KR101478827B1 - 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 ＭＡＰ１９８１ｃ 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물, 결핵균의 MAP1981c 단백질을 미성숙 수지상 세포에 처리하여 성숙화를 유도하는 방법, 및 상기 MAP1981c를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MAP1981c는 미성숙 수지상 세포를 자극하여, 전염증 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β를 분비하고 세포의 단백질 표면인자인 CD80, CD86, MHC class I, II의 발현이 증가된 성숙한 수지상 세포로 분화되도록 성숙을 촉진하고, 이를 통해 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시키는 효과가 있다.

Description

마이코박테리움 파라튜버큘로시스 ＭＡＰ１９８１ｃ 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물{Compositon for maturating dendritic cell comprising Mycobaccterium paratuberculosis MAP1981c}

본 발명은 마이코박테리움 파라튜버큘로시스(Mycobaccterium paratuberculosis)유래의 MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물, 및 이를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

수지상 세포 또는 수상돌기 세포(dendritic cell, DC)는 포유동물의 면역계의 일부를 이루는 면역 세포이다. 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 수지상 세포는 주로 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재하며 특히 피부에 있는 세포를 랑게르한스 세포라 한다. 수지상 세포는 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있으며, 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작된다. 특정 발달 단계에서 그것들은 수상돌기(dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.

수지상 세포는 조혈 골수 전구세포(hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화하며, 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR(toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식하며, 미성숙 수지상 세포는 살아있는 자가세포로부터 니블링(nibbling)이라는 과정을 통해 세포막을 탐식한다. 이들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해해서, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC (Major Histocompatibility Complex) 분자를 이용하여 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 그것은 CD (Cluster of Differentiation)80, CD86, 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 그것들은 비 항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포 뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.

모든 헬퍼 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 발현 세포(대식세포, B림프구 및 수지상 세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 나머지 헬퍼 T-세포를 활성화시킨다. 그러나 대식세포와 B림프구는 메모리 T-세포만 활성화시킬 수 있는 반면에 수지상 세포는 메모리 및 처녀(naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 발현 세포이다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포 또는 대식세포로 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구-유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성될 수 있다. PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNF-α로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

완전히 성숙한 수지상 세포는 미숙한 DC와는 정성적 및 정량적으로 상이하다. 완전히 성숙한 DC는 고 수준의 MHC(Major Histocompatibility Complex)I형 및 II형 항원, 및 고수준의 T 세포 공동자극성 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현시킨다. 이들 변화는 수지상 세포의 T 세포 활성화 능력을 증가시키는데, 이는 이들이 세포 표면상의 항원 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어 CD28과 같은 T 세포 상의 공동자극성 분자의 대응물을 통한 T 세포 활성화의 양을 증가시키기 때문이다. 추가로, 성숙한 DC는 다량의 사이토카인을 생성하며, 이 사이토카인은 T 세포 반응을 자극하고 유도한다. 이들 사이토카인 중 2 가지는 인터루킨 10 (IL-10) 및 인터루킨 12 (IL-12)이다. 이들 사이토카인은 유도된 T 세포 반응의 방향에 대해 정반대의 효과를 갖는다. IL-10이 생성되면 Th-2형 반응이 유도되는 반면, IL-12가 생성되면 Th-1 형 반응이 유도된다. 후자의 반응은 세포 면역 반응이 요구되는 경우, 예를 들면 암 면역요법에서 특히 바람직하다. Th-1형 반응에 의해 세포 면역계의 작동인자 공격수단인 세포독성 T 림프구(CTL)가 유도 및 분극화된다. 이러한 작동인자 공격수단은 종양 성장을 억제하는데 가장 효과적이다. IL-12는 또한 자연살해(NK) 세포의 성장을 유도하고, 항-혈관신생 활성을 갖고, 이는 모두 효과적인 항-종양 공격수단이다.

수지상 세포는 흔치 않고 분리하기 어렵기 때문에 서로 다른 유형과 서브셋의 수지상 세포의 정확한 생성과 발달 및 그 상호관계에 대해서는 오직 대략적으로만 알려졌다. 수지상 세포는 신체의 다른 세포들과 끊임없는 소통을 한다. 이러한 소통은 세포 표면 단백질의 상호작용에 근거한 직접적인 세포 대 세포 접촉의 형태를 취할 수 있다.

수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인은 세포의 유형에 따라 다르다. 림프구성 수지상 세포는 다량의 타입-1 IFN을 생산할 수 있는데 그것은 더 많은 활성화된 대식 세포를 모아서 탐식 작용을 가능하게 한다. 림프구성 수지상 세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상 세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상 세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류머티스성 관절염, 알레르기성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 된다.

암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 지금까지 수지상 세포의 분화를 조절(활성화)하는 물질들(LPS, TNF-α, IL-1β)은 많이 알려져 있으나 생체독성의 부작용으로 생체에의 직접적인 응용에 문제가 많다.

한편, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속에는 결핵, 우형결핵, 나병과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균종(species)뿐 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균종, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물 기생의 균종(saprophytic species) 등 현재까지 약 72 종(species)이 알려져 있으며, 그 중 인체 질환과 관련된 것이 25종에 이르는 것으로 알려져 있다.

마이코박테리움 파라투버큘로시스는 결핵균과 마찬가지로 세포 내 기생세균이나 결핵균과는 다르게 주로 동물에서 질환을 유발시킨다. 특히, 염증성 장질환의 하나인 크론씨병의 병인 기전에 마이코박테리움 아비움 아종명 파라투버큘로시스 (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, 이하 마이코박테리움 파라투버큘로시스)가 관여할 것이라는 가설이 최근 각광을 받고 있다. 마이코박테리움 파라투버큘로시스는 소, 양, 염소, 사슴 등의 동물에서 만성육아종성 염증으로 특징화된 요네병(Johne's disease)을 유발시키며 사람의 크론씨병 (Crohn's disease)과도 매우 밀접하게 연관되었다는 보고가 2000년 이후 선진국을 중심으로 보고되고 있다. 현재까지 보고된 연구 내용을 보면 사람의 크론씨병과 연관하여 Leprosy, 튜버클로시스, 파라투버큘로시스와 크론씨병을 비교하여 마이코박테리아가 크론씨병의 원인체로서 갖는 의의와, 사람의 크론씨병과 미생물과의 연관성을 규명, 크론씨병의 추정적인 원인체로서 마이코박테리움 파라투버큘로시스가 갖는 공중보건의 위험성 규명, 인 시츄 혼성화(in situ hybridization)법을 이용하여 크론씨병에 걸린 사람으로부터 마이코박테리움 파라투버큘로시스의 분리 동정, 마이코박테리움 파라투버큘로시스의 항원인 p35와 p36 단백질을 이용하여 사람의 크론씨병에 대한 혈청학적 연구 등이 수행되어 왔다. 그러나 이러한 연구에도 불구하고, 마이코박테리움 파라투버큘로시스를 크론씨병의 원인체로 확신하지 못하는 이유는 이 병원체가 극도로 느리게 자라는 특성과 균체 배양의 어려움 등 많은 제약이 있기 때문이다. 따라서 현재까지 마이코박테리움 파라투버큘로시스의 백신으로서의 가능성에 대한 연구나 이를 이용한 면역 증강 반응에 대한 연구는 거의 보고되지 않고 있다.

상기와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상 세포의 분화를 촉진하여 성숙시킴으로써 강력한 면역 반응을 일으키는 무독성의 면역조절제의 개발과 그 물질의 작용기전을 명확히 이해하는 것은 수지상 세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다

이처럼 수지상 세포는 성숙화되는 경우 면역 반응을 이용한 치료에 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있으므로, 미성숙 수지상 세포를 효과적으로 성숙시키기 위한 새로운 방법에 대한 연구가 절실히 필요하다.

KR10-2010-0013088

본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과 마이코박테리움 파라투버큘로시스에서 유래한 MAP1981c이 미성숙 수지상 세포의 성숙을 효과적으로 유도하여 성숙 수지상 세포가 되도록 촉진할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 미성숙 수지상 세포가 Th1형 성숙 수지상 세포로 분화되도록 유도할 수 있는, 마이코박테리움 파라투버큘로시스 유래 MAP1981c를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAP1981c를 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 MAP1981c을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 MAP1981c는 미성숙 수지상 세포를 자극하여, 전염증 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β를 분비하고, 세포의 단백질 표면인자인 CD80, CD86, MHC class I, II의 발현이 증가된 성숙한 수지상 세포로 분화되도록 성숙을 촉진하고, 이를 통해 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시키는 효과가 있다.

도 1은 클로닝을 통해 분리한 재조합 단백질 MAP1981c을 나타낸 도이다(a: His-tagged 재조합 MAP1981c와 벡터 대조군에 대한 SDS-PAGE 비교, b: NTA로 정제한 후 SDS-PAGE, c: 웨스턴 블랏 분석).
도 2는 MAP1981c를 처리한 수지상 세포의 생존률 측정 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 MAP1981c를 처리한 수지상 세포에서 특이적인 단백질 표면인자인 CD80, CD86과 MHC class I, II의 발현을 분석한 그래프(a) 및 상기 단백질 표면인자의 발현 양을 수치로 나타낸 그래프(b)이다.
도 4는 MAP1981c 처리에 따른 수지상 세포에서 분비되는 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-12 p70, IL-10) 분비량의 변화를 나타낸 그래프(a) 및 수지상 세포내의 IL-12p70와 IL-10의 분비량을 유세포 분석기로 분석한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 5는 MAP1981c에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 방출에 대한 열변성의 영향을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 MAP1981c에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 방출에 대한 프로테아제 K (Protease K) 소화의 영향을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 MAP1981c에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 방출에 대한 PMB의 영향 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 MAP1981c를 처리한 수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능력 측정 결과를 4℃, 37℃에서 각각 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 MAP1981c를 처리한 수지상 세포에서 신호전달계의 변화를 ERK, JNK, p38, IκB-α, NF-κB p65의 인산화 측정 및 웨스턴 블랏을 이용한 단백질 분해(a)로 확인하고, NF-κB p65가 MAP1981c처리에 의해 핵 안으로 전사되는 것을 확인한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 10은 수지상 세포에 MAPK 및 NF-κB 억제 물질들을 처리한 후 항-CD80-PE, 항-CD86-PE 세포 표면인자 항체를 이용하여 염색한 후 유세포분석기 FACs Canto로 분석한 결과(a) 및 상기 억제물질 처리에 따라 수지상 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비량이 감소되는 것을 ELISA키트를 이용하여 확인한 결과(b)를 나타낸 도이다.
도 11은 MAP1981c를 처리한 수지상 세포의 성숙 관여 TLR을 확인하기 위한 TLR2 넉아웃(TLR2 KO), TLR4 넉아웃(TLR4 KO)에서의 CD86 및 MHC II의 발현(a)과 TNF-α, IL-6, IL-1β생성 측정 결과(b)를 나타낸 도이다.

본 발명은 MAP1981c를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 MAP1981c는 미성숙 수지상 세포를 자극하여 성숙한 수지상 세포로 분화되도록 유도할 수 있으며, MAP1981c로 자극된 미성숙 수지상 세포는 성숙한 수지상 세포가 되어 MHC I형 및 II형 항원을 더 높은 수준으로 발현하고, 단백질 표면 인자인 CD80, CD86의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 전염증 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비가 뚜렷하게 증가한다.

상기 MAP1981c는 마이코박테리움 파라튜버큘로시스(M.paratuberculosisK-10) 유래 단백질이다. 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 전체 유전체 염기서열은 2004년도 1월달에 해독되어 보고되었으며[NCBI GenBank ID: AE016958.1] 이중 MAP1981c의 단백질 ID는 41408079이다. MAP1981c(hypothetical protein)은 245 아미노산 서열로 이루어졌으며, 약 27.1kDa의 크기를 갖는다.

상기 MAP1981c은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 염기서열에 의하여 코딩될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열에 의하여 코딩되는 단백질일 수 있다.

본 발명은 마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 MAP1981c 유전자를 클로닝한 후 대장균 발현시스템을 이용하여 분리, 정제하여 수지상 세포 성숙화를 유도할 수 있다.

미숙한 수지상 세포는 성숙하여 성숙한 수지상 세포를 형성한다. 성숙한 수지상 세포는 항원을 포획하고 동시 자극하는 세포 표면 분자 및 각종 사이토카인의 상향-조절된 발현을 나타내는 능력을 상실한다. 특히, 성숙한 수지상 세포는 MHC I형 및 II형 항원을 미숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준으로 발현시키고, CD (Cluster of Differentiation) 80+, CD83+, CD86+ 및 CD14-을 조절한다. 더 많은 MHC 발현으로 수지상 세포 표면상에서 항원 밀도의 증가를 유도하는 반면, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절로, T 세포 상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 신호를 강화한다.

본 발명은 MAP1981c를 포함하는 조성물을 통해 미성숙 수지상 세포가 Th1 편향적 성숙 수지상 세포로 분화 되도록 촉진할 수 있다. 유효한 재조합 방법으로 제조된 MAP1981c는 이에 제한되는 것은 아니나 0.1μg/ml 내지 10μg/ml, 바람직하게는 1 /ml 내지 5 /ml 농도로 조성물에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAP1981c를 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법을 제공한다.

상기 MAP1981c 단백질은 0.1μg/ml 내지 10μg/ml, 바람직하게는 1μg/ml 내지 5 μg/ml 농도로 미성숙 수지상 세포에 처리될 수 있다.

상기 MAP1981c 처리로 미성숙 수지상 세포를 자극하여 성숙화를 유도하기 위하여 MAP1981c로 자극된 세포를 배양할 수 있다. 적절한 성숙 수지상 세포로의 분화 유도를 위하여, 상기 세포를 바람직하게는 12~36시간 동안 배양하여 성숙시킬 수 있다.

수지상 세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있으며 세포 표면 마커를 유세포 분석기 (flow cytometry) 및 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있다. 또한 상기 세포를 사이토카인 생성 (예, ELISA, FACS 및 다른 면역 검정)을 통해 모니터할 수 있다.

본 발명에서의 MAP1981c 단백질 처리를 통해 성숙이 촉진된 성숙된 수지상 세포는 성숙된 수지상 세포가 가지는 일반적인 특징을 발현할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, MAP1981c를 미성숙 수지상 세포에 처리함으로써 미성숙 수지상 세포가 분화되어 성숙한 수지상 세포로 변화하며, 보다 바람직하게는 MAP1981c 단백질 자극에 따라 미성숙 수지상 세포는 TNF-α, IL-12p70, IL-6, IL-1ß 의 분비가 증가된 성숙 수지상 세포로 변화할 수 있으며, 이는 Th1형 세포로 편향된 성숙 수지상 세포임이 바람직하다.

또한, 본 발명은 MAP1981c를 유효성분으로 포함하는 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명에 따른 MAP1981c를 미성숙 수지상 세포에 처리함으로써 미성숙의 수지상 세포가 성숙되며, 수지상 세포의 성숙으로 표면 단백질 표시인자의 발현이 증가될 수 있다. 보다 구체적으로는, 미성숙 수지상 세포에 MAP1981c를 처리함으로써 수지상 세포를 성숙시키고 결과적으로 T 세포의 활성을 유도하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 MAP1981c는 면역증강을 위한 의약품 및 건강식품에 유용하게 사용될 수 있다.

MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물은 MAP1981c 단백질 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 0.01 내지 1000mg/kg으로 투여되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg으로 투여될 수 있다.

MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물은 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제제예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 제제예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 수지상 세포의 분리 및 재조합 MAP1981c 의 클로닝

1. 1 수지상 세포의 분리 및 유도

C57BL/6마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 적혈구를 염화암모늄을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포를 6-웰 플레이트에서 RPMI 1640(10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-4)을 첨가하여 8일 동안 배양하였다. GM-CSF 및 IL-4은 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

1.2 재조합 MAP1981c의 클로닝

마이코박테리움 파라튜버큘로시스의 게놈 DNA로부터 MAP1981c를 분리하여 클로닝하였다. 정방향 프라이머의 (5'CGCCATATGAAAGCCGATGTAGCACAGCAG-3' 서열번호3)및 역방향 프라이머 (5'-CCCAAGCTTCTGACCGGACCCCTTGACC-3', 서열번호4)를 이용하여 MAP1981c 부위를 증폭시켰다. PCR 산물을 NdeI 과 HindIII 효소들로 절단하고, 발현벡터인 pET-22b(+)벡터 (Novagen, Madison, WI)에 삽입하였다. MAP1981c 유전자가 삽입된 pET-22b(+) 벡터로 형질 전환시킨 E. coli BL21을 37℃에서 600 nm에서의 흡광도 (OD)가 0.4 내지 0.5가 되도록 배양한 후에 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하고 6시간 동안 배양하였다. 발현된 단백질은 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로오즈를 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합 단백질은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏으로 분석하여 확인하였다.

결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 재조합 MAP1981c 단백질은 27.1 kDa 위치에서 나타났다.

실시예 2. MAP1981c의 세포 독성 확인

MAP1981c의 세포독성을 확인하기 위하여, MAP1981c로 자극한 수지상 세포의 세포 생존율을 측정하였다. 미성숙 수지상 세포를 1, 2, 5/ml 농도의 MAP1981c 또는 대조군으로 100 ng/ml 농도의 LPS (lipopolysaccharide)로 24시간 동안 처리하였다. 이 후 요오드화 프로피듐(propidium iodide, PI) 및 아넥신-V로 이중 염색하고 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 분석하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 1 및 2μg/ml 농도의 MAP1981c 뿐만 아니라 5μg/ml의 MAP1981c 역시 수지상 세포에서 독성을 나타내지 않았다.

실시예 3. MAP1981c 자극에 의한 수지상 세포의 표면 인자 발현 증가

먼저 모든 세포의 성숙도를 균일하게 하기 위하여 GM-CSF 와 IL-4가 함유된 OptiMEM 배지에서 유지한 후, 수지상 세포에 1, 2, 5μg/ml 농도의 MAP1981c 및 100 ng/ml 농도의 LPS를 각각 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. 비 특이적인 결합을 억제하기 위하여 1μg/ml의 Fcγ I/III(BD bioscience)을 4℃에서 20분간 처리한 후, 수지상 세포 분석을 위해 CD11c-FITC(BD bioscience)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 이 후 항-CD80-PE(BD bioscience), 항-CD86-PE(BD bioscience), 항-MHC I 및 II-PE(BD bioscience)와 같은 세포 표면 인자 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기 FACs Canto (BD Biosciences)로 분석하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, MAP1981c의 자극은 수지상 세포의 단백질 표면 인자인 CD80, CD86과 MHC class I, MHC class II의 발현을 용량 의존적으로 증가시켰다. 이를 통해 MAP1981c에 의해 수지상 세포의 성숙이 효과적으로 이루어졌음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. MAP1981c 자극이 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향 분석

수지상 세포의 성숙 여부에 따라 분비되는 사이토카인의 종류가 달라진다. 따라서, 이를 확인하기 위해 미성숙 수지상 세포에 1, 2, 5μg/ml 농도의 MAP1981c 또는 대조군으로 100ng/ml의 LPS 를 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 상층액을 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10 및 IL-12 p70 에 대한 ELISA 키트(ebioscience)에 적용하여 사이토카인 분비량을 측정하였다. IL-12 p70과 IL-10은 수지상 세포에서 분비되는 주요 사이토카인으로 각각 T 세포가 Th1과 Th2로 분화되는데 중요한 역할을 한다. IL-12는 대표적인 Th1형 사이토카인이며, IL-10은 활성화된 단핵구, NK 세포 및 Th1 세포에 의해 생산되는 사이토카인(IL-12 p70포함)의 활성을 방해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 내용들을 바탕으로 세포내의 IL-12 p70과 IL-10의 분비량을 측정하기 위해 항-IL-12 p70-APC(BD bioscience)와 항-IL-10-APC를 염색하여 유세포 분석기 FACScallibur (Beckson Dikinson, USA)로 분석하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, ELISA 키트 분석결과 IL-12 p70이 MAP1981c 용량 의존적으로 뚜렷하게 증가하였고, 전염증 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β 또한 뚜렷하게 증가하였다(a). 이를 통해 MAP1981c이 수지상 세포를 성숙하게 하여 사이토카인의 양에 변화를 준다는 것을 알 수 있었다. 특히, 유세포 분석기로 세포내의 IL-12 p70과 IL-10의 분비량을 측정한 결과 IL-12 p70와 달리 IL-10의 분비는 유의성 있는 증가를 보이지 않아, MAP1981c이 수지상 세포를 Th1형 세포로 편향할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다(b).

실시예 5. 수지상 세포의 TNF -α 및 IL -6 방출에 대한 열변성 , 프로테인아제 K 소화 및 폴리믹신 B에 대한 영향 분석

5.1 열변성 영향 분석

LPS 및 MAP1981c에 의해 유도되는 수지상 세포의 TNF-α 및 IL-6 방출에 대한 열변성의 영향을 분석하기 위해, C57BL/6 마우스의 미성숙 수지상 세포를 100 ng/ml의 LPS 또는 5μg/ml의 MAP1981c, 또는 끓인 LPS 또는 MAP1981c로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 24시간 후에 상기 수지상 세포의 상층액내 TNF-α, IL-6의 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, MAP1981c은 단백질이므로 끓이면 분해되기 때문에 끓인 MAP1981c의 경우 TNF-α, IL-6의 분비가 억제되었다. 반면, LPS의 경우에는 끓이더라도 TNF-α, IL-6의 분비에 차이가 없었다.

5.2 프로테아제 K 영향 분석

또한, 100 ng/ml LPS 또는 5μg/ml MAP1981c에 프로테아제 K (Protease K)를 처리한 후 미성숙 수지상 세포의 배양물에 첨가하였다. 프로테아제 K의 농도를 각각 LPS와 MAP1981c 농도의 1/20로 처리한 후 50℃에서 1시간 활성화시키고 100℃에서 비활성화시켰다. 상기 수지상 세포 배양 상층액내 TNF-α, IL-6의 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다.

결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, MAP1981c는 단백질이므로 단백질 분해효소인 프로테아제 K로 처리하면 분해되기 때문에 프로테아제 K를 처리한 MAP1981c 처리 수지상 세포의 경우 TNF-α, IL-6의 분비가 억제되었다. 반면 LPS의 경우에는 프로테아제 K를 처리하여도 TNF-α, IL-6의 분비에 차이가 없었다.

5.3 LPS 억제제( 폴리믹신 B)를 이용한 LPS 오염 영향 여부 확인

MAP1981c에 의한 수지상 세포 활성화의 효과가 LPS의 오염에 의한 것이 아닌지를 확인하기 위해, C57BL/6 마우스의 미성숙 수지상 세포를 LPS 억제제인 폴리믹신 B (polymyxin B, PMB)로 전처리한 후 또는 전처리 없이 100ng/ml LPS 또는 5μg/ml MAP1981c로 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후에 상기 수지상 세포의 상층액내 TNF-α, IL-6, IL-1β의 양을 ELISA를 이용하여 분석하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, LPS의 경우 LPS에 의한 TNF-α, IL-6의 분비가 폴리믹신 B에 의해 감소되는 반면, MAP1981c의 경우 폴리믹신 B를 처리하더라도 TNF-α, IL-6의 분비에는 영향이 없었다. 이는 MAP1981c에 의한 수지상 세포 활성화의 효과가 LPS 오염에 의한 것이 아님을 보여주었다.

실시예 6. MAP1981c 에 의한 수지상 세포의 항원 취득 능력 분석

미성숙 수지상 세포는 항원 취득을 잘하지만, 성숙한 수지상 세포는 항원 취득 능력이 감소한다고 알려져 있다. 따라서 MAP1981c 단백질이 수지상 세포의 대식 활성 (endocytic activity)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 미성숙 수지상 세포를 1 ,2 5μg/ml의 MAP1981c 또는 100 ng/ml LPS로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양된 수지상 세포에 1μg/ml의 플루오레세인-결합 덱스트란(fluorescein-conjugated dextran, 분자량 40,000; Molecular Probes, Eugene, OR)을 30분 동안 첨가하였다. 37℃와 4℃ 에서 각각 30분 동안 배양한 후 콜드 스테이닝 완충액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 세포를 세척하였다. 이 후 PE (Phycoerythrin)-결합 CD11c (BD bioscience)로 염색한 후에 유세포분석기 FACs Canto (BD Biosciences)를 이용하여 덱스트란-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 탐식능을 측정하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 37℃에서 MAP1981c를 처리한 수지상 세포가 MAP1981c를 처리하지 않은 수지상 세포보다 덱스트란(항원) 포식 능력이 감소하였다. 이러한 결과에 따라, MAP1981c이 기능적인 면에서 수지상 세포를 성숙시킴을 알 수 있었다. 덱스트란의 수지상 세포에 대한 비특이적 결합을 측정하기 위해서 4 에서도 측정하여 결과값을 보정하였다. 이를 통해 MAP1981c 처리에 의해 수지상 세포의 성숙도가 증가하였음을 기능적으로 확인할 수 있었다.

실시예 7. MAP1981c 에 의한 수지상 세포의 신호전달계 활성화

수지상 세포는 성숙과정 중에 ERK, JNK, p38 등의 MAPK(mitogenactivated protein kinases) 및 NF-κB(nuclear factor-kappa B) 신호전달계가 활성화된다고 알려져 있다. 따라서, 미성숙 수지상 세포에 MAP1981c 5μg/ml을 0분 5 분, 15 분, 30 분, 60 분간 처리한 후, 세포를 파괴하여 단백질을 모두 분리하고, MAPK (mitogen-activated protein kinases) 및 NF-κB (nuclear factor-kappa B) 신호전달계와 관련된 인자인 ERK, JNK, p38, IκB-α, NF-κB p65 의 인산화 및 분해 여부를 확인하였다. 단백질양은 특정 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 방법으로 측정하였다. 또한, NF-κB p65가 MAP1981c처리에 의해 핵 안으로 전사되는지 여부를 형광 염색을 통해 확인하였다.

결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에서 나타낸 바와 같이, MAP1981c 처리에 의해 인산화되어 있는 p-p38, p-ERK, p-JNK의 양이 증가하였음을 확인하였다. 또한 p-IκB-a가 증가하고 IκB-a는 분해되는 것을 확인하였다(a). 최종 신호전달 인자인 NF-κB p65도 MAP1981c 처리에 의해 핵 안으로 전사된 것을 확인하였다(b). 이를 통해 MAP1981c는 수지상 세포의 MAPKs 및 NF-κB 신호 전달 체계에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. MAP1981c 에 의한 수지상 세포의 활성에 있어 MAPK 및 NF -κ B 의 영향 분석

MAP1981c에 의해 활성화된 수지상 세포가 MAPK 및 NF-κB의 신호 전달 체계에 의해 활성화 유도되었는지를 알아보기 위하여, U0126 (ERK1/2), SB203580 (p38), SP600125 (JNK), Bay 11-0782 (NF-κB)와 같은 MAPK 및 NF-κB 억제 물질을 이용하여 분석하였다. 구체적으로는, 수지상 세포에 MAPK 및 NF-κB 억제 물질을 1시간 동안 전 처리한 후 5μg/ml 농도의 MAP1981c 또는 대조군으로 100ng/ml의 LPS 를 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 수지상 세포의 표면인자 발현 영향 분석을 위해 CD11c-PE-cy7(ebioscience)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 이 후, 항-CD80-PE(ebioscience), 항-CD86-PE(ebioscience)와 같은 세포 표면인자 항체를 이용하여 염색한 후 유세포분석기 FACs Canto (BD Biosciences)로 분석하였다. 또한 수지상 세포의 성숙 여부에 따라 분비되는 사이토카인을 분석하기 위해 배양 상층액에 TNF-α, IL-6, IL-1β에 대한 ELISA 키트 (ebioscience)를 적용하여 사이토카인 분비량을 측정하였으며, MAPK 및 NF-κB 억제 물질을 이용하여 핵 안에서의 NF-κB p65 발현양을 측정하였다.

결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, MAPK 및 NF-κB 억제 물질들은 MAP1981c 자극에 의해 유도된 수지상 세포의 보조자극인자 CD80과 CD86 발현을 감소시키는 것을 유세포분석기 FACs Canto 분석을 통해 확인하였으며(a), ELISA 키트 분석 결과, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β들도 감소시키는 것을 확인하였다(b). 이를 통해 MAP1981c에 의한 수지상 세포의 활성은 MAPKs (ERK1/2, p38, JNK) 및 NF-κB 신호 전달 체계에 의존적이며, 이러한 신호 전달 체계에 의하여 전 염증성 사이토카인의 생성을 유도한다는 것을 확인하였다.

실시예 10. MAP1981c 에 의한 수지상 세포의 성숙과 TLR 과의 연관성 분석

MAP1981c에 의한 수지상 세포의 성숙과 TLR의 연관성을 확인하기 위해서 TLR2-/-, TLR4-/- 및 WT 마우스로부터 상기 실시예 1과 같은 방법으로 수지상 세포를 분리하였다. 분리한 각 수지상 세포에 대하여 상기 실시예 3 및 실시예4와 동일한 방법으로 CD86 및 MHC II의 발현과 TNF-α, IL-6, IL-1β 생성 정도를 측정하였다.

결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, MAP1981c는 WT이나 TLR2-/-(TLR2 KO)에서 분리한 수지상 세포에서는 CD86 및 MHC II의 발현과 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성을 크게 증가시켰지만, TLR4-/-(TLR4 KO)에서 분리한 수지상 세포에서는 CD86 및 MHC II의 발현과 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성이 크게 감소하였다. 이러한 결과는 MAP1981c가 TLR4를 경유하여 수지상 세포를 활성화시켰음을 뒷받침해준다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제조

1.1 산제의 제조

MAP1981c 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2 정제의 제조

MAP1981c 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1.3 캡슐제의 제조

MAP1981c 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1.4 주사제의 제조

MAP1981c 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1.5 액제의 제조

MAP1981c 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 조성물의 제조

2.1. 건강식품의 제조

MAP1981c 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2.2 음료의 제조

MAP1981c 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Compositon for maturating dendritic cell comprising Mycobaccterium paratuberculosis MAP1981c <130> 1.1p <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 738 <212> DNA <213> Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis <400> 1 tcactgaccg gaccccttga cccgcagcag aatcgccccg cattccgggc accgcaccac 60 gtcgtcctcg gcggccgccg agatccggga cagctccccg cggtcgattt ccagccggca 120 ggccccgcac cgccgcccca gcagctgccc ggcgcccggc cctccccggg cgcgttgccg 180 ttcgtagagg gcgaacagct cggggtccag ttcggcgctc agcgcgtcgc gccgcgacga 240 atgcagcgca cgggactcgc tgatctcgcc gcgcgcggcg tccagatcgc gccgcgcggt 300 ggccatctcg gcttccagct ccttgagcgc ctgctgctcc ccgtccagct gggcctgcag 360 ctcctcgcgg cgctccatca cctccagcag cgaatcctcc aggctggtct ggcgacgctg 420 cagtgtctcg agctcgtgct gaaggtcggc cagctgcttg gcgtcgatcg ctccggactg 480 cagcagcgag cggtcgcggt cttcgcgctg gcgcaccgcg tcgacttcgg cttccagccg 540 cagcacgtga gcatcgatgt cttccagggc gattcgcacc gcgcccagcc ggtcaccggc 600 ggcgtcgtat tcctgctgca tccgctcgca ggcctgctgc tcgggcagat gctcggcccg 660 gtgcgcgagc cgggacagct cggcatccac gttcgccaat tcgagtagtg aacgctgctg 720 tgctacatcg gctttcat 738 <210> 2 <211> 245 <212> PRT <213> Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis <400> 2 Met Lys Ala Asp Val Ala Gln Gln Arg Ser Leu Leu Glu Leu Ala Asn 1 5 10 15 Val Asp Ala Glu Leu Ser Arg Leu Ala His Arg Ala Glu His Leu Pro 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Cys Glu Arg Met Gln Gln Glu Tyr Asp Ala Ala Gly 35 40 45 Asp Arg Leu Gly Ala Val Arg Ile Ala Leu Glu Asp Ile Asp Ala His 50 55 60 Val Leu Arg Leu Glu Ala Glu Val Asp Ala Val Arg Gln Arg Glu Asp 65 70 75 80 Arg Asp Arg Ser Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ile Asp Ala Lys Gln Leu 85 90 95 Ala Asp Leu Gln His Glu Leu Glu Thr Leu Gln Arg Arg Gln Thr Ser 100 105 110 Leu Glu Asp Ser Leu Leu Glu Val Met Glu Arg Arg Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Gln Leu Asp Gly Glu Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu Ala Glu 130 135 140 Met Ala Thr Ala Arg Arg Asp Leu Asp Ala Ala Arg Gly Glu Ile Ser 145 150 155 160 Glu Ser Arg Ala Leu His Ser Ser Arg Arg Asp Ala Leu Ser Ala Glu 165 170 175 Leu Asp Pro Glu Leu Phe Ala Leu Tyr Glu Arg Gln Arg Ala Arg Gly 180 185 190 Gly Pro Gly Ala Gly Gln Leu Leu Gly Arg Arg Cys Gly Ala Cys Arg 195 200 205 Leu Glu Ile Asp Arg Gly Glu Leu Ser Arg Ile Ser Ala Ala Ala Glu 210 215 220 Asp Asp Val Val Arg Cys Pro Glu Cys Gly Ala Ile Leu Leu Arg Val 225 230 235 240 Lys Gly Ser Gly Gln 245 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP1981c forward primer <400> 3 cgccatatga aagccgatgt agcacagcag 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAP1981c reverse primer <400> 4 cccaagcttc tgaccggacc ccttgacc 28

Claims (11)

1. 마이코박테리움 파라튜버큘로시스(Mycobaccterium paratuberculosis) 유래의 MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 생체 내에서 분리된 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 MAP1981c 단백질은 0.1μg/ml 내지 10μg/ml 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 생체 내에서 분리된 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 MAP1981c 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분리된 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 MAP1981c 단백질은 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분리된 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
6. 생체 내에서 분리된 미성숙 수지상 세포에 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 유래의 MAP1981c를 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분리된 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포에 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 유래의 MAP1981c 단백질을 처리 후 세포를 12~36시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분리된 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 성숙 수지상 세포는 TNF-a, IL-12p70, IL-6, IL-1ß의 분비가 증가된 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분리된 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 MAP1981c는 0.1μg/ml 내지 10μg/ml 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 분리된 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
10. 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 유래의 MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.
    
11. 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 유래의 MAP1981c 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.

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