KR101944723B1 - I형 인터페론을 이용한 골수유래 면역반응 억제세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (1) 골수 세포에 Ⅰ형 인터페론(type Ⅰ interferon)을 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계; 및 (2) 분화 유도된 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 제조 방법과, 이에 의해 제조된 수지상 세포 및 그 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 제조되는 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있고, 이에 따라 투여되는 객체의 면역원성을 높임으로써 항암 효과를 발휘하여 항종양 백신 또는 종양 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

I형 인터페론을 이용한 골수유래 면역반응 억제세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도{METHOD FOR PREPARING MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLS USING TYPE 1 INTERFERON, MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLS PREPARED THEREBY, AND USE THEREOF}

본 발명은 I형 인터페론을 이용한 골수유래 면역반응 억제세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도에 관한 것이다.

골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)는 20년 전에 암을 유발시킨 동물 모델에서 증가된다고 보고되었으며, 암의 진행 및 전이에 영향을 준다고 알려졌다. 최근 이들 세포들은 면역 반응에서 기능적으로 중요한 역할을 한다고 평가되어 왔다. 암세포에 의해 유도되는 면역 억제 기전 중 하나는 암에 의한 골수(myeloid) 계열의 CD11b⁺Gr-1⁺ 표현형을 갖는 세포인 골수유래 면역반응 억제세포의 증가이다. MDSCs는 미성숙한 골수계 세포로 종양이나, 자가면역질환, 감염에서 과립구 등이 완전히 분화가 이루어지지 않아 미성숙한 상태로 존재한다. 이들 MDSCs는 암 환자뿐만 아니라 급성 염증 질환, 외상, 패혈증, 기생충 및 진균 감염에서도 증가한다고 알려져 있다.

상기한 골수유래 면역반응 억제세포의 기능은 활성화된 T 세포를 효과적으로 억제하는 역할을 한다. 골수유래 면역반응 억제세포가 T 세포를 조절하는 기전은 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)와 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS), 그리고 아르기나제(arginase)라는 효소가 필수아미노산인 L-아르기닌(L-arginine)의 대사를 극대화함으로써 T 세포 활성을 억제한다고 알려져 있다. 즉, 필수아미노산인 아르기닌(arginine)을 소비하는 효소인 아르기나제-1(arginase-1)을 높은 수준으로 발현하여 주변의 아르기닌(arginine)의 농도를 효과적으로 낮춘다. 아르기닌이 낮은 수준으로 존재하면 면역 세포인 T 세포가 제 기능을 하지 못하게 되며, 아르기닌에 의존하는 효소인 iNOS가 면역 기능에 중요한 매개물인 산화질소 (Nitric oxide, NO)를 더이상 만들지 못하게 될 뿐만 아니라 면역을 억제하는 강력한 독성 산화성 물질인 과산화질소(NO2)가 만들어져 대식세포와 다른 세포계에서 세포막인지질에 산화성 손상을 야기한다. 따라서, 아르기나제와 NOS 활성화를 통해 T 림프구의 증식을 억제하고 ROS의 형성을 통해 T 림프구의 기능을 억제한다고 알려져 있다.

MDSCs는 공통적으로 세포 표면 항원인 CD11b와 Gr-1을 발현하지만, 그 발현 정도가 차이가 있는 이형 개체군(heterogeneous population)의 집합이다. Gr-1은 Ly-6G와 Ly-6C라는 2개의 항원 결정기를 가지며, 이로 인해 CD11b⁺Ly-6G⁺Ly-6C^low를 가지는 과립형인 MDSCs와 CD11b⁺Ly-6G^-Ly-6C^hi를 가지는 단구 형태인 MDSCs로 나뉜다. 암 환자의 경우 과립형인 MDSCs가 70~80%, 단구 형태인 MDSCs가 20~30%를 차지한다고 알려져 있다. 두 개의 MDSCs는 다른 억제 기전으로 T 세포를 억제시킨다. 과립형인 MDSCs는 ROS의 발현이 높게 나타나고 단구 형태의 MDSCs는 NO의 생성이 높게 나타난다.

최근 연구에서는 MDSCs가 암세포나 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 면역기능에 중요한 CD8 T 세포의 기능을 억제한다고 보고되었으며, 염증반응 및 패혈증 질환에서도 MDSCs가 증가하여 면역억제기능을 나타낸다고 보고되었다. 하지만 이들 세포의 세포학적 특성 및 세포분화유도 기전에 관한 연구는 미비한 실정이다.

한편, 수지상 세포(dendritic cell)는 강력한 항원제시세포(professional antigen presenting cells; APC)로 체내 면역 유도 및 면역 조절에 중요한 역할을 담당한다.

인체 내의 수지상 세포는 전체 백혈구의 0.3%에 불과하지만 항원과 접한 적이 없는 원시 T 세포(naive T cell)를 활성화시켜 일차면역반응(primary immune response)을 유도할 수 있으며, 항원특이적인 후천성 기억 면역을 유도할 수 있는 면역 세포이다. 수지상 세포가 강력한 항원제시세포로서 역할을 할 수 있는 것은 세포 표면에 조직적합항원(MHC; major histocompatibility complex I/II) 뿐만 아니라, CD80 및 CD86와 같은 보조자극인자(co-stimulatory molecules)와 ICAM-1와 같은 세포 부착 분자(adhesion molecule)가 높이 발현되어 있고 T 세포 활성화 관련 다양한 사이토카인(cytokine; 인터페론, IL-12, IL-18 등)을 다량 분비하기 때문이다.

이와 같이, 수지상 세포가 항원 특이적인 T 세포 활성을 효과적으로 유도 혹은 조절할 수 있기 때문에 오랫동안 암 또는 난치성 면역 질환의 치료제로 사용 가능성이 연구되어 왔다. 조직 또는 혈액에서 직접 분리한 수지상 세포나, 단핵구에서 분화시킨 수지상 세포를 항원으로 감작시킨 후 성숙화된 수지상 세포를 체내에 다시 주입하면, 강력한 항원 특이적 세포독성임파구 (CTL; cytotoxic T lymphocyte)를 유도한다는 사실이 밝혀짐으로써, 암 또는 감염성 질환의 치료용 백신으로서 개발 가능성이 오래 전부터 검토되어왔다 (Inaba, K. et al., 3. Exp. Med., 178:479, 1993; Inaba, K. et al., Int. Rev.Immunol., 6:197, 1990; Hsu, F. et al., Nature Med., 2:52, 1996).

이러한 초기 연구 결과를 바탕으로 암 치료용 수지상 세포 치료제의 임상 연구가 전 세계적으로 활발하게 진행되고 있으며 다양한 암종에서 결과가 보고되고는 있으나, 아직은 단독 치료요법으로는 임상적 효과가 기대에 못 미치는 실정이다.

수지상 세포 치료제가 아직까지 성공하지 못하고 있는 가장 중요한 이유는 종양세포의 낮은 면역 원성과 암세포가 분비하는 면역억제물질에 기인한 것으로 알려져 있다. 이 경우 수지상 세포가 보다 강력한 항암 면역을 유도하여 종양세포의 낮은 면역 원성을 극복하고 종양세포의 면역 억제능을 뛰어넘을 수 있는 항암 면역을 유도할 수 있다면 치료효과를 크게 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 목적은 면역원성 수지상 세포(dendritic cells, DC)를 유도할 수 있는 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 제조된 골수유래 면역반응 억제세포를 이용하여 미접촉 T 세포(naive T cell)을 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있는 면역원성 수지상 세포를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 제조된 수지상 세포를 포함하는 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 발명자들은 골수 세포(bone marrow cells)에 Ⅰ형 인터페론(type Ⅰ interferon)을 처리하는 경우 PDCA-1 발현 수준이 높은 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)가 유도되고, 이에 성장인자를 처리하는 경우 미접촉 T 세포(naive T cell)를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있는 면역원성 수지상 세포가 유도되는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 골수 세포에 Ⅰ형 인터페론(type Ⅰ interferon)을 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에서는 골수 세포에 Ⅰ형 인터페론을 처리하는 경우 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)로의 분화를 유도할 수 있다.

본 발명에서 상기 "인터페론"은 일반적으로 이중-가닥 RNA의 존재 또는 다른 Ⅰ형 인터페론-유도 자극에 대한 면역계 세포 및 다양한 종류의 다른 세포에 의해서 전형적으로 생산되는 사이토카인에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "Ⅰ형 인터페론"은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, 인터페론-α 수용체(IFNAR)로 알려진 특이적인 세포 표면 수용체 복합체에 결합하는 능력에 의해 확인될 수 있는 인터페론 단백질 하위군의 어떠한 하나의 구성원을 포함할 수 있으며, 상기 복합체는 IFNAR1 및 IFNAR2로 이루어진다(De Weerd et al., 2007, J BiolChem　282　(28): 20053-20057). IFNAR은 키나아제 TYK2 및 JAK1과 연관되어 있다. 일단 활성화되면, IFNAR 복합체는 전사 과정의 신호 전달인자 및 활성인자(STAT) 패밀리 구성원인 STAT1 및 STAT2를 인산화시키고, 이는 인터페론 조절 인자 9(IRF9)와 이종삼량체화되어 인터페론-자극 유전자 인자 3(ISGF3) 복합체(야누스 키나아제(JAK)/STAT 경로)를 형성한다. ISGF3은 핵으로 이동하여 다양한 인터페론-자극 유전자(ISGs)의 조절 영역에서 확인할 수 있는 DNA 모티프인 인터페론-자극 반응 구성요소(ISRE)에 결합한다(상기 Hundeshagen, 2012에 검토됨). 또한 Ⅰ형 인터페론-관련 경로 내에는 다양한 양성 및 음성 피드백 루프가 있다. 포유동물 시스템에서 확인되는 Ⅰ형 인터페론은 IFN-α, IFN-β, IFN-κ, IFN-δ, IFN-ε, IFN-τ, IFN-ω 및 IFN-ζ(리미틴으로도 알려진)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 인체 내 확인되는 Ⅰ형 인터페론은 IFN-α, IFN-β, IFN-κ(IFNK으로도 알려진), 및 IFN-ω이다. IFN-α 단백질의 다양한 아형(IFN-α-2a 및 IFN-α-2b를 포함) 및 IFN-β 단백질의 다양한 아형(IFN-β-1a 및 IFN-β-1b를 포함)은 림프구, 큰포식 세포, 플라즈마사이토이드 수지상 세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 다른 세포를 포함하는 다양한 형태의 세포에 의해 생산되고, 전형적으로 선천성 면역반응에 관련되어 있다. IFN-α는 또한 HCV, 특정의 다른 바이러스 감염 및 일부 암을 포함하는 다양한 질환을 치료하기 위한 인간 투여를 목적으로 상업적으로 생산되고, 대부분은 주로 페길화 형태(예컨대, pegIFN-α)로서 상업적으로 제공되었다. IFN-β는 또한 MS를 포함하는 다양한 질환을 치료하기 위해 상업적으로 생산되었다.

본 발명에서 상기 골수 세포에 처리하는 Ⅰ형 인터페론으로는 IFN-α, IFN-β, IFN-κ 및 IFN-ω으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 IFN-α 및 IFN-β 중 1종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 IFN-β일 수 있다.

본 발명에서 상기 Ⅰ형 인터페론은 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 10 ng/ml 내지 5000 ng/ml 또는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml의 양으로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Ⅰ형 인터페론은 골수 세포의 분화 개시 이전, 분화 개시 시점 또는 분화 중에 1회 이상 처리할 수 있으나, 바람직하게는 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리한 후, 분화 중에 1회 이상 처리할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 골수 세포의 분화는 성장인자를 포함하는 배지에 상기 골수 세포를 접종하여 5일 내지 10일, 5일 내지 7일, 또는 6일 동안 배양하며 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 Ⅰ형 인터페론을 골수 세포의 분화 개시 이전에 1회 이상 처리하는 경우, 상기 Ⅰ형 인터페론을 처리한 어느 일 시점으로부터 36시간, 바람직하게는 24시간 내에 상기 골수 세포에 성장인자를 처리하여 분화를 개시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Ⅰ형 인터페론을 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리하는 경우, 골수 세포를 Ⅰ형 인터페론 및 성장인자가 첨가된 배지에 접종 및 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Ⅰ형 인터페론을 골수 세포의 분화 중에 1회 이상 처리하는 경우, 분화 개시 시점으로부터 3일(72시간) 또는 5일(120시간) 이내에 1회 이상 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "분화 개시"라 함은 골수 세포의 배양 배지에 성장인자를 첨가하거나, 또는 성장인자를 포함하는 배지에 골수 세포를 접종하여 배양하는 공정을 의미할 수 있으나, 성장인자를 사용하여 골수 세포의 분화를 유도할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

본 발명에서 상기 성장인자로는 골수 세포(myeloid cells)의 자극제로서, 바람직하게는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)일 수 있다.

본 발명에서 상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml, 10 ng/ml 내지 100 ng/ml 또는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml의 양으로 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 성장인자를 사용하여 골수 세포의 분화를 개시하는 시점과 분화 중에, Ⅰ형 인터페론을 처리하는 경우, 상기한 골수 세포로부터 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1⁺ 세포 표현형을 가지는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)가 유도될 수 있다.

본 발명에서 상기와 같이 Ⅰ형 인터페론을 처리하여 유도된 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포는 PDCA-1의 발현 수준이 높고, CD124의 발현 수준은 낮으며, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 인터페론-γ(IFN-gamma)로 자극 시 NOS2, 알기나제-1(arginase-1, Arg-1) 및 IL-10를 두드러지게 높은 수준으로 발현하는 특성을 가진다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따라 상기의 특성을 가지는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 수지상 세포의 분화 유도 시 사용되는 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml, 10 ng/ml 내지 100 ng/ml 또는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml의 양으로 처리될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 성장인자는 12시간 내지 7일 동안 처리될 수 있고, 바람직하게는 24시간 내지 5일, 보다 바람직하게는 3일 내지 5일 동안 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1⁺ 세포 표현형을 가지는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리함에 따라 면역원성(immunogenic) 수지상 세포의 분화를 유도할 수 있다.

본 발명에서 상기와 같이 얻어진 수지상 세포는 세포 표현형으로 CD64 및 CD115의 발현 수준이 높고, 지질다당류와 인터페론-γ로 자극 시 IL-12p70, TNF-α, IL-6, IL-10 및 NO₂의 발현 수준이 유의적으로 증가한다. 또한, 본 발명의 수지상 세포로 T 세포를 자극하는 경우 T 세포의 INF-γ의 분비능이 증가되고, 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도하여 면역원성을 높일 수 있다.

이러한 특성을 바탕으로, 본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 수지상 세포를 포함하는 면역 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 면역 치료제는 면역 반응을 증가시키거나, 특정 질병, 감염 또는 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 면역 반응의 일부를 선택적으로 상승시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 수지상 세포를 포함하는 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

종양에 잠재성 항원이 풍부하고 이러한 종양이 수지상 세포에 의해 제시되면 면역원성을 갖는다는 사실에 기초하여, 본 발명에 따른 수지상 세포는 종양 예방을 위한 항종양 백신 또는 종양 치료제로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 수지상 세포를 통해 객체의 면역원성을 증가시킬 수 있으므로, 이를 통해 객체 내 종양의 증식 및/또는 전이를 예방 또는 억제할 수 있다.

본 발명에 사용 가능한 수지상 세포 백신의 항원으로는 막투과 펩타이드와 결합할 수 있는 모든 항원으로, 불활성화 종양세포, 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 종양세포 관련 유전자, 펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 유전자 재조합 방법에 의해 상기 항원을 수득하고자 하는 경우, 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 공지일 수 있으며, 공지된 서열의 전장을 이용할 수 있으나, 전장의 일부를 이용할 수도 있다. 상기 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터에 클로닝하여 목적하는 항원이 발현되도록 할 수 있다.

본 발명에 따른 항종양 백신은 일회 투여함으로써 수행되는 면역화 방법과 연속 투여함으로써 수행되는 면역화 방법을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에서 상기 면역 치료제는 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 수지상 세포를 포함할 수 있다. 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물에 포함되는 수지상 세포의 함량(수)은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포 치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으나, 예를 들면, 2x10⁴ cells/ml ~ 8x10^７cell/ml의 수지상 세포가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법에서 본 발명의 면역 치료제, 항종양 백신 또는 종양치료용 약학적 조성물은 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 피하 또는 피 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 골수 세포로부터 면역원성의 수지상 세포로의 분화가 유도될 수 있는 골수유래 면역반응 억제세포를 유도할 수 있고, 이를 이용하여 대량의 면역원성 수지상 세포 또한 안정적으로 공급할 수 있도록 한다.

또한, 본 발명에서 상기와 같이 공급되는 면역원성 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도할 수 있고, 이에 따라 투여되는 객체의 면역원성을 높임으로써 항암 효과를 발휘하여 항종양 백신 또는 종양 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 TLR 작용제를 처리하는 3가지 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c⁺ 세포의 유도 여부를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c⁺ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 처리되는 TLR 작용제의 농도별 CD11c⁺ 세포 비율의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88^-/- 마우스 각각의 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c⁺MHC-Ⅱ⁺ 세포의 유도 여부를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88^-/- 마우스 각각의 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c⁺MHC-Ⅱ⁺ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c, CD11b, Gr-1, F4/80, Ly6C, CD4, CD8α, CD103, PDCA-1, B220, NK1.1 및 CD49b의 표현형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에서 CD11c⁺, CD11b⁺, Gr-1⁺, F4/80⁺, Ly6C⁺, CD4⁺, CD8α⁺, CD103⁺, PDCA-1⁺, B220⁺, NK1.1⁺ 및 CD49b⁺ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, Gr-1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, Gr-1⁺CD11b⁺CD11c^-, Gr-1^highCD11b⁺CD11c^- 및 Gr-1^intCD11b⁺CD11c^- 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, LyG 및 LyC의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c^-CD11b⁺LyG⁺LyC^-, CD11c^-CD11b⁺LyG⁺LyC^int, CD11c^-CD11b⁺LyG^-LyC^int 및 CD11c^-CD11b⁺LyG^-LyC^high 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88^-/- 마우스로부터 추출한 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c^-CD11b⁺LyG⁺LyC^-, CD11c^-CD11b⁺LyG⁺LyC^int, CD11c^-CD11b⁺LyG^-LyC^int 및 CD11c^-CD11b⁺LyG^-LyC^high 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 NO₂의 형성 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 NOS2 및 아르기나아제-1의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 분선한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 IL-10의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 아르기나아제-1(Arg-1) 및 iNOS의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 아르기나아제-1(Arg-1) 및 iNOS의 발현 수준과, Arg-1/iNOS의 발현 수준의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 있어서, CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 있어서, CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 TNF-α, IL-6, IL-12p70 및 IFN-β의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포 억제능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포의 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 Foxp3의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 조절 T 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포에 있어서 CD11c 및 MHC-Ⅱ의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 CD11c⁺MHC-Ⅱ⁺ 세포의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 M-CSF 처리를 하여 유도된 세포에 있어서 CD11b 및 F4/80의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 M-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 F4/80⁺CD11b⁺ 세포의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 T 세포에 처리한 후 FSC, CD11c 및 F40/80의 발현 수준의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 T 세포에 처리한 후 처리 비율에 따른 T 세포의 증식율의 변화와, IFN-γ 분비율의 변화를 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 단, 도 34에서 'complete'는 완전 배지로, 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지를 의미하고, 'GM-CSF'는 GM-CSF가 첨가된 완전 배지를 의미한다.
도 35는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포에서 CD11c⁺ 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6⁺ 세포 유래 수지상 세포에서 CD11c, PDCA-1, CD115, CCR2, MHC-Ⅱ, CD64, CD11b 및 Ly6C의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6⁺ 세포 유래 수지상 세포에서 Ly6C⁺, MerTK⁺, CD11b⁺, CCR2⁺ 및 PDCA-1⁺ 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 수지상 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6⁺ 세포 유래 수지상 세포를 LPS 및/또는 IFN-γ로 자극하면서 TNF-α, IL-6, IL-10, IL-12p70 및 NO₂의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 수지상 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6⁺ 세포 유래 수지상 세포를 LPS 및/또는 IFN-γ로 자극하면서 IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-5 및 IL-17A의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 수지상 세포와, 골수 유래 수지상 세포, Ly6⁺ 세포 유래 수지상 세포를 CD4 T 세포에 처리한 후 T 세포 증식능과 IFN-γ의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 실시예 10에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 분화 초기(TLR 자극 후 8, 18 및 36시간)에 유도되는 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β 사이토카인의 발현 수준을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 42는 본 발명의 실시예 11에서 골수 세포에 3 method로 TLR 작용제 대신에 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β를 처리한 후 얻어진 M-MDSCs와 수지상 세포의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 43은 본 발명의 실시예 11에서 골수 세포에 3 method로 TLR 작용제 대신에 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β를 처리한 후 각 처리 농도 별 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1⁺ 및 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1^-의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 44는 본 발명의 실시예 12에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제, TLR9 작용제 또는 IFN-β를 처리하여 유도된 Ly6C⁺ M-MDSCs에 GM-CSF를 처리한 후 각 처리 별 CD11c⁺ 세포 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 45는 본 발명의 실시예 12에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제와 IFN-β를 5 ng/ml 또는 25 ng/ml로 추가로 처리하여 유도된 Ly6C⁺ M-MDSCs에 GM-CSF를 처리한 후 각 처리 별 CD11c⁺ 세포 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 46은 본 발명의 실시예 12에서 야생형 및 Ⅰ형 IFN 수용체 넉아웃 마우스로부터 채취한 골수 세포에 3 method로 TLR9 작용제를 처리한 뒤 PDCA-1⁺ M-MDSCs와 수지상 세포의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[ 실시예 1] 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제의 처리

C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용하여 대퇴부 골수 세포(whole bone marrow cells)를 채취하였다. 채취한 골수 세포를 PBS로 세척한 후 적혈구 용혈 버퍼(Sigma Aldrich)를 사용하여 적혈구(red blood cells, RBCs)를 제거하였다. 상기 골수 세포를 6 웰 플레이트(1X10⁶ 세포/ml; 2 ml/웰)에 분주하고 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Lonza, Basel, Switzerland), 10% 우태아 혈청 (Lonza), 50 μM 머캅토에탄올 (Lonza), 0.1 mM 비필수 아미노산 (Lonza) 및 GM-CSF (20 ng/mL)로 보충된 완전-RPMI 1640 (c-RPMI 1640) 배지에서 5% CO₂ 분위기 및 37℃의 온도 조건 하에서 배양하였다. 단, 도 1에 나타낸 바와 같이, TLR2 작용제(Pam3CSK4), TLR3 작용제(poly I:C), TLR4 작용제(LPS, from Escherichia coli O111:B4), TLR7 작용제(이미퀴모드, R837) 및 TLR9 작용제(ODN1826) 각각을 50 ng/ml의 양으로 분화 개시 시점(1 method), 분화 개시 후 3일 째(2 method), 또는 분화 개시 시점과 분화 개시 후 3일 째(3 method)에 배지에 첨가하였다. 배양 3일 째에 웰에 골수 세포와 c-RPMI 1640 배지 1 ml를 추가하였다. 배양 6일 째에 세포를 수집하고, 플루오레세인(Fluorescein) 컨쥬게이트된 CD11c mAb로 염색하여 CD11c⁺ 세포의 비율을 측정하여 도 2 및 3에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제를 3 method로 처리한 경우 수지상 세포의 억제능이 강력하게 유도되었다. 또한, 3 method에 의하되 각 TLR 작용제의 처리 농도 별(TLR2 작용제 (Pam3) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR3 작용제 (Poly I:C) - 10, 100, 500 ng/ml; TLR4 작용제 (LPS) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR7 작용제 (Imiqumoid) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR9 작용제 (CPG:ODN) - 1, 10, 50 ng/ml) CD11c⁺ 세포 비율을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 처리되는 TLR 작용제의 농도 의존적으로 수지상 세포의 분화가 억제되는 것을 볼 수 있었다. 하지만, TLR3 작용제를 처리한 경우는 수지상 세포 분화 억제 효과가 관찰되지 않았다.

[ 실시예 2] 수지상 세포의 분화 억제와 MyD88의 관계 확인

추가적으로 수지상 세포 분화의 억제 효과가 MyD88 의존적으로 유도되는 지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88^-/- 마우스에 대하여 상기 실시예 1의 3 method와 동일한 방법으로 TLR 작용제를 처리하여 분화를 유도한 뒤, CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율을 측정하여 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.

도 5 및 6에서 보는 바와 같이, TLR3 작용제를 처리한 경우를 제외하고, TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하자 CD11c⁺MHC-Ⅱ⁺ 세포의 비율이 감소하였으나, MyD88를 넉아웃 시킨 경우 CD11c⁺MHC-Ⅱ⁺ 세포의 비율이 80% 이상 유지되어, 수지상 세포로의 분화가 유도됨을 볼 수 있었다.

이를 통하여 수지상 세포로의 분화는 MyD88 의존적으로 유도된다는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 3] TLR 자극에 의해 유도되는 세포의 표현형 분석

상기 실시예 1에서 3 method와 동일한 방법으로 골수 세포에 TLR 작용제를 처리하여 6일간 배양 후 수확된 세포의 표현형을 분석한 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 그 결과, TLR 자극으로 유도된 세포들은 수지상 세포의 표현형(CD11c, CD4, CD103, CD8a)은 모두 감소한 반면, Gr-1, Ly6C, CD11b의 발현은 높게 유도된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발현 양상을 통하여 골수 세포로부터 분화 유도된 세포가 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)임을 예측할 수 있었다.

단, TLR 작용제 중에서 특히 TLR7 작용제와 TLR9 작용제의 처리 시 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)의 마커인 PDCA-1가 높게 유도됨을 볼 수 있었지만, pDC의 다른 마커인 B220에는 별다른 차이를 보이지 않아 pDC가 유도된 것은 아님을 알 수 있었다.

이를 통하여 TLR2 작용제 및 TLR4 작용제와, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 시 서로 다른 종류의 MDSCs가 유도됨을 알 수 있었다.

[ 실시예 4] TLR 자극에 의해 유도된 MDSCs의 표현형 확인

상기 실시예 3에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 3 method에 따라 골수 세포에 TLR 자극을 가하여 분화 유도된 세포는 MDSCs임을 알 수 있었다. 한편, 상기 MDSC의 아형은 단핵구(monocytic)-MDSC (M-MDSCs)와 과립구(Granulocytic)-MDSC (G-MDSCs)로 나눌 수 있는데, Gr-1^high 세포는 대부분 G-MDSCs에 해당하고, Gr-1^low은 M-MDSCs로 분류할 수 있다.

이에, Gr-1 항체를 이용하여 상기 실시예 1에서 3 method의 방법으로 6일간 배양 후 수확된 MDSCs에 대하여 Gr-1 발현 수준을 확인하여 도 9 및 10에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제와 TLR4 작용제에 의해 유도된 세포들은 Gr-1^low한 MDSCs가 높게 유도되었으나, 반대로 TLR7 작용제와 TLR9 작용제로 유도된 세포들은 Gr-1^high한 MDSCs가 높게 유도된 것을 확인할 수 있었다.

더 나아가, MDSCs의 정확한 아형을 분류하기 위하여, Ly6G와 Ly6C 항체를 이용해 그 발현 양상을 확인한 결과, 도 11 및 12에서 보는 바와 같이 TLR의 자극에 의하여 골수 세포로부터 G-MDSCs (X₂ 세포)와 M-MDSCs (X₃ 세포 및 X₄ 세포)가 유도되었고, 그 중에서도 M-MDSCs의 비율이 높았으나, TLR2 작용제와 TLR4 작용제 처리 시 Ly6C^int M-MDSCs (X₃ 세포)가, TLR7 작용제와 TLR9 작용제 처리 시 Ly6C^high M-MDSCs (X₄ 세포)가 유도됨을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 5] MDSCs의 분화와 MyD88의 관계 확인

MDSCs 각 아형별 분화가 MyD88 의존적으로 유도되는 지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88^-/- 마우스에 대하여 상기 실시예 1에서 3 method와 동일한 방법으로 수행한 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 Ly6G와 Ly6C의 그 발현 양상을 확인하였다(도 13). 그 결과, TLR2 작용제와 TLR4 작용제 처리 시 Ly6C^int M-MDSCs (X₃ 세포)가 유도되고, TLR7 작용제와 TLR9 작용제 처리 시 Ly6C^high M-MDSCs (X₄ 세포)가 유도되는 것은 MyD88 의존적인 것임을 알 수 있었다.

[ 실시예 6] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도되는 분자적 파라미터

실시예 4에서 보는 바와 같이 골수 세포에 대하여 3 method의 TLR 자극에 의해 분화 유도된 세포가 M-MDSCs인지를 정확히 판단하기 위하여, M-MDSCs에서 유도되는 다양한 인자들을 분석하였다. 또한 이러한 분석에서 TLR2 작용제 및 TLR4 작용제에 의해서 유도되는 Ly6C^int M-MDSCs와, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제에 의해서 유도되는 Ly6C^high M-MDSCs의 기능적 차이를 확인하기 위하여 TLR2-M-MDSC와 TLR9-M-MDSC를 MACS 시스템을 이용하여 분리하였다. 여기서 M-MDSCs의 활성을 유도하기 위하여 LPS와 IFN-γ를 24시간 처리하였다.

구체적으로, NO 키트를 이용하여 NO₂의 형성 수준을, 웨스턴 블럿을 통해 NOS2 및 아르기나아제-1(Arginase-1)의 발현 수준을, ELISA를 통하여 IL-10의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 각각 도 14, 15 및 16에 나타내었다. 또한, FACS를 통하여 아르기나아제-1 및 iNOS의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 도 14 내지 18에서 보는 바와 같이, TLR2 작용제와 TLR9 작용제를 처리한 경우 모두에서 M-MDSCs 요소들이 유도됨을 확인할 수 있었지만, TLR9 작용제를 처리한 경우가 TLR2 작용제를 처리한 경우보다 훨씬 강력한 수준으로 유도됨을 확인할 수 있었다.

또한, TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 경우 유도된 M-MDSCs의 표현형을 확인하기 위하여 CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1의 다양한 마커의 발현 수준을 분석한 결과, 도 19 및 20에서 보는 바와 같이 CD115, F4/60 및 PDCA-1은 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs에서 높게 발현되었고, CD124는 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs에서 높게 발현되었다.

추가적으로, TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 경우 유도된 M-MDSCs에 있어서 ELISA를 이용하여 염증성 사이토카인의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 도 21에 나타내었고, FACS를 이용하여 면역 억제 인자의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 22 내지 24에 나타내었다. 그 결과, TLR9 작용제 처리 후 유도된 M-MDSCs는 TLR2 작용제 처리 후 유도된 M-MDSCs 보다 활성화 되었을 때 염증성 사이토카인을 높은 수준으로 유도하였을 뿐만 아니라 다양한 면역 억제 인자 또한 높은 수준으로 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 7] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도된 M- MDSCs에 의한 T 세포의 증식 억제 및 조절 T 세포의 분화 확인

이하에서는 M-MDSC의 또 다른 특징 중 하나는 T 세포의 증식 억제능과 조절 T 세포의 분화 유도를 확인하였다. 보다 상세하게는 OVA-pulsed DC와 OT-II 마우스의 CellTrace-labeled CD4 T 세포의 공배양(co-culture)을 통하여 T 세포를 활성화 시키고, 상기 실시예 1에서 3 method에 의해 분화 유도된 M-MDSCs를 추가한 뒤 T 세포 억제능을 확인하여 그 결과를 도 25 및 26에 나타내었고, Foxp3의 발현 수준을 확인하여 조절 T 세포의 비율을 확인해 그 결과를 도 27 및 28에 나타내었다.

도 25 내지 28에서 보는 바와 같이, 첨가되는 M-MDSCs의 수 의존적으로 T 세포의 증식은 억제하였고, Foxp3⁺ CD4 T 세포의 수는 증가하였으며, 특히 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs가 TLR2 자극 후 유도된 M-MDSCs 보다 T 세포의 증식 억제능과 조절 T 세포의 분화능이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 TLR9 작용제가 TLR2 작용제 보다 기능적으로 더욱 강력한 M-MDSCs를 유도함을 알 수 있었다.

[ 실시예 8] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도된 M- MDSCs로부터 수지상 세포와 큰포식 세포의 분화능 평가

상기 실시예 1에서 3 method에 따라 분화 유도된 M-MDSC 각각을 6-웰 플레이트(1X10⁶ cells/ml; 2 ml/well)에 분주한 뒤 10% 우태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 20 ng/ml GM-CSF 또는 M-CSF가 보충된 cRPMI 1640에서 5일 동안 배양하고 세포를 수확하였다. 상기 배양으로 수지상 세포의 분화가 유도되었는지 확인하기 위하여 수지상 세포의 항-CD11c와 항-MHC-II를 염색 후 유세포분석기 FACSverse를 통하여 분석하여 그 결과를 도 29 및 30에 나타내었다. 또한, 상기 배양으로 큰포식 세포의 분화가 유도되었는 지 확인하기 위하여 큰포식 세포의 항-CD11b와 항-F40/80으로 염색 후 유세포분석기 FACSverse를 통하여 분석하여 그 결과를 도 31 및 32에 나타내었다.

도 29 내지 32에서 보는 바와 같이, TLR9 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포와 큰포식 세포로 효과적으로 분화가 유도된 반면, TLR2 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs는 큰포식 세포로의 분화는 유도되었으나 수지상 세포로는 거의 분화가 되지 않은 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로 T 세포의 존재 하에서 상기 실시예 1의 3 method에 따라 분화 유도된 M-MDSCs 각각에 GM-CSF를 첨가하여 배양하며 T 세포의 증식 억제능과 수지상 세포로의 2차 분화 정도를 평가하였다. 그 결과 도 33 및 34에서 보는 바와 같이, TLR9 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는 GM-CSF 존재 시 T 세포 증식 억제능 및 IFN-γ 억제능이 현저하게 감소하였으나, TLR2 자극에 의해 유도된 M-MDSCs에서는 이러한 변화를 보이지 않고 지속적으로 T 세포 증식 억제 및 IFN-γ 억제능을 보여 주었다.

또한, 이러한 조건에서 CD11c의 2차 분화 정도를 확인한 결과 도 35에서 보는 바와 같이 TLR9 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는, TLR2 자극에 의해 유도된 M-MDSCs와는 달리 수지상 세포로 효과적으로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다.

이를 통하여, TLR2 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs는 안정한 유지 기능을 가지고 있고, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포로의 2차 분화가 가능함을 알 수 있었다.

[ 실시예 9] TLR9 작용제에 의해 유도된 M- MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포와 큰포식 세포의 기능 분석

이하에서는 본 발명에서 상기 TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포의 특성을 다른 방법으로 분화된 수지상 세포와 비교 분석하였다.

수지상 세포의 In vitro 분화 방법으로는 골수 세포를 이용한 분화 방법과, Ly6C⁺ 세포를 통하여 분화하는 방법 등이 있다. 이에, 상기 골수 세포를 이용한 분화 방법으로, 마우스의 대퇴부 골수로부터 분리된 세포들을 상기 실시예 8에서의 수지상 세포 분화법과 같은 방법으로 5일 동안 배양하였다(Bone marrow derived Dendritic cells, BMDC). 또한 마우스의 대퇴부 골수에서 Ly6C MicroBeads를 통하여 Ly6C⁺ 세포들을 분리 후 위와 같이 배양하였다(Ly6C⁺-derived DC). 이러한 세포들은 5일 후 CD11c MicroBeads를 통하여 수지상 세포만 다시 분리 하였다(>90%).

상기한 방법으로 분리된 수지상 세포와, 상기 실시예 8에서 2차 분화된 수지상 세포의 표현형을 분석하여 그 결과를 도 36 및 37에 나타내었다.

또한 상기한 3종의 수지상 세포 각각을 48-웰 플레이트(1X10⁵ cells/ml) 내 cRPMI 1640 배지에 분주한 뒤 수지상 세포의 자극제로 LPS와 IFN-γ를 처리하여 각각의 수지상 세포가 유도하는 사이토카인의 발현 수준을 ELISA로 분석하였고, NO₂의 형성 수준을 NO 키트로 분석하여 그 결과를 도 38 및 39에 나타내었다. 그 결과 TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 다른 방법으로 유도된 수지상 세포에 비하여 Th1 및 Th2 타입 세포의 분화에 중요한 IL-12p70 및 IL-10을 높은 수준으로 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

추가로, 본 발명에 따른 수지상 세포가 T 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 얻어진 3종의 수지상 세포를 OVA323-339 펩타이드로 1시간 자극시킨 후 OT-II 마우스로부터 분리된 CD4 T 세포와 1:5(DC:T 세포)의 비율로 3일간 공배양한 뒤, T 세포의 증식능과 IFN-γ의 발현 수준을 분석하였다. 도 40에서 보는 바와 같이, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 Ly6C⁺ 유래 수지상 세포보다 T 세포 증식능이 현저히 뛰어난 것을 볼 수 있었으며, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 다른 방법으로 분화된 수지상 세포에 비하여 Th1 세포에서 유도되는 IFN-γ가 매우 높은 수준으로 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 상기 TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs로부터 2차 분화된 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 10] TLR2 및 TLR9에 의해 유도된 M- MDSCs에 있어서 사이토카인의 영향

이하에서는 TLR2 작용제와 TLR9 작용제의 처리에 따라 분화 유도된 M-MDSC 각각에 있어서 표현형, T 세포 억제능, 조절 T 세포 형성능 및 수지상 세포로의 분화 차이가, 상기 TLR 자극에 의해 유도되는 사이토카인의 분비 차이로 인한 것임을 가정하고 실험을 진행하였다. 따라서, 골수 세포에 TLR2 작용제와 TLR9 작용제의 처리 후 분화 초기(TLR 자극 후 8, 18 및 36시간)에 유도되는 사이토카인을 분석하였다. 그 결과, 도 41에서 보는 바와 같이 TLR2 작용제로 처리한 경우 TNF-α, IL-6 및 PGE2가 유도되었고, TLR9 작용제로 처리한 경우 TNF-α, IL-6, IFN-α 및 IFN-β가 유도됨을 확인할 수 있었다. 단, 데이터에는 나타내지 않았으나, TLR2 및 TLR9 자극 시 IFN-γ, IL-15, IL-1β, TGF-β, IL-4, IL-12p70, IL-10 및 FLT2L은 유도되지 않은 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 11] 사이토카인에 의한 M- MDSCs 분화 연관성 분석

상기 실시예 10에서 확인한 바와 같이 TLR 자극에 의해 유도되는 사이토카인에 의한 M-MDSCs 형성 및 수지상 세포 분화 억제와의 관련성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1의 3 method 방법에 의하되, TLR 작용제 대신에 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β를 처리하고 배양 6일 째에 M-MDSCs와 수지상 세포의 형성 유무를 확인하였다. 도 42에서 보는 바와 같이, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β의 처리 시 농도 의존적으로 M-MDSCs가 형성되고 수지상 세포의 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 TLR9 작용제 처리 시 유도되었던 PDCA-1⁺ M-MDSCs 형성이 이러한 사이토카인에 의한 것인지 확인하기 위하여 상기와 같이 배양 6일 째에 얻어진 세포에 대하여 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1⁺ 및 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1^-의 분포를 확인하였다. 그 결과 도 43에서 보는 바와 같이, IFN-α 및 IFN-β의 Ⅰ형 IFN 자극 시 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1⁺의 표현형을 갖는 M-MDSCs가 형성된 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 12] Ⅰ형 IFN에 의해 유도된 M- MDSCs의 수지상 세포로의 분화능 평가

상기 실시예 1의 3 method 방법에 의하되, TLR2 작용제, TLR9 작용제 또는 IFN-β를 처리한 뒤 배양 6일 째에 Ly6C⁺ M-MDSCs 만을 수집한 후 실시예 8과 동일한 방법으로 GM-CSF를 처리하여 3일 배양한 뒤 각 처리 별 CD11c+ 세포 비율을 확인하였다. 그 결과 도 44에서 보는 바와 같이, Ⅰ형 IFN인 IFN-β 처리 시 TLR9 작용제 처리한 경우와 마찬가지로 수지상 세포의 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다.

추가로, 상기 실시예 1의 3 method 방법에 의하여 TLR2 작용제를 처리하면서 IFN-β를 5 ng/ml 또는 25 ng/ml로 추가로 처리한 뒤 배양 6일 째에 Ly6C⁺ M-MDSCs 만을 수집한 후 실시예 8과 동일한 방법으로 GM-CSF를 처리하여 3일 배양한 뒤 각 처리 별 CD11c⁺ 세포 비율을 확인하였다. 그 결과 도 45에서 보는 바와 같이, TLR2 작용제를 처리한 경우 수지상 세포로의 분화가 거의 유도되지 않았지만, TLR2 작용제에 Ⅰ형 IFN인 IFN-β를 함께 처리하자 수지상 세포로의 분화가 Ⅰ형 IFN의 처리 농도 의존적으로 증가하는 것을 확일할 수 있었다.

마지막으로, Ⅰ형 IFN의 기능을 확실히 알아보기 위하여, 야생형 및 Ⅰ형 IFN 수용체 넉아웃 마우스로부터 채취한 골수 세포에 상기 실시예 1의 3 method로 TLR9 작용제를 처리하여 배양 6일째에 PDCA-1⁺ M-MDSCs와 수지상 세포의 형성 정도를 평가하였다. 그 결과 도 46에서 보는 바와 같이, Ⅰ형 IFN 수용체 넉아웃 마우스로부터는 MDSCs 자체가 유도되지 않음을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에서 상기 Ⅰ형 IFN 수용체는 골수 세포로부터 PDCA-1⁺ M-MDSCs의 분화 유도와 그로부터 면역원성 수지상 세포의 분화 유도에 중요한 역할을 하는 것임을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (26)

1. 골수 세포에 Ⅰ형 인터페론(type Ⅰ interferon)을 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계를 포함하고,
   상기 Ⅰ형 인터페론은 IFN-β이고,
   상기 골수유래 면역반응 억제세포는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)이며,
   상기 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포는 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺인, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 Ⅰ형 인터페론은 골수 세포의 분화 개시 이전, 분화 개시 시점 또는 분화 중에 1회 이상 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 Ⅰ형 인터페론은 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리된 후, 분화 개시 후 3일 이내에 1회 이상 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 Ⅰ형 인터페론은 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 양으로 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도는, 성장인자 및 Ⅰ형 인터페론을 포함하는 배지에서 골수 세포를 배양하며 수행되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
8. 제4항에 있어서,
   상기 골수 세포의 분화는 성장인자를 포함하는 배지에 상기 골수 세포를 접종하여 5일 내지 10일 배양하며 수행되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 양으로 첨가되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
11. 삭제
12. 제 1항에 있어서,
    상기 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포는 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺PDCA-1⁺의 표현형을 갖는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.
13. 제1항, 제4항 내지 제10항 및 제 12항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 골수유래 면역반응 억제세포.
14. (1) 골수 세포에 Ⅰ형 인터페론(type Ⅰ interferon)을 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계; 및
    (2) 상기 골수유래 면역반응 억제세포에 성장인자를 처리하여 수지상 세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하고,
    상기 Ⅰ형 인터페론은 IFN-β이고,
    상기 골수유래 면역반응 억제세포는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)이며,
    상기 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포는 CD11c^-CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺인,
    수지상 세포의 제조 방법.
15. 삭제
16. 제14항에 있어서,
    상기 Ⅰ형 인터페론은 골수 세포의 분화 개시 이전, 분화 개시 시점 또는 분화 중에 1회 이상 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
17. 제16항에 있어서,
    상기 골수 세포의 분화는 성장인자를 포함하는 배지에 상기 골수 세포를 접종하여 5일 내지 10일 배양하며 수행되는, 수지상 세포의 제조 방법.
18. 제14항에 있어서,
    상기 (1) 단계는 골수 세포를 성장인자 및 Ⅰ형 인터페론을 포함하는 배지에서 배양하며 수행되는, 수지상 세포의 제조 방법.
19. 제14항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)인, 수지상 세포의 제조 방법.
20. 제14항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 상기 성장인자는 12시간 내지 7일 동안 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
21. 제14항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 양으로 처리되는, 수지상 세포의 제조 방법.
22. 제14항에 있어서,
    상기 수지상 세포는 미접촉 T 세포를 Th1 세포로 분화를 유도하는, 수지상 세포의 제조 방법.
23. 제14항 및 제 16항 내지 제22항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 수지상 세포.
24. 제23항의 수지상 세포를 유효 성분으로 포함하는 면역 치료제.
25. 제23항의 수지상 세포를 유효 성분으로 포함하는 항종양 백신.
26. 제23항의 수지상 세포를 유효 성분으로 포함하는 종양치료용 약학적 조성물.

Images