面的黏附蛋白桥粒黏蛋白3(desmoglein3,Dsg3)结合，导致皮肤的棘层松解，进而形成皮肤水疱和反复溃烂等症状。尽管天疱疮的发病率不高，约0.5-50/百万人口/年[1,2]，但患者皮肤屏障的损坏不仅引发疼痛，增加病原体感染风险，还损害外貌，增加心理压力，显著降低生活质量。令人鼓舞的是，2023年9月，天疱疮被列入《第二批罕见病目录》[3]，表明其得到了更广泛的重视。在此背景下，开发能模拟临床症状、且具有成本优势的动物模型将极大促进我们对天疱疮发病机制和新型疗法的研究，有助于维护罕见病患者的健康权益。
通过过继转移诱导主动PV小鼠模型是国际上常用的成年PV小鼠模型，以Dsg3敲除小鼠的脾脏淋巴细胞为供体，以Rag2–/–免疫缺陷小鼠为受体，在过继转移2-4周后，受体小鼠会发展出体重减轻、毛发脱落、局部皮肤组织破损等表型，血清中可检测出抗Dsg3抗体，皮肤组织检查显示表皮层角质形成细胞间有抗体沉积，导致黏附丧失、棘层松解[4,5]。然而，该模型的主要限制之一是供体细胞的用量巨大，通常需要使用完全弗氏佐剂(completeFreund’s adjuvant,CFA)作为活化佐剂。根据文献报道，供体细胞往往需要达到2×107[6,7]。这限制了大规模造模实验的可行性。以每只受体小鼠需要的供体细胞计算，即使提取操作完全有效，供体小鼠也只能用于造模5只受体小鼠。由于Dsg3–/–小鼠无法纯合子繁殖，其每一代的纯合子比例都低于50％，再加上性别匹配的要求，可用于造模的供体小鼠非常有限，从而显著延长了实验周期，限制了该模型在药物疗效验证方面的应用。随着模式识别受体(Toll样受体(Toll like receptor，TLR))研究的逐步透彻和深入，已有多种固有免疫细胞活化作用强的免疫佐剂得到批准用于临床或广泛用于实验研究，比如宫颈癌疫苗中的TLR4激动剂单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A,MPLA)、乙肝疫苗中的TLR9激动剂寡核苷酸1018(cytosine phosphoguanosine-containing oligonucleotide,CpG-ODNs 1018)等[8]。
上文参考文献为：
1.Kasperkiewicz,M.,et al.,Pemphigus.Nat Rev Dis Primers,2017.3:p.17026.
2.Schmidt,E.,M.Kasperkiewicz,and P.Joly,Pemphigus.Lancet,2019.394(10201):p.882-894.
3.关于公布第二批罕见病目录的通知.2023[cited 2023 18th,Sep]；国卫医政发〔2023〕26号:[Available from:
https://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/202309/content_6905273.htm.
4.Kim,A.R.,et al.,Targeting inducible costimulator expressed on CXCR5(+)PD-1(+)TH cells suppresses the progression of pemphigus vulgaris.J AllergyClin Immunol,2020.146(5):p.1070-1079e8.
5.Lee,J.,et al.,Antigen-specific B cell depletion for precisiontherapy of mucosal pemphigus vulgaris.J Clin Invest,2020.130(12):p.6317-6324.
6.Lotti,R.,et al.,Development of a Desmocollin-3Active Mouse ModelRecapitulating Human Atypical Pemphigus.Front Immunol,2019.10:p.1387.
7.Lotti,R.,et al.,A Novel In Vivo Active Pemphigus Model TargetingDesmoglein1 and Desmoglein3:A Tool Representing All PemphigusVariants.Biology(Basel),2023.12(5).
8.Pulendran,B.,S.A.P,and D.T.O'Hagan,Emerging concepts in the scienceof vaccine adjuvants.Nat Rev Drug Discov,2021.20(6):p.454-475.
发明内容
发明目的：本发明旨在解决现有技术的不足之处，提供一种寻常型天疱疮动物模型，该模型所需供体细胞更少、疾病表型更明显、疾病进展更快，为PV的抗原特异性疗法研究和开发提供了经济快捷的动物模型。
为实现上述技术目的，本发明公开了一种构建过继转移寻常型天疱疮动物模型的方法，通过接种疫苗来预先活化Dsg3–/–小鼠供体淋巴细胞，随后过继转移至Rag2–/–小鼠以诱导疾病表型的发生。所述疫苗包括抗原和免疫佐剂，其中抗原成分为重组桥粒黏蛋白3，所述免疫佐剂为TLR激动剂。
所述Dsg3–/–小鼠、Rag2–/–小鼠为C57BL/6背景小鼠，周龄为6-8周。
优选地，所述TLR激动剂选自下组中的任意一种或几种的组合：dsRNA类似物、DNA类似物、单磷酸脂质A类似物；所述dsRNA类似物包括聚肌苷酸胞苷酸、聚腺苷酸尿苷酸中的任意一种；所述DNA类似物包括CpG 1018、CpG 1466、CpG 1555、CpG 1826中的任意一种；所述单磷酸脂质A类似物包括MPLA、RC529、OM174中的任意一种。
进一步优选地，所述免疫佐剂为MPLA、Poly(I:C)和CpG1826的混合物中的任意一种。当免疫佐剂为MPLA时，按照重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg、MPLA 0.5-50μg的比例配置重组蛋白疫苗；当免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1826的混合物时，按照重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg、poly(I:C)2-300μg、CpG1826 0.2-30μg的比例配置重组蛋白疫苗。
更具体地，当免疫佐剂为MPLA时，每次给小鼠注射的剂量为重组桥粒黏蛋白30.5-50μg，MPLA 0.5-50μg；当免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1826的混合物时，每次给小鼠注射的剂量为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg，poly(I:C)2-300μg、CpG1826 0.2-30μg。
其中，接种疫苗的途径为有针或无针化的皮下注射、皮内注射、腹腔注射、肌肉内注射、淋巴结内注射、静脉注射或皮肤贴敷中的任意一种；过继转移的途径为有针或无针化的皮下注射、腹腔注射、静脉注射的任意一种。
在一个具体的实施方式中，本发明构建了一种使用TLR激动剂活化供体细胞的过继转移寻常型天疱疮动物模型，包括如下步骤：
(1)将重组桥粒黏蛋白3与免疫佐剂混合制备以重组桥粒黏蛋白3为抗原的疫苗；
(2)使用(1)中制备的疫苗接种Dsg3–/–小鼠，进行初次免疫，然后进行加强免疫；初次免疫连续接种1-3天疫苗，加强免疫为在接种第14-49天后，再次连续接种1-3天疫苗；
(3)在初次免疫后的28天-63天内，提取淋巴细胞，并将其过继转移至Rag2–/–小鼠。
(4)过继转移后的14天-21天后，观察疾病表型的出现。
其中，步骤(1)中，当免疫佐剂为MPLA时，按照重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg、MPLA0.5-50μg的比例配置重组蛋白疫苗，每次给小鼠注射的剂量为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg，MPLA0.5-50μg；当免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1826的混合物时，按照重组桥粒黏蛋白30.5-50μg、poly(I:C)2-300μg、CpG1826 0.2-30μg的比例配置重组蛋白疫苗，每次给小鼠注射的剂量为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg，poly(I:C)2-300μg、CpG1826 0.2-30μg。
更优选地，步骤(3)中，初次免疫为连续接种疫苗3天，随后在接种第14天进行加强免疫，同样连续接种3天。
优选地，每次给小鼠的注射剂量分别为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50μg，MPLA 0.5-50μg，poly(I:C)2-300μg、CpG1826 0.2-30μg。
步骤(3)中，供体细胞数量数为5×106。
有益效果：本发明通过选用合适的佐剂活化供体细胞，减少了调节性T细胞比例，降低了供体细胞用量，从而加速了疾病的进展。这为寻常型天疱疮的免疫疗法提供了重要工具。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是TLR激动剂活化供体细胞的改良PV模型。其中A图所示为PV模型的步骤示意图，对Dsg3–/–小鼠接种TLR激动剂或CFA和Dsg3后，提取淋巴细胞，按相同细胞数量过继转移至Rag2–/–小鼠；B图所示为造模后小鼠整体外观表型，分别展示了背部、尾部、颈部、面部的表皮脱落、皮肤溃烂、脱毛表型；C图所示为造模28天后模型小鼠的天疱疮评分统计；D图为模型小鼠的每周体重变化；E图所示为造模40天后ELISA检测小鼠血清中抗Dsg3抗体水平；F图所示为皮损部位组织学检查表明的表皮角质形成细胞之间抗体沉积、表皮棘层松解；G图所示为黏膜部位组织学检查表明的表皮角质形成细胞之间抗体沉积、表皮棘层松解；图中比例尺为100微米。Adjuv,adjuvant；MPLA,monophosphoryl lipid A；PC,poly(I:C)+CpG1826；CFA,complete Freund’s adjuvant；ns,not significant；HE,hemizygote；HO,homozygote.
图2是不同供体细胞造模的PV模型小鼠自身抗体水平。对Dsg3–/–小鼠接种TLR激动剂或CFA和Dsg3后，提取淋巴细胞，按图中所示细胞数量过继转移至Rag2–/–小鼠，造模40天后ELISA检测小鼠血清中抗Dsg3抗体水平。图中1e7表示1×107。
图3是实验证明TLR激动剂减少免疫反应诱导阶段的调节性T细胞比例。A图所示是实验步骤示意图，对C57BL/6J小鼠接种OVA疫苗后，在特定时间点提取淋巴结、脾脏淋巴细胞，分析其中的细胞组成和功能；B图所示为ELISA检测淋巴结匀浆中CCL17、IL-10的含量；C图所示为脾脏中滤泡调节性T细胞的比例，以及滤泡辅助性T细胞和滤泡调节性T细胞的比例；D图所示为脾脏中CD4+调节性T细胞的比例。
图4是实验证明TLR激动剂较CFA提高抗原提呈细胞的提呈能力，减少IL-10+中性粒细胞。A图所示为淋巴结内，巨噬细胞和cDC2表达MHC-II水平；B图所示为脾脏内，巨噬细胞和cDC2表达MHC-II水平；C图为脾脏各类固有免疫细胞表达IL-10的水平；D图所示为脾脏IL-10+中性粒细胞的比例和数目。
图5是TLR激动剂剂量优化实验。A图所示为初次接种7天后，淋巴结内淋巴细胞、CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞(Tfh)总数；B图所示为淋巴结内生发中心B细胞占总B细胞的比例；C图所示为淋巴结内总颗粒细胞、cDC1和pDC细胞的总数。各组的OVA用量均为5μg，佐剂用量如下：OVA+MPLA1组：MPLA0.2μg；OVA+MPLA2组：MPLA1μg；OVA+MPLA3组：MPLA 5μg；OVA+PC1组：poly(I:C)1.2μg、CpG1826 0.12μg；OVA +PC2组：poly(I:C)6μg、CpG1826 0.6μg；OVA+PC3组：poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg。
图6是实验证明CpG1826与CpG1466+CpG1555的效果相当，可互相替代。A图所示为初次接种7天后，淋巴结内淋巴细胞总数；B图所示为淋巴结内CD4+T细胞总数。Low dose为poly(I:C)2μg、CpG1826 0.2μg，或poly(I:C)2μg、CpG1466 0.2μg+CpG1555 0.2μg；Highdose为相应Low dose剂量的15倍。
具体实施方式
本发明建立了一种使用TLR激动剂构建寻常型天疱疮动物模型的方法，旨在降低供体细胞数量至传统CFA方法的1/4，以解决当前过继转移模型所需供体细胞较多、难以进行大规模实验的问题。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主体范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普遍技术知识和惯用方法，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围。
实施例1以TLR激动剂活化供体细胞的改良PV模型。
一、实验材料
SPF级7周雌性C57BL/6J-Dsg3–/–小鼠(上海南模)，雌性C57BL/6J-Rag2–/–小鼠(北京华阜康)，重组Dsg3蛋白溶液(南京铭研)，MPLA(invivogen)，poly(I:C)(invivogen)，CpG1826(生工)，CFA(invitrogen)，4％多聚甲醛(Biosharp)，OCT包埋剂(Sakura)，山羊抗鼠IgG-FITC，山羊抗鼠IgG-HRP(Abclonal)，山羊抗鼠IgG1-HRP，山羊抗鼠IgG2c-HRP(Southern Biotech)，TMB显色液(生工)等。
二、实验方法
1.过继转移PV模型
配置重组蛋白疫苗。Dsg3–/–小鼠麻醉后，经足底皮下接种50μL重组蛋白疫苗，连续接种3天。第14天，对小鼠进行加强免疫，按相同方法接种3天。
其中，重组蛋白疫苗包括如下三组(50μL重组蛋白疫苗的含量)：
(1)rDsg3+MPLA组：Dsg3蛋白5μg、MPLA 5μg；
(2)rDsg3+PC组：Dsg3蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg；
(3)rDsg3+CFA组：Dsg3蛋白5μg，CFA 25μL。
初次免疫35天后，提取Dsg3–/–小鼠脾脏淋巴细胞，裂解红细胞，计数后，经尾静脉注射过继转移至Rag2–/–小鼠。
2.皮肤组织、黏膜组织提取和组织学检测
第35天，小鼠麻醉后颈椎脱臼处死。用锋利手术刀和眼科剪取下鼠尾、足底、背部皮肤、口腔黏膜或食道，约0.5厘米×0.5厘米，摊平于锡箔纸上，液氮速冻或固定于4％多聚甲醛。
将液氮速冻后的组织用OCT包埋后，置于冰冻切片模具上，用冰冻切片机切片后，洗去OCT，加入山羊抗鼠IgG-FITC(1:100)37℃避光孵育35分钟，清洗2次后用荧光显微镜成像。
将提取的组织经4％多聚甲醛固定后，进行脱水、浸蜡、包埋。将组织块切片后，进行摊片、烘片、脱蜡、苏木精和伊红染色，封片后用显微镜选取视野拍照。
3.酶联免疫吸附实验
在不同时间点制备血清，分装冻存后用于ELISA。配置50μg/mL的Dsg3溶液，按100μL/孔加入酶标板中，4℃过夜包被，次日用洗液洗3次，加200μL封闭液(1％BSA的PBS溶液)室温孵育2小时后，清洗3次，拍干备用。按50-100μL/孔加入稀释后的待测血清，室温孵育2小时。清洗3次，拍干后加入山羊抗鼠IgG-HRP、山羊抗鼠IgG1-HRP或山羊抗鼠IgG2c-HRP(1:5000)，室温孵育1小时。清洗5-7次后拍干，加入TMB显色液室温显色30分钟，酶标仪检测450nm处的OD值。
三、实验结果
我们的研究发现，使用TLR4激动剂MPLA或联用TLR3激动剂Poly(I:C)和TLR9激动剂CpG1826作为免疫佐剂，与Dsg3混合制备疫苗来活化Dsg3–/–小鼠的供体细胞，可以诱导受体小鼠出现背部、尾部、颈部、面部的表皮脱落、皮肤溃烂、脱毛等症状，而用CFA活化的相同供体细胞数量仅能诱导轻微的脱毛表型(图1.B)。通过对模型小鼠进行疾病评分，我们发现TLR激动剂引起更高的PV评分(图1.C)，体重变化也表明其疾病进展更为严重(图1.D)。ELISA检测血浆中抗Dsg3的抗体水平，发现TLR激动剂诱导更高的自身抗体水平(图1.E)。对皮肤组织和黏膜组织进行组织学检测，显示各模型小鼠均能检测出表皮角质形成细胞之间抗体沉积、表皮棘层松解(图1.F,G)，但TLR激动剂活化的供体细胞能诱导更明显的疾病表型。
实施例2TLR激动剂可减少供体细胞数量需求。
一、实验材料
SPF级7周雌性C57BL/6J-Dsg3–/–小鼠(上海南模)，雌性C57BL/6J-Rag2–/–小鼠(北京华阜康)，重组Dsg3蛋白溶液(南京铭研)，MPLA(invivogen)，poly(I:C)(invivogen)，CpG1826(生工)，CFA(invitrogen)，山羊抗鼠IgG-HRP(Abclonal)，TMB显色液(生工)等。
二、实验方法
1.过继转移PV模型
配置重组蛋白疫苗。Dsg3–/–小鼠麻醉后，经足底皮下接种50μL重组蛋白疫苗，连续接种3天。第14天，对小鼠进行加强免疫，按相同方法接种3天。
其中，重组蛋白疫苗包括如下三组(50μL重组蛋白疫苗的含量)：
(1)rDsg3+MPLA 组：Dsg3蛋白5μg、MPLA 5μg；
(2)rDsg3+PC组：Dsg3蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg；
(3)rDsg3+CFA组：Dsg3蛋白5μg，CFA 25μL。
初次免疫28天-35天后，提取Dsg3–/–小鼠脾脏淋巴细胞，裂解红细胞，计数后，按如图所示的不同细胞数经尾静脉注射过继转移至Rag2–/–小鼠。
2.酶联免疫吸附实验
制备血清，分装冻存后用于ELISA。配置50μg/mL的Dsg3溶液，按100μl/孔加入酶标板中，4℃过夜包被，次日用洗液洗3次，加200μL封闭液(1％ BSA的PBS溶液)室温孵育2小时后，清洗3次，拍干备用。按50-100μL/孔加入稀释后的待测血清，室温孵育2小时。清洗3次，拍干后加入山羊抗鼠IgG-HRP(1:5000)，室温孵育1小时。清洗5-7次后拍干，加入TMB显色液室温显色30分钟，酶标仪检测450nm处的OD值。
三、实验结果
ELISA检测血浆中抗Dsg3的抗体水平，我们发现CFA与Dsg3配成疫苗活化Dsg3–/–小鼠后，当供体细胞数为1×107时，抗Dsg3 IgG水平较低，而当供体细胞数量增至2×107时，抗体水平显著升高(图2)。另一方面，使用TLR4激动剂MPLA，或联用TLR3激动剂Poly(I:C)和TLR9激动剂CpG1826作为免疫佐剂，以5×106供体细胞数即可超过CFA组2×107供体细胞数所诱导的自身抗体水平(图2)。以上数据表明，在供体细胞活化过程中，使用TLR激动剂替换CFA将显著降低供体细胞需求至少1/4，即可实现较好的造模效果。
实施例3TLR激动剂降低免疫反应诱导阶段的调节性T细胞比例。
本实施例采用另一种抗原OVA，在另外一个系统中进一步验证TLR激动剂降低免疫反应诱导阶段的调节性T细胞比例。
一、实验材料
SPF级7周雌性C57BL/6J小鼠(集萃药康)，OVA蛋白(sigma)，MPLA(invivogen)，poly(I:C)(invivogen)，CpG1826(生工)，CFA(invitrogen)，小鼠CD4、CD25、CXCR5、PD-1、Foxp3等流式抗体(BioLegend)、小鼠CCL17、IL-10ELISA试剂盒(武汉华美)等。
二、实验方法
1.小鼠疫苗接种
配置重组蛋白疫苗。小鼠(C57BL/6J小鼠么)麻醉后，经足底皮下接种50μL重组蛋白疫苗，连续接种3天。第14天，对小鼠进行加强免疫，按相同方法接种3天。
其中，重组蛋白疫苗包括如下三组(50μL重组蛋白疫苗的含量)：
(1)OVA+MPLA组：OVA蛋白5μg、MPLA 5μg；
(2)OVA+PC组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1826 1μg；
(3)OVA+CFA组：OVA蛋白5μg，CFA25μL。
2.组织提取与酶联免疫吸附实验
初次免疫7天后，提取引流淋巴结，称重、匀浆后吸取上清，分装冻于-80℃用于ELISA。根据试剂盒说明书检测CCL17、IL-10含量。
3.细胞提取与流式细胞术
初次免疫35天后，分离脾脏，研磨后过滤获得单细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，离心重悬后计数。封闭FcR后，加入小鼠CD4、CD25、CXCR5、PD-1抗体，室温避光孵育20分钟，洗去多余抗体，固定、破核后加入小鼠Foxp3抗体，室温避光孵育30分钟，数据采集于Cytek NL Aurora或BD Fortessa流式细胞仪，用FlowJo软件分析。
三、实验结果
我们发现以TLR4激动剂MPLA，或联用TLR3激动剂Poly(I:C)和TLR9激动剂CpG1826为免疫佐剂，与OVA配成疫苗接种后，其引流淋巴结内促进Treg产生的细胞因子CCL17和IL-10表达较未接种的小鼠相比无明显升高，而用CFA可显著提升CCL17和IL-10水平(图3.B)。进一步地，检测脾脏内滤泡抑制性细胞(Tfr)和辅助性细胞(Tfh)，能发现CFA诱导了更高比例的Tfr，同时Tfr:Tfh的比例显著低于TLR激动剂组(图3.C)。CFA还显著增加了CD4+Foxp3+和Treg比例(图3.D)，以上数据表明CFA较TLR激动剂，其诱导的免疫反应会因调节性T细胞的调控而处于较低水平。
实施例4TLR激动剂提高抗原提呈细胞的提呈能力，减少IL-10+中性粒细胞。
一、实验材料
SPF级7周雌性C57BL/6J小鼠(集萃药康)，OVA蛋白(sigma)，MPLA(invivogen)，poly(I:C)(invivogen)，CpG1826(生工)，CFA(invitrogen)，小鼠MHC-II，CD11c，CD11b，XCR1，F4/80，Ly-6G，IL-10等流式抗体(eBioscience或BioLegend)等。
二、实验方法
1.小鼠疫苗接种
配置重组蛋白疫苗。小鼠麻醉后，经足底皮下接种50μL重组蛋白疫苗，连续接种3天。第14天，对小鼠进行加强免疫，按相同方法接种3天。
其中，重组蛋白疫苗包括如下三组(50μL重组蛋白疫苗的含量)：
(1)OVA+MPLA组：OVA蛋白5μg、MPLA5μg；
(2)OVA+PC组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg；
(3)OVA+CFA组：OVA蛋白5μg，CFA25μL。
2.细胞提取与胞内细胞因子染色
初次免疫7天后，分离引流淋巴结；初次免疫35天后，分离脾脏，研磨后过滤获得单细胞悬液，用红细胞裂解液去除红细胞，离心重悬后计数，用1640完全培养基重悬。按2×106/ml加入96孔板中，加入BFA、PMA、ionomycin，二氧化碳培养箱中37℃孵育5小时。洗去培养基，封闭FcR后，加入小鼠MHC-II，CD11c，CD11b，XCR1，F4/80，Ly-6G抗体，室温避光孵育20分钟，洗去多余抗体，固定、破膜后加入小鼠IL-10抗体，室温避光孵育30分钟，数据采集于Cytek NL Aurora或BD Fortessa流式细胞仪，用FlowJo软件分析。
三、实验结果
我们发现CFA+OVA接种后，小鼠引流淋巴结中巨噬细胞和cDC2的MHC-II荧光强度均显著低于TLR激动剂接种组，表明免疫反应起始阶段，巨噬细胞和cDC2的抗原提呈能力未得到充分激活(图4A)；在脾脏中，巨噬细胞的MHC-II表达类似，但CFA组中cDC2的MHC-II表达显著低于TLR激动剂，表明CFA加强免疫后，专职抗原提呈细胞激活适应性免疫应答能力不如TLR激动剂(图4B)。
进一步分析脾脏中各种固有免疫细胞IL-10的表达情况，我们发现中性粒细胞IL-10的荧光强度高于其他固有免疫细胞(图4C)，表明其可能是IL-10的主要来源。因此，我们分析了CFA和TLR激动剂联合OVA接种后，脾脏中IL-10+中性粒细胞的比例和数量，发现CFA接种后，IL-10+中性粒细胞的比例和数目均显著高于TLR激动剂组，表明CFA可能一定程度上产生了抑制性局部免疫微环境，从而需要更多的供体细胞来诱导PV模型。
实施例5TLR激动剂以剂量依赖性的方式促进免疫反应。
一、实验材料
SPF级7周雌性C57BL/6J小鼠(集萃药康)，OVA蛋白(sigma)，MPLA(invivogen)，poly(I:C)(invivogen)，CpG1826(生工)，小鼠CD4、CD25、CXCR5、PD-1、Foxp3、Fas、GL-7、MHC-II、CD11c、CD11b、XCR1、B220等流式抗体(eBioscience或BioLegend)等。
二、实验方法
1.小鼠疫苗接种
配置重组蛋白疫苗。小鼠麻醉后，经足底皮下接种50μL重组蛋白疫苗，连续接种3天。以未接种和只单独接种OVA的小鼠作为对照。
其中，重组蛋白疫苗包括如下六组(50μL重组蛋白疫苗的含量)：
(1)OVA+MPLA1组：OVA蛋白5μg、MPLA0.2μg；
(2)OVA+MPLA2组：OVA蛋白5μg、MPLA1μg；
(3)OVA+MPLA3组：OVA蛋白5μg、MPLA 5μg；
(4)OVA+PC1组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)1.2μg、CpG1826 0.12μg；
(5)OVA+PC2组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)6μg、CpG1826 0.6μg；
(6)OVA+PC3组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg。
2.细胞提取与流式染色
初次免疫7天后，分离引流淋巴结；研磨后过滤获得单细胞悬液，离心重悬后计数，用PBS重悬。按2×106/ml加入96孔板中，封闭FcR后，加入小鼠CD4、CD25、CXCR5、PD-1、Foxp3、Fas、GL-7、MHC-II、CD11c、CD11b、XCR1、B220抗体，室温避光孵育20分钟，洗去多余抗体，数据采集于Cytek NL Aurora或BD Fortessa流式细胞仪，用FlowJo软件分析。
三、实验结果
我们发现TLR激动剂MPLA或poly(I:C)+CpG1826可剂量依赖性地增加淋巴结内总淋巴细胞、CD4+T细胞和滤泡辅助性T细胞的数目，其中MPLA大于0.2μg时、以及poly(I:C)+CpG1826各组的总淋巴细胞、CD4+T细胞升高明显，所有接种TLR激动剂为佐剂的疫苗组的滤泡辅助性T细胞数目均远高于未接种或仅接种OVA的小鼠(图5.A)；TLR激动剂也增加了生发中心B细胞的比例，达到了仅接种OVA的小鼠的3-10倍，MPLA显示出较好的量效关系，而poly(I:C)+CpG1826的诱导趋势与Tfh类似，表明淋巴结滤泡中的免疫反应可能已达到平台期(图5.B)；我们也分析了淋巴结中固有免疫细胞的数量，发现TLR激动剂可剂量依赖性地增加淋巴结内总颗粒细胞、cDC1和pDC的数目(图5.C)。综上，为诱导足效的免疫反应，后续实验中，TLR激动剂可采用如下剂量：MPLA 5μg或poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg。
实施例6TLR激动剂CpG1826和CpG1466+CpG1555可互相替代。
一、实验材料
SPF级7周雌性C57BL/6J小鼠(集萃药康)，OVA蛋白(sigma)，poly(I:C)(invivogen)，CpG1826(生工)，CpG1466(生工)，CpG1555(生工)，小鼠CD4等流式抗体(eBioscience)等。
二、实验方法
1.小鼠疫苗接种
配置重组蛋白疫苗。小鼠麻醉后，经足底皮下接种50μL重组蛋白疫苗，连续接种3天。以未接种的小鼠作为对照。
其中，重组蛋白疫苗包括如下四组(50μL重组蛋白疫苗的含量)：
(1)CpG1826低剂量组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)2μg、CpG1826 0.2μg；
(2)CpG1826高剂量组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1826 3μg；
(3)CpG1466+1555低剂量组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)2μg、CpG1466 0.2μg、CpG15550.2μg；
(4)CpG1466+1555高剂量组：OVA蛋白5μg、poly(I:C)30μg、CpG1466 3μg、CpG15553μg。
2.细胞提取与与流式染色
初次免疫7天后，分离引流淋巴结；研磨后过滤获得单细胞悬液，离心重悬后计数，用PBS重悬。按2×106/ml加入96孔板中，封闭FcR后，加入小鼠CD4抗体，室温避光孵育20分钟，洗去多余抗体，数据采集于Cytek NL Aurora或BD Fortessa流式细胞仪，用FlowJo软件分析。
三、实验结果
我们发现以poly(I:C)和CpG为免疫佐剂，低剂量或高剂量均可显著增加淋巴结内总淋巴细胞和CD4+T细胞的数目(图6.A、B)，且呈现一定的剂量依赖性趋势。值得注意的是，CpG1826和CpG1466+CpG1555对增加总淋巴细胞和CD4+T细胞数目的效果相当。因此，可合理推测CpG1826和CpG1466+CpG1555可互相替代。

Claims (10)

1.一种过继转移寻常型天疱疮动物模型的构建方法，其特征在于，首先通过接种疫苗活化Dsg3 –/– 小鼠供体淋巴细胞，然后将上述淋巴细胞过继转移至Rag2 –/– 小鼠以诱发疾病表型；所述疫苗包括抗原和免疫佐剂，所述抗原成分为重组桥粒黏蛋白3；所述免疫佐剂为TLR激动剂。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Dsg3 –/– 小鼠、Rag2 –/– 小鼠为C57BL/6J背景小鼠，周龄为6-8周。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述TLR激动剂选自下组中的任意一种或几种的组合：dsRNA类似物、DNA类似物、单磷酸脂质A类似物；所述dsRNA类似物包括聚肌苷酸胞苷酸、聚腺苷酸尿苷酸中的任意一种；所述DNA类似物包括CpG 1018、CpG 1466、CpG 1555、CpG 1826中的任意一种；所述单磷酸脂质A类似物包括MPLA、RC529、OM174中的任意一种。
4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述免疫佐剂为MPLA或Poly(I:C)和CpG1826的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种疫苗的途径为有针或无针化的皮下注射、皮内注射、腹腔注射、肌肉内注射、淋巴结内注射、静脉注射或皮肤贴敷中的任意一种；过继转移的途径为有针或无针化的皮下注射、腹腔注射、静脉注射的任意一种。
6.一种过继转移寻常型天疱疮动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备疫苗，将重组桥粒黏蛋白3与免疫佐剂混合，使其成为以重组桥粒黏蛋白3为抗原的疫苗；
（2）将（1）中制备的疫苗接种到Dsg3 –/– 小鼠，分别进行初次免疫和加强免疫，初次免疫为连续接种1-3天疫苗，加强免疫为在接种第14-49天后，再次连续接种1-3天疫苗；
（3）在初次免疫后的28天~63天后，提取淋巴细胞，并将其过继转移至Rag2 –/– 小鼠；
（4）过继转移后的14天-21天内，观察疾病表型的出现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述免疫佐剂为MPLA或poly(I:C)和CpG1826的混合物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，当免疫佐剂为MPLA时，按照重组桥粒黏蛋白3 0.5-50 μg、MPLA 0.5-50 μg的比例配置重组蛋白疫苗，每次给小鼠注射的剂量为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50 μg，MPLA 0.5-50 μg；当poly(I:C)和CpG1826的混合物作为免疫佐剂时，疫苗的配置比例为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50 μg、poly(I:C) 2-300 μg、和CpG18260.2-30 μg，每次给小鼠注射的剂量为重组桥粒黏蛋白3 0.5-50 μg， poly(I:C) 2-300 μg、CpG1826 0.2-30 μg。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，接种疫苗的途径为有针或无针化的皮下注射、皮内注射、腹腔注射、肌肉内注射、淋巴结内注射、静脉注射或皮肤贴敷中的任意一种；过继转移的途径为有针或无针化的皮下注射、腹腔注射、静脉注射的任意一种。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，供体细胞的数量为5×106-2×107。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7060868B1 (en) * 1999-03-31 2006-06-13 Keio University Autoimmune disease model animal
RU2613718C1 (ru) * 2015-11-24 2017-03-21 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздрава России (ФГБУ ГНЦДК Минздрава России) Способ моделирования пузырчатки у мышей методом введения иммуноглобулинов класса g
CN114794017A (zh) * 2022-05-13 2022-07-29 中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所) 一种寻常型天疱疮动物模型的构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7060868B1 (en) * 1999-03-31 2006-06-13 Keio University Autoimmune disease model animal
RU2613718C1 (ru) * 2015-11-24 2017-03-21 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздрава России (ФГБУ ГНЦДК Минздрава России) Способ моделирования пузырчатки у мышей методом введения иммуноглобулинов класса g
CN114794017A (zh) * 2022-05-13 2022-07-29 中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所) 一种寻常型天疱疮动物模型的构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
闫璐等: "天疱疮小鼠模型研究的现状及进展", 《中国皮肤性病学杂志》, no. 10, 15 October 2011 (2011-10-15), pages 85 - 87 *

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