KR102052880B1

KR102052880B1 - 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 차세대 수지상세포로의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 이용한 차세대 수지상세포 제조방법

Info

Publication number: KR102052880B1
Application number: KR1020180009947A
Authority: KR
Inventors: 이현아; 김현수
Original assignee: 파미셀 주식회사
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2019-12-10
Also published as: KR20190091020A

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 차세대 수지상세포로의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 이용한 성숙 차세대 수지상세포 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 수지상세포 성숙화 유도용 조성물은 미성숙 인간 수지상세포의 CD141, Clec9a 발현 및 IP-10 사이토카인 분비를 유도하고, 항암 면역기능 유도에 관여하는 IL-12p70 및 IFN-γ의 분비를 증가시켜 항암면역 기능이 우수한 CD141+, Clec9a+ 아형의 차세대 수지상세포 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 차세대 수지상세포로의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 이용한 차세대 수지상세포 제조방법{COMPOSITION FOR INDUCING MATURATION OF NEXT-GENERATION DENDRITIC CELL COMPRISING GINSENOSIDE Rg3 AND METHOD FOR PRODUCING NEXT-GENERATION DENDRITIC CELL USING THE SAME}

본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 차세대 수지상세포로의 성숙화 유도용 조성물 및 이를 이용한 차세대 수지상세포 제조방법에 관한 것이다.

수지상세포(dendritic cell, DC)는 선천면역 및 적응면역을 포함하는 모든 면역반응 유도의 필수 핵심요소로, 조혈 줄기세포로부터 분화되며 생체 미세환경 안에서 다양한 아형(subtype)으로 존재한다. 수지상세포는 항원에 특이적인 면역반응을 자극하거나 몸에 이로운 항원에 대해 면역 관용을 유도하는 반응에 관여한다.

또한, 항암면역치료제로서 수지상세포를 이용하기 위해, ex vivo에서 배양된 수지상세포를 종양항원으로 항원인식 후 다시 체내로 주입할 수 있다. 주입된 수지상세포는 종양에 특이적인 면역반응을 유도하여 효과적으로 종양을 제거할 수 있다. 이와 같이 항암면역치료제로서 수지상세포를 이용하기 위해서는 수지상세포가 성숙되어야 한다. 또한, 성숙된 수지상세포의 기능 또는 아형은 치료제의 중요한 요소 중 하나이다. 최근 CD141+, Clec9a+ 아형의 차세대 수지상세포가 가장 효율적인 항원 전달 기능을 가지고 있어 항암 면역기능 유도에 최적일 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다(Paul J. et al., Seminars in Immunology, 23:12-20, 2011 및 Lelia Delamarre et al., Seminars in Immunology, 23:2-11, 2011).

또한, 현재 국내에서 항암 면역세포 치료제로써 수지상세포에 대한 임상시험이 진행되고 있다. 하지만, 국내 임상시험에 쓰이는 수지상세포는 말초혈액으로 분리한 단핵구로부터 분화된 것으로서 임상결과가 비임상 유효성 시험에서 확인된 가능성에 대비하여 만족할 만한 결과를 얻지 못하였고, 임상시험에 사용된 수지상세포가 항암 면역기능 유도에 대한 기여도가 확실하지 않다는 연구 결과가 보고된 바 있다(Kristen J Radford et al., Current Opinion in Immunology, 27:26-32, 2014)

한편, 진세노사이드란 인삼과 배당체(glycoside)의 합성어로 인삼에서 발견되는 특이한 구조의 사포닌을 의미한다. 사포닌은 글루코오스, 아라비노오스 및 람노스와 같은 당이 치환기에 결합된 종류와 수에 따라 다양한 진세노사이드로 구분된다. 당이 붙는 구조에 따라 트리올(triol) 계열과 디올(diol) 계열로 분류되며, 프로토파낙시트리올(protopanaxatriol) 계열의 진세노사이드 종류로는 Re, Rf, Rg1, Rg2 및 Rh1가 있고, 프로토파낙시디올(protopanaxadiol) 계열의 진세노사이드 종류로는 Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rs, Rg3, Rg5 및 Rh2가 있다.

또한, 진세노사이드 Rg3(ginsenoside Rg3)는 20(S)-프로토파낙사다이올-3-0-베타-디-글루코피라노실(1,2)-베타-디-글루코피라노사이드로 불리며, 프로토파낙시디올 계열의 진세노사이드 화합물의 일종이다. 진세노사이드 Rg3는 홍삼에서만 만들어지는 진세노사이드로 특히 우수한 항암 활성 및 신경보호 활성, 혈소판 응집억제 활성, 항산화 활성, 항염증 활성, 신장보호 활성 등의 다양한 약리 활성을 나타낸다.

Paul J. et al., Seminars in Immunology, 23:12-20, 2011 Lelia Delamarre et al., Seminars in Immunology, 23:2-11, 2011 Kristen J Radford et al., Current Opinion in Immunology, 27:26-32, 2014

이에 본 발명자들은, CD141+ 및 Clec9a+ 아형의 차세대 수지상세포 (마우스 CD11c+ 및 Clec9a+ 수지상세포)를 제조하기 위해 진세노사이드 Rg3를 이용하여 미성숙 수지상세포를 성숙화시켰다. 이와 같이, 성숙시킨 수지상세포에서 CD141 (인간) 및 Clec9a (인간 및 마우스)의 발현과 IP-10 사이토카인 분비를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 i) 진세노사이드 Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계; 및 ii) 성숙 수지상세포를 수득하는 단계를 포함하는 차세대 수지상세포 제조방법을 제공한다. 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 차세대 수지상세포를 제공한다.

나아가, 상기 차세대 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 차세대 수지상세포 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 수지상세포 성숙화 유도용 조성물은 미성숙 수지상세포의 CD141, Clec9a 발현 및 IP-10 사이토카인 분비를 유도하고, 항암 면역기능 유도에 관여하는 IL-12p70 및 IFN-γ의 분비를 증가시켜 항암면역 기능이 우수한 CD141+, Clec9a+ 아형의 차세대 수지상세포 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포의 표현형 마커들의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 2는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포의 IFN-γ, IL-12p70 및 IL-10 사이토카인의 분비량을 나타낸 도면이다.
도 3은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포에 의한 T세포의 증식률을 측정한 도면이다.
도 4는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 이용한 마우스 폐암 면역치료의 유효성 시험을 위한 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 5는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 이용한 면역치료를 받은 실험군 및 식염수를 처리한 대조군 마우스의 종양 크기를 정상 마우스와 비교한 도면이다.
도 6은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 실험군과 식염수를 투여한 대조군 마우스의 35일 동안의 생존률을 나타낸 도면이다.
도 7은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포로 항암 치료한 폐암 유발 마우스의 비장세포를 종양항원으로 자극하여 IFN-γ를 분비하는 T세포의 수를 측정한 사진이다.
도 8은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 이용한 마우스 난소암 면역치료의 유효성 시험을 위한 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 9는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포(pulsed-DC)를 이용한 면역치료를 받은 실험군 및 식염수를 처리한 대조군 마우스의 체중 변화를 나타낸 도면이다.
도 10은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 실험군과 식염수를 투여한 대조군 마우스의 54일 동안의 생존률을 나타낸 도면이다.
도 11은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포로 항암 치료한 난소암 유발 마우스의 비장세포를 종양항원으로 자극하여 IFN-γ를 분비하는 T세포의 수를 측정한 사진이다.
도 12는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 이용한 마우스 전립선암 면역치료의 유효성 시험을 위한 프로토콜을 나타낸 도면이다.
도 13은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포(cellgram-DC) 또는 기존 연구에서 주로 사용되는 단핵구 유래 수지상세포(mono-DC)로 치료받은 실험군 및 식염수를 처리한 대조군 마우스의 종양 부피 변화를 비교한 도면이다.
도 14는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포로 항암 치료한 전립선암 유발 마우스의 비장세포를 종양항원으로 자극하여 IFN-γ를 분비하는 T세포의 수를 측정한 사진이다.
도 15는 인간 및 마우스의 성숙 수지상세포를 제조하는 과정을 도식화한 도면이다.
도 16은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 인간 성숙 수지상세포의 표현형 마커들의 발현량을 나타낸 도면이다.
도 17은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 인간 성숙 수지상세포의 CD141 및 Clec9a의 발현을 확인한 유세포 분석 도면이다.
도 18은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 인간 성숙 수지상세포가 분비하는 IL-12p70, IFN-γ, IP-10 및 IL-10의 분비량을 나타낸 도면이다.
도 19는 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 인간의 성숙 수지상세포에 의한 T세포의 증식률을 측정한 도면이다.
도 20은 진세노사이드 Rg3를 처리하여 성숙시킨 인간 성숙 수지상세포에 의한 종양항원 특이적인 면역반응을 확인한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 진세노사이드 Rg3를 이용한 차세대 수지상세포 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 차세대 수지상세포 제조방법은 i) 진세노사이드 Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계; 및 ii) 성숙 수지상세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 '수지상세포'란 선천면역 및 적응 면역반응을 매개하는 항원제시세포(antigen-presenting cell)를 의미한다. 상기 수지상세포는 항원제시능력이 우수하여 항원에 인식한 적이 없는 naive T세포를 항원인식 시킬 수 있다. 또한, 성숙된 수지상세포는 T세포 활성화 및 증식에 필요한 신호 자극을 줄 수 있다.

상기 수지상세포가 발현하는 표현형 마커를 통해 성숙 여부를 확인할 수 있다. 또한, 이를 통하여 인간 및 다른 포유동물의 수지상세포도 특정할 수 있는데 예를 들면, 인간에게서 CD141+ DC로 표기되는 수지상세포는, 마우스에서는 CD11c+CD8a+ DC로 표기된다.

본 발명에서 사용되는 용어 '미성숙 수지상세포'란, CCR7 및 세포질 단백질 DC-LAMP(Dendritic cell-lysosomal associated membrane protein)를 낮은 수준으로 발현하고, 공동 자극 분자 CD40, CD80 및 CD86을 낮은 수준으로 발현하며, CD1a 및 CCR1(C-C chemokine receptor type 1), CCR2, CCR5 및 CXCR1(CXC chemokine receptors type 1)을 통상적 수준으로 발현하는 수지상세포를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 '성숙 수지상세포'란, 미성숙 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미한다. 성숙 수지상세포는 DC-LAMP 뿐만 아니라 MHC 클래스 II, CD40, CD80, CD83 및 CD86의 발현이 증가하고, 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 방출한다. 또한, 성숙 수지상세포와 T세포를 포함하는 혼합림프구 반응(mixed lymphocyte reaction)에서, 동종이계 T세포(allogeneic T cells) 및 동종동계 T세포(syngeneic T cells)의 증식을 증가시킨다. 또한, 인간 성숙 수지상세포는 전형적으로 CD83, CCR7 및 CXCR4를 높은 수준으로 발현한다.

특히, 인간 성숙 수지상세포는 CD141 및 Clec9a의 발현이 증가된 것일 수 있다. 다만, 성숙 수지상세포가 마우스 유래인 경우 CD11c+ 및 Clec9a+의 발현이 증가된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 'CD141'이란 분화클러스터(Cluster of differentiation)141, 트롬보모듈린(thrombomodulin) 또는 BDCA3로 불리는 세포 표면에 발현하는 내재막단백질(integral membrane protein)을 의미한다. 상기 CD141은 인간에게서 중피세포(mesothelial cell), 단핵구(monocyte), 몇몇 아형의 수지상세포에서 발현된다.

본 발명에서 사용하는 용어 'Clec9a'란 C형 렉틴 수용체 패밀리 9(C-type lectin domain family 9 member A) 구성원으로 골수계 세포(myeloid lineage cell)에서 발현하는 활성화 수용체 단백질을 의미한다.

또한, 상기 성숙 수지상세포는 CD80, CD86, CCR7의 발현이 증가된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 'CD80'이란 분화클러스터 80 또는 B7-1로 불리는 수지상세포에서 발현하고, T세포 활성화 및 생존에 필요한 보조자극신호를 제공하는 수용체 단백질을 의미한다. 수지상세포에서 CD80의 발현은 수지상세포의 기능적 성숙을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 'CD86'이란 분화클러스터 86 또는 B7-2로 불리는 항원제시세포에서 발현하고, T세포 활성화 및 생존에 필요한 보조자극신호를 제공하는 수용체 단백질을 의미한다. 수지상세포에서 CD86의 발현은 수지상세포의 기능적 성숙을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 'CCR7'이란 분화클러스터 197 또는 C-C 키모카인 수용체 타입 7로 불리는 다양한 림프 조직, 활성화된 B세포 및 T림프구에서 발현하고, 수지상세포의 성숙화를 자극하는 수용체 단백질을 의미한다. 상기 CCR7은 T세포가 2차 림프기관인 림프절이나 비장으로 이동할 수 있게 유도한다.

본 발명에서 사용하는 용어 '차세대 수자상세포'란, 종래의 수지상세포에 비해 항암 면역 기능이 강화된 수지상세포를 의미한다. 상기 차세대 수지상세포는 CD141⁺ 및 Clec9a⁺일 수 있다. 특히, 성숙된 차세대 수지상세포는 CD80, CD86, CCR7의 발현이 증가된 것일 수 있다. 바람직하게 상기 차세대 수지상세포는 상술한 Rg3 존재하에서 미성숙 수지상세포를 성숙시켜 수득된 것일 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계에서 진세노사이드 Rg3를 1 내지 10,000 ㎍/ 1x10⁶ cells, 10 내지 1000 ㎍/ 1x10⁶ cells, 30 내지 100 ㎍/ 1x10⁶ cells 농도로 처리할 수 있다. 바람직하게는, 50 ㎍/ 1x10⁶ cells 농도의 진세노사이드 Rg3를 1회 처리할 수 있다.

또한, 상기 진세노사이드 Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계에서 배양시간은 1 내지 72시간, 6 내지 60시간, 12 내지 48시간 동안 배양할 수 있다. 바람직하게는, 18 내지 48 시간 동안 배양하여 성숙시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 미성숙 수지상세포는 CD14+ 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF 존재 하에 배양하여 수득한 것일 수 있다. 구체적으로, IL-4 및 GM-CSF를 각각 독립적으로 10 내지 10000 IU/㎖, 100 내지 5000 IU/㎖, 500 내지 2500 IU/㎖, 800 내지 1500 IU/㎖ 농도로 처리할 수 있다. 또한, 상기 농도를 유지하기 위해, 매일 또는 2 내지 4일간 배지에 혼합된 IL-4 및 GM-CSF 농도를 측정 후 추가할 수 있다. 바람직하게, IL-4 및 GM-CSF는 각각 1000 IU/㎖ 농도의 2 내지 4일 간격으로 배양기간 동안 처리하여 배양된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 '단핵구'는 혈액 내에 존재하는 식세포의 일종으로 대식세포나 수지상 세포로 분화하는 세포를 의미한다. 상기 CD14를 세포표면에 발현하는 단핵구는 IL-4 및 GM-CSF를 처리하여 미성숙 수지상세포로 분화될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 'CD14'란, 분화클러스터 14로 불리며 주로 대식세포나 수지상세포 표면에 발현하고, 세균의 지질다당류를 인식하는 기능을 하는 수용체 단백질을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 'IL-4'란, 인터루킨 4로 불리며 CD14+ 단핵구가 대식세포로 분화되지 않고 수지상세포로 분화 되도록 하는 작용하는 사이토카인을 의미한다. 또한, 상기 IL-4는 naive 헬퍼 T세포(Th0 cell)를 헬퍼 T세포(Th2 cell)로 분화유도에 작용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 'GM-CSF'란, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자로 대식세포, T세포, 비만 세포, 자연살해세포, 내피세포, 그리고 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질을 의미한다. 상기 GM-CSF는 백혈구의 성장인자로 기능하며, 줄기세포를 자극하여 과립구와 단핵구로 분화시킨다. 단핵구는 조직으로 이동하여 대식세포와 수지상세포로 성숙한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 성숙 차세대 수지상세포를 제공한다. 구체적으로, 상기 차세대 수지상세포는 IL-12 및 특이적으로 IFN-γ 및 IP-10의 분비가 증가된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 'IL-12'란, 수지상세포, 대식세포, 과립구 및 인간 B 림프아구세포(lymphoblastoid cell)가 항원자극을 받아 분비하는 사이토카인 단백질을 의미한다. 상기 IL-12는 naive T세포가 헬퍼 T세포(Th1 cell)로 분화하는데 관여한다. 이 외에도 T세포와 자연살해세포(NK cell)의 IFN-γ 및 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 사이토카인의 분비를 자극하며, IFN-γ의 분비를 억제하는 사이토카인인 IL-4의 분비를 감소시킨다. 또한, IL-12는 자연살해세포와 세포독성 T세포(CD8+ cytotoxic T lymphocytes)의 세포독성 활성을 강화하는데 중요하게 작용한다.

본 발명에서 사용하는 용어 'IFN-γ'란, 인터페론 타입 II에 멤버인 이량체의 사이토카인 단백질을 의미한다. 상기 IFN-γ는 주로 자연살해세포, 세포독성 T세포에 의해 생산되며, 항원에 특이적으로 면역반응이 일어나는 적응 면역계를 활성화시킨다. 또한, IFN-γ는 면역계에서 바이러스의 증식을 직접적으로 억제하는 중요한 역할을 한다.

본 발명에서 사용하는 용어 'IP-10'이란, CXCL10(C-X-C motif chemokine 10) 또는 small-inducible cytokine B10로 불리며 단핵구, 내피세포, 섬유아세포에서 분비되는 사이토카인을 의미한다. 상기 IP-10은 단핵구, T세포, 자연살해세포 및 수지상세포에 대한 화학적 포착, 내피세포에 대한 T세포 접착 촉진, 골수 콜로니 형성억제 및 혈관신생 억제와 같은 항암작용을 한다.

또한, 본 발명은, 차세대 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 암은 췌장암, 간암, 위암, 폐암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 식도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 자궁경부암, 유방암, 혈액암, 피부암, 상피암, 뇌암, 중추신경암 또는 난소암일 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 유방암, 신장암, 난소암, 전립선암, 교모세포종 및 악성흑색종일 수 있다.

상기 인간 차세대 수지상세포는 CD141 및 Clec9a 수용체의 발현이 증가된 것을 특징으로 하며, IL-12 및 IFN-γ와 IP-10의 발현이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 CD141 및 Clec9a 수용체와 IL-12 및 IFN-γ, IP-10 사이토카인은 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명의 암 치료용 약학 조성물이 주사용 제형으로 제조될 경우에 통상적으로 세포가 부유된 액체 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 암 치료용 약학 조성물에는 미생물에 의한 오염을 방지하기 위해서 항미생물제가 안정화제 등이 추가로 포함될 수 있다. 적합한 항미생물제로서는 젠타마이신(gentamycin) 등이 있고, 알부민 등의 단백질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 피하 (sub-cutaneous), 피 내(intra-dermal), 림프절 내(intra-nodal) 및 정맥 내(intra-venous) 등에 적당한 방법에 의해서 투여될 수 있다. 바람직하게는, 피하 또는 림프절 내로 투여할 수 있다. 한편, 본 발명의 암 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여 스케줄, 투여량 및 환자의 건강 상태 등에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 암 치료용 약학 조성물은 1회 5x10⁴ 내지 5x10⁸, 또는 5x10⁶ 내지 5x10⁷ 양으로 투여할 수 있다.

또한, 차세대 수지상세포에 근거한 암 치료용 약학 조성물의 효능을 높이기 위하여 수지상세포를 주입시에 IL-12와 같은 T세포의 활성화를 도와주는 사이토카인, 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor), 면역화학요법제 등과 같이 면역회피 기전을 극복하거나 종양미세환경을 개선 할 수 있는 제제와 병용투여 할 수 있다. 또는 항암면역 유전자 치료제와 병용 사용 할 수 있다.

또한, 본 발명은 진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는, 미성숙 수지상세포 성숙화 유도용 조성물을 제공한다. 상기 진세노사이드 Rg3는 미성숙 수지상세포의 성숙화 과정 동안 CD80, CD86, CCR7 수용체로 이루어진 군에서 적어도 하나의 수용체 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 CD80, CD86 및 CCR7은 앞서 기술한 바와 같다.

또한, 상기 진세노사이드 Rg3는 미성숙 수지상세포의 성숙화 과정 동안 CD141 및 Clec9a 수용체의 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 CD141 및 Clec9a 수용체는 앞서 기술한 바와 같다. 또한, 상기 진세노사이드 Rg3는 미성숙 수지상세포의 성숙화 과정 동안 IP-10 사이토카인의 분비를 증가시킬 수 있다.

상기 미성숙 수지상세포는 CD14+ 단핵구에 IL-4 및 GM-CSF를 처리하여 분화시킨 것일 수 있다. 상기 CD14 수용체, IL-4 및 CM-CSF는 앞서 기술한 바와 같다.

나아가, 본 발명은 미성숙 수지상세포에 진세노사이드 Rg3를 처리하는 단계를 포함하는 차세대 수지상세포 성숙화 유도방법을 제공한다. 또한, 상기 미성숙 수지상세포는 CD14+ 단핵구에 IL-4 및 GM-CSF를 처리하여 분화된 것일 수 있으며, CD14 수용체, IL-4 및 CM-CSF는 앞서 기술한 바와 같다. 또한, 상기 진세노사이드 Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계에서 진세노사이드 Rg3를 1 내지 10,000 ㎍/ 1x10⁶ cells, 10 내지 1000 ㎍/ 1x10⁶ cells, 30 내지 100 ㎍/ 1x10⁶ cells 농도로 처리할 수 있다. 바람직하게는, 50 ㎍/ 1x10⁶ cells 농도의 진세노사이드 Rg3를 1회 처리할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 조정배지 제조

조정배지를 제조하기 위해 인간의 골수를 채취하여 피콜(ficoll) 과정을 거친 후, 단핵세포를 수득하였다. 그 후, 골수 유래 단핵세포에서 중간엽 줄기세포를 분리하였다. 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하는 기간 동안 수거한 배양액의 상층액을 모아 혼합하였다. 그 후, 검사 및 필터 여과 과정을 거쳐 제조하였다.

구체적으로, 인간의 골수를 채취한 후, 골수는 1x DPBS와 1:1로 혼합시켰다. 그 후, 피콜과 1:1 부피 비율이 되도록 채취한 골수를 피콜 위로 흘려주었다. 원심분리 후 흰색층만 수거하여 1x DPBS로 3번 세척하였다. 그 후 펫릿만 남기고, T 플라스크로 옮겨 배양하였다.

피콜 과정을 거쳐 얻은 단핵세포(mononuclear cell)를 FBS 10%(v/v) 및 젠타마이신(gentamicin sol) 10 ㎎/㎖ 농도로 혼합된 DMEM low glucose(1 g/L) 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포만 분리하였다. 순수 분리된 중간엽 줄기세포의 증식을 위해 35 내지 56일 동안 배양을 진행하였다. 배양하는 동안 3 내지 5일 마다 전체 배양액의 25%(v/v) 용량의 배지를 줄기세포 배양액에 추가해 주면서 37℃ 온도에서 CO₂ 5% 조건으로 배양하였다.

배양기간 동안 4 내지 7일마다 새로운 배지로 교체하면서 사용한 배양액을 모은 후 원심분리를 하여 상층액을 수집하였다. 단핵세포를 배양하는 기간 동안 배양액을 5회 회수하였다. 수집한 상층액은 마이코플라즈마(Mycoplasma), 무균 및 바이러스 시험을 통해 검사한 후 0.2um 필터로 걸러 수집하였다.

I. 마우스 수지상세포의 분화 유도 및 특성 확인

실시예 1. 마우스 성숙 수지상세포 제조

마우스의 성숙 수지상세포를 제조하기 위해 마우스 골수 유래 CD34+ 조혈모세포를 분리하여 준비하였다. 그 후, CD34+ 조혈모세포를 CD14+ 단핵구 세포로 분화 및 증식시켰다. CD14+ 단핵구 세포를 미성숙 수지상세포로 분화시킨 후, Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 성숙시켜 성숙 수지상세포를 제조하였다(도 15).

실시예 1.1. 마우스 CD34+ 조혈모세포 준비

골수에서 피콜을 이용하여 단핵세포만 분리한 후, lineage negative cell selection beads(MACS, Milteney Biotech)를 이용하여 CD34+ 조혈모세포를 분리하였다.

실시예 1.2. CD14+ 단핵구 세포로의 분화

실시예 1.1.에서 얻은 CD34+ 조혈모세포를 FBS 10%(v/v), 10 ㎎/㎖ 농도의 젠타마이신 및 제조예 1.에서 제조한 조정배지가 혼합된 DMEM low glucose(1 g/L) 배지에서 7 내지 10일 동안 배양을 진행하였다. 37℃, CO₂ 5% 조건으로 배양하였다. 그 후, 단핵구를 수득하였다.

실시예 1.3. 미성숙 수지상세포로의 분화

실시예 1.2.에서 얻은 골수 유래 단핵구를 미성숙 수지상세포로 분화시키기 위해 1000 IU/㎖ 농도의 GM-CSF와 1000 IU/㎖ 농도의 IL-4를 처리하고 5 내지 6일 동안 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

실시예 1.4. 진세노사이드 Rg3의 성숙화 유도 확인

실시예 1.3.에서 얻은 미성숙 수지상세포 배양액에 50 ㎍/㎖ Rg3을 첨가하여 18 내지 48시간 동안 배양하여 성숙화시켰다. 그 후, 성숙화시킨 수지상세포에 FITC, APC(Allophycocyanin) 및 PE(Phycoerythrin)등이 표지된 anti-clec9a, anti-CD8a, anti-CD11c, anti-HLA-ABC antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD86 antibody 및 anti-CCR7 antibody를 처리하여 염색한 후, 유세포분석기(CytoFLEX Flow Cytometry Analyzer, Beckman, USA)을 통해 형광강도(Fluorescence intensity)를 측정하였다.

그 결과, Rg3을 첨가하여 제조된 마우스 성숙 수지상세포에서 항원제시 기능을 담당하는 MHC I/II 및 수지상세포의 기능적 성숙도를 나타내는 HLA-ABC, CD80/86, CCR7 및 차세대 수지상세포 마커인 Clec9a 발현이 증가하였다(도 1).

실험예 1. 마우스 성숙 수지상세포의 특성 확인

실험예 1.1. 마우스 성숙 수지상세포에서의 표현형 마커 확인

실시예 1.4.에서 얻은 마우스 성숙 수지상세포에 FITC, APC(Allophycocyanin) 및 PE(Phycoerythrin) 등이 표지된 anti-CD8 antibody 및 anti-Clec9a antibody(eBioscience) 등을 처리하여 염색한 후, 유세포분석기(CytoFLEX Flow Cytometry Analyzer, Beckman, USA)을 통해 형광강도(Fluorescence intensity)를 측정하였다. 그 결과, 마우스 성숙 수지상세포는 차세대 수지상세포의 표현형 마커인 CD8+CD11c+ 및 Clec9a+의 발현이 증가하였다(도 1).

실험예 1.2. 마우스 성숙 수지상세포에서의 사이토카인 분비 확인

실시예 1.4.에서 얻은 마우스 성숙 수지상세포가 배양액으로 분비한 IL-12p70, IFN-γ 및 IL-10의 양을 ELISA 방법을 통해 확인하였다. ELISA 방법은 ELISA kit (Quantikine, R&D, USA)를 이용하여 진행하였으며, ELISA kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 그 결과, 마우스 성숙 수지상세포는 항암면역 작용을 하는 IL-12 및 IFN-γ를 잘 분비하고, 면역억제 사이토카인인 IL-10의 분비는 감소하였다(도 2).

실험예 2. 마우스 성숙 수지상세포에 의한 T세포 증식 및 활성화 확인

실시예 1.4.에서 얻은 마우스 성숙 수지상세포는 마이토마이신(Mytomicin-C)을 처리하여 증식 기능을 차단하였다. 마우스의 비장단핵세포로부터 피콜을 이용하여 림프구를 분리한 후, 상기 마우스 성숙 수지상세포와 림프구를 1:10 비율로 FBS 10%(v/v), 10 ㎎/㎖ 농도의 젠타마이신(gentamicin sol), 또는 1 ㎍/㎖ 농도의 PHA(Phytohemagglutin)가 혼합된 DMEM low glucose(1 g/L) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 4일 동안 공동배양 하였다. 4일 후, 살아있는 세포의 수를 CCK8 분석을 통해 정량하여 T세포 증식율을 확인하였다. 그 결과, 마우스 성숙 수지상세포와 T세포를 공동 배양한 실험군의 T세포 증식이 T세포만 존재하는 대조군에 비해 180% 증식하였다(도 3).

실험예 3. 폐암 유발 마우스에서의 마우스 성숙 수지상세포의 항암효과 확인

실험예 3.1. 폐암 유발 마우스 제조

마우스 폐암 세포주(C57BL/6 mouse syngeneic "Lewis Lung Carcinoma" (3LL=LLC) cell line)를 배양하여 5x10⁵cells/ 100 ㎕ 농도의 마우스 폐암 세포를 거두어 정맥 내 주입하였다. 종양 형성 유무는 마지막 치료 2주 후 마우스를 희생시켜 확인하였다.

실험예 3.2. 마우스 성숙 수지상세포에 의한 항암효과 확인

종양 세포 주입 2주 후부터 상기 실험예 3.1.에서 제조한 폐암 유발 마우스에 상기 실시예 1.에서 제조하여 폐암 세포용해액으로 교육시킨 1x10⁶ 개의 마우스 성숙 수지상세포를 투여하기 시작하였다. 일주일 간격으로 마우스 성숙 수지상세포를 복강내로 투입하였다. 대조군은 마우스 성숙 수지상세포 대신 식염수를 복강내로 투입하였다. 식염수를 투여한 마우스군은 2주 후부터 사망하기 시작하였고, 실험종료 전까지 40%가 사망하였다. 반면에 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 마우스군의 경우 실험종료 전까지 100% 생존하였다(도 6).

한편, 마우스 폐암 세포 주사 후 35일째까지 생존여부 및 독성반응을 관찰하였으며, 35일째에 살아있는 모든 동물모델을 희생시켜 폐암 형성 및 전신전이 양상을 육안으로 관찰하였다. 그 결과, 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 마우스의 종양크기가 식염수를 투여받은 마우스의 종양크기에 비해 약 50% 감소하였다(도 5).

또한, 상기 희생한 마우스의 비장세포를 종양항원과 함께 배양하여 체내에서 유도된 종양항원 특이 면역 반응을 ex vivo에서 관찰하였다. 그 결과, 마우스 폐암 세포에 반응하여 IFN-γ를 분비하는 T세포가 유도됨을 확인하였다(도 7).

실험예 4. 난소암 유발 마우스에서의 마우스 성숙 수지상세포의 항암효과 확인

실험예 4.1. 난소암 유발 마우스 제조

마우스 난소암 세포주(C57BL/6 mouse syngeneic "ID8-luc2 cell line)를 배양하여 5x10⁶ cells/ 100 ㎕ 농도의 마우스 난소암 세포를 거두어 복강 내 주입하였다. 종양 형성 유무는 마지막 치료 9주 후 마우스를 희생시켜 확인하였다. 또한, 난소암 성장과 함께 발생하는 복수형성에 따라 미리 종양형성을 예측하였다.

실험예 4.2. 마우스 성숙 수지상세포에 의한 항암효과 확인

종양 세포 주입 5주 후부터 상기 실험예 4.1.에서 제조한 난소암 유발 마우스에 상기 실시예 1.에서 제조하여 난소암 세포 용해액으로 교육시킨 5x10⁶ 개의 마우스 성숙 수지상세포를 투여하기 시작하였다. 일주일 간격으로 마우스 성숙 수지상세포를 복강내로 투입하였다. 대조군은 마우스 성숙 수지상세포 대신 식염수를 복강내로 투입하였다. 식염수를 투여한 마우스군은 난소암 세포 주입 35일 후부터 사망하기 시작하였고, 실험종료 전까지 45%가 사망하였다. 반면에 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 마우스군의 경우 실험종료 전까지 80% 생존하였다(도 10).

한편, 마우스 난소암 세포 주사 후 64일째까지 생존 여부 및 독성반응을 관찰하였으며, 64일째에 살아있는 모든 동물모델을 희생시켜 복막 및 복강내 각 장기표면 종양 형성, 복수 양을 육안으로 관찰하였다. 그 결과, 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 마우스의 종양형성 정도(복수형성으로 인한 치중 변화)가 식염수를 투여받은 마우스의 종양크기에 비해 유의하게 감소하였다(도 9).

또한, 상기 희생한 마우스의 비장세포를 종양항원과 함께 배양하여 체내에서 유도된 종양항원 특이 면역 반응을 ex vivo에서 관찰하였다. 그 결과, 마우스 난소암세포 용해액 자극에 에 반응하여 IFN-γ를 분비하는 T세포가 유도됨을 확인하였다(도 11).

실험예 5. 전립선암 유발 마우스에서의 마우스 성숙 수지상세포의 항암효과 확인

실험예 5.1. 전립선암 유발 마우스 제조

마우스 전립선암 세포주(C57BL/6 mouse syngeneic "TRAMP-C1 cell line)를 배양하여 5x10⁶ cells/ 100 ㎕ 농도의 마우스 전립선암 세포를 거두어 피하 (subcutaneous injection) 내 주입하였다. 피하에 생성되어 성장하는 종양의 부피를 주기적으로 측정하여 항암효과를 확인하고 전립선암 세포주 주입 120일에 마우스를 희생시켜 면역반응 유도 여부 및 조직검사를 실시하였다.

실험예 5.2. 마우스 성숙 수지상세포에 의한 항암효과 확인

종양 세포 주입 8일 후부터 상기 실험예 5.1.에서 제조한 전립선암 유발 마우스에 상기 실시예 1.에서 제조하여 전립선암 세포 용해액으로 교육시킨 5x10⁶ 개의 마우스 성숙 수지상세포를 투여하기 시작하였다. 일주일 간격으로 마우스 성숙 수지상세포를 복강내로 3회 투입하였다. 대조군은 기존 연구에서 주로 사용되고 있는 mono-DC를 동량 투여하거나, 식염수를 복강내로 투입하였다.

그 결과, 기존의 마우스 성숙 수지상세포(Mono DC)를 투여한 개체의 종양크기는 대조군의 종양크기와 비교하였을 때 유의미한 차이를 보이지 않았다. 반면, Rg3로 성숙시킨 마우스 성숙 수지상세포를 투여한 개체의 종양크기(약 1,500mm³)는 대조군의 종양크기(3,100mm³) 비교하였을 때 2배 정도 감소된 유의미한 차이를 보였다(도 13).

한편, 마우스 전립선암 세포 주사 후 50일 후 일부 동물모델을 희생시켜 비장세포를 채취한 후 종양항원과 함께 배양하여 체내에서 유도된 종양항원 특이 면역 반응을 ex vivo에서 관찰하였다. 그 결과, 마우스 전립선암세포 용해액 자극에 반응하여 IFN-γ를 분비하는 T세포가 유도됨을 확인하였다(도 14).

II. 인간 수지상세포의 분화 유도 및 특성 확인

실시예 2. 인간 성숙 수지상세포 제조

인간의 성숙 수지상세포를 제조하기 위해 인간 골수 유래 CD34+ 조혈모세포를 분리하여 준비하였다. 그 후, CD34+ 조혈모세포를 CD14+ 단핵구 세포로 분화 및 증식시켰다. CD14+ 단핵구 세포를 미성숙 수지상세포로 분화시킨 후, Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 성숙시켜 성숙 수지상세포를 제조하였다(도 15).

실시예 2.1. 인간 골수 유래 CD34+ 조혈모세포 준비

골수에서 피콜을 이용하여 단핵세포만 분리한 후, CD34 항체가 부착된 마그네틱 비드(MACS, Milteney Biotech)를 이용하여 CD34+ 조혈모세포만 분리하였다.

실시예 2.2. CD14+ 단핵구 세포로의 분화

실시예 2.1.에서 얻은 CD34+ 조혈모세포를 FBS 10%(v/v), 10 ㎎/㎖ 농도의 젠타마이신 및 제조예 1.에서 제조한 조정배지가 혼합된 DMEM low glucose(1 g/L) 배지에서 10 내지 14일 동안 배양을 진행하였다. 배양하는 동안 조정배지의 농도가 총 배양액의 10%(v/v)가 되도록 유지하면서, 37℃, CO₂ 5% 조건으로 배양하였다. 그 결과 단핵구를 수득하였다.

실시예 2.3. 미성숙 수지상세포로의 분화

실시예 2.2.에서 얻은 골수 유래 단핵구를 미성숙 수지상세포로 분화시키기 위해 1000 IU/㎖ 농도의 GM-CSF와 1000 IU/㎖ 농도의 IL-4를 처리하고 5 내지 6일 동안 37℃, CO₂ 5% 조건으로 배양하였다.

실시예 2.4. 진세노사이드 Rg3의 성숙화 유도

실시예 2.3.에서 얻은 미성숙 수지상세포 배양액에 50 ㎍/㎖ Rg3을 첨가하여 18 내지 48시간 동안 배양하여 성숙화시켰다. 그 후, 성숙화시킨 수지상세포에 FITC, APC(Allophycocyanin) 및 PE(Phycoerythrin)등이 표지된 anti-HLA-ABC antibody, anti-CD83 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD86 antibody, anti-CCR7 antibody, anti-CD141 antibody 및 anti-Clec9a antibody(eBioscience)를 처리하여 염색한 후, 유세포분석기(CytoFLEX Flow Cytometry Analyzer, Beckman, USA)을 통해 형광강도(Fluorescence intensity)를 측정하였다.

그 결과, Rg3을 첨가하여 제조된 인간 성숙 수지상세포에서 차세대 수지상세포의 특이 마커인 CD141, Clec9a의 발현과 기능적 성숙도를 나타내는 HLA-ABC, CD80/86, CCR7 및 CD83의 발현이 증가하였다(도 16).

실험예 6. 인간 성숙 차세대 수지상세포의 특성 확인

실험예 6.1. 인간 성숙 수지상세포에서의 표현형 마커 확인

실시예 2.4.에서 얻은 성숙 수지상세포에 FITC, APC(Allophycocyanin) 및 PE(Phycoerythrin)등이 표지된 anti-HLA-ABC antibody, anti-CD83 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD86 antibody, anti-CCR7 antibody, anti-CD141 antibody 및 anti-Clec9a antibody(eBioscience)를 처리하여 염색한 후, 유세포분석기(CytoFLEX Flow Cytometry Analyzer, Beckman, USA)을 통해 형광강도(Fluorescence intensity)를 측정하였다.

그 결과, 인간 성숙 수지상세포에서 치료용으로 사용될 차세대 수지상세포의 표현형 마커인 CD141+ 및 Clec9a+의 발현이 증가하였다(도 16 및 도 17).

실험예 6.2. 인간 성숙 수지상세포에서의 사이토카인 분비 확인

실시예 2.4.에서 얻은 성숙 수지상세포가 배양액으로 분비한 IL-10, IL-12p70, IFN-γ 및 IP-10의 양을 ELISA 방법을 통해 확인하였다. ELISA 방법은 ELISA kit를 이용하여 진행하였으며, ELISA kit의 매뉴얼에 따라 진행하였다. 그 결과, 차세대 수지상세포의 마커로 인식되는 IP-10 사이토카인의 분비가 확인되었고, 인간 수지상세포는 항암면역 작용을 하는 IL-12 및 IFN-γ를 잘 분비하였다. 또한, 면역억제 사이토카인인 IL-10의 분비는 감소하였다(도 18).

실험예 7. 인간 성숙 수지상세포에 의한 T세포 증식 확인

실시예 2.3.에서 분화시킨 미성숙 수지상세포 및 실시예 2.4.에서 성숙시킨 수지상세포에 마이토마이신(Mytomicin-C)을 처리하여 증식 기능을 차단하였다. 인간의 말초혈액으로부터 피콜을 이용하여 림프구를 분리한 후, 상기 미성숙 또는 성숙 수지상세포와 림프구를 1:10 비율로 FBS 10%(v/v), 10 ㎎/㎖ 농도의 젠타마이신(gentamicin sol), 또는 1 ㎍/㎖ 농도의 PHA(Phytohemagglutin)가 혼합된 DMEM low glucose(1 g/L) 배지에서 37℃, CO₂ 5% 조건으로 4일 동안 공동배양 하였다. 4일 후, 살아있는 세포의 수를 CCK8 분석을 통해 정량하여 T 세포 증식율을 확인하였다. 그 결과, 성숙 수지상세포와 림프구를 공동 배양한 실험군의 T세포 증식이 림프구만 존재하는 대조군에 비해 450% 증식하였다(도 19).

실험예 8. 인간 성숙 수지상세포의 종양항원 특이 면역반응 유도 확인

실시예 2.3.에서 얻은 미성숙 수지상세포 배양액에 HepG2 50 내지 100 ㎍/ml의 세포 용해액을 넣어 18 내지 48시간 배양하여 항원 교육을 시킨 후, 10 내지 50 ㎍/ml Rg3을 첨가하여 18 내지 48시간 동안 배양하여 성숙화시켰다. 그 후, 상기 성숙 수지상세포를 마이토마이신을 처리하여 증식기능을 차단하였다. 인간의 말초혈액으로부터 피콜을 이용하여 림프구를 분리한 후, 상기 HepG2 항원으로 교육된 성숙 수지상세포와 IL-2, FBS 10%(v/v) 및 10 ㎎/㎖ 농도의 젠타마이신(gentamicin sol)이 혼합된 DMEM 배지에서 37℃, CO2 5% 조건으로 14일 동안 동시 배양(co-culture)하였다. 이때, 성숙 수지상세포와 림프구의 비율은 1:10 비율로 동시 배양하였다.

14일간 배양하면서 2 내지 3일 마다 항원 교육된 성숙 수지상세포와 2 %(20 ㎕/1 ㎖) IL-2가 포함된 배지를 새롭게 공급하였다. 14일 후, 살아있는 세포만 분리하여, HepG2, H929 또는 PC3 종양세포주와 1:10 비율로 37℃, CO2 5% 조건에서 4일 동안 공동배양 하였다. 4일 후, 살아있는 세포의 수를 CCK8 분석을 통해 정량하여 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 인간위암세포주(HepG2) 항원을 탑재한 성숙 수지상세포로 유도된 림프구는 위암 세포주(HepG2)는 사멸시켰으나, 전립선암(PC3) 또는 형질세포종(H929)세포주의 생존에는 영향을 미치지 않았으므로, 종양항원 특이 살해면역반응(CTL)가 유도됨을 확인하였다(도 20).

Claims

i) 진세노사이드 Rg3 존재 하에 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계; 및
ii) 성숙 수지상세포를 수득하는 단계를 포함하는
차세대 수지상세포 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 성숙 수지상세포는 CD141 및 Clec9a를 발현하는 것인, 차세대 수지상세포 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 성숙 수지상세포는 CD80, CD86, CCR7의 발현이 증가된 것인, 차세대 수지상세포 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 진세노사이드 Rg3는 10 내지 100 ㎍/ 1x10⁶ cells 농도로 처리된 것인, 차세대 수지상세포 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 배양하는 단계에서 배양시간은 12 내지 72시간인 것을 특징으로 하는, 차세대 수지상세포 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 미성숙 수지상세포는 CD14+ 단핵구(monocyte)를 IL-4 및 GM-CSF 존재 하에 배양하여 수득한 것인, 차세대 수지상세포 제조방법.
제1항의 제조방법에 의해 제조된 차세대 수지상세포.
제7항의 차세대 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
진세노사이드 Rg3를 유효성분으로 포함하는 차세대 수지상세포 성숙화 유도용 배양 조성물.