KR20130091465A - 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 ｍａｐ１３０５ 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 유래의 MAP1305 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 및 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 MAP1305 단백질을 미성숙 수지상 세포에 처리하여 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기의 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MAP1035 단백질은 미성숙 수지상 세포를 효과적으로 수지상세포를 성숙시킴으로써 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시킬 수 있다.

Description

마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 ＭＡＰ１３０５ 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물{COMPOSITION FOR MATURATION OF DENDRITIC CELL COMPRISING Mycobacterium paratuberculosis MAP1305}

본 발명은 마이코박테리움 파라튜버큘로시스(Mycobacterium paratuberculosis) 유래의 MAP1305 단백질을 유효 성분으로 포함하는 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시키는 수지상 세포의 성숙화 유도방법에 관한 것이다.

마이코박테리움 (Mycobacterium) 속(屬)에는 결핵, 우형결핵(牛形結核), 나병(癩病)과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균종(species) 뿐 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균종, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물(死物)기생의 균종 (saprophytic species) 등 현재까지 약 72 종(species)이 알려져 있으며, 그 중 인체 질환과 관련된 것이 25종에 이르는 것으로 알려져 있다.

마이코박테리움은 결핵균과 마찬가지로 세포 내 기생세균이나 결핵균과는 다르게 주로 동물에서 질환을 유발시킨다. 특히, 염증성 장질환의 하나인 크론씨병의 병인 기전에 마이코박테리움 아비움 아종명 파라투버큘로시스 (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, 이하 마이코박테리움 파라튜버큘로시스)가 관여할 것이라는 가설이 최근 각광을 받고 있다. 마이코박테리움 파라튜버큘로시스는 소, 양, 염소, 사슴 등의 동물에서 만성육아종성 염증으로 특징화된 요네병 (Johne's disease)을 유발시키며 사람의 크론씨병 (Crohn's disease)과도 매우 밀접하게 연관되었다는 보고가 2000년 이후 선진국을 중심으로 보고되고 있다. 최근까지 이루어진 연구는 mycobacteri가 크론씨병의 원인체로서 갖는 의의와, 사람의 크론씨병과 미생물과의 연관성, 크론씨병의 추정적인 원인체로서 마이코박테리움 파라튜버큘로시스가 갖는 공중보건의 위험성 규명, in situ hybridization 법을 이용한 크론씨병에 걸린 사람으로부터 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 분리 동정, 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 항원인 p35와 p36 단백질을 이용한 사람의 크론씨병에 대한 혈청학적 연구 등이 있다. 그러나 이러한 연구에도 불구하고, 마이코박테리움 파라튜버큘로시스를 크론씨병의 원인체로 확신하지 못하는 이유는 이 병원체가 극도로 느리게 자라는 특성과 균체 배양의 어려움 등 많은 제약이 있기 때문이다. 따라서, 현재까지 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 백신으로서의 가능성에 대한 연구는 전무한 실정이다.

마이코박테리움 파라튜버큘로시스와 숙주의 면역반응에 대한 연구는 상피 세포과 매크로파지 세포주를 이용하여 이루어지고 있다. 최근 마우스 모델이 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 감염모델로 각광을 받고 있으며 그 이유는 사람의 임상상과 병리조직학적으로 유사한 건락성 괴사 (caseous necrosis)의 소견을 나타내기 때문으로 알려져 있다. 최근에는 숙주의 특이적 면역인자 결핍에 따른 연구도 보고된 바 있다. 한 보고에 의하면 IFN-γ와 TNF-α가 넉아웃되면 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 감염을 조절할 수 없으며 TLR-2 수용체와 물리적인, 생리적 상호작용을 통하여 여러가지 싸이토카인의 분비를 조절한다고 알려져 있다.

하지만 이러한 현상은 다른 감염질환에서도 공통적으로 나타나는 현상이므로 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 감염의 특이적 면역반응에 대한 연구가 필요한 실정이며, 특히, in vitro에서 빠르게 자라는 특징과 반대로 사람의 폐질환에서는 가장 만성적인 질병을 유발시키는 기전과 결핵과 유사하게 수년에서 수십 년 동안 지속 되는 기전, 재활성화의 가능성 여부, 이와 관련된 면역학적 현상을 규명하는 연구가 매우 중요할 것으로 평가된다.

수지상 세포 또는 수상돌기 세포 (dendritic cell, DC)는 포유동물의 면역 계의 일부를 이루는 면역 세포이다. 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 수지상 세포는 주로 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재하며 특히 피부에 있는 세포를 랑게르한스 세포라 한다. 수지상 세포는 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있으며, 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작되게 한다. 특정 발달 단계에서 그것들은 수상돌기 (dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.

수지상 세포는 조혈 골수 전구세포 (hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화하며, 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR (toll-like receptor)와 같은 패턴 인식 수용체 (pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식하며, 미성숙 수지상 세포는 살아있는 자가세포로부터 니블링 (nibbling)이라는 과정을 통해 세포막을 탐식한다. 이들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해해서, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC (Major Histocompatibility Complex) 분자를 이용하여 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 그것은 CD (Cluster of Differentiation)80, CD86, 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 그것들은 비 항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포 뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.

모든 헬퍼 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 발현 세포(대식세포, B림프구 및 수지상 세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 나머지 헬퍼 T-세포를 활성화시킨다. 그러나 대식세포와 B림프구는 메모리 T-세포만 활성화시킬 수 있는 반면에 수지상 세포는 메모리 및 처녀 (naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 발현 세포이다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포로도 대식세포로도 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구-유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 생성될 수 있다. PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNF-α로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

완전히 성숙한 수지상 세포는 미숙한 DC와는 정성적 및 정량적으로 상이하다. 완전히 성숙한 DC는 고 수준의 MHC (Major Histocompatibility Complex)I형 및 II형 항원, 및 고수준의 T 세포 공동자극성 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현시킨다. 이들 변화는 수지상 세포의 T 세포 활성화 능력을 증가시키는데, 이는 이들이 세포 표면상의 항원 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어 CD28과 같은 T 세포 상의 공동자극성 분자의 대응물을 통한 T 세포 활성화의 양을 증가시키기 때문이다. 추가로, 성숙한 DC는 다량의 사이토카인을 생성하며, 이 사이토카인은 T 세포 반응을 자극하고 유도한다. 이들 사이토카인 중 2 가지는 인터루킨 10 (IL-10) 및 인터루킨 12 (IL-12)이다. 이들 사이토카인은 유도된 T 세포 반응의 방향에 대해 정반대의 효과를 갖는다. IL-10이 생성되면 Th-2형 반응이 유도되는 반면, IL-12가 생성되면 Th-1 형 반응이 유도된다. 후자의 반응이 세포 면역 반응이 요구되는 경우, 예를 들면 암 면역요법에서 특히 바람직하다. Th-1형 반응에 의해 세포 면역계의 작동인자 공격수단인 세포독성 T 림프구(CTL)가 유도 및 분극화된다. 이러한 작동인자 공격수단은 종양 성장을 억제하는데 가장 효과적이다. IL-12는 또한 자연살해(NK) 세포의 성장을 유도하고, 항-혈관신생 활성을 갖고, 이는 모두 효과적인 항-종양 공격수단이다. 따라서, IL-12를 생성하는 수지상 세포의 사용은 면역자극에 사용하는데 이론상 최적으로 적합하다.

수지상 세포는 흔치 않고 분리하기 어렵기 때문에 서로 다른 유형과 서브셋의 수지상 세포의 정확한 생성과 발달 및 그 상호관계에 대해서는 오직 대략적으로만 알려졌다. 수지상 세포는 신체의 다른 세포들과 끊임없는 소통을 한다. 이러한 소통은 세포 표면 단백질의 상호작용에 근거한 직접적인 세포 대 세포 접촉의 형태를 취할 수 있다.

수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인은 세포의 유형에 따라 다르다. 림프구성 수지상 세포는 다량의 타입-1 IFN을 생산할 수 있는데 그것은 더 많은 활성화된 대식 세포를 모아서 탐식 작용을 가능하게 한다. 림프구성 수지상 세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상 세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상 세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류머티스성 관절염, 알레르기성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 된다.

암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 지금까지 수지상 세포의 분화를 조절(활성화)하는 물질들(LPS, TNF-α, IL-1β)은 많이 알려져 있으나 생체독성의 부작용으로 생체에의 직접적인 응용에 문제가 많다.

상기와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상 세포의 분화를 촉진하여 성숙시킴으로써 강력한 면역 반응을 일으키는 무독성의 면역조절제의 개발과 그 물질의 작용기전을 명확히 이해하는 것은 수지상 세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다

본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과 마이코박테리움 파라튜버큘로시스에서 유래한 MAP1305이 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킨다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미성숙된 수지상 세포를 간편하고 효과적으로 성숙시킬 수 있는, MAP1305 단백질을 유효성분으로 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAP1305 단백질을 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화 시키는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 MAP1305 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상의 세포 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAP1305를 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화 시키는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 MAP1305는 미성숙 수지상 세포의 분화를 촉진함으로써 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킬 수 있으며, 이를 통해 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시키는 효과가 있다.

도 1은 MAP1305를 처리한 수지상 세포의 생존률 측정 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 MAP1305를 처리한 수지상 세포에서 특이적인 단백질표면인자인 CD80, CD86과 MHC class I, II의 발현을 분석한 도이다
도 3은 MAP1305를 처리한 수지상 세포에서 수지상 세포가 성숙되면서 분비되는 사이토카인의 발현을 분석한 도이다.
도 4는 10 μg/ml의 MAP1305, 50ng/ml의 LPS로 처리 후, 유세포분석기FACs Canto (BD Biosciences)를 이용하여 37℃ 및 4℃에서 덱스트란-FITC (Fluorescein isothiocyanate) 탐식능의 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 MAP1305에 의한 수지상 세포의 성숙과 TLR과의 관계를 측정하기 위하여 WT, TLR2-/- 및 TLR4-/- 에서 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현을 관찰한 결과를 나타낸 도이다. MAP1305는 WT에서 분리한 수지상 세포에서 TNF-α, IL-6의 발현을 뚜렷하게 증가시켰다.
도 6은 MAP1305에 의하여 활성화된 수지상 세포에 의한 T 세포의 분화를 나타낸 도이다.

본 발명은 MAP1305를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것이다.

마이코박테리움 파라튜버큘로시스(M. paratuberculosis K-10)의 전체 유전체 염기서열이 2004년도 1월달에 해독되어 보고되었으며 [NCBI GenBank ID:AE016958.1] 이중 MAP1305의 단백질 ID는 41395755이다.

MAP1305 (trpC) 는 272개의 아미노산 서열로 이루어진 27.9KDa 세포외 항원이다. 현재 추정되는 기능은 Indole-3-glycerol-phosphate synthase로 작용할 것으로 예상되고 있다. MAP1305의 염기서열은 서열번호 1로, 아미노산 서열은 서열번호 2로 각각 나타내었다.

본 발명은 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 MAP1305에 대한 유전자를 클로닝하고 대장균 발현시스템을 이용하여 분리, 정제하여 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 제공할 수 있다.

미숙한 수지상 세포는 성숙하여 성숙한 수지상 세포를 형성한다. 성숙한 수지상 세포는 항원을 포획하고 동시 자극하는 세포 표면 분자 및 각종 사이토카인의 상향-조절된 발현을 나타내는 능력을 상실한다. 특히, 성숙한 수지상 세포는 MHC I형 및 II형 항원을 미숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준으로 발현시키고, CD (Cluster of Differentiation) 80+, CD83+, CD86+를 조절한다. 더 많은 MHC 발현으로 수지상 세포 표면상에서 항원 밀도의 증가를 유도하는 반면, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절로, T 세포 상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 신호를 강화한다.

본 발명은 MAP1305를 포함하는 조성물을 통해 성숙한 수지상 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 유효한 재조합 방법으로 제조된 MAP1305는 이에 제한되는 것은 아니나 1μg/ml 내지 15μg/ml, 바람직하게는 10μg/ml 농도로 조성물에 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAP1305를 처리하는 것을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 MAP1305 단백질은 1 μg/ml 내지 15μg/ml, 바람직하게는 10 μg/ml 농도로 처리될 수 있다. 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAP1305를 처리하여 성숙화를 유도하기 위하여 MAP1305가 처리된 세포를 배양할 수 있다. 적절한 성숙 수지상 세포로의 분화 유도를 위하여 상기 세포를 바람직한 일 예로써 12시간 ~ 36시간동안 배양하여 성숙시킬 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 MAP1305 단백질 처리를 통해 성숙이 촉진된 성숙된 수지상 세포는 성숙된 수지상 세포가 가지는 일반적인 특징을 발현할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, MAP1305를 미성숙 수지상 세포에 처리함으로써 미성숙 수지상 세포가 분화되어 성숙한 수지상 세포로 변화하며, 보다 바람직하게는 TNF-α, IL-12p70, IL-6, IL-1ß의 생성이 증가된 성숙 수지상 세포로 변화할 수 있다.

또한, 본 발명은 MAP1305를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따르면 미성숙 수지상 세포에 MAP1305를 처리함으로써 미성숙의 수지상 세포가 성숙되며, 수지상 세포의 성숙으로 표면 단백질 표시 인자의 발현이 증가 될 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 면역 증강용 조성물에 따르면, 유효성분인 MAP1305의 처리를 통해서 수지상 세포를 성숙시키고 결과적으로 T 세포의 활성을 유도하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다.

수지상 세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있으며 세포 표면 마커를 유세포 분석기(flow cytometry) 및 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있다. 또한 상기 세포를 사이토카인 생성 (예, ELISA, FACS 및 다른 면역 검정)을 통해 모니터할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 수지상 세포의 분리 및 재조합 MAP1305 의 클로닝

1.1 수지상 세포의 분리 및 유도

C57BL/6마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 적혈구를 염화암모늄을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포를 6-웰 플레이트에서 RPMI 1640 (10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-4)을 첨가하여 8 일 동안 배양하였다. GM-CSF 및 IL-4은 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

1.2 재조합 MAP1305 의 클로닝

마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 게놈 DNA로부터 MAP1305를 분리하여 클로닝하였다. 정방향 프라이머 (5'-CGCCATATGAGTCCGGCTACCGTGCTTGAC-3', 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 (5'-CCCAAGCTTGCGAGCCGGTTTCGGACA-3', 서열번호 4)를 이용해 MAP1305 부위를 증폭시켰다. PCR 산물을 NdeI 과 HindIII 효소들로 절단하고, 발현벡터인 pET-22b(+)벡터 (Novagen, Madison, WI)에 삽입하였다. MAP1305 유전자가 삽입된 pET-22b(+) 벡터로 형질 전환시킨 E. coli BL21을 37℃에서 600 nm에서의 흡광도 (OD)가 0.4 내지 0.5가 되도록 배양한 후에 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하고 6시간 동안 배양하였다. 발현된 단백질은 니켈-니트릴로트라이아세트산 (Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로즈를 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합 단백질은 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다.

실시예 2. MAP1305 의 세포 독성 확인

MAP1305를 처리한 수지상 세포의 세포 생존율을 측정하기 위해서, 수지상 세포를 10μg/ml 농도의 MAP1305 또는 대조군으로 50ng/ml 농도의 LPS (lipopolysaccharide)로 24 시간 동안 처리하였다. 이 후 요오드화 프로피듐 (propidium iodide, PI) 및 아넥신-V로 이중 염색하고 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 분석하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 10μg/ml 농도의 MAP1305로 자극하였을 때 수지상 세포에서 독성을 나타내지 않았다.

실시예 3. MAP1305 에 의한 수지상 세포의 표면 인자 발현 분석

먼저 모든 세포의 성숙도를 균일하게 하기 위하여 GM-CSF 와 IL-4가 함유된 OptiMEM 배지에서 유지한 후, 수지상 세포에 10μg/ml 농도의 MAP1305 및 50 ng/ml 농도의 LPS를 각각 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. 비 특이적인 결합을 억제하기 위하여 1 μg/ml의 Fc I/III(BD bioscience)을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC(BD bioscience)로 4℃에서 20분간 염색하였다. 이 후 항-CD80-PE(BD bioscience), 항-CD86-PE(BD bioscience), 항-MHC I 및 II-PE(BD bioscience)와 같은 세포 표면 인자 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기 FACs Canto (BD Biosciences)로 분석하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, MAP1305은 수지상 세포의 단백질 표면 인자인 CD80, CD86와 MHC class I, MHC class II의 발현을 뚜렷하게 증가시켰다. 이를 통해 MAP1305에 의해 수지상 세포의 성숙이 효과적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. MAP1305 가 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향 분석

수지상 세포의 성숙 여부에 따라 분비되는 사이토카인의 종류가 달라진다. 이를 확인하기 위해 수지상 세포에 10μg/ml 농도의 MAP1305 또는 대조군으로 50ng/ml의 LPS 를 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 상층액을 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10 및 IL-12 p70 에 대한 ELISA 키트에 적용하여 사이토카인 분비량을 측정하였다.

IL-12 p70과 IL-10은 수지상 세포에서 분비되는 주요 사이토카인으로 각각 T 세포가 Th1과 Th2로 분화되는데 중요한 역할을 한다. IL-12는 대표적인 Th1형 사이토카인이며, IL-10은 활성화된 단핵구, NK 세포 및 Th1 세포에 의해 생산되는 사이토카인(IL-12 p70포함)의 활성을 방해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 내용들을 바탕으로 세포내의 IL-12 p70와 IL-10의 분비량을 측정하기 위해 항-IL-12 p70-APC (BD bioscience)과 항-IL-10-APC를 염색하여 유세포 분석기 FACScallibur (Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다.

결과는 도3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, IL-12 p70이 MAP1305에 의하여 뚜렷하게 증가하였고, 전염증 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β 또한 뚜렷하게 증가하였다. 따라서, MAP1305이 수지상 세포를 성숙하게 하여 사이토카인의 양에 변화를 준다는 것을 알 수 있다. 반면 IL-10의 분비에는 유의성 있는 증가를 보이지 않아, MAP1305이 수지상 세포를 Th1형 세포로 편향할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.

실시예 5. MAP1305 에 의한 수지상세포의 항원 취득 능력 분석

미성숙 수지상세포는 항원취득을 잘하지만, 성숙한 수지상세포는 항원취득 능력이 감소한다고 알려져 있다. 따라서 MAP1305 단백질이 수지상세포의 대식 활동 (endocytic activity)에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 미성숙 수지상 세포를 10μg/ml의 MAP1305 또는 50 ng/ml LPS를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.

이 수지상 세포에 1μg/ml의 플루오레신 결합 덱스트란(fluoresceinconjugated dextran, 분자량 40,000; Molecular Probes, Eugene, OR)을 1시간 동안 첨가하였다. 37℃와 4℃에서 각각 30분 동안 배양한 후 콜드 스테이닝 완충액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 세포를 세척하였다. 이 후 PE (Phycoerythrin)-결합 CD11c (BD bioscience)로 염색한 후에 유세포분석기FACs Canto (BD Biosciences)를 이용하여 덱스트란-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 탐식능을 측정하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도4 에 나타낸 바와 같이, 37℃에서 MAP1305을 처리한 수지상 세포가 그렇지 않은 것보다 덱스트란(항원) 포식 능력이 감소하였다. 이러한 결과에 따라, MAP1305이 기능적인 면에서 수지상 세포를 성숙시킴을 알 수 있었다. 덱스트란의 수지상 세포에 대한 비특이적 결합을 측정하기 위해서 4℃에서도 측정하여 결과값을 보정하였다. 이를 통해 MAP1305처리에 의해 수지상세포의 성숙도가 증가하였음을 기능적으로 확인할 수 있었다.

실시예 6. MAP1305 에 의한 수지상 세포의 성숙과 TLR 과의 연관성 분석

MAP1305에 의한 수지상 세포의 성숙과 TLR의 연관성을 보기 위해서 TLR4-/-, TLR2-/- 및 WT 마우스로부터 실시예 1과 같은 방법으로 수지상 세포를 분리하였다. 분리한 각 수지상 세포에 대하여 실시예 4와 같은 방법으로 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성 정도를 측정하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에서 나타낸 바와 같이 MAP1305를 처리한 경우 WT, TLR2-/-의 수지상 세포에서는 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비가 증가하였지만 TLR4-/-의 수지상 세포에서는 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비가 감소됨을 확인할 수 있었다. 반면에 TLR1/2 길항제인 Pam3CSK4의 경우 WT, TLR4-/-의 수지상 세포에서는 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비가 증가하였지만 TLR2-/-의 수지상 세포에서는 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비가 감소됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해 MAP1305가 LPS와 마찬가지로 TLR4 를 경유하는 것을 확인하였다. 다른 TLR 길항제인 Imiquimod (TLR7 길항제) 1μg/ml, ODN (TLR9 길항제) 1μg/ml, Poly I:C(TLR3 길항제) 20μg/ml를 처리한 경우에는 WT의 수지상 세포와 비교시 TLR2-/- 나 TLR4-/-에서 싸이토카인 분비에 차이가 없었다. 이를 통해 TLR2-/-의 수지상세포가 기능상에 TLR2만을 억제하고 있으며 TLR4의 경우 특이적으로 TLR4만을 억제하고 있어 기능상에 전혀 문제가 없음을 제시하고 있다.

실시예 7. MAP1305 의 T 세포 분화효과

동종 T 세포 증식을 촉진하는 능력은 in vitro에서 수지상 세포의 성질이다. 동종 T 세포 자극에 MAP1305가 탐지 가능한 영향을 주는지를 확인하기 위해 본 발명자들은 MAP1305 또는 LPS를 처리하여 수지상 세포 성숙을 유도하기 전과 후의 수지상 세포의 allostimulatory 능력을 비교하였다. MAP1305에 의해 성숙한 수지상 세포가 CD8+ T, CD4+ T세포의 증식에 영향을 주는지를 확인하기 위해 CD8+ T, CD4+ T세포를 OVA특이적 OT-1 T세포 수용체 트랜스제닉 마우스에서 분리하였다. 또한 정제된 수지상 세포를 5μg/ml의 MAP1305, 10μg/ml의 MAP1305 및 50 ng/ml 농도의 LPS로 처리하거나 하지 않고(음성 대조군) 24시간 동안 배양하였다. 그 후 OVA 특이 CD8+ T세포의 증식 여부를 확인하기 위해 OVA 257-264 펩타이드, CD4+ T세포의 증식여부를 확인하기 위해 OVA323-339 펩타이드를 MAP1305 및 LPS를 처리한 수지상 세포에 1시간 동안 자극시킨 후 세포를 분리하였다. 이 후 OVA특이 T세포에 CFSE 형광염색약을 염색한 후 4일간 동시 배양하였다.

수지상 세포에 의해 자극된 T세포는 수지상 세포와 클러스터를 형성하게 되는데 수지상세포/T세포(DC/T Cell) 클러스터 크기는 미처리된 세포에 의해 형성된 클러스터와 비교해서 MAP1305에 노출된 반응에서 더 증가되었다. 또한 T 세포의 분화에 대한 효과는, MAP1305를 처리한 수지상 세포와 배양한 동종 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포의 증식률이 미처리 수지상 세포와 배양한 T 세포보다 빠른 것을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 MAP1305 처리로 유도된 성숙이 T 세포의 분화를 촉진하고 미처리된 수지상 세포의 allostimulatory 능력을 현저히 증가시켰음을 뒷받침해준다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> COMPOSITION FOR MATURATION OF DENDRITIC CELL COMPRISING Mycobacterium paratuberculosis MAP1305 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> Mycobacterium paratuberculosis <400> 1 atgagtccgg ctaccgtgct tgactccatc ctcgaaggag tccgggccga cgttgccgcg 60 cgcgaagccc tgatcagcct gtcggagatc aaagccgccg cggccgccgc gccaccgcca 120 ctcgacgtga tggccgcgtt gcgcgagccc ggaatcggcg tcatcgccga agtcaagcgc 180 gccagcccgt cggcgggttc cctggcgacc attgccgatc cggccaaact ggcacgcgcc 240 tacgaagacg gcggcgcccg catcatcagc gtgttgaccg aggagcgacg cttccacggc 300 tcgctcgacg acctcgacgc ggtccgggcc gcggtctcca tcccggtgct gcgcaaagac 360 tttgtggtgc agccgtatca gatccacgag gcgcgtgcgc acggcgccga catgctgctg 420 ctcatcgtgg ccgcgctgga gcagtcggcg ctggtgtcga tgctggaccg caccgaatcg 480 ctgggcatga ccgcgctcgt cgaggtgcac accgaggaag aagccgaccg ggcgctgcgg 540 gctggcgcca aggtgatcgg cgtcaacgcc cgcgatctgg cgacgctgga ggtggaccgg 600 gattgcttcg cccgcatcgc tccaggcctg cccagcaacg tgatccggat cgccgagtcc 660 ggcgtgcgcg gcaccggtga cctgctggcg tatgccggcg cgggcgccga cgccgtcctg 720 gtgggcgagg gcctggtgaa aagcggtgac ccgcgcgccg cggtcgccga cctggttacc 780 gcgggcaccc atccgtcctg tccgaaaccg gctcgctaa 819 <210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Mycobacterium paratuberculosis <400> 2 Met Ser Pro Ala Thr Val Leu Asp Ser Ile Leu Glu Gly Val Arg Ala 1 5 10 15 Asp Val Ala Ala Arg Glu Ala Leu Ile Ser Leu Ser Glu Ile Lys Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Pro Leu Asp Val Met Ala Ala Leu Arg 35 40 45 Glu Pro Gly Ile Gly Val Ile Ala Glu Val Lys Arg Ala Ser Pro Ser 50 55 60 Ala Gly Ser Leu Ala Thr Ile Ala Asp Pro Ala Lys Leu Ala Arg Ala 65 70 75 80 Tyr Glu Asp Gly Gly Ala Arg Ile Ile Ser Val Leu Thr Glu Glu Arg 85 90 95 Arg Phe His Gly Ser Leu Asp Asp Leu Asp Ala Val Arg Ala Ala Val 100 105 110 Ser Ile Pro Val Leu Arg Lys Asp Phe Val Val Gln Pro Tyr Gln Ile 115 120 125 His Glu Ala Arg Ala His Gly Ala Asp Met Leu Leu Leu Ile Val Ala 130 135 140 Ala Leu Glu Gln Ser Ala Leu Val Ser Met Leu Asp Arg Thr Glu Ser 145 150 155 160 Leu Gly Met Thr Ala Leu Val Glu Val His Thr Glu Glu Glu Ala Asp 165 170 175 Arg Ala Leu Arg Ala Gly Ala Lys Val Ile Gly Val Asn Ala Arg Asp 180 185 190 Leu Ala Thr Leu Glu Val Asp Arg Asp Cys Phe Ala Arg Ile Ala Pro 195 200 205 Gly Leu Pro Ser Asn Val Ile Arg Ile Ala Glu Ser Gly Val Arg Gly 210 215 220 Thr Gly Asp Leu Leu Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Ala Asp Ala Val Leu 225 230 235 240 Val Gly Glu Gly Leu Val Lys Ser Gly Asp Pro Arg Ala Ala Val Ala 245 250 255 Asp Leu Val Thr Ala Gly Thr His Pro Ser Cys Pro Lys Pro Ala Arg 260 265 270 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 cgccatatga gtccggctac cgtgcttgac 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 cccaagcttg cgagccggtt tcggaca 27

Claims (8)

1. MAP1305 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 MAP1305 단백질은 마이코박테리움 파라튜버큘로시스(Mycobacterium paratuberculosis) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 MAP1305 단백질은 1μg/ml 내지 15 μg/ml 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
4. 미성숙 수지상 세포에 MAP1305를 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 MAP1305 처리 후 세포를 12시간 이상 36시간 이하로 배양하는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 MAP1305는 미성숙 수지상 세포의 성숙 과정 동안 TNF-α, IL-12p70, IL-6, IL-1ß의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 MAP1305 단백질은 1μg /ml 내지 15μg/ml 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
8. 제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물.
   

Images