KR101143369B1

KR101143369B1 - 종양괴사인자?알파를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 분화방법

Info

Publication number: KR101143369B1
Application number: KR1020090036953A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 윤석란; 이지원
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2012-05-17
Also published as: KR20100118232A

Abstract

본 발명은 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 촉진시키는 분화용 조성물 및 분화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 및/또는 IL-15을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 자연살해세포의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 본 발명의 TNF-α및/또는 IL-15은 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, 자연살해세포의 활성을 증가시키므로, 자연살해세포 분화용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

TNF-α, IL-15, 자연살해세포, 분화.

Description

종양괴사인자?알파를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 분화방법{A composition containing tumor necrosis factor?α for differentiating natural killer cell as an active ingredient and a method of differentiation using the same}

본 발명은 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α)를 단독, 또는 IL-15와 함께 처리하는 방법을 이용하여 생체외(in vitro)에서 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화를 유도하는 기술에 관한 것이다.

성체 줄기세포 중 하나인 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액을 구성하는 모든 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 및 림프구)로 분화할 수 있는 세포로서, 주로 골수에 있는 조혈줄기세포로부터 생체의 면역체계를 구성하는 세포가 지속적으로 자가 재생된다. 이들 면역체계를 구성하는 세포들 중 특히, 자연살해세포(natural killer cell, 이하 'NK 세포'라 약칭함)는 비특이적으로 암세포를 살상할 수 있는 능력이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되었으며, NK 세포의 분화와 활성 의 결함은 유방암(Konjevic G, et al., Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2001), 흑색종암(Ryuke Y, et al., Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), 폐암(Villegas FR, et al., Lung Cancer, 35: 23-28, 2002) 등 다양한 질병들과 관련 되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 연구들을 바탕으로 암 치료에 NK 세포를 이용하는 NK 세포 치료법이 대두되고 있다. NK 세포를 이용한 세포 치료를 위해서는 생체외(in vitro) 상에서 NK 세포를 배양하는 것이 필요하며, NK 세포의 생체외 분화 조건을 최적화하는 것은 필수적이다.

생체내(In vivo) NK 세포는 골수에서 분화 과정을 거치며 골수의 미세환경은 NK 세포의 분화에 필수적이다. NK 세포는 분화 과정을 거침에 따라 다양한 표면 분자들을 순차적으로 획득하는 것을 특징으로 한다. 마우스 모델에서, NK 세포는 분화 과정 중에 CD122, NK1.1, NKG2 family, Ly49 family, DX5(CD49b), 및 CD43을 순차적으로 발현한다(Kim, S., et al., Nat Immunol, 3: 523-528, 2002). 생체외(In vitro) 상에서 조혈줄기세포로부터 성숙한 NK 세포를 분화시키는 방법은 이미 보고되어 있다. 골수에서 분리한 SCF(stem cell factor), Flt3L(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand), 및 IL-7(interleukin-7)를 처리하여 NK 전구체 세포(precursor NK, pNK)로 분화시키며, pNK 세포에 IL-15을 처리하여 성숙한 NK 세포(mature NK, mNK)로 분화시킨다(Noelle Sevilir Williams. et al., J Immunol, 163: 2648-2656, 1999; Yoon, SR., et. al., Mol Cells, 24: 1-8, 2007). IL-15은 NK 세포의 분화, 증식 및 생존에 필요한 주요 인자로 알려져 있다(Cooper, M.A., et al., Blood, 100: 3633-3638, 2002). 그러나 IL-15 만을 처리하여 분화시킨 NK 세포들은 불완전한 표면 분자 발현 양상을 보이는 것으로 알려져 있으며(Fehniger, T.A., et al., Blood, 97: 14-32, 2001), 이는 NK 세포의 완전한 분화에는 또 다른 인자들이 필요함을 의미한다.

골수 미세환경에 존재하는 다양한 인자들 이외에 NK 세포의 분화에는 적절한 전사인자들의 활성화가 필수적이다(Di Santo, J.P., et al., Annu Rev Immunol, 24: 257-286, 2006). Ets-1, Id2, PU.1, IRF-2, T-bet 및 Gata-3 등과 같은 전사인자들이 NK 세포의 분화과정에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있으며, 이들의 NK 세포 분화에 있어서의 중요성은 유전자 결함 마우스를 이용한 실험들을 통해 증명되었다(Samson, S.I., et al., Immunity, 19: 701-711, 2003; Townsend, M.J., et al., Immunity, 20: 477-494, 2004). 또한, 특정 전사인자들은 NK 세포 분화의 서로 다른 단계에서 특이적으로 작용하는 것이 밝혀졌다.

종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, 이하 'TNF-α'라 약칭함)는 세포의 증식, 분화 및 세포사멸(apoptosis) 등 광범위한 세포 반응을 유도할 수 있는 다면 발현성의 사이토카인이다(Li, H. et al., Cytokine, 41: 1-8, 2008). 상기 TNF-α는 활성화된 대식세포, T 세포 및 NK 세포에 의해 생성되며, 면역체계에서 표적세포(target cell)의 세포사멸을 유도하고 염증반응을 유도하는 사이토카인으로서 중요한 역할을 한다(Mason, A.T., et al., J Leukoc Biol, 58: 249-255, 1995). TNF-α는 두 가지 종류의 수용체(TNFR1 및 TNFR2)를 통해 NF-κB(nuclear factor kappa B), MAPKs(mitogen-activated protein kinases), 캐스파제 의존 사멸신호경로(caspase-dependent death signaling pathways) 등의 다양한 신호 전달 과정을 유도함으로써 광범위한 세포 반응을 유도하며, 이는 세포 종류와 미세 환경에 의존적이다(Wajant, H. et al., Cell Death Differ, 10: 45-65, 2003). TNF-α가 조혈 전구 세포로부터 대식세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 호산구 및 호염구 등의 분화 과정에 관여함이 보고되었다(Soo Han Hwang, et al., Cytokine, 33: 239-245, 2006). 조혈줄기세포가 분화 과정을 거칠 때는 공통 림프계 전구세포 또는 공통 골수계 전구세포로 분화되며 어떤 종류의 전구세포로 분화되었는지에 따라 이후에 생성될 수 있는 혈구세포의 종류가 달라진다. 자연살해세포는 공통 림프계 전구세포로부터 유래하며, 대식세포, 랑게르한스 세로, 호산구 등은 공통 골수계 전구세포로부터 유래한다. 또한, 생체외(In vitro)에서 조혈줄기세포로부터 이들 세포의 분화를 유도하는 성장인자들이 보고되어 있는데, 이는 세포별로 차이가 있다. 수지상 세포는 GM-CSF(granulocyte-macrophage colonystimulating factor), IL-4, TNF-α를 필요로 하며, GM-CSF, TNF-α, TGF-β(transforming growth factor-β)는 수지상 세포의 한 종류인 랑게르한스 세포, GM-CSF, IL-3, IL-5는 호산구, GM-CSF, IL-3, TGF-β, NGF(nerve growth factor)는 호염구의 분화를 유도한다 (Soo Han Hwang, et al., Cytokine, 33: 239-245, 2006).

NK 세포에 있어서는 TNF-α가 세포 독성과 증식 조절에 관여한다는 내용만이 알려져 있으며(B Naume, et al., J Immunol, 146: 3-45-3048, 1991), NK 세포의 분 화에 미치는 영향은 알려진 것이 없다.

이에, 본 발명자들은 TNF-α의 NK 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구한 결과, TNF-α가 NK 세포 분화 관련 전사인자인 T-bet 및 Gata-3의 발현을 증가시키고, NK 세포 분화의 신호전달경로인 NF-κB를 활성화시켜 pNK 세포에서 mNK 세포로의 분화를 촉진시키고, IFN-γ의 생성을 증가시켜 NK 세포의 활성을 증진시키는 것을 확인하였으며, 생체외(in vitro)에서 TNF-α를 단독, 또는 IL-15와 함께 처리하는 경우 NK 세포 분화가 현저하게 증가되는 것을 확인함으로써, TNF-α및/또는 IL-15를 자연살해세포 분화제의 유효성분으로 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 골수 유래 조혈줄기세포에서 자연살해세포로의 분화를 증가시키는 분화용 조성물, 및 생체외(in vitro)에서 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화 증가를 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α, TNF-α)를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TNF-α 및 IL-15(interleukin-15)을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TNF-α 및 IL-15을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 생체외(in vitro) 자연살해세포 분화 과정에 TNF-α 및/또는 IL-15을 첨가하여 자연살해세포의 분화를 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 생체외(in vitro) 자연살해세포 분화 과정에 TNF-α 및 IL-15을 첨가하여 자연살해세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 활성이 증진된 자연살해세포를 암세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 항암 세포 치료 방법을 제 공한다.

본 발명에서 살펴보는 바와 같이, TNF-α및/또는 IL-15은 자연살해세포 분화에 관여하고 자연살해세포의 활성을 증가시키므로 상기 TNF-α및/또는 IL-15을 함유하는 조성물은 자연살해세포의 분화를 조절하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 항암 세포치료법을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어들을 정의한다.

본 발명에서 사용된 용어 "암"은 개체의 필요에 따라 규칙적인 증식과 억제를 할 수 있는 정상세포와 달리 조직 내에서 무제한의 증식을 하는 미분화 세포로 구성되어 종괴 또는 종양을 형성하는 모든 질환을 의미하며, 원발암 또는 전이암을 모두 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 발생 또는 전이를 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정 의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 암의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 토끼, 원숭이, 개, 소, 돼지 또는 쥐 등의 모든 포유류 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 또는 TNF-α 및 인터루킨-15(interleukin-15, IL-15)를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포(natural killer 세포, NK 세포) 분화용 조성물을 제공한다.

상기 TNF-α는 10 ng/ml ~ 50 ng/ml의 농도로 사용하는 것이 바람직하고 15 ng/ml ~ 30 ng/ml의 농도로 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 TNF-α는 NK 세포 특유의 표면 분자들인 NK 세포의 CD122, NKG2A/C/E, NKG2D 및 DX5의 발현을 증가시키고, NK 세포의 활성을 나타내는 인터페론-감마(Interferon-γ, IFN-γ)의 생성을 증가시키며, NK 세포의 분화에 연관된 전사인 자들인 T-bet, Gata-3 및 Ets-1의 발현을 증진시키므로 NK 세포의 분화를 촉진시키고 활성을 증가시킬 수 있다.

상기 조성물은 TNF-α를 포함하는 것이 바람직하고, TNF-α를 IL-15과 함께 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서는 TNF-α가 NK 세포의 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 생체외(in vitro)에서 조혈줄기세포로부터 SCF, Flt3L 및 IL-7의 존재 하에서 배양한 NK 전구체 상태의 세포들에 TNF-α 및/또는 IL-15를 처리한 후, NK 세포의 표면 분자 발현 정도를 유세포분석기를 이용하여 분석하였다. 상기 분석 결과, TNF-α 단독 처리군, 및 IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 군은 대조군 및 IL-15 단독 처리군에 비해 CD122, NKG2A/C/E, NKG2D 및 DX5와 같은 다양한 NK 세포의 표면 분자 발현이 현저하게 증가하였으며, IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 군이 TNF-α와 IL-15를 각각 단독으로 처리한 군에 비해 현저하게 증가하였다(도 1 및 도 2 참조). 따라서, TNF-α가 생체외(in vitro)에서 NK 세포 분화를 유도하며, 이는 IL-15의 존재 하에서 더욱 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서는 TNF-α가 NK 세포의 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위해, NK 전구체 상태의 세포들에 TNF-α 및/또는 IL-15을 처리한 후, IFN-γ의 생성 정도를 ELISA 분석을 이용하여 분석하였다. 상기 분석 결과, TNF-α를 단독으로 처리한 군은 IL-15을 처리한 군에 비해 적은 양의 IFN-γ를 생성하였으나 IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 군은 TNF-α와 IL-15를 각각 단독으로 처리한 군에 비해 현저하게 IFN-γ를 증가시켰다. 또한, 완전히 분화시킨 성숙한 NK 세포를 회수하여 TNF-α와 IL-15을 제거한 후, 상기와 같은 방법으로 IFN-γ 생성의 자극제인 IL-12를 처리한 다음, IFN-γ 생성 정도를 분석하였다. 상기 분석 결과, TNF-α를 단독으로 처리한 군은 IL-15을 처리한 군에 비해 IFN-γ의 생성량이 증가하였으며, IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 군은 TNF-α와 IL-15를 각각 단독으로 처리한 군에 비해 현저하게 IFN-γ의 생성량을 증가시켰다(도 3 참조). 따라서, TNF-α는 NK 세포의 표현형적 분화를 유도하고, IL-15와 함께 활성화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서는 TNF-α가 NK 세포 분화 관련 전사인자들의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, NK 전구체 상태의 세포들에 TNF-α 및/또는 IL-15을 처리한 후, NK 세포의 분화에 연관있는 전사인자들(Ets-1, Gata-3, T-bet)의 발현을 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 수준에서 확인하였다. 상기 분석 결과, TNF-α 단독 처리군은 대조군에 비해 상기 전사인자들의 발현을 증가시켰으며, 특히 IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 군은 TNF-α와 IL-15를 각각 단독으로 처리한 군에 비해 현저하게 상기 전사인자들의 발현을 증가시켰다(도 4 참조). 따라서, TNF-α가 NK 세포의 분화에 연관있는 전사인자들의 발현을 조절함으로써 분화를 유도하고, 특히 T-bet 및 Gata-3가 TNF-α 매개의 NK 세포 분화에 특이적으로 관여하고 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서는 NK 세포의 분화와 TNF-α 매개의 신호 전달과의 연관성을 확인하기 위해, TNF-α에 의한 NF-κB의 활성화 정도를 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 이용하여 분석하였다. 상기 분석 결과, TNF-α는 IκBα의 양을 현저 히 감소하였다. 또한, TNF-α에 의해 유도된 NF-κB가 NK 세포의 분화에 관여하는지 알아보기 위하여, NF-κB 저해제인 BAY 11-7082를 TNF-α 처리 전에 전처리한 후, NK 세포 분화 정도를 유세포분석기로 분석하였다. 상기 분석 결과, NF-κB 저해제인 BAY 11-7082를 전처리한 경우에 NK 세포의 분화가 현저히 감소함을 확인하였다(도 5 참조). 따라서, TNF-α에 의해 유도된 NK 세포 분화의 증가는 NF-κB의 활성화를 필요로 함을 알 수 있었다.

상기 결과들을 통해, 본 발명의 TNF-α 단독 처리, 또는 IL-15와 함께 처리하는 경우, 생체외(in vitro)에서 자연살해세포의 전구체 상태에서 성숙한 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, 상기 성숙한 자연살해세포의 활성을 증진시킴으로써 TNF-α 및/또는 IL-15을 자연살해세포 분화용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 분화용 조성물은 TNF-α 단독, 또는 TNF-α 및 IL-15에 추가로 동일 또는 유사한 자연살해세포 분화 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 골수 유래 조혈줄기세포에서 자연살해세포 전구체로 분화를 유도 및 촉진하는 SCF(stem cell factor), Flt3L(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand) 및 IL-7(interleukin-7)를 포함할 수 있으며, 자연살해세포 전구체에서 성숙한 자연살해세포로의 분화를 촉진하는 것으로 알려진 Vitamin D3, 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN), IL-2 또는 IL-21를 포함할 수 있다.

본 발명의 분화용 조성물은 투여를 위해서 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식 염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 분화용 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.1 ~ 10000 ng/ml 이며, 바람직하게는 1 ~ 1000 ng/ml이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 암의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니나, 유방암, 흑색종암, 위암, 및 폐암 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 TNF-α 및 IL-15의 병합 처리는 생체외(in vitro)에서 자연살해세포 전구체에서 성숙한 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, 상기 성숙한 자연살해세포의 활성을 증진시키므로, TNF-α 및 IL-15을 항암용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

성숙한 자연살해세포는 다양한 면역조절 사이토카인 및 케모카인을 생성한다(Shi F. D., et al., Nat. Immunol., 1, 245, 2000). 상기 성숙자연살해세포는 IFN-γ를 생성하는 능력을 획득하고(Van Beneden K., et al., J . Immunol., 166, 4302, 2001), IL-15(Crosier, K. E. et al., Pathology, 29, 131, 1997; Nakano, T., et al., J. Biochem., 323, 387, 1997) 또는 IL-2(Goruppi, S., et al., Oncogene, 12, 471, 1996)에 의해 부분적으로 조절되는 XCL1, CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, CCL22 및 CXCL8(Lundwall, A., et al., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986)를 포함한 많은 케모카인을 분비하고 반응한다. 이들 케모카인은 이차 림프구 조직에서 감염 및 신생 세포에 대한 자연살해세포 추적에 중요한 역할을 하며 그 조직에서 IFN-γ의 생성이 T 세포 반응을 직접적으로 조절하는 역할을 할 수 있다(Lundwall, A., et al., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986).

성숙한 자연살해세포는 하기의 두 가지 기전에 의해 암세포를 죽일 수 있다. 하나는 세포 수용체를 이용한 방법으로서, 자연살해세포는 세포 표면에 세 가지 종류의 종양괴사인자 단백질들을 발현한다. 이는 파스리간드(FASL), 종양괴사인자 및 트레일(TRAIL)로 암세포에 있는 이들 수용체와 결합하여 암세포의 아포토시스를 유도하는 것으로 알려져 있다(Ashkenazi, A., Nature Rev. Cancer., 2, 420, 2002). 또 다른 하나는 퍼포린(Perforin)이나 그랜자임(Granzyme)과 같은 세포질성 과립물들을 이용하는 방법으로서, 상기 물질들은 암세포의 세포막을 뚫어 암세포를 용해시키며 결국에는 암세포를 죽게 만드는 작용을 하게 된다(Trapani, J. A., et al., Curr. Opin. Immunol., 12, 323, 2000).

본 발명의 항암용 조성물은 TNF-α 단독, 또는 TNF-α 및 IL-15에 추가로 동일 또는 유사한 항암 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 1000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.001 ~ 100 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 TNF-α 및/또는 IL-15을 이용하여 자연살해세포의 분화를 증가시키커나 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 방법은

1) 조혈줄기세포에 전구체 자연살해세포(pNK 세포) 유도제를 첨가하여 전구체 자연살해세포로의 분화를 유도하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 전구체 자연살해세포에 TNF-α를 단독 처리, 또는 TNF-α 및 IL-15를 병합 처리하여 성숙한 자연살해세포로 분화시키는 단계를 포함하는 방법으로 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 전구체 자연살해세포 유도제는 SCF(stem cell factor), Flt3L(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand) 및 IL-7(interleukin-7)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 처리는 TNF-α을 처리하는 것이 바람직하고, TNF-α 및 IL-15을 함께 처리하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 TNF-α, 또는 TNF-α 및 IL-15는 자연살해세포의 전구체 상태에서 성숙한 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, 성숙한 자연살해세포의 활성을 증가시킬 수 있으므로, 이들을 분화제로 이용하여 자연살해세포의 분화 촉진 또는 활성 증진 방법에 이용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 TNF-α 및/또는 IL-15의 처리에 의해 분화된 자연살해세포를 암세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 항암 세포 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 TNF-α, 또는 TNF-α 및 IL-15는 자연살해세포로의 분화를 촉진시키고, IFN-γ의 생성량을 증가시키는 등의 자연살해세포의 활성을 증가시키므로, 이런 활성이 증가된 자연살해세포를 항암 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 마우스의 골수로부터 조혈줄기세포의 분리

6 내지 9주령의 C57BL/6 마우스(코아텍, 한국)의 종아리뼈, 넓적다리뼈 및 골반뼈를 각각 분리한 후, 막자사발로 갈아서 분쇄한 분쇄물을 70 마이크론 세포 스트레이너(strainer)로 통과시킴으로써 총 골수 세포를 추출하였다. 상기 골수에 서 추출한 세포에 아세설팜칼륨(Acesulfame Potassium, ACK) 용액을 처리하여 적혈구를 제거한 후, B220, CD2, NK1.1, CD11b, Gr-1 및 TER-119 항체(Becton-Dickinson and PharMingen, San Diego, CA)를 처리하여 각각에 해당하는 B 세포, T 세포, NK/NKT 세포, 단핵구, 과립구 및 적혈구에 붙이고, 이를 MACS 세포 분리 키트(MACS Cell Separation Kit)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 이용하여 음성선택(negative selection)으로 제거함으로써, 분화된 면역세포들을 제거하였다. 조혈줄기세포의 특이 표면 분자인 CD117(c-kit)에 대한 마이크로비드(microbeads)와 MACS를 이용하여 양성선택(positive selection)으로 CD117+인 조혈줄기세포(hematopoietic stem 세포, HSC 세포)를 분리하였다.

<실시예 2> 조혈줄기세포로부터 자연살해세포(natural killer cell, NK)로의 분화

골수에서 분리한 조혈줄기세포인 CD117+ 세포를 24 웰 플레이트(24-well plate)(Becton and Dickinson Bioscience, San Diego, CA)에 1.5 x 10⁶cells/well의 농도로 10% 우태혈청(fetal bovine serum, FBS), 2 μg/ml 인도메타신(indometacin)(Sigma-Aldrich, St. Louis), 20 μg/ml 젠타마이신(gentamicin)(Sigma-Aldrich), 30 ng/ml 마우스(murine) SCF(murine SCF)(PeproTech, Rocky Hill, NJ), 50 ng/ml 마우스 Flt3L(PeproTech), 0.5 ng/ml 마우스 IL-7(PeproTech)을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂에서 7일간 배양 하였다. 최초 배양 3일 후 절반의 배양 상층액을 같은 조성의 사이토카 인이 함유된 새로운 배지로 갈아주었다. 성숙 자연살해세포(mature natural killer cell, mNK) 세포로의 분화를 위해 7일간 배양한 전구체 자연살해세포(precursor natural killer cell, pNK)를 회수하여 50 ng/ml 마우스 IL-15(PeproTech)을 포함하는 배지, 20 ng/ml 마우스 TNF-α을 포함하는 배지, 및 50 ng/ml 마우스 IL-15(PeproTech)과 20 ng/ml 마우스 TNF-α을 모두 포함하는 배지에서 각각 6일간 추가적으로 배양하였다. 3일 간격으로 절반의 배지를 같은 조성의 사이토카인이 함유된 새로운 배지로 갈아주었다. 배양 13일째, 항(anti)-NK1.1와 항-CD3 항체를 이용하여 NK1.1⁺CD3^-인 NK 세포의 순도를 분석하고, 다양한 NK 세포 표면 분자에 대한 항체를 이용하여 NK 세포의 분화 정도를 유세포분석기(flow cytometry)(BD Bioscience, Mountainview, CA)로 분석하였다.

<실험예 1> TNF-α가 NK 세포 분화에 미치는 영향 조사

TNF-α가 NK 세포의 분화에 영향을 미치는지 조사하기 위해, 생체외(in vitro)에서 조혈줄기세포로부터 SCF, Flt3L 및 IL-7의 존재 하에서 7일간 배양한 NK 전구체 상태의 세포들에 20 ng/ml의 TNF-α를 처리하였다. 우선, pNK 세포가 TNF-α에 반응할 수 있는 수용체들을 발현하고 있는지를 유세포분석기로 분석한 결과, pNK 세포들은 TNFR1과 TNFR2를 모두 발현하고 있음을 확인하였다(도 1A).

또한, 최적의 TNF-α 농도를 정하기 위해, TNF-α 단독, 또는 IL-15와 함께 다양한 농도(0, 10, 20, 50, 100 ng/ml)로 처리하여 NK1.1⁺CD3^-인 세포들의 비율을 분석하였다. 참고로, NK1.1은 NK 세포의 잘 알려진 표면 분자이며, CD3는 T 세포의 특징적인 표면 분자이다. 상기 분석 결과, TNF-α에 의해 유도된 NK 세포의 분화는 20 ng/ml 농도의 TNF-α에서 포화 상태에 이르는 것을 확인하였다(도 1B).

또한, pNK 세포들을 IL-15를 처리하지 않은 군(대조군), IL-15(50 ng/ml) 단독 처리군, TNF-α(20 ng/ml) 단독 처리군, 및 IL-15(50 ng/ml)과 TNF-α(20 ng/ml)를 함께 처리한 군에서 각각 CD122, NKG2A/C/E, NKG2D 및 DX5와 같은 다양한 NK 세포의 표면 분자 발현을 FACS로 확인하였다. 그 결과, pNK 세포에 20 ng/ml 농도의 TNF-α를 단독으로 처리하였을 때, NK1.1⁺CD3^-인 세포의 비율이 IL-15를 처리하지 않은 조건(대조군)에 비해 3배 이상 증가하였고, IL-15과 함께 처리했을 때는 NK 세포의 분화가 더욱 증가됨을 확인하였다(도 1B).

CD122, NKG2A/C/E, NKG2D, DX5와 같은 다른 NK 세포 특유의 표면 분자들의 발현도 TNF-α에 의해 증가되는 것을 확인되었다 (도 2).

따라서, TNF-α가 생체외(in vitro)에서 NK 세포 분화를 유도하며, 이는 IL-15의 존재 하에서 더욱 증가됨을 알 수 있었다.

<실험예 2> TNF-α가 NK 세포의 IFN-γ 생성에 미치는 영향 조사

IFN-γ의 생성은 NK 세포의 활성을 확인할 수 있는 주요한 특징이며, 완전히 분화된 NK 세포들은 IL-12, IL-15 및 IL-18 같은 자극 신호가 주어지면 IFN-γ를 생성함으로써 활성을 나타낸다.

이에, TNF-α를 이용하여 분화시킨 NK 세포가 완전한 기능을 할 수 있는지 확인하기 위해, 생체외(in vitro)에서 분화 과정 동안에 NK 세포의 배양 상층액에 존재하는 IFN-γ의 농도를 ELISA 분석법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 생체외(in vitro)에서 분화시킨 NK 세포를 회수하여 1 X PBS로 두 번 세척하고, 평면바닥 96 웰 플레이트(flat-bottom 96-well plate)(BD)에서 3 x 10⁵cells/well 농도로 20 ng/ml 마우스 IL-12(PeproTech)를 포함하는 배지를 사용하여 20시간 동안 IFN-γ 생성에 대한 자극을 주었다. 상층액에 존재하는 IFN-γ의 농도는 Quantikine mouse IFN-γ immunoassay kit(R&D systems, Minneeapolis, MN)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, TNF-α를 단독으로 처리한 경우는 IL-15을 처리한 조건에 비해 상당히 적은 양의 IFN-γ를 생성함을 확인하였다(도 3A). 이는 TNF-α가 직접적인 IFN-γ 자극제(stimulator)로 작용할 수 없음을 의미하는 것을 알 수 있었다.

또한, 완전히 분화시킨 성숙한 NK 세포를 회수하여 TNF-α와 IL-15을 제거한 후, 상기와 같은 방법으로 IFN-γ 생성의 자극제인 IL-12를 처리한 다음, IFN-γ 생성 정도를 ELISA 분석법으로 측정하였다. 그 결과, mNK 세포들에 IL-12에 의한 자극을 주어진 경우, TNF-α에 의해 분화된 NK 세포들 역시 상당히 많은 양의 IFN-γ를 생성하였으며(도 3B), IFN-γ의 생성량은 NK 세포의 분화 정도에 상응하는 것을 알 수 있었다(도 3C).

따라서, TNF-α는 NK 세포의 표현형적 분화를 유도하지만, 활성화를 위해서 는 또 다른 자극 신호가 필요함을 알 수 있었다.

<실험예 3> TNF-α가 NK 세포 분화 관련 전사인자들의 발현에 미치는 영향 조사

TNF-α에 의해 유도되는 NK 세포 분화의 분자적 메커니즘을 확인하기 위하여, NK 세포의 분화에 연관 있다고 알려진 다양한 전사인자들(Ets-1, Id2, PU.1, Gata-3, IRF-2, T-bet)의 발현을 정량적 실시간 PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 mRNA 수준에서 확인하였다. 구체적으로, 분화 과정 중의 NK 세포를 회수하고 Trizol Reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 1 ~ 3 μg의 RNA를 2.5 U의 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, M-MLV) 역전사효소(reverse transcriptase)(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)와 함께 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA의 전사체는 SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio, Tokyo, Japan)와 Real-time system TP 800(Takara Bio)를 이용하여 정량하였으며, 시료의 표준화를 위해 GAPDH를 사용하였다. 각각의 프라이머(primer)는 프라이머3 소프트웨어(Primer3 software)를 사용하여 제작하였다. 그 결과, TNF-α와 IL-15의 존재 하에서 T-bet, Gata-3 및 Ets-1의 mRNA 발현이 증가되는 반면에, Id2, PU.1, 및 IRF-2의 발현은 큰 영향을 받지 않았다(도 4).

이전 연구를 통해, T-bet과 Gata-3는 NK 세포의 후기 분화 과정에 중요하게 작용한다는 것이 알려져 있다. 상기 분화 과정 중에 TNF-α가 pNK에서 mNK 세포로 분화시키는 후반부에 첨가되는 것을 생각할 때, 상기 전사인자들의 두드러진 증가 는 이전 연구와 일맥상통한다. 따라서, TNF-α는 NK 세포의 분화에 연관있는 전사인자들의 발현을 조절함으로써 분화를 유도하고, 특히 T-bet과 Gata-3가 TNF-α 매개의 NK 세포 분화에 특이적으로 관여하고 있음을 알 수 있었다.

<실험예 4> NK 세포의 생체외(in vitro) 분화 과정 중 TNF-α에 의한 NF-κB의 활성화 조사

TNF-α는 NF-κB, JNK 및 p38 MAPK 경로를 활성화시킨다는 것이 잘 알려져 있다.

이에, NK 세포의 분화와 TNF-α 매개의 신호 전달과의 연관성을 확인하기 위해, 상기 인자들의 활성화를 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 분화시킨 세포들은 RIPA 용해 완충용액(lysis buffer)를 이용하여 용해시켰다. 총 세포 용해물에 존재하는 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Protein Assay Kit)(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 측정하였다. 30 ~ 60 μg의 단백질 시료를 12% SDS-PAGE 겔(gel)을 이용하여 분리한 후, Immobilon-P Transfer Membrane(Millipore Corporation, Billerica, MA)으로 전달시켰다. 5% 탈지분유(skim milk)로 30분간 블라킹(blocking)한 후, 각 인자의 일차 항체를 4℃에서 하루 동안 처리하였다. 상기 막에 붙은 일차 항체(primary antibody)에 HRP가 접합된 이차 항체(HRP-conjugated secondary antibody)를 붙이고, 이를 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore Corporation)을 이용하여 확인하였다. 참고로, NF-κB는 NF-κB 억제제(inhibitor)인 IκBα의 분해 를 거쳐 활성화되며, JNK와 p38 MAPK는 인산화됨으로써 활성화된다. 상기 분석 결과, TNF-α를 처리하였을 때, IκBα의 양이 현저히 감소하였고, p38의 인산화가 두드러지게 증가하였으나, JNK의 인산화는 확인할 수 없었다(도 5A).

또한, TNF-α에 의해 유도된 NF-κB와 p38 MAPK가 NK 세포의 분화에 관여하는지 알아보기 위하여, NF-κB 저해제인 BAY 11-7082와 p38 MAPK 저해제인 SB 203580을 TNF-α 처리 1시간 전에 전처리한 후, NK 세포 분화 정도를 유세포분석기로 분석하였다. 그 결과, NF-κB 저해제인 BAY 11-7082를 전처리한 경우에만 NK 세포의 분화가 현저히 감소함을 확인하였다(도 5B).

따라서, TNF-α에 의해 유도된 NK 세포 분화의 증가는 NF-κB의 활성화를 필요로 함을 알 수 있었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

TNF-α 25 ㎎

IL-15 25 ㎎

유당 50 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

TNF-α 25 ㎎

IL-15 25 ㎎

유 당 50 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

TNF-α 25 ㎎

IL-15 25 ㎎

유 당 50 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

TNF-α 25 ㎎

IL-15 25 ㎎

유 당 50 ㎎

글리세린 100 ㎎

자일리톨 100 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 300 ㎎이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

TNF-α 25 ㎎

IL-15 25 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 100 ㎎

전분 100 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<1-6> 주사액제의 제조

TNF-α 20 ㎍/㎖

IL-15 50 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 TNF-α 및 IL-15을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 TNF-α 및/또는 IL-15를 이용하여 자연살해세포 세포의 분화를 조절하는 방법을 개발하고, 나아가 항암 세포치료법을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 자연살해세포의 생체외(in vitro) 분화에 TNF-α가 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 전구체 자연살해세포들에 20 ng/ml의 TNF-α를 처리한 후, TNFR1 및 TNFR2가 발현하는지 유세포분석기로 분석한 결과 (A), 및 자연살해세포의 생체외(in vitro) 분화에 처리하는 최적의 TNF-α 농도를 정하기 위하여, TNF-α 단독, 또는 IL-15와 함께 다양한 농도로 처리하여 각 조건에서의 NK1.1⁺CD3^-인 세포들의 비율을 유세포분석기로 분석한 결과 (B)를 나타내는 그래프이다.

도 2는 자연살해세포의 생체외(in vitro) 분화에 TNF-α가 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 전구체 자연살해세포들을 사이토카인이 없는 상태(control), IL-15(50 ng/ml) 단독, TNF-α(20 ng/ml) 단독, 및 IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 조건에서 다양한 NK 세포의 표면 분자 발현을 유세포분석기로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 TNF-α가 자연살해세포의 IFN-γ 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 자연살해세포의 배양 상층액을 회수하여 IFN-γ의 농도를 ELISA로 측정한 결과 (A), 배양 후 자연살해세포를 회수하여 IL-15과 TNF-α를 제거하고 IL-12로 20시간 동안 재자극한 다음 상층액을 회수하여 IFN-γ의 농도를 ELISA로 측정한 결과 (B), 및 이때 자연살해세포들의 분화 정도를 FACS로 분석한 결과 (C)를 나타내는 그래프이다.

도 4는 TNF-α가 자연살해세포 분화 관련 전사인자들의 발현에 미치는 영 향을 조사하기 위하여, 생체외(in vitro) 분화 과정에서 전구체 자연살해세포들에 사이토카인이 없는 상태(control), IL-15(50 ng/ml) 단독, TNF-α(20 ng/ml) 단독, 및 IL-15과 TNF-α를 함께 처리한 후 2일, 4일, 6일째되는 날에 분화시킨 세포들을 회수하여 T-bet, Gata-3, Id2, PU.1 및 IRF-2의 mRNA 발현을 실시간(real-time) PCR로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 TNF-α에 의해 유도된 자연살해세포 분화 과정에 연관있는 신호 전달 경로를 확인하기 위하여, TNF-α에 의해 활성화되는 다운스트림(downstream) 신호 전달 경로를 웨스턴블랏팅(western blotting)으로 분석한 결과 (A), 및 각 신호 전달 경로에 대한 저해제(NF-κB 저해제인 BAY 11-7082와 p38 MAPK 저해제인 SB 203580)를 TNF-α 처리 1시간 전에 전처리한 경우의 자연살해세포 분화 정도의 변화 (B)를 유세포분석기로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

Claims

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1) 시험관 내(In vitro)에서, 조혈줄기세포에 SCF(stem cell factor), Flt3L(Fms-like tyrosine kinase 3 ligand) 및 IL-7(interleukin-7)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 전구체 자연살해세포(precursor natural killer cell, pNK 세포) 유도제를 첨가하여 전구체 자연살해세포로의 분화를 유도하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 전구체 자연살해세포에 TNF-α 및 IL-15를 병합 처리하여 성숙한 자연살해세포(mature natural killer cell, mNK 세포)로 분화시키는 단계를 포함하는, 시험관 내(In vitro)에서 조혈줄기세포에서 자연살해세포로 분화시키는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 TNF-α는 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell, HSC 세포)에서 자연살해세포로의 분화를 촉진시키거나 자연살해세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(In vitro)에서 조혈줄기세포에서 자연살해세포로 분화시키는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 TNF-α는 인터페론-감마(Interferon-γ, IFN-γ), T-bet, Gata-3 및 Ets-1의 발현을 증진시키거나, NF-κB를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 시험관 내(In vitro)에서 조혈줄기세포에서 자연살해세포로 분화시키는 방법.
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