KR100914520B1

KR100914520B1 - ３―Ｂｒ―Ｆａｓ 또는 １０―Ｂｒ―Ｆａｓ를 유효성분으로함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물

Info

Publication number: KR100914520B1
Application number: KR1020070082456A
Authority: KR
Inventors: 곽종영; 진준오; 박주인; 권정희
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2007-08-16
Filing date: 2007-08-16
Publication date: 2009-09-02
Also published as: KR20090017928A

Abstract

본 발명은 미성숙 수지상 세포를 성숙화시키는 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 Fascaplysinopsis sp.로부터 분리한 3-bromo-fascaplysine(3-Br-Fas) 또는 10-bromo-fascaplysine(10-Br-Fas)를 함유하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 고가의 사이토카인을 대신한 세포추출물로 수지상 세포를 성숙화시킬 수 있어, 보다 경제적이고 효과적으로 암 치료용 세포치료제를 제조할 수 있다.

Description

３―Ｂｒ―Ｆａｓ 또는 １０―Ｂｒ―Ｆａｓ를 유효성분으로 함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물{Composition for Inducing Maturation of Dendritic Cell Comprising 3-bromo-fascaplysine or 10-bromo-fascaplysine}

암 치료의 주종을 이루는 수술, 항암제, 방사선 치료 등은 부작용이 따르고, 환자의 약 50%는 다시 재발되거나 전이될 위험이 커 암의 근본적인 치료법은 되지 못하는 실정이다 (Jourdan, J.L. et al., NZ Med. J., 112:91, 1999). 특히, 전이암이나 재발암의 경우는 대부분 수술이 불가능하며 화학적 치료제에 저항성을 가지는 경우가 많기 때문에, 새로운 치료제의 개발이 절실히 요구되는 실정이며, 최근 가장 각광을 받고 있는 것이 수지상 세포를 이용한 세포치료제이다.

수지상 세포(dendritic cell)는 가장 강력한 항원 전달 세포(Antigen presenting cells)로서, 생체 내 극히 적은 수로 존재하지만 T 세포 면역을 조절하는 기능이 매우 뛰어나다. 또한 조직 또는 혈액으로부터 분리된 수지상 세포를 in vitro에서 항원으로 자극시킨 후 성숙한 수지상 세포 형태로 in vivo에 다시 주입하는 경우, 면역원성을 나타내는 것으로 확인되어, 암 또는 병원균의 특이 항원에 대한 면역을 유도하기 위한 세포 백신으로서 그 응용 가치가 매우 크다 (Inaba, K. et al., 3. Exp. Med., 178:479, 1993; Inaba, K. et al., Int. Rev. Immunol., 6:197, 1990; Hsu, F. et al., Nature Med., 2:52, 1996).

수지상 세포백신은 세포간의 정교한 인지작용에 의거한 암세포 특이적 면역반응을 유도하여 암세포만을 공격 사멸시키는 방법으로 기존 항암치료와 달리 부작용이나 고통이 거의 없는 무독성의 치료방법이다. 특히 치료기간 동안 입원할 필요가 없고 정기적으로 내원하여 백신을 투여 받는 형태이기 때문에 다른 암치료와 달리 환자의 삶의 질을 저하하지 않는 인체 친화적인 차세대 암치료제로 기대를 모으고 있다. 기존의 임상연구사례를 보면 백신 치료 후 단기간의 평가시점까지 종양치료반응을 보이지 않는 환자라 하더라도 이후 다른 항암치료에 대한 반응률이 크게 향상되는 것으로 보고되고 있다. 그러므로 수지상 세포 백신은 단독치료뿐 아니라 다른 항암치료와 병행할 경우 난치성 암의 치료에 보다 큰 상승효과를 기대할 수 있을 것이다. 특히 수지상 세포 백신은 원발암을 수술로 제거한 후 전이 및 재발을 방지할 수 있는 치료제로 사용할 수 있어 암치료시장에서 상당한 경쟁력을 갖게 될 것이다.

수지상 세포 백신 제작과정은 크게 두 단계로 나누어진다. 제1단계 배양은 여러 혈액 유래의 세포로부터 미성숙 수지상 세포로 분화를 유도하는 단계로서 분화 유도 물질(사이토카인 또는 다른 세포분화 촉진제)을 처리하여 배양 최종일에 미성숙 수지상 세포로서 수확하는 것이다. 제2단계 배양은 이러한 미성숙 수지상 세포에 암 또는 병원균 특이 항원을 처리하는 단계로서 항원과 함께 수지상 세포 성숙화 인자를 배양액에 첨가함으로써 항원 특이 면역 유도성을 취득한 백신으로서 성숙된 수지상 세포를 수확하는 것이다.

면역자극제로서 분리된 수지상 세포는 말초 혈액내에서 낮은 빈도수로 존재하고, 분리된 수지상 세포의 순도가 낮기 때문에 사용이 제한된다. 특히, 사람 말초 혈액내 수지상 세포의 빈도수는 백혈구의 약 0.1%인 것으로 평가되고 있다. 이러한 혈액내 수지상 세포의 낮은 빈도수는 수지상 세포 전구체가 풍부한 세포 집단을 분리하고 이들 전구체를 생체외 또는 시험관내에서 배양하여 미성숙하거나 성숙한 수지상 세포를 수득하기 위한 관심을 증가시켰고, 몇몇 세포 유형이 수지상 세포 전구체로서 작용하는 잠재력을 갖는 것으로 동정되었다. 혈액에서 유래된 CD14⁺ 단핵구 특히 이의 표면상에 성장 인자인 과립구-단핵구 콜로니 자극인자(GM-CSF)에 대한 수용체를 발현하는 단핵구가 공지된 수지상 세포 전구체이다 (미국특허 제5,994,126호 및 미국특허 제5,851,756호). 또 다른 공지된 수지상 세포 전구체는 CD34 세포 표면 마커를 발현하는 골수 유래 세포를 포함한다.

혈액 유래 미성숙 수지상 세포는 항원의 포획과 처리, 주조직 적합체의 생산, 그리고 주조직 적합체-외부 펩타이드의 결합을 생성할 수 있는 능력이 있으나 T 세포를 활성화 하는 기능은 거의 없다. 게다가 최근 연구에 의하면, 미성숙 수지상 세포를 세포치료제로 사용하였을 경우 암을 더 활성화하는 결과를 나타내기도 한다고 하므로, 수지상 세포를 이용한 세포치료제는 T 림프구의 활성화를 충분히 유도시킬 수 있을 정도로 성숙된 수지상 세포를 이용하는 것이 중요하다.

수지상 세포를 수득하고, 성숙화시키는 기술은 여러 문헌에 기재되어 있으며, 마이크로파아지 또는 수지상 세포 특성 중 어느 하나를 발현할 능력을 가진 전분화능 세포로부터 유래한 미성숙 수지상 세포로부터 성숙한 수지상 세포를 생산하며, 미성숙 수지상 세포를 IFN-α를 포함한 수지상 세포 성숙화 인자와 접촉시키는 방법 (유럽특허 제922,758호), 인간 CD34⁺ 조혈 세포를 (i)GM-CSF와 (ⅱ)TNF-α 및 IL-3와 또는 (ⅲ)GM-CSF 및TNF-α와 배양하여, CD1a⁺ 조혈 세포의 형성을 유도하고, 상기 배양물로부터 상기 CD1a⁺ 인간 수지상 세포를 회수하는 방법 (유럽특허 제663,930호), 말단 혈액세포를 분리하여, CD34항원을 발현하는 혈액전구세포를 부유화시키고 상기 세포를 조혈 성장 인자 및 사이토카인의 조합물로 확장하는 방법 (WO 95/28479) 등이 있다.

국내의 공지된 기술로는 사람의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리한 후 CD14⁺단구(monocyte)를 분리하여 이를 수지상 세포로 유도하는 방법 (대한민국 등록특허 제585,456호)과 CD11b^-/ CD8⁺/ CD86^- 등을 분리한 후 이에 사이토카인을 가하여 수지상 세포로 분화 유도하는 방법 (대한민국 등록특허 제542,817호)등이 있다.

그러나, 종래의 기술의 경우 환자별로 목적하는 수지상 세포 치료제를 얻기 위해 생산 공정시 성숙 수지상 세포를 유도하는데 박테리아를 이용하거나 비싼 사이토카인이 이용되어 다른 치료제에 비해 고가인 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 수지상 세포의 성숙화를 효율적으로 유도하는 조성물을 찾기 위하여 예의 노력한 결과, Fascaplysinopsis sp.로부터 추출한 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas가 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 사이토카인 등의 기존 분화 촉진제와 비교하여, 효율적으로 성숙된 수지상 세포를 유도하고, 보다 안정적이면서도 저렴하게 사용할 수 있는 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 이용하는 것을 특징으로 하는 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas로 성숙화 유도된 수지상 세포를 함유하는 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3-bromo-fascaplysine(3-Br-Fas) 또는 10-bromo-fascaplysine(10-Br-Fas)를 유효성분으로 함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명은 (a) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 분화된 수지상 세포에 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 처리하여 수지상 세포를 성숙화시키는 단계를 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도 방법 및 유도된 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따르면 고가의 사이토카인을 대체하는 세포추출물로 수지상 세포를 성숙화시킬 수 있어, 보다 경제적이고 효과적으로 암 치료용 세포치료제를 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 Spnge Fascplysinopsis sp.로부터 분리한 3-bromo-fascaplysine (3-Br-Fas)와 10-bromo-fascplysine (10-Br-Fas)의 구조를 나타낸 그림이다.

도 2는 건강한 공여자로부터 제공받은 단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화유도하고 LPS, 3-Br-Fas 및 10-Br-Fas를 처리하여 세포의 형태학적 변화를 Giemsa 염색법을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 미성숙 수지상 세포에 3-Br-Fas와 10-Br-Fas를 처리하였을 때 변화하는 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 미성숙 수지상 세포에 3-Br-Fas와 10-Br-Fas를 처리하였을 때 MHC-class Ⅱ의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 미성숙 수지상 세포에 3-Br-Fas, 10-Br-Fas 및 LPS를 각각 처리하여 배양하였을 때 세포에서 분비되는 사이토카인의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 3-Br-Fas 및 10-Br-Fas를 각각 처리한 수지상 세포와 CD4⁺ T 림프구를 함께 배양하여 T 림프구의 증식 유도 능력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 3-Br-Fas 및 10-Br-Fas를 각각 처리한 수지상 세포와 CD4⁺ T 림프구를 함께 배양하여 얻은 배지에서 인터페론-감마의 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 관점에서 3-bromo-fascaplysine(3-Br-Fas) 또는 10-bromo-fascaplysine(10-Br-Fas)를 유효성분으로 함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서는, 해면(Fascaplysinopsis sp.)에서 추출한 두 종류의 Fascaplysin 알칼로이드가 단핵구로부터 유도된 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙화를 유도하는 것을 발견하였다.

여기서 사용된 단핵구는 건강한 공여자로부터 받은 것으로 15 ng/mL GM-CSF와 10 ng/mL 인터루킨-4로 6일간 배양하여 미성숙 수지상 세포로 분화 유도하였다.

본 발명에서 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법은 상기 Fascaplysin 알칼로이드인 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 이용하여 수행하였으며, 상기 3-Br-Fas 및 상기 10-Br-Fas의 구조를 도 1에 나타내었다.

본 발명의 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물에 포함되는 3-Br-Fas와 10-Br-Fas의 농도는 0.1∼10 μM 농도로 하는 것이 바람직하며, 상기 농도 안의 범위에서 성숙 수지상 세포 특이적인 단백질 표면 인자인 CD80, CD86 그리고 CD83의 발현양이 높게 나타났다.

3-Br-Fas와 10-Br-Fas의 농도는 0.1 μM 미만에서는 성숙화 유도작용이 낮아 수지상 세포의 성숙화 정도가 미흡하거나 성숙이 불가능하며, 10 μM 초과에서는 고농도에 의한 세포 독성을 가지고 성숙화 효율 또한 떨어지는 것으로 확인되어 0.1∼10 μM 농도로 하는 것이 바람직하다.

본 발명은 다른 관점에서, 혈액으로부터 분리된 단핵구를 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및 상기 분화된 수지상 세포에 3-bromo-fascaplysine(3-Br-Fas) 또는 10-bromo-fascaplysine(10-Br-Fas)를 처리하여 수지상 세포를 성숙화시키는 단계를 포함하는 수지상 세포의 성숙화 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 미성숙 수지상 세포에 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 처리고 성숙 수지상 세포로의 형태학적 변화를 주사 현미경으로 측정하여, 성숙화된 수지상 세포에 나타나는 덴드라이트가 강력해지는 것을 확인하였다. 또한, 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현을 확인해 본 결과, 대조군인 LPS와 마찬가지로 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas을 처리한 수지상 세포에서 성숙 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 성숙화된 수지상 세포를 함유하는 암치료용 세포치료제에 관한 것이다.

3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas에 의해 유도된 성숙 수지상 세포의 사이토카인 분비능을 확인한 결과, 인터루킨-12p40과 IP-10의 분비가 증가되는 것을 확인되었으나, 그 외에 인터루킨-10, -12p70 그리고 TNF-α의 분비는 확인되지 않았다.

성숙 수지상 세포의 가장 중요한 특징으로는 T 림프구의 증식과 활성을 유도하는 것이다. 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas에 의해 유도된 성숙 수지상 세포는 면역작용에 충분한 수의 T 림프구 증식을 유도하였고 증식된 T 림프구는 충분한 양의 인터페론-감마를 분비하는 것으로 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 3-Br-Fas 및 10-Br-Fas의 추출

Fascaplysinopsis sp.는 본 발명자와 공동연구를 수행하고 있는 러시아 국립과학원 생유기화학 극동연구소(PIBOC)에서 제공하였으며 3-Br-Fas 및 10-Br-Fas의 상세한 추출법은 이미 논문으로 개제되어 있다 (Roll, D.M. et al ., J. Org . Chem ., 53:3276, 1988).

Fascaplysinopsis sp.에 대한 간단한 추출법을 알아보면, 해양에서 채집하여 냉동보관된 Fascaplysinopsis sp.를 MeOH에서 가압 동결 건조시킨 후, CCl₄과 CHCl₃를 이용하여 추출하였다. 추출되어진 CCl₄ 분획은 Partisl (isooctane/EtOAc, 7:3)의 HPLC에 Bio-Beads S-X12 (hexane/CH₂Cl₂, 7:3)로 컬럼크로마토그래피에 의해 luffariellolide를 추출하였고, CHCL₃ 분획은 reverse-phase HPLC (ODS-3, MeOH/H₂O/HOAc, 60:39.8:0.2) 또는 핏빛 프리즘을 이용하여 결정화하여 fascaplysin을 획득하였다.

실시예2: 단핵구로부터 미성숙 수지상 세포의 분화 유도

건강한 공여자로부터 받은 말초 혈액으로부터 마이크로비드를 이용하여 CD14⁺단핵구를 분리하였다. 분리된 단핵구는 10% FCS와 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 함유된 RPMI-1640 배지에서 5%의 CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 15 ng/ml GM-CSF와 10 ng/ml의 인터루킨-4를 6일 동안 처리하였다. 분화된 수지상 세포는 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자인 CD1a, MHC-classⅡ와 단핵구 특이적 단백질 표면 인자인 CD14를 이용하여 분화 정도를 확인하여 미성숙 수지상 세포로 분화되었음을 확인하였다.

실시예 3: 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas에 의한 수지상 세포의 형태학적 변화

실시예 2에서 분화 유도된 미성숙 수지상 세포에 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 1 μM으로 처리하고 대조군으로 LPS 1 μg/ml를 처리하여 성숙 수지상 세로로 성숙화를 유도한 후 Giemsa 염색법과 주사 현미경을 이용하여 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 미성숙 수지상 세포에 비해 성숙 수지상 세포로 성숙화가 유도된 세포는 강력한 덴드라이트가 형성된 것을 확인할 수 있었다 (도 2).

실시예 4: 수지상 세포의 단백질 표면 인자의 발현 변화

실시예 2에서 분화 유도된 미성숙 수지상 세포에 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 처리하여 성숙 수지상 세포 특이적 단백질 표면 인자의 발현 정도를 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 미성숙 수지상 세포(1X10⁶)에 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas를 1 μM으로 처리하고 대조군으로 LPS 1 μg/ml를 처리하여 단백질 표면 인자의 발현을 측정하였다.

그 결과, 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas에 의해 유도된 성숙 수지상 세포는 LPS를 처리한 성숙 수지상 세포와 비교였을 때 CD86의 발현은 유사하게 나타나는 반면, CD80과 CD83의 발현은 증가하지 않는 것으로 확인되었다 (도 3). 또한 MHC classⅡ는 대조군인 LPS에 비해 약하기는 하나 미성숙 수지상 세포와 비교하였을 때, 3-Br-Fas와 10-Br-Fas에 의해 발현이 증가하는 것으로 확인되었다 (도 4).

실시예 5: 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas에 의해 성숙화된 수지상 세포의 사이토카인 분비능

3-Br-Fas, 10-Br-Fas 및 대조군인 LPS에 의해 성숙화된 수지상 세포의 배양액을 분리하여 ELISA 법을 이용하여 사이토카인 분비를 확인하였다.

3-Br-Fas 및 10-Br-Fas에 의해 유도된 성숙 수지상 세포에서는 인터루킨-10, -12p70 그리고 TNF-α의 분비는 나타나지 않았으나 인터루킨-12p40과 인터페론-감마의 분비와 직접 관련 있는 IP-10의 분비는 증가하였으며, 그 양은 LPS에 의한 성숙 수지상 세포에 비해 적은 것으로 확인되었다 (도 5).

실시예 6: 성숙 수지상 세포의 T 림프구 활성

성숙화된 수지상 세포의 가장 중요한 능력 중의 하나는 T 림프구의 활성을 유도하는 것이다. 활성화된 T 림프구는 증식 속도가 빨라지며 인터페론-감마의 분비가 증가한다. 3-Br-Fas, 10-Br-Fas에 의해 성숙화 된 수지상 세포는 대조군인 LPS에 비하여 낮기는 하지만 미성숙 수지상 세포보다 2배 높은 T 림프구의 증식능을 나타내었으며 (도 6), 증식된 T 림프구는 대조군과 비슷한 정도의 인터페론-감마를 분비하는 것으로 확인되었다 (도 7).

이상으로 본 발명의 내용을 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이제 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

3-bromo-fascaplysine(3-Br-Fas) 또는 10-bromo-fascaplysine(10-Br-Fas)를 유효성분으로 함유하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제1항에 있어서, 3-Br-Fas 또는 10-Br-Fas는 0.1∼10 μM농도로 함유되는 것을 특징으로하는 조성물.
다음 단계를 포함하는 수지상 세포의 성숙화 방법:

(a) 혈액으로부터 분리된 단핵구를 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및

(b) 상기 분화된 수지상 세포에 3-bromo-fascaplysine(3-Br-Fas) 또는 10-bromo-fascaplysine(10-Br-Fas)를 처리하여 수지상 세포를 성숙화시키는 단계.
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