KR101221590B1 - 결핵균의 ｒｖ0351 단백질을 포함하는 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물 - Google Patents
결핵균의 ｒｖ0351 단백질을 포함하는 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수지상 세포의 성숙을 유도하는 조성물, 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법 및 세포 치료제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, Rv0351을 유효성분으로 함유하는 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물, 상기 조성물을 처리하여 미성숙 수지상 세포를 성숙화하는 방법 및 상기 방법에 의해 성숙화된 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 성숙된 수지상 세포로 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시킬 수 있다.
Description
본 발명은 수지상 세포의 성숙을 유도하는 조성물, 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법 및 세포 치료제에 관한 것이다.
수지상 세포 또는 수상돌기 세포(dendritic cell, DC)는 포유동물의 면역계의 일부를 이루는 면역 세포이다. 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 수지상 세포는 주로 피부(피부에 있는 세포를 특히 랑게르한스 세포라 부름), 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재한다. 그것들은 또한 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있다. 일단 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작되게 한다. 특정 발달 단계에서 그것들은 수상돌기(dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.
수지상 세포는 조혈 골수 전구세포(hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화한다. 이 세포들은 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스와 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR(toll-like receptor)와 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식한다. 미성숙 수지상 세포는 또한 살아있는 자가 세포로부터 니블링(nibbling)이라는 과정을 통해 약간의 세포막을 탐식한다. 일단 그것들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 그것은 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해해서, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC 분자를 이용하여 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 그것은 CD80(B7.1), CD86(B7.2), 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 그것들은 또한 수지상 세포가 혈류를 통해 비장으로 가거나 림프계를 통해 림프절로 이동하게 유도하는 주화성 수용체인 CCR7를 증가시킨다. 여기서 이 세포들은 항원 발현 세포로 작용한다: 그것들은 비항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포 뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.
모든 헬퍼 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 발현 세포(대식세포, B림프구 및 수지상세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 나머지 헬퍼 T-세포를 활성화시킨다. 그러나 대식세포와 B림프구는 메모리 T-세포만 활성화시킬 수 있는 반면에 수지상 세포는 메모리 및 처녀(naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 발현 세포이다.
성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포로도 대식세포로도 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구-유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성될 수 있다. PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNFα로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.
수지상 세포는 흔치 않고 분리하기 어렵기 때문에 서로 다른 유형과 서브셋의 수지상 세포의 정확한 생성과 발달 및 그 상호관계에 대해서는 오직 대략적으로만 알려졌다. 수지상 세포는 신체의 다른 세포들과 끊임없는 소통을 한다. 이러한 소통은 세포 표면 단백질의 상호작용에 근거한 직접적인 세포 대 세포 접촉의 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포의 수용체 B7과 림프구의 CD28과의 상호작용을 들 수 있다.
그러나 세포 간 상호작용은 사이토카인을 통해서 떨어진 상태로도 일어날 수 있다. in vitro 실험에서 미생물 추출물에 의해 수지상 세포를 자극함으로써 수지상 세포가 빠르게 IL-12를 생산하게 했다. IL-12는 처녀 CD4 T 세포가 Th1 표현형이 되게 한다. 최적의 결과는 수지상 세포가 표면에 나타낸 항원에 대해 공격하도록 면역계를 활성화시키는 것이다.
수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인은 세포의 유형에 따라 다르다. 림프구성 수지상 세포는 다량의 타입-1 IFN을 생산할 수 있는데 그것은 더 많은 활성화된 대식 세포를 모아서 탐식작용을 가능하게 한다. 림프구성 수지상 세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상 세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상 세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류머티스성 관절염, 알러지성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 된다.
암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 지금까지 수지상세포의 분화를 조절(활성화)하는 물질들(LPS, TNF-α, IL-1β)은 많이 알려져 있으나 생체독성의 부작용으로 생체에의 직접적인 응용에 문제가 많았다.
상기와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상세포의 분화를 촉진하여 성숙시킴으로써 강력한 면역 반응을 일으키는 무독성의 면역조절제의 개발과 그 물질의 작용기전을 명확히 이해하는 것은 수지상 세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 성숙화된 수지상 세포를 함유하는 세포 치료제를 제공하는데 있다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Rv0351을 유효성분으로 함유하는, 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 Rv0351은 1 내지 20 ㎍/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 Rv0351을 처리하여 성숙시키는, 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공한다.
상기 방법은 Rv0351을 넣고 20 내지 30 시간 배양하여 성숙시키는 것이 바람직하며, 상기 Rv0351은 미성숙 수지상 세포의 배지에 1 내지 20 ㎍/ml의 용량으로 첨가되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명에서 Rv0351의 수지상 세포 성숙화는 TLR(toll-like receptor)-4를 자극하여 일어나는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 성숙화된 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 수지상 세포를 성숙시키는 방법에 의해 미성숙 세포가 성숙 수지상 세포로 잘 분화될 수 있어서 신체의 면역 반응을 효과적으로 활성화시킬 수 있다.
도 1a는 재조합 Rv0351을 나타낸 것이다(A: His-tagged Rv0351에 대한 SDS-PAGE, B: NTA로 정제한 후 SDS-PAGE, C: 웨스턴 블롯 분석).
도 1b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 생존률 측정 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 보조자극인자와 MHC class I, II의 발현 분석 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 사이토카인(IL-12p40/p70, IL-10) 발현 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-10) 분비 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2d는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 성숙 관여 TLR 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 CCR7 발현 정도 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 주화성 분석 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 T 세포와의 클러스터링 형성능을 나타낸 것이다.
도 5b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 CD8+ 세포 증폭 비율을 나타낸 것이다.
도 5c는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 IFN-γ의 생성 정도를 나타낸 것이다.
도 6a는 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α 및 IL-6 방출에 대한 열변성의 영향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 사이토카인 생산에 대한 PMB의 영향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 사이토카인의 생산에 대한 프로테인아제 K 소화의 영향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 생존률 측정 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 보조자극인자와 MHC class I, II의 발현 분석 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 사이토카인(IL-12p40/p70, IL-10) 발현 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2c는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-10) 분비 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2d는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 성숙 관여 TLR 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 CCR7 발현 정도 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 주화성 분석 실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 T 세포와의 클러스터링 형성능을 나타낸 것이다.
도 5b는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 CD8+ 세포 증폭 비율을 나타낸 것이다.
도 5c는 Rv0351을 처리한 수지상 세포의 IFN-γ의 생성 정도를 나타낸 것이다.
도 6a는 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α 및 IL-6 방출에 대한 열변성의 영향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 사이토카인 생산에 대한 PMB의 영향 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 사이토카인의 생산에 대한 프로테인아제 K 소화의 영향 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 Rv0351을 유효성분으로 함유하는, 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
Rv0351(GRPE protein, HSP-70 cofactor)는 235 아미노산 서열로 이루어진 24-kDa 세포질 항원으로, ER stress(Endoplasmic Reticulum Stress)에 의한 열 충격 단백질(heat shock protein)의 발현을 조절하는 보조인자(cofactor)의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 Rv0351은 1 내지 20 ㎍/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 Rv0351을 처리하여 성숙시키는, 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공한다.
상기 미성숙 수지상 세포는 종래 알려진 방법으로 채취하여 분화시킬 수 있다. 즉, 골수 세포 또는 단핵구에 GM-CSF 및 IL-4를 넣고 6일간 배양하여 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
상기 성숙화 방법은 Rv0351을 넣고 20 내지 30 시간 배양하여 성숙시키는 것을 특징으로 한다. 또한 Rv0351은 미성숙 수지상 세포의 배지에 1 내지 20 ㎍/ml의 용량으로 첨가되는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 우선 수지상 세포를 성숙시키는 Rv0351의 효능 실험을 하기 전에 Rv0351의 수지상 세포에 대한 독성 실험을 하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이 수지상 세포에 Rv0351을 10 ㎍/ml까지 처리하여 아넥신-V로 염색하였는데 그 결과 10 ㎍/ml에서도 수지상 세포에 세포독성이 나타나지 않았으므로 약 10 ㎍/ml 정도의 Rv0351은 수지상 세포에 독성이 없다고 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Rv0351이 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는지에 대한 실험을 했다. 수지상 세포가 성숙하면 보조자극인자와 MHC class I, II와 같은 분자의 발현이 현저히 증가하므로 수지상 세포에 Rv0351을 각각 5 ㎍/ml, 10 ㎍/ml의 농도로 처리한 후 24시간 동안 37℃에서 배양했다. 여기서 LPS를 양성 대조군으로 사용하여 Rv0351의 효과를 비교하였다. 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이 Rv0351은 수지상 세포의 표면 분자를 용량 의존적으로 증가시켰다. 그러므로 Rv0351은 수지상 세포의 표면 분자 변화에 영향을 끼침을 알 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 Rv0351이 수지상 세포를 성숙시킨다는 것을 더욱 확실히 확인하기 위해서 수지상 세포가 항원을 포식하는 능력을 측정하였다. 수지상 세포는 미성숙한 상태에서는 포식 작용이 활발하지만 항원을 포식하여 성숙하게 되면 더 이상 탐식작용이 일어나지 않는다. 그러므로 성숙하게 된 수지상 세포일수록 항원 탐식 능력이 떨어지게 된다. 항원 탐식능력은 FITC로 염색된 덱스트란을 이용하여 실험하였다. 6일 동안 배양시킨 수지상 세포를 두 그룹으로 나누어서 하나는 Rv0351를 24시간 처리하고 하나는 처리하지 않았다. 상기 두 그룹의 수지상 세포에 FITC로 염색한 덱스트란을 처리한 뒤 다시 수지상 세포를 CD11c-PE로 염색하여 유세포분석기로 분석하였다. 도 2d에 나타낸 바와 같이, Rv0351을 처리한 수지상 세포가 그렇지 않은 것보다 항원 포식 능력이 감소하였다. 이러한 점에서 Rv0351이 기능적인 면에서 수지상 세포를 성숙시킴을 알 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 Rv0351이 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 했다. 수지상 세포가 성숙하게 되면 분비하는 사이토카인 역시 변하게 된다. 그러므로 수지상 세포를 Rv0351로 처리했을 때 T-세포에 영향을 주는 전염증 또는 항염증성 사이토카인 분비의 변화에 영향을 주는지를 실험하였다. IL-12와 IL-10은 수지상 세포에서 분비되는 주요 사이토카인으로 각각 T 세포가 Th1과 Th2로 분화되는데 중요한 역할을 한다. 수지상 세포에서 분비되는 TNF-a, IL-6, IL-1β, IL-12p, IL-10을 ELISA로 측정하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이 IL-12가 증가했고 전염증 사이토카인인 TNF-a, IL-6, IL-1β 또한 증가하였으므로, Rv0351이 수지상 세포를 성숙하게 하여 사이토카인의 양에 변화를 준다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 Rv0351을 처리한 수지상 세포에서 CCL7의 발현이 어떻게 달라지는지 실험하였다. 수지상 세포가 성숙하게 되면 이동 능력이 증가하게 되므로 이동과 관련된 수용체를 수지상 세포가 성숙하였는지를 나타내는 지표로 이용할 수 있다. 수지상 세포의 이동 관련 수용체 중 CCL19와 반응하는 CCR7이 성숙 시에 증가하기 때문에 수지상 세포에 Rv0351을 처리한 것과 양성대조군으로 LPS를 처리한 것, 그리고 아무 처리도 하지 않은 음성 대조군을 CCR7-PE 및 CD11c-FITC로 염색하여 유세포측정기로 측정하였다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, Rv0351을 처리하였을 때 처리하지 않은 수지상 세포보다 CCR7의 수치가 증가하였으므로 Rv0351이 수지상 세포의 이동 능력을 증가시킨다고 할 수 있다.
이를 더욱 확실하게 확인하기 위하여 본 발명의 다른 실시예에서는 Rv0351로 처리한 수지상 세포의 CCL19에 대한 주화성을 실험하였다. CCR7의 결합 리간드는CCL19라는 점을 이용해 300ng/ml의 CCL19에 반응해서 이동하는 수지상 세포의 수를 측정한 결과 Rv0351로 처리한 수지상 세포가 음성 대조군에 비해서 더 많이 이동하였음을 알 수 있었다(도 4b). 결론적으로 Rv0351은 수지상 세포를 성숙하게 만들어서 2차 림프기관으로 이동한 뒤 T 세포와 반응하는데 필요한 이동능력을 증가시킨다고 할 수 있다.
동종 T 세포 증식을 촉진하는 능력은 in vitro에서 수지상 세포의 성질이다. 본 발명의 다른 실시예에서는 Rv0351이 수지상 세포를 활성화시킴으로써 CD8+ T 세포의 활성화에 관여하는지를 알아보기 위해 혼합-림프구 반응 실험을 수행하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이 수지상 세포에 의해 자극되어진 T 세포는 수지상 세포와 클러스터를 형성하게 되는데 DC/T 세포 클러스터 크기는 미처리된 세포에 의해 형성된 클러스터와 비교해서 Rv0351에 노출된 반응에서 더 증가되었다. 또한, T 세포의 증식에 대한 효과는 Rv0351을 처리한 수지상 세포와 배양한 동종 CD8+ T 세포의 증식률이 미처리 수지상 세포와 배양한 T 세포보다 빨랐다. 또한, Rv0351에 의해 성숙된 수지상 세포는 CD8+ T 세포로부터 IFN-γ 생성을 증가시켰다.
또한 본 발명은 상기 수지상 세포 성숙화 방법에 의해 성숙화된 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 Rv0351을 아쥬반트로 이용하여 암치료용 세포 치료제로 사용될 수 있다.
상기 암치료용 세포 치료제에서 성숙화된 수지상 세포는 CD80, CD86, MHC classⅠ 및 MHC class Ⅱ에 대해서 양성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 암치료용 세포 치료제는 비경구적으로 예를 들어, 피하, 복강, 근육 내, 경피 (transdermal/transcutaneous) 주사로 투여될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 세포 치료제는 직접 종양의 병변 부위에 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포 치료제는 단일 투여 또는 다중 투여 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 본 발명의 세포 치료제는 기타 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 세포 치료제는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 본 발명의 수지상세포를 포함하는데, 이러한 담체는 그 자체로 치료제를 투여 받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체인 것이 바람직하다. 적합한 담체는 통상적으로 크고 느리게 대사화되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체(예를 들어, 오일 소적 또는 리포좀) 및 불활성 바이러스 입자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 수지상세포 자체의 면역보강제 효과 이외에 면역자극제 또는 면역보강제로서 작용할 수 있다.
본 발명의 세포 치료제는 또한 치료제의 유효성을 증강시키는 추가의 면역보강제를 포함할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
수지상 세포 및 Rv0351 준비
1. 1 수지상 세포의 분리 및 유도
수지상세포는 이전에 알려진 방법과 같이 마우스의 골수세포로부터 유도했다. 우선 C57BL/6마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 적혈구를 염화암모늄을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포를 6-웰 플레이트에서 RPMI 1640(10% 열-불활화 FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 5×10-5 M 2-ME, 10mM HEPES (pH 7.4), 10 ng/ml GM-CSF, 10 ng/ml IL-4)를 첨가하여 배양하였다. 배양 후 3일과 5일째에는 부유 세포를 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다.
이후에 기술될 실험들에서는 배양 6일째의 부착되지 않은 수지상 세포를 사용하였다. 일부 실험에서 CD11c+ 수지상세포를 항-CD11c(N418) 마이크로비드와 자기 세포 분류 시스템(Vario MACS: Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 이용하여 분리 후 사용하였다. LPS(E.coli 055:B 타입, Sigma)는 Rv0351에 대한 양성대조군으로 사용하였다.
1.2 재조합 Rv0351 단백질 발현 및 정제
결핵균 게놈 DNA로부터 Rv0351 유전자를 증폭하기 위한 프라이머의 정방향 쪽에는 NdeI, 역방향 쪽에는 HindIII 제한효소 위치를 넣었다. 정방향 프라이머의 서열은 5'-GTGACGGACGGAAATCAAAAGC-3'(서열번호: 1)이고, 역방향 프라이머의 서열은 5'-ACTGCCCGACGGTTCTGATTC-3'(서열번호: 2)이었다. PCR 유전자 산물을 T-벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝한 후 NdeI과 HindIII으로 절단하고, 발현벡터인 pET22b에 삽입하였다. Rv0351 유전자가 삽입된 pET22b 벡터로 형질전환시킨 E. coli BL-21을 600 nm에서의 흡광도(OD)가 0.4-0.6이 되도록 배양한 후에 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고 8시간 동안 배양하였다. 발현된 단백질은 니켈-니트릴로트라이아세트산(Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로즈 컬럼을 이용하여 정제하였다. 분리 정제된 단백질은 Polymixin B bead를 이용하여 LPS를 제거한 후, 0.2 μM 주사기 필터를 이용하여 오염원을 제거하였고, 최종적으로 정제한 재조합 단백질은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 1a).
<실시예 2>
수지상 세포의 생존율 측정
LPS 또는 Rv0351로 자극한 수지상 세포의 세포 생존율을 측정하기 위해서, 수지상 세포를 100 ng/ml 농도의 LPS 또는 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 Rv0351로 24시간 동안 처리 후에 5 ㎍ml- 1 의 요오드화 프로피듐(propidium iodide, PI) 및 아넥신-V로 이중 염색하고 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 분석하였다(도 1b).
도 1b에 나타낸 바와 같이 10 ㎍/ml까지는 수지상 세포에 세포독성이 나타나지 않았으므로 10 ㎍/ml의 Rv0351은 수지상 세포에 독성이 없다고 할 수 있다.
<실시예 3>
Rv0351에 의한 수지상 세포의 성숙 정도 분석
3.1 보조자극인자와 MHC class I, II의 발현 분석
수지상 세포에 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml 농도의 Rv0351 및 100 ng/ml 농도의 LPS를 각각 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. 미처리 대조군에는 배지만을 처리하였다. 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1 ㎍/ml의 Fcγ I/III(BD bioscience)을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC(BD bioscience)로 4℃에서 20분간 염색하였다. 그리고, 보조자극인자와 MHC 분자의 발현 양상을 측정하기 위하여 항-CD80-PE(BD bioscience), 항-CD86-PE(BD bioscience), 항-MHC I 및 II-PE(BD bioscience)를 1 ㎍/ml씩 처리하여 4℃에서 30분간 염색했다. PBS 완충액(2% FBS와 0.01% 아지드 나트륨 함유)로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 고정 후에 FACScallibur(Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다(도 2a).
도 2a에 나타낸 바와 같이 Rv0351은 수지상 세포의 보조자극인자와 MHC class I, II의 발현을 용량 의존적으로 증가시켰다. 그러므로 Rv0351은 수지상 세포의 성숙을 유도하여, 수지상 세포의 성숙화의 지표인 다양한 표면 분자 변화에 영향을 끼침을 알 수 있다.
3.2 사이토카인 분비에 미치는 영향 분석
Rv0351에 의해 CD11c 수지상 세포내에서 IL-12p40/p70 및 IL-10이 생산되는지 확인하기 위해, 수지상 세포에 5 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml 농도의 Rv0351 및 100 ng/ml 농도의 LPS를 각각 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1 ㎍/ml의 Fcγ I/III(BD bioscience)을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC(BD bioscience)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 추가적으로, 세포내 싸이이토카인을 염색하기 위해 세포에 항-IL-12p40/p70-PE (BD bioscience) 및 항-IL-10-PE(BD bioscience)를 1 ㎍/ml씩 처리하여 4℃에서 30분간 염색했다. PBS 완충액(2% FBS와 0.01% 아지드 나트륨 함유)로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 고정 후에 FACScallibur(Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다. 그 결과를 도 2b에 도시하였다. 여기에 각 조건별로 양성인 세포의 비율을 나타내었고, 이는 4번의 개별적 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 2b에 나타낸 바와 같이 Rv0351은 CD11c 수지상 세포에서 IL-12p40/p70의 발현을 용량 의존적으로 증가시켰으며, IL-10의 발현에는 영향이 없었다.
또한, 마그네틱 비드로 정제된 수지상 세포에서 IL-12p70, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-10이 생산되는지 여부를 ELISA로 분석하였다(도 2c).
도 2c에 나타낸 바와 같이 Rv0351은 수지상 세포에서 IL-10을 제외한 IL-12p70, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 용량 의존적으로 증가시켰다.
3.3 수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능 측정
미성숙 수지상 세포를 5 또는 10 ㎍/ml의 Rv0351 또는 100 ng/ml LPS의 존재 또는 부재 조건 (negative control)에서 24시간 동안 배양하였다. 이 수지상 세포에 1 ㎍/ml의 플루오레신 결합 덱스트란(fluorescein-conjugated dextran, 분자량 40,000; Molecular Probes, Eugene, OR)을 1시간 동안 첨가하였다. 37℃와 4℃ 에서 각각 30분 동안 배양한 후 콜드 스테이닝 완충액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 다음 세포를 3회 세척한 후에 PE(Phycoerythrin)-결합 CD11c(BD bioscience)로 염색한 후에 FACSCalibur를 이용하여 덱스트란-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 탐식능을 측정하였다. 덱스트란의 수지상 세포에 대한 비특이적 결합을 측정하기 위해서 4℃에서도 측정하였다(도 2d).
도 2d에 나타낸 바와 같이, Rv0351을 처리한 수지상 세포가 그렇지 않은 것보다 덱스트란(항원) 포식 능력이 감소하였다. 이러한 점에서 Rv0351이 기능적인 면에서 수지상 세포를 성숙시킴을 알 수 있다. 덱스트란의 수지상 세포에 대한 비특이적 결합을 측정하기 위해서 4℃에서도 측정하였다.
<실시예 4>
Rv0351
에 의한 수지상 세포의 성숙과
TLR
과의 연관성 분석
Rv0351에 의한 수지상 세포의 성숙과 Toll-like receptor (TLR)의 연관성을 보기 위해서 TLR2-/-, TLR4-/- 및 WT 마우스로부터 실시예 1.1과 같은 방법으로 수지상 세포를 분리하였다. 분리한 각 수지상 세포에 대하여 실시예 3.1과 같은 방법으로 CD86 및 MHC II의 발현을 측정하였으며, 실시예 3.2와 같은 방법으로 TNF-α의 생성 정도를 측정하였다. Rv0351은 WT이나 TLR2-/-에서 분리한 수지상 세포의 경우 CD86 및 MHC II의 발현과 TNF-a의 생성을 증가시켰지만, TLR4-/-에서 분리한 수지상 세포의 경우 D86 및 MHC II의 발현과 TNF-a의 생성이 크게 감소되었다(도 3). 이러한 결과는 Rv0351이 TLR4를 경유하여 수지상 세포를 활성화시켰음을 뒷받침해준다.
<실시예 5>
Rv0351이 수지상 세포의 이동 능력에 미치는 영향 분석
5.1 CCR7(chemokine receptor 7) 발현정도 측정
수지상 세포에 5 및 10 ㎍/ml Rv0351 또는 100 ng/ml LPS를 각각 24시간 처리한 후 세포를 회수하였다. 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1 ㎍/ml의 Fcγ I/III을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC로 4℃에서 20분간 염색하였다. 그 다음 다시 항CCR7-PE를 처리하여 4℃에서 30분간 염색하였다. PBS 완충액 (2% FBS와 0.01% 아지드 나트륨 함유)로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드로 고정 후에 FACScallibur(Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다(도 4a).
도 4a에 나타낸 바와 같이 Rv0351을 처리하였을 때 처리하지 않은 수지상 세포보다 CCR7의 수치가 증가하였으므로 Rv0351이 수지상 세포의 이동 능력을 증가시킬 것으로 예상할 수 있다.
5.2 주화성 분석
정제된 수지상 세포를 24시간 동안 10 ㎍/ml의 Rv0351 및 50 ng/ml의 LPS로 처리하거나 하지 않고(음성 대조군), 케모킨 CCL19 (300 ng/mL)에 반응하여 이동하는 것을 측정하였다. 트랜스웰 플레이트(세공 크기 8.0 ㎛; Corning, Acton, MA)의 아래쪽 챔버에는 500 ㎕의 CCL19를 포함하는 것과 포함하지 않는 무혈청(serum-free) 배지를 넣었다. 무혈청 배지에 재현탁된 수지상 세포(0.1 mL에 1 x 105 세포)를 트랜스웰 플레이트의 위쪽 챔버에 넣고 5% CO2 하에 37℃에서 3시간 동안 이동하도록 두었다. 아래쪽 챔버에서 거둔 이동한 수지상 세포의 수는 FACS(60-second counts)로 셌다(도 4b).
도 4b에 나타낸 바와 같이 CCR7의 결합 리간드인 CCL19에 반응해서 이동하는 수지상 세포의 수를 측정한 결과, Rv0351로 처리한 수지상 세포가 음성 대조군에 비해서 더 많이 이동하였음을 알 수 있었다.
<실시예 6>
Rv0351로 처리된 수지상 세포가 T 세포에 미치는 영향 분석
동종 T 세포 증식을 촉진하는 능력은 in vitro에서 수지상 세포의 성질이다. 동종 T 세포 자극에 Rv0351이 탐지 가능한 영향을 주는지를 확인하기 위해, Rv0351 또는 LPS를 처리하여 수지상 세포 성숙을 유도하기 전과 후의 수지상 세포의 allostimulatory 능력을 비교하였다. 특히, Rv0351에 의한 성숙한 수지상 세포가 특이적으로 CD8+ T 세포의 증식에 영향을 주는지를 확인하기 위해 CD8+ T 세포를 OVA 특이적 OT-1 T 세포 수용체 트랜스제닉 마우스에서 분리하였다. 또한, 정제된 수지상 세포를 5 ㎍/ml의 Rv0351, 10 ㎍/ml의 Rv0351 및 50 ng/ml의 LPS로 처리하거나 처리하지 않고(음성 대조군), 24시간 동안 배양 후 OVA 특이 CD8+ T 세포와의 증식 여부를 확인하기 위해 Rv0351 및 LPS를 처리한 수지상 세포에 OVA(257-264) 펩타이드를 1시간 동안 자극시킨 후 분리한 OVA 특이 CD8+ T 세포에 CFSE 형광 염료를 염색한 후 4일간 동시 배양하였다.
수지상 세포에 의해 자극되어진 T 세포는 수지상 세포(DC)와 클러스터를 형성하게 되는데 DC/T 세포 클러스터의 크기는 미처리된 세포에 의해 형성된 클러스터와 비교해서 Rv0351에 노출된 반응에서 더 증가되었다(도 5a). 또한, T 세포의 증식에 대한 효과는, Rv0351을 처리한 수지상 세포와 배양한 동종 CD8+ T 세포의 증식률이 미처리 수지상 세포와 배양한 T 세포보다 빨라 보였으며, LPS 처리 수지상 세포에서 관찰된 레벨과 유사하였다(도 5b). 이러한 결과는 Rv0351 처리로 유도된 성숙이 미처리된 수지상 세포의 allostimulatory 능력을 현저히 증가시켰음을 뒷받침해준다.
수지상 세포에서 Rv0351의 IL-12 (사이토카인을 포함하는 Th1) 생성에 대한 촉진 효과를 확인하기 위해, Rv0351 존재 하에 성숙된 수지상 세포에서 초기의 T 세포 반응의 특성을 조사하였다. 전술된 바와 같은 방법으로 수지상 세포와 T세포를 배양한 후 동시 배양 2일째에 배양액을 수거해 Th1 반응을 촉진하는 IFN-γ의 생성정도를 ELISA 방법으로 측정하였다. Rv0351에 의해 성숙된 수지상 세포는 CD8+ T 세포내 IFN-γ 생성을 증가시켰다(도 5c).
<실시예 7>
Rv0351이 수지상 세포의 성숙을 유도하는 물질임을 재검증
7.1
LPS
및
Rv0351
에 의해 유도되는 수지상 세포의
TNF
-α 및
IL
-6 방출에 대한
열변성의
영향 분석
LPS 및 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α 및 IL-6 방출에 대한 LPS 및 Rv0351의 열변성의 영향을 분석하기 위해, C57BL/6 마우스의 미성숙 수지상 세포를 100 ng/ml LPS 또는 10 ㎍/ml Rv0351, 또는 끓인 LPS 또는 Rv0351로 처리하거나, 처리하지 않았다. 24시간 후에 상기 수지상 세포의 상층액내 TNF-α, IL-6의 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이 Rv0351은 단백질이므로 끓이면 분해되기 때문에 끓인 Rv0351의 경우 TNF-α, IL-6의 분비가 억제되었다. 반면, LPS의 경우에는 끓이더라도 TNF-α, IL-6의 분비에 차이가 없었다.
7.2 LPS 및 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 사이토카인 생산에 대한 PMB의 영향 분석
Rv0351의 수지상 세포 활성화의 효과가 LPS의 오염에 의한 것이 아닌지 확인하기 위해, C57BL/6 마우스의 미성숙 수지상 세포를 LPS 억제제인 polymyxin B (PMB)로 전처리한 후 또는 전처리 없이 100ng/ml LPS 또는 10㎍/ml Rv0351로 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후에 상기 수지상 세포의 상층액내 TNF-α, IL-6의 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다.
도 6b에 나타낸 바와 같이 LPS의 경우 LPS에 의한 TNF-α나 IL-6의 분비가 PMB에 의해 감소되는 반면, Rv0351의 경우 PMB를 처리하더라도 TNF-α나 IL-6의 분비에는 영향이 없었다. 이는 Rv0351이 LPS 오염에 의한 것이 아님을 증명한다.
7.3 LPS 및 Rv0351에 의해 유도되는 수지상 세포의 사이토카인의 생산에 대한 프로테인아제 K 소화의 영향 분석
배지, 100 ng/ml LPS 또는 10 ㎍/ml Rv0351을 프로테인아제 K로 처리한 후 미성숙 수지상 세포의 배양물에 첨가하였다. 프로테인아제 K의 농도를 LPS와 Rv0351 농도의 1/20로 처리한 후 50℃에서 1시간 활성화시키고 100℃에서 비활성시켰다. 상기 수지상 세포의 상층액내 TNF-α, IL-6 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다.
도 6c에 나타낸 바와 같이 Rv0351은 단백질이므로 단백질 분해효소인 프로테인아제 K로 처리하면 분해되기 때문에 프로테인아제 K를 처리한 Rv0351의 경우 TNF-α, IL-6의 분비가 억제되었다. 반면 LPS의 경우에는 프로테인아제 K를 처리하여도 TNF-α, IL-6의 분비에 차이가 없었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University
<120> A composition for maturation of dendritic cell containing M.
tuberculosis RV0351 protein
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gtgacggacg gaaatcaaaa gc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
actgcccgac ggttctgatt c 21
Claims (7)
- Rv0351을 유효성분으로 함유하는, 수지상 세포의 성숙화 촉진용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 Rv0351은 1 내지 20 ㎍/ml의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 미성숙 수지상 세포에 Rv0351을 처리하여 성숙시키는, 수지상 세포의 성숙화 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 Rv0351을 넣고 20 내지 30시간 배양하여 성숙시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 Rv0351은 미성숙 수지상 세포의 배지에 1 내지 20 ㎍/ml의 용량으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포의 성숙은 Rv0351이 TLR(toll-like receptor)-4를 자극하여 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
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