CN110337491A - 免疫耐受性浆细胞样树突状细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法和根据上述方法制备的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞及包含其的细胞治疗剂。本发明通过简单且容易的工序来从未成熟树突状细胞以高产率诱导出具有免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞，从而能够实现大量免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的稳定供给。

Description

免疫耐受性浆细胞样树突状细胞及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法和根据上述方法制备的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞及包含其的细胞治疗剂。
背景技术
在免疫系统中，免疫反应与免疫耐受互相协调并保持平衡。在发生过度免疫反应的情况下，可发生类风湿性关节炎、1型糖尿病的自身免疫疾病和败血症以及过敏性疾病等，其对人类生存和生活质量具有很大影响。
以往，人们认为树突细胞仅在诱导免疫反应中起重要作用，但最近随着人们已知它们对免疫耐受反应也有很大贡献，对其的研究正变得更活跃。
树突状细胞作为对先天免疫及因后天性因果选择性产生的获得性免疫调节起到中枢作用的细胞，具体地，是执行呈递从外部侵入T细胞的抗原信息的功能的代表性的抗原呈递细胞的一种。
并且，上述树突状细胞作为先天免疫与后天免疫之间的桥梁的细胞，相当于在在免疫细胞中可启动(priming)初始T细胞(naive T cells)唯一细胞。其在包括淋巴组织在内的多种组织的各组织细胞间隙中以树枝形态存在。并且，上述树突状细胞作为最终分化的细胞，其在体内存在整体免疫细胞的1％以下，与单核细胞或巨噬细胞相比，可以更强烈地诱导淋巴细胞的活性，并且以未成熟的形态源自骨髓途径血流迁移到体内的所有器官。由此，树突状细胞采集各组织周边的抗原并迁移到淋巴器官，以向T淋巴细胞转移抗原，从而对T细胞的激活起到重要的作用。
由此，最近，上述树突状细胞被用作免疫疫苗或免疫治疗剂，并且已知上述免疫疫苗或免疫治疗剂安全且均无副作用，因而其对于各种疾病的使用正在扩大。
另一方面，上述树突状细胞根据起源(origin)、表型(phenotype)及功能(function)等由各种部分亚群(subpopulations)组成。具体地，对应于各种病原菌来源刺激，浆细胞样树突状细胞(plasmacytoide dendritic cells，pDC)可以以高水平生产I型IFN。其通过这些表面表型区别于常规树突状细胞(conventional Dendritic cells，cDC)。上述pDC表达B220，且以低水平表达CD11c，相反地，cDCs以高水平表达CD11c及CD11b，但不表达B220。上述pDC及cDC通过未成熟树突状细胞成熟的过程获取，使得它们可用作和谐免疫反应的有效刺激物。
如上所述，已知pDC在因DNA病毒或单链RNA病毒而传染时通过分泌大量的I型IFNs来激活免疫细胞，从而在防御病毒传染中起到重要的作用。尤其，其通过强烈激活可呈递抗原的成熟的树突状细胞(maturated DCs，mDCs)来有助于扩增基于T细胞的抗病毒反应。然而，与其他树突状细胞相比，对于pDC在体内分化或作用的研究微乎其微。
最近，自身免疫疾病治疗用树突状细胞的活用是突出的。自身免疫疾病作为慢性疾病，是估计全球有数十亿患者的主要疾病。迫切需要通过调节主管树突状细胞的免疫的特定基因的表达或发现免疫耐受诱导物质来使免疫耐受性始终得到维持或强化的免疫耐受性树突状细胞的制备技术。尤其，尽管已经进行了许多证明pDC在各种自身免疫疾病或传染性疾病中起到重要作用的研究，然而尚不清楚用于制备免疫耐受性pDC的系统性且标准化的分化方法。
发明内容
技术问题
对未成熟树突状细胞(dendritic cells)处理Toll样受体激动剂(toll-likereceptor agonist，TLR agonist)后，在上述未成熟树突状细胞开始分化或分化期间处理Toll样受体激动剂的情况下，本发明的发明者发现了诱导了免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，从而实现了本发明。
本发明的一目的在于，提供可从未成熟树突状细胞大量制备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的方法。
本发明的再一目的在于，提供通过上述方法制备始终并始终显示免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞。
本发明的另一目的在于，提供利用上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞可在免疫细胞中的也诱导分化成调节T细胞，并可抑制效应T细胞的活性的细胞治疗剂。
本发明的另一目的及优点通过以下的发明的详细说明、发明要求保护范围以及附图变得更明确。
解决问题的手段
为了实现上述目的，本发明提供包括对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂(toll-like receptor agonist)的步骤的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendritic cells，pDC)的制备方法。
并且，本发明提供通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来被诱导的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
并且，本发明提供包含上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的细胞治疗剂。
发明的效果
本发明通过简单且容易的工序来从未成熟树突状细胞以高产率诱导出具有免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞，从而能够实现大量免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的稳定供给。
并且，在本发明中，如上所述获取的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞通过诱导抗炎性细胞因子的表达，抑制炎性细胞因子的表达，促进向调节T细胞的分化来可有效预防或治疗自身免疫疾病、过敏性免疫疾病或过敏性疾病等。
附图说明
图1为示出根据本发明一实施例的对未成熟树突状细胞的分化诱导用因子(Flt3L-containing media)及Toll样受体激动剂(TLRs agonists)的处理方法的设计图的图。
图2为示出在实施例1中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Pam3)后的被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的分离的图。
图3的(a)部分为示出在实施例1中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，特异诱导到被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的表面表达分子的图。
图3的(b)部分为以图表的方式示出在实施例1中根据未成熟树突状细胞与本发明一实施例的数量的比率处理Toll样受体激动剂(Pam3)后的被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的数量的比率的图。
图4为以图表的方式示出实施例2中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中对细胞因子(IFN-α、IFN-β、IL-12p70、IL-10)的表达形态进行比较的结果的图。
图5为以图表的方式示出实施例3中根据本发明一实施例处理各种Toll样受体激动剂后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞与一般浆细胞样树突状细胞(non)中对细胞因子IL-10的表达形态进行比较的结果的图。
图6为以图表的方式示出根据实施例4的根据本发明一实施例的对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂(Pam3)的时间点对细胞因子(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-10)的表达形态进行比较的结果的图。
图7为以图表的方式示出实施例5中根据本发明一实施例处理各种Toll样受体激动剂(Pam3)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中对MHC complex分子、CD80及CD86的表达形态进行比较的结果的图。
图8为以图表的方式示出实施例6中根据本发明一实施例处理各种Toll样受体激动剂(Pam3)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中对IDO、CCR9及PD-L1的表达形态进行比较的结果的图。
图9的(a)部分为示出实施例7中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)，之后通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖到调节T细胞的结果的图。
图9的(b)部分为示出实施例7中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Pam3)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)，之后测量调节T细胞的增殖率的结果的图。
图10为示出实施例8中野生型树突状细胞(WT)及从TLR2基因敲除小鼠分离的树突状细胞(TLR2-/-)与Rv1411c蛋白的结合程度的图。
图11为以图表的方式示出实施例9中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白(0.1μg/ml，0.5μg/ml))后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c(0.1μg/ml)-pDC，Rv1411c(0.5μg/ml)-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中对细胞因子(IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-10)的表达形态进行比较的结果的图。
图12为以图表的方式示出实施例10中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，在被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中对MHC complex分子、CD80、CD86及免疫耐受诱导分子(IDO、CCR9及PD-L1)的表达形态进行比较的结果的图。
图13为以图表的方式示出实施例11中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，混合被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)并培养后，对T细胞的增殖程度进行比较的结果的图。
图14为以图表的方式示出实施例11中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，混合被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)与一般浆细胞样树突状细胞(pDC)并培养后，对IFN-gamma的分泌形态进行确认的结果的图。
图15的(a)部分为示出实施例12中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)，之后通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖到调节T细胞的结果的图。
图15的(b)部分为示出实施例12中根据本发明一实施例对T细胞处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(RVc1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)，之后测量调节T细胞的增殖率的结果的图。
图16为以图表的方式示出实施例13中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(Rv1411c蛋白)后，将通过诱导的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)分化的T细胞与CD4+、CD25-效应T细胞一同培养后，相对于CD25-效应T细胞与启动的T细胞的比率T细胞增殖能的变化的结果的图。
图17为以图表的方式示出实施例14中根据本发明一实施例处理Toll样受体激动剂(RYv1411c蛋白及Pam3)后，对浆细胞样树突状细胞(TLR agonist)与未处理诱导的浆细胞样树突状细胞(Non)的数量进行比较的结果的图。
然而，在图1至图17中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005。
具体实施方式
本发明的最佳实施方式
本发明涉及包括对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂的步骤的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法。
在本说明书中，术语“树突状细胞(dendritic cell，DC)”是指通过将抗原吸收到细胞内部来与MHC(major histocompatibility complex)类I复合物或MHC类Ⅱ复合物一同对各种抗原样品呈递到T细胞的专职性抗原呈递细胞(professional antigen presentingcell)。并且，树突状细胞包含免疫原性(immunogenic)及免疫耐受性(tolerogenic)抗原呈递细胞，根据成熟度可分为未成熟树突状细胞(immature dendritic cells；“imDC”)、半成熟树突状细胞(semimature dendritic cells；“smDC”)及成熟树突状细胞(maturedendritic cells；“mDC”)。
在本说明书中，术语“未成熟树突状细胞”在树突状细胞的早熟期发现，不表达作为单核细胞的表面表型的CD14，并且，共同刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86及CD274中的任一种以低于成熟树突状细胞的水平表达。
在本说明书中，术语“半成熟树突状细胞”作为丧失一部分未成熟树突状细胞的特性且具有一部分成熟树突状细胞的表型的特性的树突状细胞，是指部分或不完全地显示成熟的形态及表型性特性的树突状细胞。
在本说明书中，术语“成熟树突状细胞”是指由未成熟树突状细胞成熟形成的细胞。成熟树突状细胞的特征在于，DC-LAMP以及MHC类Ⅱ、CD40、CD54、CD80、CD86及CD274的表达高，且具有在释放抗炎性细胞因子(proinflammatory cytokine)、混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction)增加初始同种异系T细胞(allogeneic T cells)及同种同系T细胞(syngeneic T cells)的增殖和/或生成树突状细胞细胞因子的增加。成熟树突状细胞通常以高水平表达CCR7及CXCR4。
然而，在本发明中，优选地，处理上述Toll样受体激动剂的树突状细胞为未分化的未成熟树突状细胞。其中，上述未成熟树突状细胞可包含初始树突状细胞(naivedendritic cells)，可以从哺乳类的骨髓等分离并获取。
并且，在本发明中，通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的免疫耐受性树突状细胞可以是免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendritic cells，pDC)。
在本说明书中，术语“浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells)”是指树突状细胞的一个子集(subset)，1958年，由Dr.Lennert与Dr.Remmele初次从人体的淋巴结组织学性地发现浆细胞(plasma cell)的形态并被公开，然而由于其不表达B细胞特定标记(immunoglobulin)，不表达作为T细胞的共同标记的CD3且表达淋系抗原(myeloidlineage antigen)和MHC类Ⅱ，因而由命名为浆细胞样T细胞(Plasmacytoid T cells)改命名为血浆单核细胞(plasmacytoid monocyte)。之后，随着确认具有可以诱导作为树突状细胞的原有性质的同种异系混合淋巴细胞反应(allerogenic mixed lymphocyte reaction，MLR)的能力，再次被命名为浆细胞样树突状细胞，并且也可以简称为“pDC”。
在本说明书中，术语“免疫耐受性”是指对于特定抗原不显示免疫反应的状态以及抑制免疫反应的状态。因此，在本发明中，上述“免疫耐受性浆细胞样树突状细胞”促进IL-10等的抗炎性细胞因子的分泌，抑制IL-12p70及TNF-α等的炎性细胞因子的分泌，并且由于最近被称为免疫耐受诱导分子的吲哚胺-2,3双加氧酶(indoleamine-2,3dioxygenase，IDO)分子及作为免疫耐受诱导细胞的表面分子的CCR9以高水平表达，因而诱导调节T细胞(regulatory T cells)的分化，可抑制效应T细胞(effector T cells)的活性。
在本发明中，可在上述未成熟树突状细胞从开始分化之前到分化期间处理上述Toll样受体激动剂以稳定地大量制备免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。其中，上述“开始分化之前”可以包括对未成熟树突状细胞处理分化诱导用因子之前的时间点。并且，上述“分化期间”可以指从对上述未成熟树突状细胞处理分化诱导用因子的时间点到通过上述分化诱导用因子完成分化之前的时间点。优选地，可包括从处理分化诱导用因子的时间点到上述处理后的7天以内的时期，但不限于此。
在本发明中，只要是如上所述仅在未成熟树突状细胞的开始分化之前或分化期间处理，上述Toll样受体激动剂对具体时间点没有特别限制。然而，在本发明中，在未成熟树突状细胞的分化期间处理上述Toll样受体激动剂的情况下，可在从开始分化时间点至7天(168小时)、5天(120小时)或3天(72小时)以内处理，但不限于此。并且，在本发明中，在未成熟树突状细胞的开始分化之前处理上述Toll样受体激动剂的情况下，可在处理上述激动剂的时间点到36小时，优选地，24小时以内使用分化诱导用因子开始分化未成熟树突状细胞，但也不限于此。
并且，在本发明中，可以处理上述Toll样受体激动剂一次以上，虽然没有特别限制具体处理次数，但是在未成熟树突状细胞的分化期间处理上述Toll样受体激动剂的情况下，可从上述未成熟树突状细胞的开始分化时间点至7日、5日或3日之内处理上述Toll样受体激动剂至少一次。并且，在未成熟树突状细胞的开始分化之前处理上述Toll样受体激动剂的情况下，对上述未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂一次以上后，从任一处理时间点至36小时或24小时之内开始分化上述未成熟树突状细胞，可在其分化期间选择性地追加处理一次以上。
其中，上述“开始分化”可指对未成熟树突状细胞的培养基添加分化诱导用因子或通过对包含分化诱导用因子的培养基接种未成熟树突状细胞并培养的工序，但是只要是其可以使用分化诱导用因子诱导未成熟树突状细胞的分化，则没有特别限制。
在本说明书中，术语“Toll样受体激动剂(toll-like receptor agonist)”作为病原体(pathogen)衍生保存物质，可以是PAMPs(Pathogen associated molecularpatterns)。其中，上述病原体可以是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌或病毒。并且，上述Toll样受体激动剂作为从损伤或死细胞释放的内因性(endogenous)分子，可以是DAMPs(Damage associated molecular patterns)。为了通过TLR信号开始免疫应答并传递信号，DAMPs或PAMPs在细胞的细胞质内收集衔接分子。上述Toll样受体激动剂与片段、变体、类似物、同源(homology)或Toll样受体相结合，可以是用于诱导NF-κB活动的激活等的基于TLR-介导的激活的PAMPs或DAMPs的衍生物。作为上述Toll样受体激动剂的片段、变体、类似物、同源或衍生物与TLR激动剂的氨基酸的至少30～99％相同，用于诱导基于Toll样受体-介导的激活。
在本发明中，虽然没有特别限制对上述未成熟树突状细胞处理的Toll样受体激动剂的种类，但是，优选地，PAMPs配体，更优选地，为可途径髓样分化因子初次应答基因88(Myeloid differentiation primary response gene 88)信号的种类可从未成熟树突状细胞诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化。
并且，在本发明中，上述Toll样受体激动剂可包含选自由TLR2激动剂、TLR4激动剂，TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂以及TLR13激动剂组成的组中的一种以上，更具体地，可包含下表1所示的配置中的一种以上，但不限于此。只要能够与树突状细胞的Toll样受体相结合且途径髓样分化因子初次应答基因88信号的配体，则均可使用。
并且，在本发明中，将TLR2激动剂用作上述Toll样受体激动剂的情况下，还可以包含用作其辅助受体(co-receptor)的TLR1激动剂及TLR6激动剂中的一种以上。其中，作为上述TLR1激动剂及TLR6激动剂的具体示例可以是下表1中所示的配体，但只要是用作上述TLR2激动剂的辅助受体的配体，则没有特别限制。
表1
在本发明中，上述Toll样受体激动剂可以来源于微生物、病毒、植物或动物，并且可以是合成的，其起源没有特别限制。
并且，在本发明中，上述未成熟树突状细胞的分化可通过使用分化诱导用因子来执行。其中，优选地，使用FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3，Flt3L)作为上述分化诱导用因子，但是只要是能够将上述未成熟树突状细胞诱导分化成浆细胞样树突状细胞及一般树突状细胞(conventional plasmacytoid cells，cDCs)，则没有特别限制。
并且，在本发明中，上述未成熟树突状细胞的分化可通过在包含分化诱导用因子的培养基培养上述未成熟树突状细胞，或在上述未成熟树突状细胞的培养基添加上述分化诱导用因子来执行。
并且，在本发明中，选择性地，上述分化诱导用因子可在分化上述未成熟树突状细胞的过程中另外添加一次以上。
在本说明书中，术语“FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3，Flt3L)”相当于通过激活造血祖细胞(hematopoietic progenitors)来执行作为细胞因子及生长因子的功能的内因性低分子。
并且，在本发明中，上述未成熟树突状细胞的分化持续时间没有特别限制，可根据所使用的培养基的种类及环境不同，例如，可以执行5天至15天，优选地，可以执行7天至10天，更优选地，可以执行8天至9天。
在本发明中，可通过处理如上所述的Toll样受体激动剂来对从未成熟树突状细胞诱导分化的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞进一步处理Toll样受体激动剂，从而激活上述浆细胞样树突状细胞的免疫耐受性。
在本发明中，如上所述，用于激活完成分化的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的Toll样受体的种类没有特别限制，可以包含选自由TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、LR12激动剂及TLR13激动剂组成的组中的一种以上，优选地，可以使用TLR9激动剂。
在本发明中，可通过如上所述的工序将未成熟树突状细胞有效地诱导分化成免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。由此，可利用未成熟树突状细胞，通过简单且容易的工序来实现大量免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的稳定供给。
根据另一实例，本发明涉及通过上述方法制备的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
通过本发明获取的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞可诱导调节T细胞分化并抑制效应T细胞的活性，从而可有效抑制免疫反应。
本发明还涉及包含上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的细胞治疗剂。
在本说明书中，术语“细胞治疗剂”是指在体外通过增殖筛选为了恢复细胞与组织的功能而存活的自体(autologous)、同种(allogenic)、异种(xenogenic)细胞，或通过以其他方法改变细胞的生物特性等的一系列行为来用于治疗、诊断及预防的目的的药物。美国自1993年、韩国自2002年将细胞治疗剂作为药物来管理。这种细胞治疗剂大可分为两个种类，第一种为用于抑制生物体内免疫反应或用于调节免疫反应的亢进等免疫反应的细胞治疗剂，第二种为用于再生组织或恢复器官功能的干细胞治疗剂，本发明提供的细胞治疗剂可以是上述免疫细胞治疗剂。
在本发明中，上述细胞治疗剂可用于诱导调节T细胞的分化或促进其活性，尤其，由于可有效抑制免疫反应，因而可用于预防或治疗自身免疫疾病、过敏性免疫疾病及多种过敏性疾病。
在本发明中，上述细胞治疗剂的给药途径可以是通过任何常规途径，只要是能够到达靶组织。可以是肠外给药，例如，腹膜内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药或皮内给药，但不限于此。上述组合物可以与通常用于治疗细胞的药物载体一起被剂型化为合适的形态。“药学上可接受的”是指生理学上可接受的，且当给人给药时，通常不会引起胃肠病症、头晕等过敏反应或类似的反应的组合。作为药学上可接受的载体可以是例如，水、适合的油、食用油、含水葡萄糖和乙二醇等的肠外给药用载体，还可以进一步包含稳定剂和防腐剂。作为适合的稳定剂包括亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸等的抗氧化剂。作为适合的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯及氯丁醇。
并且，在本发明中，上述细胞治疗剂可以通过能够移动到靶细胞的任意装置给药。
本发明的细胞治疗剂可包含用于治疗疾病的治疗有效量的细胞治疗剂。治疗有效量(therapeutically effective amount)为可由研究人员、兽医、医生或其他临床想到的从器官系统、动物或人类诱导生物或医学反应的有效成分或药物组合的量，其包含诱导所治疗的疾病或障碍的症状的缓和的量。对于本领域技术人员显而易见的是，包含在本发明的细胞治疗剂的浆细胞样树突状细胞的含量(数量)将根据所需效果而变化。因此，本领域技术人员可以容易地确定最佳细胞治疗剂的含量，可根据疾病的种类、疾病的严重程度、包含在组合物的其他成分的含量、剂型的种类、以及患者的年龄、体重、通常健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径及组合物的分泌率、治疗期间、同时使用的药物等的多种因子调节，例如，可包含2×104cells/ml～8×107cell/ml的浆细胞样树突状细胞，但不限于此。
在本发明的治疗方法中，包含本发明的细胞治疗剂作为有效成分的组合物可以通过直肠、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、胸骨内、经皮、局部、眼球内皮下或皮内途径以常规方式给药。
本发明的包含免疫耐受性浆细胞样树突状细胞作为有效成分的细胞治疗剂可用于预防自身免疫疾病、过敏性免疫疾病或过敏性疾病、或者可用作改善用皮肤外用剂。在这种情况下，根据身体部位，其剂型没有特别限制。具体地，例如，可以是具有柔软化妆水、营养化妆水、按摩霜、营养霜、面膜、凝胶或皮肤粘合型化妆品的剂型的化妆品组合物，并且，可以是乳液、软膏、凝胶、霜剂、贴剂或喷雾剂等的经皮给药型剂型。并且，在基于各剂型的外用剂组合物中，本领域技术人员可以毫无困难地根据其他皮肤外用剂的剂型或使用目的等选择除了如上所述的本发明的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞之外的其他成分，在此情况下，当与其他原料同时施用时其效果可能上升。
本发明的实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。对于本发明所属领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于更具体地说明，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：Toll样受体激动剂对浆细胞样树突状细胞分化调节效果
为了确认在对未成熟树突状细胞的分化期间处理Toll样受体激动剂的情况下，是否诱导分化成免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，根据图1所示的设计图如下进行实验。
具体地，利用骨髓取样注射器取样C57BL/6小鼠的大腿部的骨髓。用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)洗涤取样的骨髓后，利用氯化铵除去除红细胞。将分离的细胞(3×106cell/孔)接种到6-孔板后，添加包含10％的FBS(Fetal bovine serum，小牛血清)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素/链霉素、50μM的巯基乙醇、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的丙酮酸钠及250ng/ml的FLT3L的1ml的RPMI 1640并开始培养基分化。分化开始第三天，以100ng/ml至500ng/ml的浓度处理了Pam3。分化开始5天后，进一步补充上述1ml的上述RPMI 1640，之后培养到第八天。利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，从通过培养获取的细胞分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上(图2)。由于上述Toll样受体激动剂的处理可对浆细胞样树突状细胞的分化产生影响，因而第八天确认在浆细胞样树突状细胞特异诱导的表面表达分子，并将其结果显示在图3的(a)部分。并且，在对浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)处理Toll样受体激动剂的情况下，测量初始未成熟树突状细胞的数量与经过8天后所得浆细胞样树突状细胞的数量的比率，并将其结果显示在图3的(b)部分。然而，为了确认上述Toll样受体激动剂的分化调节效果，将未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图2所示，即使处理Toll样受体激动剂也可以确认诱导分化成浆细胞样树突状细胞，并且可以确认分化效率也与未处理的情况没有差异。
实施例2：确认分离的浆细胞样树突状细胞的刺激及细胞因子的分泌形态
为了确认上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞的细胞因子分泌形态，将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板后，处理ODN1826(1μg/ml)以产生刺激。经过24小时后，分离所得上清液，通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme Linked Immunosorbentassay)确认细胞因子分泌形态，并将其结果显示在图4。然而，为了Toll样受体激动剂的处理效果，将上述实施例1中在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图4所示，通常，在浆细胞样树突状细胞(pDC)中I型干扰素(IFN-α及IFN-β)和作为代表性的炎性细胞因子的TNF-α及IL-12p70被强烈诱导。但是，在对被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)处理Toll样受体激动剂(0.5μg/ml)的情况下，可以确认当用ODN1826刺激时，其表达水平骤减。相反地，可以确认作为免疫抑制性细胞因子的IL-10的表达水平则处理Toll样受体激动剂后诱导的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)中显著增加。
由此，根据本发明的通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞具有免疫耐受性，这与一般浆细胞样树突状细胞不同。
实施例3：根据各种Toll样受体激动剂的处理确认浆细胞样树突状细胞中的IL-10 分泌形态
为了确认各种Toll样受体激动剂的免疫耐受性诱导效果，通过与上述实施例1相同的方法诱导浆细胞样树突状细胞的分化，Toll样受体激动剂使用了下述表2中所示配体。培养8天后，利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分理出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板，处理ODN1826(1μg/ml)后，培养24小时。之后，仅分离上清液，通过酶联免疫吸附法确认免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌形态，并将其结果显示在图5。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(non)。
表2
Non TLR2激动剂 TLR3激动剂 TLR4激动剂 TLR7激动剂 TLR9激动剂
未处理 Pam3 Poly I：C LPS 咪喹莫特 CpG-ODN
如图5所示，可以确认在用ODN1826刺激的各种Toll样受体激动剂中，只有用途径髓样分化因子初次应答基因88信号的TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂及TLR8激动剂处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的IL-10的表达水平明显增加。
由此，可知在处理未成熟树突状细胞的分化期间途径髓样分化因子初次应答基因88的信号的Toll样受体的情况下，免疫耐受性浆细胞样树突状细胞被诱导。
实施例4：根据Toll样受体激动剂的处理时间点确认浆细胞样树突状细胞中的细 胞因子分泌形态
为了确认根据Toll样受体激动剂的处理时间点的免疫耐受性诱导效果，通过与上述实施例1相同的方法诱导浆细胞样树突状细胞的分化，开始分化日(0 day treatment)、自开始分化日到经过3天时(3 day treatment)处理Toll样受体激动剂。共培养8天后，利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板，处理ODN1826(1μg/ml)后，培养24小时。之后，仅分离24上清液后，通过酶联免疫吸附法确认细胞因子的分泌形态，并将其结果显示在图6。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(no-treatment，non)。
如图6所示，在开始分化日(0 day treatment)或自开始分化日到第三天(3 daytreatment)均处理Toll样受体激动剂的情况下，与未处理的情况(no-treatment)相比，I型干扰素(IFN-α及IFN-β)和作为代表性的炎性细胞因子的TNF-α及IL-12p70的表达被抑制，作为抗炎性细胞因子的IL-10的表达水平明显增加。
由此，可知即使在未成熟树突状细胞开始分化时间点同时处理Toll样受体激动剂和作为分化诱导用因子的FLT3L，也与在分化期间处理的情况相同地诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化。
实施例5：确认用处理Toll样受体激动剂处理的浆细胞样树突状细胞的共刺激因 子及MHC分子的表达
在包含浆细胞样树突状细胞的树突状细胞中，当识别到外部抗原时，为了激活T细胞通过MHC分子呈递抗原，并通过表达CD80及CD86等的共刺激因子来促进相互作用。
由此，用ODN1826刺激上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞后，培养24小时，之后确认了上述细胞表面分子的表达水平。首先，为了确认对分析浆细胞样树突状细胞的表面因子表达产生的影响，在4℃的温度下，对作为浆细胞样树突状细胞的特异标记的抗-CD11c(PE-Cy7，BD Biosciences)、抗-PDCA-1(PerCP-eFluor 710，ebioscience)和细胞表面分子处理特异性抗-CD80(v450，BD Biosciences)、抗-CD86(APC，ebioscience)、抗-MHC-I(PE，ebioscience)及抗-MHC-II(APC-eFluor 780，ebioscience)抗体30分钟后，通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20(BD Biosciences)进行了分析。将其结果显示在图7。然而，为了Toll样受体激动剂的处理效果，将未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图7所示，在一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中，用于呈递作为共刺激因子的CD86和外因性抗原的MHC类Ⅱ分子以高水平表达，但是在通过处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的情况下，显示出没有反应或减少反应的特点。另一方面，可知用于呈递作为另一共刺激因子中的一种的CD80和内因性抗原或交叉抗原MHC类I分子由于被Toll样受体激动剂处理，因而以高于与未处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的细胞(pDC)的水平表达。
实施例6：确认对浆细胞样树突状细胞处理Toll样受体激动剂的免疫耐受诱导分 子的表达
通常，树突状细胞通过抗原呈递诱导T细胞反应以激活后天性免疫反应，在一些免疫耐受性树突状细胞的情况下，已报告能够抑制T细胞的反应。据报告，这种免疫反应的抑制最近通过各种免疫耐受诱导分子，例如，PD-L1及IDO来被诱导。并且，据报告，CCR9+pDCs可通过调节T细胞的强烈诱导来诱导各种免疫耐受现象。
因此，在下文中，为了从上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞确认免疫耐受诱导分子的表达，在4℃的温度下，对浆细胞样树突状细胞处理作为特异性标记的抗-CD11c(PE-Cy7，BD Biosciences)及抗-PDCA-1(PerCP-eFluor 710，ebioscience)和作为免疫耐受诱导细胞表面分子的抗-PD-L1(PE，ebioscience)及抗-CCR9(FITC，ebioscience)等的细胞表面因子抗体30分钟。并且，为了测量在细胞内诱导的IDO的表达，在4℃的温度下，固定(fixation)/渗透(permeabilization)(BD Bioscience)30分钟后，染色抗-IDO(eFluor660，ebioscience)，利用流式细胞分析仪LSRFortessa x-20分析表达水平后，将其结果显示在图8。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，将上述实施例1中未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(pDC)。
如图8所示，在用Toll样受体激动剂处理的浆细胞样树突状细胞的情况下，当用ODN1826刺激时，可以确认与未处理的浆细胞样树突状细胞相比CCR9及IDO分子的表达量均明显增加，CCR9则在未刺激时也显示高于未处理的浆细胞样树突状细胞的表达形态。
由此，在未成熟树突状细胞的分化时处理Toll样受体激动剂的情况下，具有免疫耐受性的浆细胞样树突状细胞被诱导分化。
实施例7：确认对浆细胞样树突状细胞处理Toll样受体激动剂的调节T细胞的诱导 能力
据报告，免疫耐受性浆细胞样树突状细胞(Tolerogenic pDC)诱导分化成调节T细胞(Regulatory T cell，Treg)，并抑制效应T细胞(effector T细胞)的活性或增殖。
因此，在下文中，确认了基于通过处理Toll样受体激动剂来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的调节T细胞(Foxp3+CD4+T cells)的增殖与否。具体地，将从同种异型小鼠分离后用CellTrace(Invitrogen)染色的T细胞与上述实施例1中分离的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)以5：1的比率混合培养5天。然而，作为上述浆细胞样树突状细胞使用用ODN1826刺激(ODN+)的浆细胞样树突状细胞和为刺激(ODN－)的浆细胞样树突状细胞。培养5天后，在4℃的温度下，将抗-CD4(Percp-cy5.5，ebioscience)处理30分钟，在37℃的温度下，将Foxp3/转录因子染色缓冲液(Transcription Factor Staining Buffer)(ebioscience)处理30分钟。之后，用抗-Foxp3(PE，ebioscience)处理后，通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖为调节T细胞，并将其结果显示在图9的(a)部分，计算调节T细胞的增殖率并将其结果显示在图9的(b)部分。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，将用ODN1826刺激(ODN+)或为刺激的一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图9所示，在一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的情况下，不诱导调节T细胞的增殖，当用ODN1826刺激(ODN+)时，反而可以确认抑制了调节T细胞的增殖。相反地，在用Toll样受体兴奋剂处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(TLRs-pDC)的情况下，可确认调节T细胞的增殖在用ODN1826刺激的情况(ODN+)下明显高于未刺激的情况(ODN－)。
由此，可知根据本发明对被诱导分化的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞进一步处理Toll样受体激动剂的情况下，免疫耐受性被激活并且也有效诱导分化为调节T细胞。
实施例8：确认作为Rv1411c蛋白的Toll样受体激动剂的活性
根据现有报告，结核杆菌来源蛋白质能够与多种Toll样受体相结合。因此，在下文中，通过确认从TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠的骨髓中分化的树突状细胞与Rv1411c蛋白的结合，来确认了作为Rv1411c蛋白的Toll样受体激动剂的活性。
具体地，分离小鼠骨髓并去除红细胞后，为了分化树突状细胞使用包含10％的FBS、1％的抗生素及100ng/ml的GM-CSF(granulocyte-macrophage-colony stimulatingfactor)的RPMI1640培养8天。培养8天后，分别对从野生型树突状细胞(WT)和TLR2基因敲除小鼠(TLR2-/-)分离的树突状细胞处理5μg/ml的Rv1411c蛋白后，间歇性地混合2个小时，使得蛋白质容易结合。之后，对标记在Rv1411c蛋白的His分子染色具有抗原-抗体特异性的抗体，通过流式细胞分析仪测量结合程度，并将其结果显示在图10。
如图10所示，确认了在野生型树突状细胞(WT)中，与TLR2敲除树突状细胞(TLR2-/-)相比，增加了与Rv1411c蛋白的结合，但是即便在TLR2敲除树突状细胞(TLR2-/-)中处理了Rv1411c蛋白也是与未处理的实验组相同的结果。
由此，Rv1411c蛋白结合到TLR2受体，并作为TL2激动剂具有活性。
实施例9：确认Rv1411c蛋白的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化诱导能力
通过与上述实施例1相同的工序诱导免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的分化，使用确认了上述实施例8中的作为Toll样受体激动剂的活性的Rv1411c蛋白(0.1μg/ml，0.5μg/ml)作为Toll样受体激动剂。培养8天后，利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将分离的细胞(5×105cell/ml)接种到48孔板，用ODN1826(1μg/ml)处理后，培养24天。分离通过培养所得上清液，并将通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme Linked Immunosorbent assay)确认细胞因子分泌形态的结果显示在图11的图表。分离通过培养所得上清液，并通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme LinkedImmunosorbent assay)确认细胞因子分泌形态，将其结果显示在图11的图表。然而，为了确认Rv1411c蛋白的处理效果，将作为未处理Rv1411c蛋白的、用ODN1826刺激(ODN+)或未刺激的(ODN－)一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图11所示，当用Rv1411c蛋白处理浆细胞样树突状细胞(Rv1411c(0.1μg/ml)-pDC，Rv1411c(0.5μg/ml)-pDC)刺激ODN1826时，在一般浆细胞样树突状细胞中强烈诱导的I型干扰素(IFN-α及IFN-β)和作为代表性的炎性细胞因子的TNF-α及IL-12p70的表达以浓度依赖性地方式骤减，作为免疫抑制性细胞因子的IL-10则以浓度依赖性地其表达水平明显增加。
由此，可知用Rv1411c蛋白处理浆细胞样树突状细胞具有免疫耐受性，这与一般浆细胞样树突状细胞不同，免疫耐受性的程度与上述Rv1411c蛋白的处理浓度成正比，因此也增加。
实施例10：确认通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的 共刺激因子、MHC分子及免疫耐受诱导分子的表达
在上述实施例9中用Rv1411c蛋白诱导分化的浆细胞样树突状细胞中，确认了表面分子及酶的表达形态。
首先，为了分析浆细胞样树突状细胞的表面因子表达影响，在4℃的温度下，对浆细胞样树突状细胞处理作为特异性标记的抗-CD11c(PE-Cy7，BD Biosciences)及抗-PDCA-1(PerCP-eFluor 710，ebioscience)和抗-CD80(v450，BD Biosciences)、抗-CD86(APC，ebioscience)、抗-MHC-I(PE，ebioscience)及抗-MHC-II(APC-eFluor 780，ebioscience)、抗-PD-L1(PE，ebioscience)及抗-CCR9(FITC，ebioscience)等的细胞表面因子抗体30分钟。并且，为了确认在细胞内诱导的IDO的表达，在4℃的温度下，固定(fixation)/渗透(permeabilization)(BD Bioscience)30分钟后，处理抗-IDO(eFluor 660，ebioscience)，之后利用流式细胞分析仪LSRFortessa x-20进行分析，并将其结果显示在图12。然而，为了确认Rv1411c蛋白的处理效果，将作为Rv1411c蛋白未处理的、ODN1826刺激(ODN+)或未刺激(ODN－)的一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图12所示，当刺激ODN1826时，在用Rv1411c蛋白未处理的一般浆细胞样树突状细胞(pDC)中，用于呈递作为共刺激因子的CD86和外因性抗原的MHC类Ⅱ分子以高水平表达，相反，在通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的情况下，显示出没有反应或减少反应的特点。
相反地，在作为用于呈递作为另一共刺激因子中的一种的CD80和内因性抗原或交叉抗原MHC类I分子的情况下，用Rv1411c蛋白出来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)以高于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的水平表达。
并且，在用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的情况下，当用ODN1826刺激(ODN+)时，可以确认与未刺激的情况(ODN－)相比PD-L1、CCR9及IDO分子的表达量均增加，CCR9和PD-L1则在未刺激时(ODN－)也显示高于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的表达形态。
实施例11：通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的T细胞 的活性的抑制
在免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的生物体内最重要的特点是抑制的T淋巴细胞的活性。因此，为了确认上述实施例9中通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞对T细胞的增殖和活性产生的影响，进行了以下实验。
具体地，通过1X的PMA/Ionomycin(ebioscience)刺激从同种异型小鼠分离并用CellTrace(Invitrogen)染色的T细胞(1.5×105cell/well)。这种PMA/Ionomycin的处理是T淋巴细胞的增殖速度增加，并促进干扰素γ(IFN-gamma)的分泌。当产生这些反应时，混合T细胞和Rv1411c蛋白以使被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的比率成为1：5，并培养3天。3天后，处理抗-CD4(Percp-cy5.5，ebioscience)、抗-CD8(Percp-cy5.5，ebioscience)并在4℃的温度下，染色30分钟。通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20分析T细胞的增殖程度并将其结果显示在图13。并且，分离通过培养3天所得上清液后，并通过酶联免疫吸附法(ELISA，Enzyme LinkedImmunosorbent assay)确认细胞因子分泌形态，将其结果显示在图14的图表。然而，为了确认Rv1411c蛋白的处理效果，将作为未处理Rv1411c蛋白的、用ODN1826刺激(ODN+)或未刺激的(ODN－)一般浆细胞样树突状细胞表示为比较例(pDC)。
如图13所示，虽然通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)和一般浆细胞样树突状细胞(pDC)均诱导T细胞，但是通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)对于CD4+T细胞的增殖诱导能力明显低于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)。
并且，如图14所示，通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)以低于一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的水平诱导IFN-gamma的分泌。
实施例12：通过用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的调节T 细胞的分化的调节
将从同种异型小鼠分离后用CellTrace(Invitrogen)染色的T细胞与上述实施例9中用Rv1411c蛋白处理被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)或一般浆细胞样树突状细胞(pDC)培养5天，以使其比率成为10：1、5：1或1：1。然而，作为上述浆细胞样树突状细胞使用用ODN1826刺激的(ODN+)和未刺激的(ODN－)。培养第5天，在4℃的温度下，对细胞处理抗-CD4(Percp-cy5.5，ebioscience)30分钟，在37℃的温度下，将Foxp3/转录因子染色缓冲液(ebioscience)处理30分钟。之后，染色抗-Foxp3(PE，ebioscience)并通过流式细胞分析仪LSRFortessa x-20确认是否增殖为调节T细胞，并将其结果显示在图15的(a)部分，计算调节T细胞的增殖率并将其结果显示在图15的(b)部分。
如图15所示，在一般浆细胞样树突状细胞(pDC)的情况下，不诱导调节T细胞的增殖，当用ODN1826刺激(ODN+)时，反而可以确认抑制了调节T细胞的增殖。相反地，在用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的情况下，可确认调节T细胞的增殖在用ODN1826刺激的情况(ODN+)下明显高于未刺激的情况(ODN－)，并且可确认T细胞对浆细胞样树突状细胞(Rv1411c-pDC)的比率约增加，调节T细胞的增殖率也越增加。
由此，在根据本发明对被诱导分化的免疫耐受性浆细胞样细胞进一步处理Toll样受体激动剂的情况下，也可以通过激活免疫耐受性来有效诱导调节T细胞的增殖。
实施例13：基于用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的效应T 细胞的活性抑制
据报告，调节T细胞诱导免疫耐受树突状细胞并抑制其他T细胞的增殖。因此，在下文中，根据上述实施例12确认了作为由Rv1411c蛋白被诱导分化的T细胞的调节T细胞的活性。
首先，分离小鼠的脾脏，去除红细胞后，使用磁性细胞分选系统(MACS)分离CD4+、CD25-效应T细胞后，为了能够识别增殖程度，染色紫色增殖燃料(violet proliferationdye)。之后，将分化的T细胞与CD4+、CD25-效应T细胞在由抗CD3e和抗CD28抗体涂覆的孔中一起培养2天。其结果，相对于CD25-效应T细胞对启动T细胞的比率，测量T细胞增殖能力的变化，并以图表的方式在图16中示出。
如图16所示，可以确认在用Rv1411c蛋白处理来被诱导分化的浆细胞样树突状细胞中，只有由用ODN1826刺激的细胞(Rv1411c-pDC(ODN))诱导的T细胞减少效应T细胞的分化程度。
由此，可知在根据本发明对被诱导分化的免疫耐受性浆细胞样细胞进一步对Toll样受体激动剂处理的情况下，通过激活免疫耐受性来有效抑制效应T细胞的活性。
实施例14：用Toll样受体激动剂处理后被诱导分化的浆细胞样树突状细胞的获得 产率
利用骨髓取样注射器取样C57BL/6小鼠的大腿部的骨髓。用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)洗涤取样的骨髓后，利用氯化铵除去除红细胞。将分离的细胞(5×105cell/孔)接种到6-孔板后，添加包含10％的FBS(Fetal bovine serum，小牛血清)、2mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素/链霉素、50μM的巯基乙醇、0.1mM的非必需氨基酸、1mM的丙酮酸钠及250ng/ml的FLT3L的1ml的RPMI 1640并开始培养基分化。分化开始第三天，用Toll样受体激动剂以100ng/ml至500ng/ml的浓度处理了Rv1411c蛋白和Pam3。分化开始5天后，进一步补充上述1ml的上述RPMI1640，之后培养到第八天。利用浆细胞样树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)和磁性细胞分选系统(Vario MACS：Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，从通过培养获取的细胞分离出浆细胞样树突状细胞，其纯度为85％以上。将测量分离的浆细胞样树突状细胞的数量(TLR agonist)的结果表示在图17的图表。然而，为了确认Toll样受体激动剂的处理效果，在未成熟树突状细胞的分化期间未处理Toll样受体激动剂的情况表示为比较例(non)。
如图17所示，可知在未成熟树突状细胞的分化期间处理Toll样受体激动剂的情况(TLR agonist)下，与未处理的情况(Non)相比，被分化诱导的浆细胞样树突状细胞的数量明显增加。
由此，可知在未成熟树突状细胞的分化期间处理Toll样受体激动剂的情况下，可制备大量的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
以上，详细说明了本发明的特定部分，对本发明所属领域普通技术人员显而易见的是，这些具体说明仅仅是优选示例，不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (20)

1.一种免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
包括对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
通过在上述未成熟树突状细胞开始分化之前或分化期间处理上述Toll样受体激动剂来诱导分化成上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
3.根据权利要求1所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
在上述未成熟树突状细胞从开始分化到完成分化之前处理上述Toll样受体激动剂。
4.根据权利要求2或3所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
上述未成熟树突状细胞的分化通过使用分化诱导用因子来执行。
5.根据权利要求4所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
上述分化诱导用因子为FMS样酪氨酸激酶3配体。
6.根据权利要求4所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
对上述未成熟树突状细胞处理上述分化诱导用因子一次以上。
7.根据权利要求1所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
对上述未成熟树突状细胞同时处理上述Toll样受体激动剂与上述分化诱导用因子。
8.根据权利要求1所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
处理上述Toll样受体激动剂一次以上。
9.根据权利要求1所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂途径髓样分化因子初次应答基因88信号。
10.根据权利要求1所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂包含选自由TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂以及TLR13激动剂组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求10所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂还包含TLR1激动剂及TLR6激动剂中的至少一种。
12.根据权利要求2所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
还包括对被诱导分化的上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞进一步处理Toll样受体激动剂以激活免疫耐受性的步骤。
13.根据权利要求12所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞的制备方法，其特征在于，
用于激活上述免疫耐受性的上述Toll样受体激动剂为TLR9激动剂。
14.一种免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，其特征在于，
通过对未成熟树突状细胞处理Toll样受体激动剂来被诱导。
15.根据权利要求14所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，其特征在于，
通过在上述未成熟树突状细胞开始分化之前或分化期间处理上述Toll样受体激动剂来诱导分化成上述免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
16.根据权利要求14所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂包含选自由TLR2激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR11激动剂、TLR12激动剂以及TLR13激动剂组成的组中的一种以上。
17.根据权利要求16所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞，其特征在于，
上述Toll样受体激动剂还包含TLR1激动剂及TLR6激动剂中的至少一种。
18.一种细胞治疗剂，其特征在于，
包含权利要求14至17中任一项所述的免疫耐受性浆细胞样树突状细胞。
19.根据权利要求18所述的细胞治疗剂，其特征在于，
上述细胞治疗剂诱导分化成调节T细胞。
20.根据权利要求18所述的细胞治疗剂，其特征在于，
上述细胞治疗剂抑制效应T细胞的活性。
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