BR112019015785A2 - Células dendríticas plasmocitóides tendo tolerância imune e método para a produção das mesmas - Google Patents
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Abstract
a presente invenção relata um método para produção de células dendríticas plasmacitóides tendo tolerância imune, células dendríticas plasmacitóides tendo tolerância imune produzidas pelo método, e um agente terapêutico compreendendo as células. a presente invenção poderá induzir uma alta produtividade de células dendríticas plasmacitóides tendo tolerância imune das células dendríticas imaturas através de um processo simples e fácil, e assim possibilitando um estável suprimento de células dendríticas plasmacitóides tendo tolerância imune em grandes quantidades.
Description
“CÉLULAS DENDRÍTICAS PLASMOCITÓIDES TENDO TOLERÂNCIA IMUNE E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DAS MESMAS’’
CITAÇÃO À PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido é baseado em e reivindica prioridade do Pedido de Patente Coreano No. 10-2017-0014018, requerido em 31 de Janeiro de 2017, perante o Escritório Coreano de Propriedade intelectual, cujo texto é ora incorporado em sua integralidade por referência.
CAMPO TÉCNICO [0002] A presente invenção relata um método de produção de células dendríticas plasmacitóides tolerogências, células dendríticas plasmacitóides tolerogências produzidas pelo método, e células de agentes terapêuticos incluindo as mesmas.
ANTECEDENTES [0003] No sistema imune, a resposta imune e a reação da tolerância imune deverão ser coordenadas e balanceadas entre si. Quando uma super reposta imune ocorre, por exemplo, artrite reumatoide, doenças autoimunes como diabetes do tipo I, sepse, e doenças alérgicas hipersensitivas poderão ocorrer. Elas tem uma grande impacto na sobrevivência humana e qualidade de vida. [0004] Previamente, foi através que as células dendríticas atuam como um importante papel somente na indução das respostas imunes. Recentemente, se tornou conhecido que as células dendríticas grandemente contribuem para a reação da tolerância imune. Assim pesquisas nas células dendríticas relataram a reação de tolerância imune ter sido ativa.
[0005] As células dendríticas tem uma papel fundamental não somente na imunidade inativa mas também no controle da imunidade adquirida, que é seletivamente induzida pela causa adquirida. Especificamente, a célula dendrítica é um tipo de um antígeno apresentando célula que realiza uma função de apresentar informação sobre um antígeno invadido do exterior à um célula T.
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2/39 [0006] Além disso, as células dendríticas tem uma ponte entre a imunidade ativa e a imunidade adquirida. As células dendríticas são capazes de iniciar células T idílicas entre as células imunes. As células dendríticas são presentes em uma forma de ramos in um espaço intercelular de cada dos vários tecidos incluindo tecido linfoide. Além disso, as células dendríticas são finalmente células diferenciadas e estando presentes em 1 % ou menos do total de células imunes no corpo. Entretanto, as células dendríticas são capazes de induzir atividade linfócito muito mais fortemente que células monócitos ou macrófagos. As células dendríticas tem um forma imatura originada da medula óssea e poderão ser transferidas para todos os órgãos através da corrente sanguínea. Assim, as células dendríticas poderão desempenhar um papel importante na ativação da célula T pela coleta de antígeno em torno de cada tecido e se movendo aos órgãos linfáticos e então transferindo o antígeno aos linfócitos T.
[0007] Assim, recentemente as células dendríticas tem sido usadas como vacinas imunizantes ou agentes imunoterapêuticos. As vacinas imunizantes e os agentes imunoterapêuticos são todos conhecidos por serem seguros sem efeitos colaterais e seu uso é aumentado para o tratamento de várias doenças. [0008] As células dendríticas são compostas de várias sub-populações dependendo de sua origem, e função. Em particular, células dendríticas plasmacitóides (pDC_ poderão produzir IFN tipo I e altos níveis em resposta à estímulo derivado de vários patógenos. As células dendríticas plasmacitóides sai distintas das células dendríticas convencionais (cDC) baseadas nas superfícies fenótipos. Os expressos pDC B220 e os expresso CD11 em um baixo nível. Entretanto, os expresso cDC ambos CD11c e CD11 b am altos níveis e não expressos B220. Ambos pDC e cDC são obtidos de um processo pelo qual as células dendríticas imaturas são maturas de modo que o pDC e cDC possam atuar como efetivos estimulantes para uma resposta imune harmoniosa.
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3/39 [0009] Como motado, pDC é conhecido para desempenhar um importante papel na defesa contra vários IFNs tipo I na infecção por viroses DNA ou viroses RNA de cadeia única. Em particular, células dendríticas maturas fortemente ativadas pDC, (mDCs) dos presentes antígenos, ajudando a amplificar respostas antivirais por células T. Entretanto, estudo na diferenciação ou papel do pDC no corpo não tem sido vigorosamente comparadas à outras células dendríticas.
[00010] Recentemente, o uso de células dendríticas para o tratamento de doenças autoimunes tem se tornado proeminente. A doença autoimune é uma doença crônica que é estimada para ter bilhões de pacientes em todo o mundo. Há uma urgente necessidade para uma tecnologia de produção de células dendríticas tolerogênicas que mantenham ou acentuem tolerância à imunidade consistentemente pelo controle da expressão de específicos genes responsáveis para a imunidade das células dendríticas ou descobrindo substâncias induzindo tolerância imune. Em particular, apesar de haver muitos estudos que pDCs desempenham um importante papel em vária doenças infecciosas ou autoimunes, um método de diferenciação padronizado e sistemático para produção de pDCs tolerogêncos é desconhecido.
SUMÁRIO [00011] Os inventores da presente invenção descobriram que o tratamento de um agonista receptor tipo toll (agonista TLR) para células dendríticas imaturas para iniciar a diferenciação das células dendríticas imaturas ou tratamento do agonista receptor tipo toll durante a diferenciação das células dendríticas imaturas resulta na indução de células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas. Desta forma, a presente invenção foi alcançada.
[00012] Um propósito da presente invenção é prover um método para a produção de massa das células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas à partir das células dendríticas imaturas.
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4/39 [00013] Outro propósito da presente invenção é prover células dendríticas plasmacitóides que são produzidas pelo método e consistentemente tolerogênico.
[00014] Ainda outro propósito da presente invenção é prover uma célula de agente terapêutico de indução de diferenciação nas células regulatórias T e inibindo a atividade das células efetoras T entre as células imunes usando as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas.
[00015] Outros propósitos e vantagens da presente invenção se tornarão mais aparentes a partir da seguinte detalhada descrição da invenção, reivindicações e desenhos.
[00016] Uma exemplar configuração da presente invenção provê um método de produção de células dendríticas plasmacitóides tolerogências (pDC), o método incluindo uma etapa de tratamento das células dendríticas imaturas com os agonistas receptores tipo toll.
[00017] Além disso, outra exemplar configuração da presente invenção provê células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas induzidos pelo tratamento das células dendríticas imaturas com agonistas receptores tipo toll.
[00018] Além disso, ainda outra configuração exemplar da presente invenção provê uma célula de agente terapêutico que inclui as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas.
[00019] De acordo com a exemplar configuração da presente invenção, as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas poderão ser induzidas à partir das células dendríticas imaturas em uma alta produtividade usando um processo simples e fácil, e assim possibilitando um estável suprimento de grande número de células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas.
[00020] Além disso, de acordo com exemplares configurações da presente invenção, as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas obtidas como acima descrito induzem expressão de citocinas anti-inflamatórias e suprimindo a expressão das citocinas anti-inflamatórias na células
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5/39 regulatórias T, e assim efetivamente prevenindo ou tratamento doenças autoimunes, doenças imunes hipersensitivas ou doenças alérgicas.
[00021] A acima sumário é ilustrativo somente e não sendo intencionada para ser de nenhuma forma limitativo. Em adição aos aspectos ilustrativos, e características descritas acima, outros aspectos, configurações e características se tornarão aparentes por referência aos desenhos apresentados em caráter exemplificativo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
- A Figura 1 mostra um diagrama de design esquemático de um método de tratamento das células dendríticas imaturas usando um fator de indução de diferenciação (meio contendo Flt3L) e agonistas receptores tipo toll (agonistas TLTs) de acordo com uma configuração da presente invenção;
- A Figura 2 mostra a separação de células dendríticas plasmacitóides (TLRspDC) como diferenciada de uma maneira após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção no Exemplo 1;
- A Figura 3A mostra moléculas de expressão de superfície especificamente induzidas às células dendríticas plasmacitóides como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção no Exemplo 1;
- A Figura 3B mostra um raio do número de células dendríticas plasmacitóides como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção, comparado ao número de células dendríticas imaturas no Exemplo 1;
- A Figura 4 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre padrões de expressão de citocina (IFN-α, ΙΡΝβ, IL-12p70, e IL-10) de células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo
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6/39 com uma configuração da presente invenção e as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 2;
- A Figura 5 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre padrões de expressão de citocina (IL-10) de células dendríticas plasmacitóides como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando vários agonistas receptores tipo toll de acordo com uma configuração da presente invenção e as células dendríticas plasmacitóides convencionais (non) no Exemplo 3;
- A Figura 6 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre padrões de expressão da citocina (IFN-a, IFN-β, TNF-a, IL-12p79 e IL-10) baseados no tempo de tratamento das células dendríticas imaturas usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção no Exemplo 4;
- A Figura 7 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre padrões de expressão da molécula complexa MHC, CD80, e CD86, das células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) como diferenciadas de uma maneiras induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção e as células dendríticas plasmacitóides(pDC) no Exemplo 5;
- A Figura 8 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre padrões de expressão de IDO, CCR9 e PD-L1 das células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção e células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 6;
- A Figura 9A mostra resultados de medição usando um citômetro de fluxo LSFRortessa x-20 de proliferação de indicação nas células regulatórias T sendo alcançada pelo tratamento usando as células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com
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7/39 uma configuração da presente invenção usando as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 7 com relação às células T;
- A Figura 9B mostra resultados de medição de um taxa de proliferação de células regularorias T pelo tratamento usando as células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção usando as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pD) no Exemplo 7, com relação à células T;
- A Figura 10 mostra as ligações entre células dendríticas tipo silvestre (WT) e células dendrítica (TLR2-/-) isoladas do camundongo knockout TLR2 e proteína Rv141c no Exemplo 8;
- A Figura 11 é um gráfico mostrando os resultados de comparação entre padrões de expressão da citocina (IFN-a, IFN-β, TNF-a, IL-12p70, IL-10) de células dendríticas plasmacitóides (Rv1411c(0.1 pg/ml)-pDC, Rv1411c (0.5 pg/ml)=pDC como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando um agonista receptor tipo toll (proteína Rv141vc (0..1 pg/ml, 0.5pg/ml) de acordo com uma configuração da presente invenção e das células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 9;
- A Figura 12 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre padrões de expressão de molécula complexa MHC, CD80, CD86, e molécula de indução de tolerância imune (IDO, CCR9 e PD-LI) de células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (proteína Rv1411c) de acordo com uma configuração da presente invenção e as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 10;
- A Figura 13 mostra resultados de comparação de proliferação da célula T como obtida pela mistura e cultura das células T e células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzia após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (proteína Rv1411c) de acordo com uma configuração da presente invenção e proliferação da célula
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T como obtida pela mistura e cultura de células T e células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 11;
- A Figura 14 mostra resultados de comparação de um padrão de secreção de gama-IFN como obtido pela mistura e cultura de células T e células dendríticas plasmacitóides (Rv141c-pDC) como diferenciado de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (proteína Rv1411C) de acordo com uma configuração da presente invenção e um padrão de secreção de gama-IFN como obtido pela mistura e cultura das células T e das células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 11;
- A Figura 15A mostra resultados de medição usando um citômetro de fluxo LSRFortessa x-20 de proliferação de indicação nas células regulatórias T sendo alcançada pelo tratamento usando as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (proteína Rv1411c) de acordo com uma configuração da presente invenção usando as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 12 com relação às células T;
- A Figura 15B mostra resultados de medição de uma taxa de proliferação de células regulatórias T pelo tratamento usando as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de uma maneira induzida após tratamento usando o agonista receptor tipo toll (proteína Rv1411c) de acordo com uma configuração da presente invenção usando as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) no Exemplo 12 com relação às células T;
- A Figura 16 é uma gráfico mostrando os resultados de medições de alterações na proliferação da célula T baseados em um raio de células T preparada à células efetoras CD-25, como obtidas após cultura, juntamente com células T efetoras CD-25 + CD4, células T como diferenciadas pelas células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de
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9/39 uma maneira induzida à uma configuração da presente invenção no Exemplo 13;
- A Figura 17 é um gráfico mostrando resultados de comparação entre o número de células dendríticas plasmacitóides (agonista TLR) induzidas após tratamento como o agonista receptor tipo toll (proteína RYv1411 c e Pam3) de acordo com uma configuração da presente invenção e o número de células dendríticas plasmacitóides induzidas após não tratamento (Non) usando o agonista receptor no Exemplo 14.
[00022] Da Figura 1 à Figura 17, * significa P < 0.05, ** significa P < 0.01 e *** significa P < 0.005.
DETALHADA DESCRIÇÃO [00023] Na seguinte detalhada descrição, referência é feita aos desenhos em anexo, que formam uma parte da mesma. As configurações ilustrativas descrita na detalhada descrição, desenhos e reivindicações não são entendidos para serem limitativos. Outras configurações poderão ser utilizadas, e outra alterações poderão ser feitas, sem fugir do espírito e escopo do assunto aqui apresentado.
[00024] A presente invenção relata ao método de produção de células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas, o método incluindo a etapa de tratamento de células dendríticas imaturas com agonistas receptores tipo toll. [00025] Como usado aqui, o termo “células dendríticas (DCs) refere-se à uma célula apresentando antígeno para absorver o antígeno na célula e apresentando vários antígenos simples à célula T juntamente com complexo classe I (complexo de maior histocompatibilidade) ou complexo II MHC. Além disso, as células dendríticas incluem ambas células apresentando tolerogênico e imunogênico, e poderão ser classificados nas células dendríticas imaturas (“imDC”), células dendríticas semimatura (“smDC”), células dendríticas maturas (“mDC”), de acordo com sua maturidade.
[00026] Como usado aqui, o termo “células dendríticas imaturas” são encontradas nos estágios maduros iniciais das células dendríticas. As células
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10/39 dendríticas imaturas não expressam CD14 como a superfície fenótipo da célula monócito. A célula dendrítica imatura poderá expressar uma das moléculas co-estimulantes CD40, CD54, CD80, CD86 e CD274 em um mas baixo nível que as células dendríticas imaturas.
[00027] Como usado aqui, o termo “células dendríticas semi-imaturas” referese às células dendríticas à células dendríticas que perdem algumas das propriedade das células dendríticas imaturas e tem algumas características doe fenótipo das células dendríticas maturas. Esta célula dendrítica semimatura poderá significar uma célula dendrítica que exibe parcialmente ou incompletamente características fenoticas e formando maturas.
[00028] Como aqui usado, o termo “células dendríticas maturas” refere-se à células nas quais as células dendríticas imaturas são maturadas. As células dendríticas maturas expressam altos níveis de classe II MHC, CD40, CD54, CD80, CD86 e CD274 bem como DC-LAMP, e liberando citocinas antiinflamatórias. As células dendríticas maturas poderão ser caracterizadas por terem a habilidade de motivar um aumento na proliferação das células T alogênicas promitivas e células T singeneicas e/ou aumentada produção de citocinas de células dendríticas em uma reação linfócito misturada. As células dendríticas maturas tipicamente expressam altos níveis de CCR7 E CXCR4.
[00029] Entretanto, de acordo com a presente invenção, as células dendríticas a serem tratadas com o agonista receptor tipo toll são preferivelmente células dendríticas imaturas que não tem diferenciação experimentada. Nesta conexão, as células dendríticas imaturas poderão incluir células dendríticas idílicas e podendo ser isoladas e obtidas de medula óssea de mamíferos e podendo ser isoladas e obtidas da medula óssea de mamíferos e outros.
[00030] Além disso, de acordo com a presente invenção, as células dendríticas tolerogênicas diferenciadas das células dendríticas imaturas pelo tratamento de células dendríticas imaturas usando o agonista receptor tipo toll poderão ser células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas (pDC).
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11/39 [00031 ] Como usado aqui, o termo “células dendríticas plasmacitóides” sal um subconjunto de células dendríticas. A célula dendrítica plasmacitóide foi primeiramente conhecida por histologicamente encontrar a forma de uma célula plasma em um linfonodo huumani pelo Dr. Lennert e Dr. Remmele em 1958. É sabido que as células dendríticas plasmacitóides não expressam um marcador especifico de célula (imunoglobulina). Assim, as células dendríticas plasmacitóides são chamadas de células T plasmacitóides. É sabido que as células dendríticas plasmacitóides expressam antígeno de linhagem mieloide e classe II MHC enquanto não expressando CD3 que é um marcador comum da célula T. Assim, as células dendríticas plasmacitóides são nomeadas como monócitos plasmacitóides. Assim será confirmado que as células dendríticas plasmacitóides tem a capacidade de induzir uma reação linfócito misturada alogênico (MLR) que é uma propriedade intrínseca das células dendríticas. Assim, as células dendríticas plasmacitóides são chamadas células dendríticas plasmacitóides, simplesmente, como “pDC”.
[00032] Como usado aqui, o termo “tolerogênico” se refere não somente à um estado que a célula não exibe uma resposta imune à um específico antígeno, mas também que a célula que inibe a resposta imune. Assim sendo, de acordo com a presente invenção, as “células dendríticas plasmacitóides” promovem secreção de citocinas anti-inflamatórias como IL-10, e inibindo a secreção das citocinas inflamatórias como IL-12p70 e TNF-α. Recentemente, as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas expressaram dioxigenase indoleamina-2,3 (IDO) conhecida como moléculas de indução de tolerância imune, e CCR9 como uma molécula de superfície de células de indução de tolerância imune em altos níveis, e assim induzindo diferenciação das células regulatórias T e para inibir a atividade das células efetoras T.
[00033] De acordo com a presente invenção, as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas poderão ser produzidas e em grandes quantidades pelo tratamento das células dendríticas imaturas usando o agonista receptor tipo toll antes da iniciação da diferenciação ou durante a
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12/39 diferenciação das células dendríticas imaturas. Nesta conexão, “antes da iniciação da diferenciação” poderá incluir o tempo antes do fator de indução de diferenciação a ser aplicado às células dendríticas imaturas. Além disso, a duração “duração da diferenciação” se refere à duração de um tempo quanto o fator de indução de diferenciação for aplicado às células dendríticas imaturas à um tempo antes da diferenciação ser completado pelo fator de indução de diferenciação. Preferivelmente, a duração “duração da diferenciação” poderá ser o fator de indução de diferenciação. Preferivelmente, a duração “durante a diferenciação” poderá incluir a duração do tempo do tratamento do fator de indução da diferenciação à 7 dias após o tratamento. Entretanto, a presente invenção não é limitada à isto. De acordo com a presente invenção , o tempo de aplicação do agonista receptor tipo toll não é limitado à um específico tempo enquanto o agonista receptor tipo toll é aplicado antes ou durante a diferenciação das células dendríticas imaturas como acima descrito. De acordo com a presente invenção, quando o agonista receptor tipo toll por aplicado durante a diferenciação das células dendríticas imaturas, o agonista recepto tipo toll poderá ser aplicado nelas dentro de 7 dias (168 horas), 5 dias (120 horas) ou 3 dias (72 horas) à partir da iniciação da diferenciação. Entretanto, a presente invenção não é limitada à isto. Além disso, de acordo com a presente invenção, quando o agonista receptor tipo toll for aplicado nelas antes da iniciação da diferenciação das células dendríticas imaturas, os fatores induzindo diferenciação podendo ser usados para iniciar a diferenciação das células dendríticas imaturas dentro de 36 horas, preferivelmente 24 horas, da aplicação do agonista receptor tipo toll. Entretanto a presente invenção não está limitada à isto.
[00034] Além disso, de acordo com a presente invenção, o agonista receptor tipo toll poderá ser aplicado uma vez ou mais. Os específicos tempos de aplicação não são particularmente limitados. Em um exemplo, quando aplicar o agonista receptor tipo toll nelas durante a diferenciação das células dendríticas imaturas, o agonista receptor tipo toll poderá ser aplicado nelas ao
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13/39 menos uma vez dentro de 7 dias, 5 dias ou 3 dias à partir do tempo de iniciação de diferenciação das células dendríticas imaturas. Além disso,, quando do tratamento do agonista receptor tipo toll antes da iniciação da diferenciação das células dendríticas imaturas, a diferenciação das células dendríticas imaturas poderá ser iniciada dentro de 36 ou 24 horas de qualquer um ponto de tempo de tratamento das células dendríticas imaturas como agonista receptor tipo toll ao menos uma vez, e então, um ou mais adicionais tratamentos poderão opcionalmente serem realizados durante a diferenciação.
[00035] Nesta conexão, a “iniciação de diferenciação” se refere à adição do fator induzindo diferenciação à um meio de cultura das células dendríticas imaturas, ou à inoculação das células dendríticas imaturas em um meio contendo os fatores de indução de diferenciação. Entretanto, a iniciação da diferenciação não é particularmente limitado enquanto a iniciação da diferenciação poderá induzir a diferenciação das células dendríticas imaturas usando o fator de indução de diferenciação.
[00036] Como usado aqui, o termo “agonista receptor tipo toll” poderá se referir à uma substancia de molécula derivada de uma patógeno e poderá ser padrões moleculares associados patógenos (PAMPs). Nesta conexão, o patógeno poderá ser uma bactéria gram-positiva, bactéria gram-negativa, fungo ou virose. Além disso, o agonista receptor tipo toll poderá ser moléculas endógenas liberadas de células danificadas ou mortas e poderá ser padrões moleculares associados a danos (DAMPS). DAMPs ou PAMPs iniciam uma reposta imune através do sinal TLD e moléculas adaptadoras de coleta dentro do citoplasma da célula para liberar o sinal. O agonista receptor tipo toll poderá ser fragmentos, variantes, análogos, hologo, ou derivados de PAMPs ou DAMPs que se conectam ao receptores tipo toll e induzindo ativação mediada TLR, como ativação de NF-kB. Os fragmentos, variantes, análogos, homólogos ou derivados do agonista receptor tipo toll são ao menos 20 à 90%
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14/39 idênticos ao aminoácidos do agonista TLR e induzindo a ativação mediada do receptor tipo toll.
[00037] O agonista receptor tipo toll aplicado às células dendríticas imaturas de acordo com a presente invenção não é particularmente limitado, mas é um ligante PAMPs, Mais preferivelmente, o agonista receptor tipo toll aplicado às células dendríticas imaturas é capaz de induzir a diferenciação das células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas das células dendríticas imaturas através do sinal (de gene de resposta de diferenciação primária mieloide 88) My D88.
[00038] Além disso, de acordo com a presente invenção, o agonista receptor tipo toll inclui ao menos um selecionado do grupo consistindo de um agonista TLR2, um agonista TLR4, um agonista TLR5, um agonista TLR7, um agonista TLR8, um agonista TLR9, um agonista TLR11, um agonista TLR12, e um agonista TLR13. Mais especificamente, um ou mais dos ligantes mostrados na Tabela 1 abaixo poderão ser incluídos no agonista receptor tipo toll. Entretanto, a presente invenção não é particularmente limitada à isto. Enquanto qualquer ligante poderá ser ligado ao receptor tipo toll da célula dendrítica e podendo encontrar o sinal MyD88, qualquer ligante poderá ser usado sem limitação.
[00039] Além disso, de acordo com a presente invenção, quando o agonista TLR2 for usado como agonista receptor tipo toll, um ou mais dos agonistas TLR1 e TLR6 atuam como co-receptador para o agonista TLR2 podendo ainda ser incluído no agonista receptor tipo toll. Nesta conexão, exemplos específicos do agonista TLR1 e TLR6 poderão ser ligantes mostrados na Tabela 1 abaixo. Os ligantes como o agonista TLR1 e o agonista TLR6 poderão não ser particularmente limitados enquanto os ligantes são capazes de atuarem como co-receptor pra o agonista TLR2, [Tabela 1]
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| Ligante | PAMPs (ligantes Associados Patógenos) | Hospedeiro natural ligante | Ligante sintético |
| TLR1 | Múltiplos lipopeptídeos triacil | Bactéria | Pam3Cys-* |
| TRL2 | Múltiplos glicolipídios | Bactéria | CFA |
| Múltiplos lipopeptídeos | Bactéria | Pam3, MALP2-** | |
| Múltiplas lipoproteínas | Bactéria | Pa,2Cys** | |
| Ácido lipoteicoico | Bactéria gram-positiva | FSL-1 | |
| HSP 70, (outras proteínas de choque aquecido | Células hospedeira | Hib-OMPC | |
| Zimosan (Beta- glucan) | Fungo | ||
| Proteína | Micobactéria m tuberculose | ProteínaRv1411c, ESAT-6, Proteína PE/PP, Rv0577 | |
| TLR3 | RNA de vertente dupla | Vírus | Poly (l:C) Baixo peso molecular ou alto peso molecular |
| TRL4 | Lipopolisacarídeo (LPS); ou IPS análogo (MPLA) | Bactéria GramNegativa | AGP |
| Proteína de choque aquecido | Bactéria e célula hospedeira | MPLA | |
| Fibronogeno | Célula hospedeira | RC-529 | |
| Fragmentos de sulfato de Heparina | Célula hospedeira | MDF2B | |
| Fragmentos de ácido hialurônico | Célula hospedeira | CFA | |
| Níquel | |||
| Vários medicamento opioides | |||
| Proteína | Micobactéria m tuberculose | RpfE, RpfB, Rv2299c, HBHA | |
| TLR5 | Flagelina | Bactéria | Flagelina |
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| TLR6 | Múltiplos lopopeptídeos dyacil | Micoplasma | FSL1-** |
| Pam2Cys** MALP2-** | |||
| TLRV7 | Vírus ssRNA (influenza, VSV, HIV, HCV) | Vírus RNA | Análogos guanosine; imidazoquinolines (por exemplo, Aldara ® R848, Resiquimod®, loxoribina |
| TLRV8 | Pequenos compostos sintéticos; simples RNA isolado | RNA, humano e vírus | Imidazoqulilinas; loxoribina; ssPolyU, 3M-012 |
| TLRV9 | DBAQ oligodeoxinucletóide CpGF Unmetilato. DNA; vírus dsDNA; DNA (HSV, MCMV), Hemozoina plamodium | Bactéria, Vírus DNA | Oligonuceótide CpG, várias sequências como sintetizadas (por exemplo, CpGODN 2006, 1826, 2395) |
| TRL10 | |||
| TLR11 | Profilina | Toxoplasma gondii | |
| TLR12 | Profilina | Toxoplasma gondii | |
| TLR13 | Sequência RNA ribosomal bacterial “CGGAAAGACC” | Vírus, bactéria | |
| *Ligantes reconhecidos por TLR1 e ** Ligantes reconhecidos por TLR2 e TLR6 |
00040] De acordo com a presente invenção, o agonista receptor tipo toll poderá ser derivado de microrganismos, viroses, plantas ou animais ou poderão ser sintetizados. Não há qualquer restrição em uma fonte da mesma.
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17/39 [00041] Além disso, a diferenciação das células dendríticas imaturas de acordo com a presente invenção poderá ser realizada usando o fator de indução de diferenciação. Nesta conexão, será preferível usar ligante 3quinase tirosina tipo FMS (Flt3L) como fator de indução de diferenciação. O fator de indução de diferenciação não é particularmente limitado enquanto o fator de indução de diferenciação poderá induzir a diferenciação das células dendríticas imaturas em células dendríticas plasmacitóides e células dendríticas convencionais (células plasmacitóides convencionais, cDCs).
[00042] Além disso, de acordo com a presente invenção, a diferenciação das células dendríticas imaturas poderá ser acompanhada pela incubação das células dendríticas imaturas em um meio contendí is fatores de indução de diferenciação, pela adição do fator de indução de diferenciação ao meio de cultura para as células dendríticas imaturas.
[00043] Além disso, de acordo com a presente invenção, opcionalmente, o fator de indução de diferenciação poderá ser adicionado uma ou mais vezes durante a diferenciação das células dendríticas imaturas.
[00044] Como usado aqui, o termo “quinase tirosina tipo FMS (Flt3L)” se refere à uma pequena molécula endogenosa que atua como um citocina e fator de crescimento pela ativação de progenitores hematopoiéticos.
[00045] Além disso, de acordo com a presente invenção, a duração da diferenciação das células dendríticas imaturas não é particularmente limitada. A duração da diferenciação das células dendríticas imaturas poderá variar dependendo do tipo do meio a ser usado e o ambiente. Por exemplo, a duração da diferenciação da células dendríticas imaturas poderá ser na faixa de 5 dias à 15 dias, preferivelmente de 7 dias à 10 dias, mais preferivelmente de 8 dias à 9 dias.
[00046] De acordo com a presente invenção, a tolerância imune das células dendríticas plasmacitóides poderá ativada por adicional tratamento do agonista receptor tipo toll às células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas diferenciadas de uma maneira induzida das células dendríticas imaturas pelo
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18/39 tratamento das células dendríticas imaturas usando o agonista receptor tipo toll.
[00047] De acordo com a presente invenção, os tipos de agonistas receptores tipo toll usados para ativa as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas diferenciadas como acima descrito, não são particularmente limitadas mas poderão incluírem ao menos uma selecionada de um grupo consistindo de um agonista TLR1, um agonista TLR2, um agonista TLR3, um agonista TLR4m um agonista TLR5, um agonista TLR6, um agonista TLR7, um agonista TLR8, um agonista TLR9, um agonista TLR11, um agonista TLR12, e um agonista TLR13. Preferivelmente, i agonista TLR9 poderá ser usado.
[00048] De acordo com a presente invenção, a diferenciação das células dendríticas imaturas as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas poderão ser induzidas através do processo acima. Assim sendo, será possível estavelmente suprir uma grande quantidade de células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas através de um simples e fácil processo usando as células dendríticas imaturas.
[00049] De acordo com outra implementação da presente invenção, a presente invenção relata células dendríticas plasmacitóides tolerogênica produzida pelo método.
[00050] As células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas obtidas da presente invenção poderão induzir diferenciação das células regulatórias T e inibir a atividade das células efetoras T, e assim efetivamente suprimindo a resposta imune.
[00051] Além disso, a presente invenção relata agentes terapêuticos de células incluindo células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas.
[00052] Como aqui usado, o termo “agente terapêutico de célula” se refere à um produto medico para tratamento, diagnose, e prevenção através de uma série de ações incluindo proliferação e seleção viva autólogo, alogênico, células xenogênicas in vitro, ou alteração de características biológicas da célula com outros métodos no sentido de restaurar a função de células e
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19/39 tecidos. Os Estados Unidos tem classificado o agente de célula terapêutica como produto farmaceutici desde 1993, e a Coréia desde 2002. Esses agentes terapêuticos de células poderão ser categorizados em duas categorias. Uma primeira categoria inclui agentes terapêuticos de células imunes para o controle de respostas imunes como inibição de resposta imune in vivo ou exacerbação da resposta imune. A segunda categoria inclui um agente terapêutico de célula tronco para regeneração de tecido ou recuperação da função do órgão. O agente terapêutico da células provido de acordo com a presente invenção poderá ser agente terapêutico imune.
[00053] De acordo com a presente invenção, o agente terapêutica da célula poderá ser usado para induzir diferenciação das células regulatórias T ou atividade estimulante das mesmas e podendo ser usado para prevenir ou tratar doenças autoimunes, doença imune com hipersensitividade e várias d oenças alérgicas, por efetiva supressão da resposta imune.
[00054] De acordo com a presente invenção, a rota de administração do agente terapêutico de célula poderá ser qualquer rota convencional enquanto ela possa alcançar o tecido alvo. A rota de administração poderá incluir administração parental. Por exemplo, a administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intravenosa. Entretanto, a presente invenção não é limitada a isto. As composições poderão ser formuladas em uma adequada forma juntamente com um transportador farmacêutico comumente usado n terapia da célula. O termo “transportador farmaceuticamente aceitável” se refere à composições que são fisiologicamente aceitáveis e que, quando administradas à humanos, não normalmente causam reações alérgicas como distúrbios gastrointestinais, tontura, ou outros. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, condutores para administração parental como águam óleos adequados, glucose aquosa e glicóis , etc., e poderão ainda incluir estabilizadores e preservativos. Os estabilizadores adequados incluem antioxidantes como sulfato de hidrogênio
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20/39 sódio, sulfato de sódio ou ácido ascórbico. Preservativos adequados incluem cloreto de benzalcônio, metil, metil ou propilparabeno e clorobutanol.
[00055] Além disso, de acordo com a presente invenção, um agente terapêutico de célula poderá ser administrado por qualquer dispositivo capaz de migrar para uma célula alvo.
[00056] O agente terapêutico celular de acordo com a presente invenção poderá incluir uma quantidade efetiva terapêutica de um agente terapêutico de célula para o tratamento da doença. A quantidade efetiva terapêutica se refere à quantidade do ingrediente ativo ou composição farmacêutica que induz uma resposta médica ou biológica em um sistema de tecido, animal ou humano, como contemplado por um pesquisador, veterinário, físico e outros clínicos. Isto inclui a quantidade que induz o alivio dos sintomas da doença ou enfermidade sendo tratada. Será aparente para um técnico no assunto, conhecedor do estado da técnica, que o conteúdo (número) das células dendríticas plasmacitóides incluídas no agente terapêutico da célula de acordo com a presente invenção variará dependendo do efeito desejado. Assim o agente terapêutico da célula otimizada poderá ser facilmente determinada por um técnico do assunto conhecedor do estado da técnica e poderá ser controlado baseado em vários fatores como o tipo da doença, a severidade da doença, o conteúdo de outros ingredientes contidos na composição, o tipo da formulação, e a idade, peso, estado geral de saúde, sexo e dieta de um paciente, tempo de administração, rota da administração e taxa de secreção da composição, duração do tratamento, um tipo de um medicamento administrado concorrentemente, etc. Por exemplo, as células dendríticas plasmacitóides de 2 x 104 células/ml 8 x 107 células/ml poderão ser incluídas no agente terapêutico da célula. Entretanto, a presente invenção não é limitada à isto.
[00057] No método de tratamento de acordo com a presente invenção, a composição incluindo o agente terapêutico celular de acordo com a presente invenção como um ingrediente ativo poderá ser administrado através de
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21/39 qualquer variedade de rotas incluindo retal, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, instrasternal, percutânea, local, subcutânea intraocular ou rotas intracutâneas.
[00058] O agente terapêutico celular de acordo com a presente invenção que inclui as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas como um ingrediente ativo, poderá ser usado como uma preparação externa da pele para prevenir ou melhoras doenças autoimunes, doenças imunes hipersensitivas, ou doenças alérgicas. Neste caso, a formulação do mesmo dependendo da parte do corpo não é particularmente limitada. Especificamente, a preparação externa poderá ser, por exemplo, uma composição cosmética tendo uma formulação de um agonista suavizado, uma loção nutricional, um creme para massagem, um creme nutricional, uma embalagem, um gel ou um cosmético tipo adesivo de pele. Além disso, a preparação externa poderá ser uma forma de dosagem transdermal como loção, gel, pomada, creme, emplastro ou spray. Além disso, na composição para aplicação externa de acordo com cada formulação, componentes outros que as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas de acordo com a presente invenção poderão ser selecionadas e misturadas nelas sem dificuldade por um técnico no assunto conhecedor do estado da arte dependendo da formulação ou propósito de uso de outras preparações externas para a pele. Neste caso, um efeito sinérgico poderá ocorrer quando os componentes outros que as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas são misturas com as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas.
[00059] Após isso a presente invenção será descrita em maiores detalhes como referência aos Exemplos. Deverá ser entendido por um técnico no assunto conhecedor do estado da técnica que esses Exemplos não somente para descrição da presente invenção mais especificamente, e que o escopo da presente invenção não está limitado à esses Exemplos e estando de acordo com o espírito da presente invenção.
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Exemplos [ Exemplo 1] Efeito requlatório de diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides pelo agonista receptor tipo toll [00060] No tratamento de células dendríticas imaturas usando o agonista receptor tipo toll durante a diferenciação das células dendríticas imaturas, no sentido de checar se as células dendríticas imaturas são diferenciadas de uma maneira induzida nas células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas, o seguinte experimento foi realizado de acordo com o diagrama mostrado na Fig. 1.
[00061] Especificamente, amostras medulas ósseas foram coletadas de seringas coletando medula óssea usando rato C57BL/6. A medula óssea coletada foi lavada com salina tamponada com fosfato (PBS) e células sanguíneas vermelhas foram removidas da mesma usando cloreto de amônio. Células separadas (3 x 106 células/alvéolo) foram inoculadas em uma placa alvéolo-6. Então ,1 m I de RPMI 1640 contendo 10% de FBS (soro bovino fetal), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 50 μΜ de mercapotoetanol, 0.1 mM de aminoácido não essencial, 1mM de piruvato de sódio e 250 ng/ml de FLT3L sendo adicionado nelas para iniciar a cultura e diferenciação das células. No terceiro dia após o início da diferenciação, Pam3 foi aplicado nelas em uma concentração de 100 à 500 ng/ml. Em 5 dias do início da diferenciação, 1 ml de RPMI 1640 foi ainda suplementado nelas. As células foram cultivadas por 8 dias. Das células obtidas após a incubação, as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas foram separadas em uma pureza igual ou superior à 85% por um kit de separação de células dendríticas plasmacitóides (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) e um sistema de triagem de células magnéticas (Vario MACS: Milotenyi Biotec, Auburnm CA) (Fig. 2). Face ao tratamento usando o agonista receptor tipo toll poderá afetar a diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides, moléculas de expressão de superfície especificamente induzidas à partir das células dendríticas plasmacitóides sendo checadas no oitavo dia e os resultados sendo
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23/39 mostrados na Fig. 3A. Além disso no caso (TLRs-pDC) quando as células dendríticas imaturas foram tratadas com o agonista receptor tipo toll, o raio do númeri das células dendríticas plasmacitóides obtidas após o oitavo dia ao número das células dendríticas imaturas foi medido. Os resultados são mostrados na Fig, 3B. Nesta conexa, no sentido de checar a diferenciação do efeito regulatório do agonista receptor tipo toll, o caso sem o tratamento baseado no agonista receptor tipo toll é mostrado no Exemplo Comparativo (pDC).
[00062] Como mostrado na Fig. 2, foi confirmado que a diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides foi induzida pela aplicação do agonista receptor tipo toll às células dendríticas imaturas, Podermos confirmar que não há diferença entre a eficiência da diferenciação no não tratamento usando o agonista receptor tipo toll e a eficiência da diferenciação no tratamento usando o agonista receptor tipo toll.
[Exemplo2] Estímulo às células dendríticas plasmacitóides isoladas e a confirmação do padrão de secreção de citocina das mesmas [00063] No sentido de checar o padrão de secreção da ocitocina das células dendríticas plasmacitóides quando isoladas do Exemplo 1, as células isoladas (5 x 105 células/ml) foram inoculadas em uma placa de alvéolos 48 e tratadas e estimuladas com ODN1826 (1 pg/ml). Nas 24 horas após o estímulo, sobrenadante foi separado, e o padrão de secreção de citocina foi checado por ELISA (enzina ligada à ensaio iminusorvente) e os resultados são mostrados na Fig. 4. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor tipo toll, no Exemplol, o caso no qual o agonista receptor tipo toll não foi aplicado nele durante a diferenciação das células dendríticas imaturas é mostrado no Exemplo Comparativo (pDC).
[00064] Como mostrado na Fig. 4, em geral, um interferon tipo I (IFN-α e IFNβ e as típicas citocinas inflamatórias TNF-α e IL-12p70 foram fortemente induzidas à partir das células dendríticas plasmacitóides (pDC). Entretanto, quando as células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) diferenciadas de
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24/39 maneira induzida através de tratamento com o agonista receptor tipo toll (0.5 pg/ml) foram estimuladas com ODN1826m o nível de expressão do interferon tipo I (IFN-a e IFN-β) e típicas citocinas inflamatórias TNF-α e IL-12p70 foi altamente reduzido. Ao contrário, quando as células dendríticas plasmacitóides (TLRspDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento com o agonista receptor tipo toll (0.5 pg/ml) forma estimuladas de maneira induzida através e tratamento com o agonista receptor tipo toll (0.5 pg/ml) sendo estimuladas com ODN1826, o nível de expressão de IL-10 como uma citocina imunosupressiva foi significantemente aumentado.
[00065] Desta forma, foi mostrado que as células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida das células dendríticas imaturas através de aplicação do agonista receptor tipo toll às células dendríticas imaturas de acordo com a presente invenção tem tolerância imune ao contrário das células dendríticas plasmacitóides convencionais.
[Exemplo 3] Confirmação do padrão de secreção IL-10 das células dendríticas plasmacitóides induzidas através de tratamento usando vários agonistas receptores tipo toll [00066] No sentido de checar o efeito de indução à tolerância imune de vários agonistas receptores tipo toll, a diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides sendo induzida pelo mesmo método do Exemplo 1. Os ligantes mostrados na Tabela 2 foram usados como o agonista receptor tipo toll. À partir das células obtidas após 8 dias de cultura, as células dendríticas plasmacitóides foram separadas em uma pureza igual ou superior que 85% por um kit de separação de células dendríticas plasmacitóides (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) e um sistema de seleção de células magnéticas (Vario MACS: Miltenyi Biotec, CA). As células separadas (5 x 105 células/ml) foram inoculadas em uma placa alvéolo 48. ODN1826 (1 pg/ml) foi aplicado nela e as células sendo cultivadas por 24 horas. Assim, o sobrenadante foi separado. O padrão de secreção da citocina imunosupressiva IL-10 foi então checado por ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima). Os resultados
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25/39 são mostrados na Fig. 5. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor tipo toll, o caso no qual o agonista receptor tipo toll não sendo aplicado nele durante a diferenciação das células dendríticas imaturas sendo mostrada como Exemplo Comparativo (non).
[Tabela 2]
| Non | Agonista TLR2 | Agonista TLR3 | Agonista TLR4 | Agonista TKR7 | Agonista TLR9 | |
| Não tratamento | Pam3 | Poly 1: C | LPS | Imiquimod | CpGODN |
00067] Como mostrado na Fig. 5, o nível de expressão de il-10 de somente as células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida através de tratamentos com agonistas TLR2, TLR4, TLR7 e TLR8 que afetam o sinal MYD88 entre vários agonistas receptores tipo toll sendo significativamente aumentado quando as células dendríticas plasmacitóides foram estimuladas com ODN1826.
[00068] Neste caso, somente o tratamento usando os receptores tipo toll que afetam o sinal MYD88 durante a diferenciação das células dendríticas imaturas poderá induzir as células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas. [Exemplo 4] Confirmação do padrão de secreção da citocina das células dendríticas plasmacitóides de acordo com o tempo de tratamento usando agonista receptor tipo toll [00069] A diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides foi incluída pelo mesmo método como no Exemplo 1 no sentido de checar o efeito de indução de tolerância imune do agonista receptor tipo toll de acordo com o ponto de tempo do tratamento. Além disso, os agonistas receptores tipo toll foram aplicados no tempo inicial da diferenciação (0 dia de tratamento) e sendo aplicado em 3 dias após o início da diferenciação (3 dias de tratamento). Após o total de 8 dias de cultura, as células dendríticas plasmacitóides foram isoladas deles em uma pureza igual à ou superior à 85% usando um kit de separação das células dendríticas plasmacitóides (Miltenyi Biotec, Auburn. CA) e um sistema de triagem de célula magnética (Vario
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MACS: Miltenyi Biotece, Auburn, CA). As células separadas (5 x 105 células/ml) foram isoladas em uma placa alvéolo 48. ODN1826 ) 1 pg/ml) foi aplicado nelas e as células foram cultivadas por 24 horas. Então, o sobrenadante foi separado. O padrão de secreção da citocina foi então checado por ELISA (ensaio imunossorvente ligado à enzima). Os resultados são mostrados na Fig. 6. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor tipo toll, o caso no qual o agonista receptor não sendo aplicado nelas durante a diferenciação das células dendríticas imaturas sendo mostrado como Exemplo Comparativo (não tratamento, non).
[00070] Como mostrado na Fig. 6, quando o agonista receptor tipo toll foi aplicado no início da diferenciação (0 dia de tratamento) ou 3 dias (3 dias de tratamento), o nível de expressão do interferon tipo I (IFN-α e IFN-β) e TNF-a e IL-12p70 como as mais proeminente citocinas inflamatória sendo inibidas quando comparadas com o não tratamento, mas o nível de expressão de IL10 como uma citocina anti-inflamatória foi significativamente aumentado quando comparados como o não tratamento.
[00071] Assim, mesmo quando o agonista receptor tipo toll foi aplicado simultaneamente juntamente com o fator de indução de diferenciação FLT3L, ou seja, quando o agonista receptor tipo toll foi aplicado no início do tempo de diferenciação das células dendríticas plasmacitóides, a diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas foi induzida como no caso do tratamento usando o agonista receptor tipo toll durante a diferenciação das células dendríticas imaturas.
[Exemplo 5] Confirmação da expressão de fator de co-estímulo e molécula MHC das células dendríticas plasmacitóides induzidas através de tratamento com agonista receptor tipo toll [00072] Células dendríticas incluindo células dendríticas plasmacitóides poderão apresentar um antígeno externo através de moléculas MHC para
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27/39 ativar as células T quando detectar o antígeno externo e podendo expressar fatores de co-estímulo como CD80 e CD86 para interações de estímulo. [00073] Assim, as células dendríticas plasmacitóides isoladas do Exemplo 1 foram estimuladas com ODN1826 e então cultivadas por 24 horas. Então, os níveis de expressão das moléculas das superfícies das células das mesma foram checadas. Para investigar o efeito das células dendríticas plasmacitóides na superfície do fator de expressão, anticorpos anti-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences), e anti-PDCA-1 (PerCP-eFluor 710 ebioscience) como específicos marcadores às células dendríticas plasmacitóides, e anticorpos anti-CD80 (v450, BD Biosciences). Anti-CD86 (APC, ebioscience), anti-MHC-l (PE, ebioscience) e anti-MHC-ll (APC-eFluor 780, ebioscience) como específicos marcadores das moléculas das superfícies das células foram aplicados nelas à 4Q C por 30 minutos. Então, as células dendríticas plasmacitóides tratadas foram analisadas usando um dispositivo de fluxo de citometria LSRFotessa x-20 (BD Biosciences). Os resultados são mostrados na Fig. 7. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor tipo toll, o caso no qual o agonista receptor tipo toll não foi aplicado nelas durante a diferenciação das células dendríticas imaturas sendo mostrado como Exemplo Comparativo (pDC).
[00074] Como mostrado na Fig. 7,o fator de co-estímulo CD86 e molécula classe II MHC apresentando antígeno exógeno foram expressados em altos níveis à partir das convencionais células dendríticas plasmacitóides (pDC). Entretanto, o fator de co-estímulo CD86 e molécula classe II MHC apresentando o antígeno exógeno não foram expressados ou foram expressados em um nível inferior à partir das células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) induzidas através de tratamento com agonista receptor tipo toll. Ao contrário, um dos outros co-fatores de estímulo, e moléculas classe I CD80 e MHC apresentando o antígeno endógeno ou antígeno cruzado foram expressados em altos níveis à partir das células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) induzidas através de tratamento com
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28/39 agonista receptor tipo toll, comparado às células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) sem tratamento com agonista receptor tipo toll.
[Exemplo 61 Confirmação da expressão de molécula induzindo tolerância imune das células dendríticas plasmacitóides induzidas através de tratamento com agonista receptor tipo toll [00075] As células dendríticas convencionais ativam a resposta imune adquirida pela indução da resposta da célula T através da apresentação de antígeno. Entretanto, algumas células dendríticas tolerogênicas tem sido reportadas para suprimir as respostas das células T. A inibição das respostas imunes tem recentemente sido reportada para se alcançada pela indução de várias moléculas induzindo tolerância imune, por exemplo, PD-L1 e IDO, Além disso,CCR9 + pDCs foram reportadas para induzir várias fenômenos de tolerância imune através de forte indução das células regulatórias T.
[00076] Assim sendo, no sentido de checar a expressão de moléculas induzindo tolerância imune à partir das células dendríticas plasmacitóides isoladas do Exemplo 1, anticorpos anti-CD11c (PE-Cy7, BD Biosciences) e anti-PDCA-1 (PerCP-eFluor 710. Eboscience) marcadores específicos para as células dendríticas plasmacitóides, eanti-PD-L1 (PE, ebioscience), e antiCCR9 (FITCn ebioscience) como moléculas de superfície de células induzindo tolerância imune sendo aplicadas nelas à 4Q C por 30 minutos, Além disso, para determinar a expressão do IDO induzido na célula, substancia de fixação/impermeabilização (BD Bioscience) foi aplicada nelas à 4Q C por 30 minutos e anti-IDO (eFluor 660 ebioscience) foi manchado. Os níveis de expressão dos mesmos foram analisados usando um citômetro de fluxo LSRFortessa x-20 e os resultados sendo mostrados na Fig. 8. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor tipo toll, o caso no qual o agonista receptor tipo toll não sendo aplicado neles durante a diferenciação das células dendríticas imaturas no Exemplo 1 é mostrado como o Exemplo Comparativo (pDC).
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29/39 [00077] Como mostrado na Fig. 8, quando as células dendríticas plasmacitóides induzidas através de tratamento do agonista receptor tipo toll foram estimuladas com ODN1826, os níveis de expressão de moléculas CCR9 e IDO das mesma foram significativamente aumentados comparado com as células dendríticas plasmacitóides convencionais sem tratamento. Quando as células dendríticas plasmacitóides induzidas através de tratamento com o agonista receptor tipo toll não foram estimuladas com ODN1826, o nível de expressão das moléculas CCR9 das mesmas foi mais alto comparado com as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) sem tratamento.
[00078] Assim, no tratamento usando agonistas receptores tipo toll durante a diferenciação das células dendríticas imaturas, a diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides tendo tolerância imune poderá ser induzida. [Exemplo 7] Confirmação da habilidade na indução da célula T pelas células dendríticas plasmacitóides induzidas através de tratamento usando agonista receptor tipo toll [00079] As células dendríticas plasmacitóides tolerogências (Tolerogênica pDCs) foram reportadas para induzir diferenciação na células regulatórias T (Treg) e inibir a atividade ou proliferação das células efetoras T.
[00080] Assim, se examinou se as células regulatórias T (Foxp3 + CD4 + células T) são proliferadas pelas células dendríticas plasmacitóides (TLRspDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando o agonista receptor tipo toll. Especificamente, as células T isoladas do rato alogénico e então coradas com CelITrace (Invitrogen) foram misturadas e cultivadas com as células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) isoladas do Exemplo 1 em um raio de mistura de 5: 1 por 5 dias de cultivo. As células dendríticas plasmacitóides estimuladas com ODN1826 (ODN +) e as células dendríticas plasmacitóides não estimuladas com ODN1826 (ODN-) foram usadas como células dendríticas plasmacitóides. Após 6 dias de cultura, antiCD4 (Percp-cy5.5, ebioscience) foi aplicado nelas à 4Q por 30 minutos e então
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30/39 o fator de transmissão Foxp3 usando tampão (eBioscience) foi aplicado nelas à 37Q C por 30 minutos, Após o tratamento dom anti-Foxp3 (PE, ebioscience), os resultados foram checados pelo citômetro de fluxo LDRFortessa x-20 por proliferação na célula regulatória T. A Fig. 9 mostra os resultados. A taxa de proliferação das células regulatórias T foi calculada e os resultados mostrados na Fig. 9B. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor tipo toll, as células dendríticas plasmacitóides estimuladas com ODN1826 são indicadas como ODN + enquanto as células dendríticas plasmacitóides convencionais não estimuladas com ODN1826 são indicadas como Exemplo Comparativo (pDC).
[00081] Como mostrado na Fig. 9, as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) não induziram proliferação da célula regulatória T. Entretanto, como as células dendríticas plasmacitóides convencionais foram sujeitas ao estímulo com ODN1826 (ODN +), isto resultou na inibição da proliferação na célula regulatória T. Ao contrário, quando as células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) diferenciadas de maneira induzida através do agonista receptor tipo toll baseado em tratamento foram sujeitas ao estímulo com ODN1826 (ODN +1), isto induzir a proliferação da célula regulatória T mais significativamente que quando as células dendríticas plasmacitóides (TLRs-pDC) diferenciadas de maneira induzida através do agonista receptor tipo toll baseadas em tratamento não foram sujeitas ao estímulo com ODN1826 (ODN-).
[00082] Assim, quando as células dendríticas plasmacitóides (YLRs-pDC) diferenciadas de maneira induzida de acordo com a presente invenção foram sujeitas ainda ao agonista receptor tipo toll baseadas em tratamento, a ativade tolerogênica foi induzida e a diferenciação nas células regulatórias T foi ainda induzida.
[Exemplo 8] Confirmação da atividade de proteína Rv1411c como agonista receptor tipo toll
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31/39 [00083] Vários estudos mostraram que as proteínas derivadas de M. tuberculose poderão se ligar à vários receptores tipo toll. Assim, a ligação da proteína Rv1411c às células dendríticas diferenciadas da medula óssea do rato Knockout TLR2 e do rato tipo silvestre foi checada para verificar a atividade da proteína Rv1411c como um agonista receptor tipo toll.
[00084] Especificamente, a medula óssea do rato foi separada do rato e as células sanguíneas foram removida dele. Para diferenciação nas células dendríticas, a medula óssea foi cultivada por 8 dias em um meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 1% de antibiótico e 10ng/ml de FG-CSF (fator de estímulo macrófago granulócito). Após 8 dias de cultura, 5 pg/ml de proteína Rv1411 c foi aplicada à cada das células dendríticas do rato tipo silvestre (WT) e células dendríticas isoladas do rato knockout TLR2 (TLR2-/-) e então intermitentemente misturas entre si por outras 2 horas, para facilitar a ligação da proteína às células dendríticas. Então após macular a mistura usando anticorpos tendo anticorpo antígeno específico para moléculas His classificadas à proteína RV1411c, o grau de ligação entre elas foi medido usando um citômetro de fluxo. Os resultados são mostrados na Fig. 10.
[00085] Como mostrado na Fig. 10, as células dendríticas tipo silvestres (WT) foram encontradas para ter aumentada ligação à proteína Rv1411c comparada às células derivadas knockout TLR2 (TLR2-/-). Quando s células dendríticas derivadas knockout TLR2 (TLR2-/-) foram tratadas usando a proteína Rv1411c, a resistência de ligação entre elas foi confirmada para ser a mesma daquela do grupo experimental não tratado.
[00086] Assim, foi confirmado que a proteína Rv1411 c liga o receptor TLR2 e tem atividade como o agonista TL2.
[Exemplo 9] Indução da habilidade de diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides tolerogências pela proteína Rv1411c [00087] A diferenciação nas células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas foi induzida pelo mesmo procedimento do Exemplo 1. O agonista receptor tipo toll empregado na proteína Rv1411c (0.1 pg/ml), cuja atividade como agonista
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32/39 receptor tipo toll foi confirmada no Exemplo 8. Após 8 dias de cultura, as células dendríticas plasmacitóides foram separadas à uma pureza de 85% ou mais usando um kit de separação de células dendríticas plasmacitóides (Miltenyi Biotec, CA) e um sistema de triagem de célula magnética (Vario MACS: Miltenyi Biotec, CA). As células separadas (5 x 105 células/ml) foram inoculadas em uma placa alvéolo 48. Após tratamento das células com ODN1826 (1 pg/ml), as células foram cultivadas por 24 horas. Após a cultura, o sobrenadante foi separado e então o padrão de secreção de citocina foi checado através do Ensaio Imunoabsorção (ELISA). O resultado é mostrado na Fig. 11. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando a proteína Rv1411c, as células dendríticas plasmacitóides tratadas com a proteína Rv1411c é indicada como RV1411c-pDC, e as células dendríticas plasmacitóides convencionais estimuladas com ODN1826 (ODB +) e não estimuladas com ODN1826t (ODN-) são indicadas como Exemplo Comparativo (pDC).
[00088] Como mostrado na Fig. 11, quando as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411c) (0.1 pg/ml)-pDC, Rv1411c (0.5 pg/ml)-pDC tratado com a proteína Rv1411c foram estimuladas com ODN1826, a expressão do interferon tipo I (IFB-α e IFN-β) e TNF-a e IL-12p70, como típica citocina inflamatória como fortemente induzida à partir das células dendríticas plasmacitóides foi drasticamente reduzida de uma maneira de concentração dependente, enquanto o nível de expressão de IL-10, como uma citocina imunossupressora tendo uma classificação aumentada de uma maneira de concentração dependente.
[00089] Esses resultados sugerem que as células dendríticas plasmacitóides tratadas com a proteína Rv1411 c tem a tolerância imune que não o caso para células dendríticas plasmacitóides convencionais. O nível de tolerância imune foi aumentado em proporção à concentração da proteína Rv1411c.
[Exemplo 10] Confirmação da expressão do fator de co-estímulo, molécula MHC, e molécula de indução da tolerância imune das células dendríticas
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33/39 plasmacitóides de uma maneira induzida pelo tratamento com proteína Rv1411c.
[00090] No Exemplo 9, os padrões de expressão das moléculas de superfície e enzimas das células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida através do tratamento usando a proteína Rv1411c foram checados. [00091] Primeiramente, para investigar o efeito das células dendríticas plasmacitóides na expressão do fator de superfície, anticorpos anti-CD11c (PE-Cy7, BD Bisciences) e anti-PDCA-1 (PerCP-eFluor 710, ebioscience) anticorpos como específicos marcadores às células dendríticas plasmacitóides e anti-CD80 (v450m BD Biosciences), anti-CD86 (APC, ebioscience), anti-MHC-l (PE, ebioscience), anti-MHC-ll (APC-eFluor 780, ebioscience), anti-PD aos fatores de superfícies de células sendo aplicados à 4Q C por 30 minutos. Além disso, para determinar a expresso do IDO induzido na célula, a substância de fixação/permeabilização (BD Bioscience) foram aplicadas nela à 4Q C por 30 minutos, e o anti-IDO (eFluor 660, ebioscience) foi corado após tratamento. Os níveis de expressão das mesmas foram analisados usando um citômetro de fluxo LSRFortessa x-20 e os resultados são mostrados na Fig. 12. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando a proteína Rv1411c, as células dendríticas plasmacitóides tratadas com a proteína Rv1411c é indicado como Rv1411c-pDCm e as células dendríticas plasmacitóides convencionaid estimuladas com ODN1826 (ODN +) e não estimuladas com ODN1826 (ODN -) são indicadas como Exemplo Comparativo (pDC) como não tratados com a proteína Rv1411c.
[00092] Como mostrado na Fig. 12, o fator de co-estímulo CD86 e a molécula classe I apresentando antígeno exógeno são expressados em altos níveis das células dendríticas plasmacitóides convencionaid (pDC) como não tratadas com a proteína Rv1411c durante o estímulo ODN1826 das mesmas. Entretanto, o fator co-estimulatório CD86 e a molécula classe I MHC apresentando antígeno exógeno são expressados em muitos altos níveis ou não são expressados à partir das células dendríticas plasmacitóides
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34/39 (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de maneira induzida através de tratamento com proteína Rv1411 c durante o estimula ODN1826 das mesmas. [00093] Ao contrário, CD80 como um dos outros fatores co-estimulatórios, e uma molécula classe I MHC apresentando o endógeno ou antígeno cruzado foi expressado em maiores níveis à partir das células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como mais diferenciadas de maneira induzida através de tratamento com proteína Rv1411c que das células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC).
[00094] Além disso, os níveis de expressão de PD-L1, CCR-9 e moléculas IDO a partir das células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de maneira induzida através de tratamento com proteína Rv1411c foram significativamente aumentadas durante o estímulo ODN1826 nas mesmas (ODN+) comparado com o não estímulo ODN1826 (ODN-). Além disso, o nível de expressão do CCR9 e PD-L1 das células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) como diferenciadas de maneira induzida através de tratamento com proteína Rv1411c durante o não estímulo ODN1826 (ODN-) são mais altos que os níveis de expressão das mesmas das células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC).
[00095] [Exemplo 11] inibição da ativação da célula T por células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida pelo tratamento do a proteína Rv1411c [00096] A mais importante característica das células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas in vivo é inibir a atividade dos linfócitos T. O seguinte experimento foi conduzido para checar i efeito das células dendríticas plasmacitóides tolerogênicas diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando proteína Rv1411 c no Exemplo 9 na proliferação e atividade das células T.
[00097] Especificamente, as células T (1.5 c 105 células/alvéolos) como isoladas do rato alogénico e corado com um CelITrace (Invitrogeno) foram estimulados com 1 x PMA/lonomicina (ebioscience). Este tratamento do
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35/39 lonomicina/PMA aumenta a taxa de proliferação dos linfócitos T, e assim promovendo a secreção do gamma interferon (IFN-gamma). Quando essas reações forem realizadas, as células t foram misturadas em um raio de mistura de 1:5 com as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411c-pDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando proteína Rv1411c ou células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) e então a mistura sendo cultivada por 3 dias. Após 3 dias, abti-CD4 (Percp-cy5.5, ebioscience) e anti-CD8 (Percp-cy5.5), ebioscience) foram aplicados nelas à 4Q C por 30 minutos. A mistura tratada foi tingido, A proliferação das células T foi analisada por um citômetro de fluxo LSRFortessa x-20 e os resultados são mostrados na Fig. 13. Além disso, o sobrenadante obtido após 3 dias de cultura foi separado, e então o segundo padrão de secreção do gamma-IFN foi checado através de um Ensio de Imunoabsorvente Ligado à Enzima (ELISA). Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando a proteína Rv1411c, as células dendríticas plasmacitóides tratadas coma proteína Rv1411c é indicada como Rv1411c-pDC, e as células dendríticas plasmacitóides convencionais estimuladas com ODN1826 (ODN +) e não estimuladas com ODN1826 (ODN -) são indicadas como Exemplo Comparativo (pDC) como não tratadas com a proteína Rv1411c.
[00098] Como mostrado na Fig. 13, ambas células dendríticas plasmacitóides (Rv1411c-pDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando a proteína RV1411c e as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando a proteína Rv1411 c tem inferior habilidade de indução da proliferação das células T + CD4 comparado às células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC).
[00099] Em adição, como mostrado na Fig. 14, as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411c-pDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usado a proteína Rv1411c em um nível inferior de secreção do
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36/39 gamma-IFN comparado àquele das células dendríticas plasmacitóides convencionais não tratadas.
[Exemplo 12] Controle da diferenciação da célula T pelas células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando a proteína Rv1411c [000100] As células T quando isoladas do rato alogênico e tingidas com um CelITrace (Invitrogen) foram misturadas em um raio de mistura de 10: 1,5 ou 1:1 com as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411c-pDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento usando a proteína Rv1411c ou células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) e então a mistura foi cultivada por 5 dias. Nesta conexão, as células dendríticas plasmacitóides foram estimuladas com ODB1826 (ODN +) e estimuladas com ODN1826 (ODN No quinto dia após a incubação, anti-CD4 (Percep-cy5.5, ebioscience) e anti-CD4 (Percp-cy5,5, ebioscience) foram aplicados nelas à 4Q C por 30 minutos. Então, um tampão de coloração do fator de transcrição/anti-Foxp3 (ebioscience) foi aplicado nelas à 37Q C por 30 minutos. Então, a mistura foi colorida com anti-Foxp3 (PE, ebioscience). A proliferação nas células regulatórias T foi checada usando um citômetro de fluxo LSRFortessa x-20. Os resultados não mostrados na Fig. 15(a). Além disso, a proliferação da taxa da célula regulatória T foi calculada e os resultados sendo mostrados na Fig, 15(b).
[000101] Como mostrado na Fig. 15m as células dendríticas plasmacitóides convencionais (pDC) não induziram a proliferação da célula regulatória T. Quando o estímulo com ODN1826 foi aplicado à pDC, isto leva à inibição da proliferação da célula regulatória T. Ao contrário, quando as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) diferenciadas de maneira induzida através de tratamento com a proteína Rv1411c foi sujeita ao estímulo com ODN1826 (ODN +), isto induzindo a proliferação da célula regulatória T mais significativamente que quando as células dendríticas plasmacitóides (Rv1411 c-pDC) foi estimulada (ODN -). Quando o raio das células dendríticas
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37/39 plasmacitóides (Rv1411c-pDC) às células T aumenta, se poderá checar que a taxa de proliferação das células T regulatórias ainda aumentaram.
[000102] Assim, o agonista receptor tipo toll, foi ainda aplicado à célula dendrítica plasmacitóide tolerogênica diferenciada de maneira induzida de acordo com a presente invenção, a capacidade tolerogênica poderá ser ativada para permitir a proliferação da célula regulatória T para se ainda efetivamente induzida.
[Exemplo 13] Inibição da atividade da célula efetora T pelas células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida pelo tratamento com a proteína Rv1411 c [000103] As células regulatórias T tem sido reportadas para induzir as células dendríticas plasmacitóides e inibir a proliferação de outras células T. Assim sendo, foi examinada a atividade das células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida pela proteína Rv1411c baseada no tratamento de acordo com o Exemplo 12 com célula regulatória T.
[000104] Primeiramente, o baço do rato é separado e os glóbulos vermelhos são removidos dele. CD4 + células T efetoras CD-25 foram isoladas usando um sistema de triagem de células magnéticas (MACS) e coloridas com uma proliferação de tinta violeta para determinar o grau de proliferação. Então, as células T diferenciadas foram incubadas juntas com as células T efetoras CD25, CD4 +, por 2 dias em alvéolos revestidos com anticorpos anti-CD3 e antiCD28. Como um resultado, a alteração na habilidade da proliferação da célula T foi medida baseada no raio das células T primadas às células T efetorasCD25. Os resultados são mostrados na Fig. 16.
[000105] Como mostrado na Fig. 16, as células T induzidas pelas células estimuladas ODN1826 (Rv1411c-pDC)(ODN) entre as células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida pela proteína Rv1411c baseada em tratamento reduzido pelo nível diferenciado das células efetoras T.
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38/39 [000106] Assim, quando o agonista receptor tipo toll foi ainda aplicado à célula dendrítica tolerogênica diferenciada de acordo com a presente invenção, a habilidade tolerogênica poderá ser ativada para permitir a ativação da célula T efetora para ser efetivamente inibida.
[Exemplo 14] Aquisição da produtividade das células dendríticas plasmacitóides diferenciadas de maneira induzida pelo tratamento usando agonista receptor tipo toll [000107] A medula óssea da coxa foi coletada do rato C57BL/6 usando uma seringa de coleta de medula óssea. A medula óssea coletada foi lavada com salina tamponada com fosfato (PBS), e glóbulos vermelhos foram removidas dela usando cloreto de amônia. As células separadas ( 5 x 105 células/alvéolos) foram inoculadas em uma placa elveodo-6. Então, 1 ml de RPMI 1640 contendo 10% de FBS (soro de bovino fetal), 2 mM glutamina-L, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 50 μΜ de mercaptoetanol, 0.1 nM de aminoácido não essencial, 1 nM de piruvato de sódio e 259 ng/ml de FLT3 foi adicionado nelas para iniciar cultura e diferenciação das células. No terceiro dia após o início da diferenciação, Pam3 e a proteína Rv1411c como o agonista receptor tipo toll foram aplicados nelas em uma concentração de 100 à 500 ng/ml. Nos 5 dias do início da diferenciação, 1 ml de RPMI 1640 foi ainda suplementado nelas. As células foram cultivadas por 8 dias. Das células obtidas após a incubação, as células dendríticas plasmacitóides foram separadas em uma pureza igual à ou superior que 85% pelo kit de separação das células dendríticas plasmacitóides (Miltenyi Biotec, Auburn, CA_ e um sistema de triagem de células magnéticas (Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Os resultados da medição do número (agonista TLR) das células dendríticas plasmacitóides isoladas são mostrados na Fig. 17. Nesta conexão, no sentido de checar o efeito do tratamento usando o agonista receptor do tipo toll, o caso de não tratamento usando o agonista receptor tipo toll durante a diferenciação das células dendríticas imaturas é mostrado no Exemplo Comparativo (non).
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39/39 [000108] Como mostrado na Fig. 17, quando o agonista receptor tipo toll for aplicado às células dendríticas imaturas durante a diferenciação das células dendríticas imaturas (agonista (TLR), o número de células dendríticas plasmacitóides como diferenciadas de maneira induzida foi significativamente aumentado comparado com aquele do não tratamento (non).
[000109] Assim, quando o tratamento usando os agonistas receptores do tipo toll for realizado durante a diferenciação das células dendríticas imaturas, uma grande quantidade de células dendríticas plasmacitóides tolerogências poderá ser produzida.
[000110] Do citado acimam será apreciado que várias configurações da presente invenção foram aqui descritas com o propósito de ilustração, e que várias modificações poderão ser feitas sem fugir do escopo e espírito da presente invenção. De acordo com isso, as várias configurações mostrada aqui não são intencionadas para serem limitativas, com o real escopo e espírito sendo indicado pelas seguintes reivindicações.
Claims (20)
- REIVINDICAÇÕES1 .-“MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM CÉLULA DENSTRÍTICA PLASMACITÓIDE TOLEROGÊNICA (pDC), caracterizado por o método compreender tratamento em uma célula dendrítica imatura usando um agonista receptor tipo ferramental.
- 2. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental ser aplicado à célula dendrítica imatura antes da iniciação da diferenciação ou durante a diferenciação da célula dendrítica imatura, de forma a induzir a diferenciação da célula dendrítica imatura na célula dendrítica plasmacitóide tolerogênica.
- 3. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental ser aplicado a célula dendrítica imatura à um tempo de compilação de diferenciação da célula dendrítica imatura na célula dendrítica plasmacitóide tolerogênica.
- 4. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por a diferenciação da célula dendrítica imatura na célula dendrítica plasmacitóide tolerogênica ser realizada usando um fator de indução de diferenciação.
- 5. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o fator de indução de diferenciação incluir quinase tirosina tipo FMS.
- 6. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o fator de indução de diferenciação ser aplicado à célula dendrítica imatura em uma ou mais vezes.
- 7. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental e o fator de indução de diferenciação serem correntemente aplicados à célula dendrítica imatura.
- 8. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental ser aplicado à célula dendrítica imatura em uma ou mais vezes.Petição 870190094694, de 23/09/2019, pág. 43/572/3
- 9. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental afetar o sinal MyD88 (gene de resposta primário de diferenciação de Mielóide 88).
- 10. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental incluir ao menos um selecionado de um grupo consistindo de uma agonista TLR2, um agonista TLR4, um agonista TLR5, um agonista TLR7, um agonista TLR8, um agonista TLR9, um agonista TLR11, um agonista TLR 12 e um agonista TLR13.
- 11 .-“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental ainda incluir ao mens um dos agonistas TLR1 e TLR6.
- 12. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o método ainda incluir adicionalmente a aplicação do agonista receptor tipo ferramental à célula dendrítica plasmacitóide tolerogênica diferenciada, e assim ativar a tolerância imune.
- 13. -“MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o agonista receptor tipo ferramental usado para ativar a tolerância imune ser um agonista TLR9.
- 14. -“CÉLULA DENDRÍTICA PLASMACITÓIDE TOLEROGÊNICA”, caracterizada por ser induzida pelo tratamento da célula dendrítica imatura usando um agonista receptor tipo ferramental.
- 15. -“CÉLULA DENDRÍTICA PLASMACITÓIDE TOLEROGÊNICA”, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por a célula dendrítica plasmacitóide tolerogência ser diferenciada de uma maneira induzida pelo tratamento da célula dendrítica imatura usando o agonista receptor tipo ferramental antes da iniciação da diferenciação ou durante a diferenciação da célula dendrítica imatura.
- 16. -“CÉLULA DENDRÍTICA PLASMACITÓIDE TOLEROGÊNICA”, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o agonista receptor tipo ferramental incluir ao menos um selecionado de um grupo consistindo de umPetição 870190094694, de 23/09/2019, pág. 44/573/3 agonista TLR2, um agonista TLR4, um agonista TLR5, um agonista TLR7, um agonista TLR8, um agonista TLR9, um agonista TLR11, um agonista TLR12 e um agonista TLR13.
- 17. -“CÉLULA DENDRÍTICA PLASMACITÓIDE TOLEROGÊNICA”, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o agonista receptor tipo ferramental ainda incluir ao menos um dos antagonistas TLR1 e TLR6.
- 18. -“AGENTE TERAPÊUTICO DE CÉLULA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 à 17, caraterizado por compreender a célula dendrítica plasmacitóide tolerogênica.
- 19. -“AGENTE TERAPÊUTICO DE CÉLULA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por o agente terapêutico da célula induzir diferenciação nas células regulatórias T.
- 20. -“AGENTE TERAPÊUTICO DE CÉLULA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o agente terapêutico de célula inibir a atividade das células efetoras T.
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