ES2643030T3 - Células madre mesenquimales y sus usos - Google Patents

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ES2643030T3 ES10011223.4T ES10011223T ES2643030T3 ES 2643030 T3 ES2643030 T3 ES 2643030T3 ES 10011223 T ES10011223 T ES 10011223T ES 2643030 T3 ES2643030 T3 ES 2643030T3
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Abstract

Células madre mesenquimales no manipuladas genéticamente para uso en la reducción o limitación de la inflamación en un humano mediante la mediación de un desplazamiento de la población de células T de células TH1 proinflamatorias a células TH2 antiinflamatorias, en donde la inflamación está en el cerebro o en el intestino.

Description

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DESCRIPCION
Celulas madre mesenquimales y sus usos
Esta invencion se refiere a celulas madre mesenquimales. Mas particularmente, esta invencion se refiere a celulas madre mesenquimales para uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos inflamatorios.
Las celulas madre mesenquimales (MSC) son celulas madre multipotentes que pueden diferenciarse facilmente en linajes que incluyen osteoblastos, miocitos, condrocitos y adipocitos (Pittenger, et al., Science, vol. 284, pag. 143 (1999); Haynesworth, et al., Bone, vol. 13, pag. 69 (1992); Prockop, Science, vol. 276, pag. 71 (1997)). Estudios in vitro han demostrado las capacidades de MSC para diferenciarse en musculo (Wakitani, et al., Muscle Nerve, vol. 18, pag.1417 (1995)), precursores tipo neuronal (Woodbury, et al., J. Neurosci. Res., vol. 69, pag. 908 (2002); Sanchez-Ramos, et al., Exp. Neurol., vol. 171, pag. 109 (2001)), cardiomiocitos (Toma, et al., Circulation, vol. 105, pag. 93 (2002); Fakuda, Artif. Organs, vol. 25, pag. 187 (2001)), y posiblemente otro tipo de celulas. Ademas, se ha demostrado que las MSC proporcionan capas alimentadoras eficaces para la expansion de celulas madre hematopoyeticas y embrionarias (Eaves, et al., Ann. NY Acad. Sci., vol. 938, pag. 63 (2001); Wagers, et al., Gene Therapy, vol. 9, pag. 606 (2002)). Estudios recientes con una variedad de modelos animales han demostrado que las MSC pueden ser utiles en la reparacion o regeneration de tejidos de hueso, cartllago, menisco o miocardicos danados (DeKok et al., Clin. Implants Oral Res., vol. 481 (2003)); Wu et al., Transplantation, vol. 75, pag. 679 (2003); Noel et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, vol. 3, pag. 1000 (2002); Ballas, et al., J. Cell. Biochem. Suppl., vol. 38, pag. 20 (2002); Mackenzie, et al., Blood Cells Mol. Dis., vol. 27 (2002)). Varios investigadores han utilizado MSC con resultados alentadores para el trasplante en modelos de enfermedades animales incluyendo osteogenesis imperfecta (Pereira, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 95, pag. 1142 (1998)), parkinsonismo (Schwartz, et al., Hum. Gene Ther., vol. 10, pag. 2539 (1999)), lesion de la medula espinal (Chopp, et al., Neuroreport, vol. 11, pag. 3001 (2000); Wu, et al., J. Neurosci. Res., vol. 72, pag. 393 (2003)) y trastornos cardlacos (Tomita, et al., Circulation, vol. 100, pag. 247 (1999). Shake, et al., Ann. Thorac. Surg., vol. 73, pag. 1919 (2002)). Es importante destacar que tambien se han publicado resultados prometedores en ensayos cllnicos para la osteogenesis imperfecta (Horwitz et al., Blood, vol. 97, pag 1227 (2001), Horowitz, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 99, pag. 8932 (2002)) y el injerto mejorado de trasplantes heterologos de medula osea (Frassoni, et al., Int. Society for Cell Therapy, SA006 (resumen) (2002); Koc, et al., J. Clin. Oncol., vol. 18, pag. 307 (2000)).
Las MSC expresan el antlgeno de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en su superficie, pero no expresan la clase II del MHC (Le Blanc et al., Exp. Hematol., vol. 31, pag. 890 (2003), Potian, et al., J. Immunol., vol. 171, pag. 3426 (2003)) y ninguna molecula coestimuladora B7 o CD40 (Majumdar et al., J. Biomed. Sci., vol. 10, pag. (2003)), lo que sugiere que estas celulas tienen un fenotipo de baja inmunogenicidad (Tse, et al., Transplantation, vol. 75, pag. 389 (2003)). Las MSC tambien inhiben las respuestas proliferativas de la celula 1 de una manera independiente del MHC (Bartholomew et al., Exp. Hematol., vol. 30, pag 42 (2002), Devine et al., Cancer J., vol. 7, pag. 576 (2001), DiNicola, et al., Blood, vol. 99, pag. 3838 (2002)). Estas propiedades inmunologicas de las MSC pueden mejorar su injerto de trasplante y limitar la capacidad del sistema inmunitario receptor para reconocer y rechazar las celulas alogenicas tras el trasplante. La production de factores por las MSC, que modulan la respuesta inmune y soportan la hematopoyesis junto con su capacidad para diferenciarse en tipos de celulas apropiados bajo estlmulos locales, las convierten en celulas madre deseables para estudios de trasplante celular (Majumdar, et al., Hematother. Stem Cell Res., vol. 9, pag. 841 (2000), Haynesworth et al., J. Cell. Physiol., vol. 166, pagina 585 (1996).
Actualmente, los solicitantes han examinado las interacciones de celulas madre mesenquimales con poblaciones de celulas inmunes aisladas, incluyendo celulas dendrlticas (DC1 y DC2), celulas T efectoras (Th1 y Th2) y celulas NK. Con base en tales interacciones, los solicitantes descubrieron que las celulas madre mesenquimales pueden regular la produccion de diversos factores que pueden regular varias etapas en el proceso de respuesta inmune. De este modo, las celulas madre mesenquimales pueden emplearse en el tratamiento de enfermedades, condiciones o trastornos que involucran inflamacion.
El alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
En general, la terapia con celulas madre mesenquimales (MSC) se basa, por ejemplo, en la siguiente secuencia: recoleccion de tejido que contiene MSC, aislamiento y expansion de las MSC y administration de las MSC a los seres humanos, sin manipulation bioqulmica o genetica.
Las celulas madre mesenquimales que se administran pueden ser una composition homogenea o pueden ser una poblacion de celulas mixtas enriquecida en las MSC. Las composiciones de celulas madre mesenquimales homogeneas pueden obtenerse cultivando celulas adherentes de medula o periosticas y las composiciones de celulas madre mesenquimales pueden ser obtenidas cultivando celulas adherentes de medula o periosticas y las celulas madre mesenquimales pueden ser identificadas por marcadores de superficie celular especlficos que se identifican con anticuerpos monoclonales unicos. Un metodo para obtener una poblacion celular enriquecida en celulas madre mesenquimales se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 5.486.359. Fuentes alternativas para las celulas madre mesenquimales incluyen, pero no se limitan a, sangre, piel, sangre del cordon umbilical, musculo, grasa, hueso y pericondrio.
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Las celulas madre mesenquimales pueden administrarse mediante una diversidad de procedimientos. Las celulas madre mesenquimales se pueden administrar en forma sistemica, tal como por administracion intravenosa, intraarterial o intraperitoneal. Las celulas madre mesenquimales pueden ser de un espectro de fuentes incluyendo autologas, alogenicas o xenogenicas.
Las celulas madre mesenquimales se pueden administrar conjuntamente con un portador farmaceutico aceptable. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales pueden administrarse como una suspension de celulas en un medio llquido farmaceuticamente aceptable para inyeccion.
La presente invencion proporciona celulas madre mesenquimales para su uso como se define en la reivindicacion 1.
Aunque el alcance de este aspecto de la presente invencion no esta limitado por ningun razonamiento teorico, se cree que las celulas madre mesenquimales promueven la maduracion de celulas T a las celulas T reguladoras (TReg), controlando con ello las respuestas inflamatorias. Tambien se cree que las celulas madre mesenquimales inhiben las celulas T auxiliar 1 (celulas Th1), disminuyendo as! la expresion del interferon-Y (IFN-y) en ciertas reacciones inflamatorias.
En una realization, las celulas madre mesenquimales pueden usarse para limitar la inflamacion en el intestino durante la enfermedad inflamatoria intestinal. Aunque el alcance de este aspecto de la presente invencion no esta destinado a limitarse a ningun razonamiento teorico, se cree que las celulas madre mesenquimales promueven una mayor secretion de lnterleuquina-10 (IL-10) y la generation de celulas T reguladoras (celulas Treg).
En otra realizacion, las celulas madre mesenquimales pueden usarse para controlar la inflamacion en el cerebro. Aunque el alcance de esta realizacion no se limita a ningun razonamiento teorico, se cree que las celulas madre mesenquimales promueven la secrecion de citoquinas supresoras tales como lL-10 y la generacion de celulas Treg.
Las celulas madre mesenquimales se administran a un humano, tal como se ha descrito anteriormente.
Las celulas madre mesenquimales tambien pueden administrarse sistemicamente, como se ha descrito anteriormente.
Las celulas madre mesenquimales se administran en una cantidad efectiva para tratar una respuesta inflamatoria en un humano. Las celulas madre mesenquimales se pueden administrar en una cantidad de aproximadamente 1x105 celulas/kg a aproximadamente 1x107 celulas/kg, preferiblemente de aproximadamente 1x106 celulas/kg a aproximadamente 5 x 106 celulas/kg. La dosificacion exacta de las celulas madre mesenquimales que se van a administrar depende de una variedad de factores, incluyendo la edad, el peso y el sexo del paciente, la respuesta inflamatoria que se esta tratando y su extension y gravedad.
Las celulas madre mesenquimales pueden administrarse conjuntamente con un portador farmaceutico aceptable, como se ha descrito anteriormente.
Debe entenderse que las celulas madre mesenquimales, cuando se emplean en las terapias y tratamientos mencionados anteriormente, pueden emplearse en combination con otros agentes terapeuticos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo, pero no limitandose a, factores de crecimiento, citoquinas, farmacos tales como farmacos antiinflamatorios y celulas distintas de las celulas madre mesenquimales, tales como celulas dendrlticas, y pueden administrarse con portadores solubles para celulas tales como acido hialuronico o en combinacion con matrices solidas tales como colageno, gelatina, u otros pollmeros biocompatibles, segun sea apropiado.
La invencion se describira ahora con respecto a los dibujos, en los que:
Figura 1. Las MSC modulan las funciones de las celulas dendrlticas. (A) Analisis de citometrla de flujo de celulas DC1 monoclticas maduras usando anticuerpos contra HLA-DR y CD11c y de celulas plasmacitoides DC2 usando anticuerpos contra HLA-DR y CD123 (receptor de lL-3). (—): control de isotipo; (-): anticuerpos conjugados con FITC/PE. (B) Las MSC inhiben la secrecion de TNF-a (eje y primario) y aumentan la secrecion de 1L-10 (eje y secundario) a partir de DC1 y DC2 activadas, respectivamente. (C) MSc cultivadas con celulas DC1 maduras inhiben la secrecion de IFN-y (eje y primario) por celulas T e incrementan los niveles de lL-4 (eje y secundario) en comparacion con MSC o DC solamente. La disminucion de la production de IFN-y proinflamatorio y el aumento de la production de lL-4 antiinflamatoria en presencia de MSC indicaron un desplazamiento de la poblacion de celulas T hacia un fenotipo antiinflamatorio.
Figura 2. Las MSC inhiben la funcion de celulas T efectoras proinflamatorias. (A) Analisis de citometrla de flujo de los numeros de celulas TReg (en %) mediante tincion de PBMC o fraction no adherente en cultivo de MSC+PBMC (MSC+PBMC) con CD4 conjugadas cono FITC (eje x) y anticuerpos CD25 conjugados con PE. Se establecieron puertas con base en anticuerpos de control de isotipo como antecedentes. Los graficos son representativos de 5 experimentos independientes. (B) Las celulas Th1 generadas en presencia de MSC secretaron niveles reducidos de IFN-y (eje Y primario) y las celulas Th2 generadas en presencia de MSC secretaron mayores cantidades de lL-4 (eje y secundario) en sobrenadantes de cultivo celular. (C) Las MSC inhiben la secrecion de IFN-y a partir de celulas NK purificadas cultivadas durante 0, 24 u 48 horas en una placa de 24 pozos. Los datos mostrados son la media ± DE, de la secrecion
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de citoquina en un experimento y son representatives de tres experimentos independientes.
Figura 3. Las MSC conducen a un mayor numero en la poblacion de celulas TReg y mayor expresion del GITR. (A) Se aislo una poblacion de celulas TReg Cd4+ CD25+ de cultivos de PBMC o MSC+PbMc (relacion de MSC con respecto a PBMC 1:10) (cultivadas sin ninguna estimulacion adicional durante 3 dlas) usando un procedimiento de aislamiento magnetico de 2 etapas. Estas celulas se irradiaron (para bloquear cualquier proliferation adicional) y se usaron como estimuladores en una reaction de linfocitos mixtos (MLR), en la que los respondedores eran PBMC alogenicas (relacion de estimulador con respecto a respondedor 1:100) en presencia de fitohemaglutinina (PHA) (2,5 mg/mL). Las celulas se cultivaron durante 48 horas, tras lo cual se anadio timidina 3H, y se hizo recuento de la radiactividad incorporada despues de 24 horas. Los resultados mostraron que la poblacion de TReg, generada en presencia de MSC (carril 3) era similar funcionalmente a las celulas TReg generadas en ausencia de MSC (carril 2). (B) Se cultivaron PBMC durante 3 dlas en ausencia (grafico superior) o presencia (grafico inferior) de MSC (relacion de MSC con respecto a PBMC 1:10), despues de lo cual se recogio la fraction no adherente y se inmunotino con GITR marcado con FlTC y CD4 marcada con PE. Los resultados muestran un aumento de mas de dos veces en la expresion de GITR en celulas cultivadas en presencia de MSC.
Figura 4. Las MSC producen PGE2 y el bloqueo de PGE2 invierte los efectos inmunomoduladores mediados por MSC. (A) secretion de PGE2 (media ± DE) en sobrenadantes de cultivo obtenidos a partir de MSC cultivadas en presencia o ausencia de bloqueadores de PGE2 NS-398 o indometacina (Indomet.) a diversas concentraciones. Las concentraciones de inhibidor estan en pM y los datos presentados son valores obtenidos despues de cultivo durante 24 horas (B) expresion de COX-1 y COX-2 en MSC y PBMC usando RT-PCR en tiempo real. Las MSC expresaron niveles significativamente mas altos de COX-2 en comparacion con PBMC, y cuando se cultivaron MSC en presencia de PBMC, hubo un aumento de > 3 veces en la expresion de COX-2 en MSC. Se muestran datos representativos de 1 de 3 experimentos independientes. Los cultivos de MSC+PBMC se prepararon en una placa de camara de migration entre pozos donde se colocaron MSC sobre la camara inferior y PBMC en la camara superior. (C) La presencia de bloqueadores de PGE2 indometacina (Ind.) o NS-398 aumenta la secrecion de TNF-a de las DC activadas (□) y la secrecion de IFN-g de celulas Th1 (□) en comparacion con los controles. Los datos se calcularon como el cambio porcentual de los cultivos generados en ausencia de MSC e inhibidores de PGE2 (D) La presencia de bloqueadores de PGE2 indometacina (Indo) y NS-398 durante el cocultivo de MSC-PBMC (1:10) invierte los efectos anti-proliferativos mediados por MSC en las PBMC tratadas con PHA. Los datos mostrados son de un experimento y son representativos de 3 experimentos independientes.
Figura 5. La secrecion constitutiva de citoquinas MSC se eleva en presencia de PBMC alogenicas. Utilizando las MSC humanas previamente caracterizadas, se analizaron los niveles de las citoquinas 1L-6 y VEGF, el mediador lipldico PGE2 y la metaloproteinasa de matriz 1 (pro MMP-1) en el sobrenadante de cultivo de MSC cultivadas durante 24 horas en presencia (barras sombreadas) o ausencia (barras sin color) de PBMC (relacion de MSC con respecto a PBMC 1:10). Las MSC produjeron 1L-6, VEGF y PGE2 constitutivamente, y los niveles de estos factores aumentaron en el cocultivo con PBMC, lo que sugiere que las MSC pueden desempenar un papel en la modulacion de las funciones inmunes en un entorno inflamatorio.
Figura 6. Las MSC inhiben la proliferacion de celulas T inducida por mitogeno de una manera dependiente de la dosis. Se incubaron cantidades crecientes de PBMC alogenicas con un numero constante de MSC (2.000 celulas/pozo) en placas de 96 pozos en presencia o ausencia de PHA (2,5 mg/mL) durante 72 horas, y se determino la incorporation de timidina 3H (en recuentos por minuto, o cpm). Hubo una inhibition dependiente de la dosis de la proliferacion de PBMC tratadas con PHA en presencia de MSC. Se muestran resultados representativos de 1 de 3 experimentos independientes. Resultados similares fueron reportados por LeBlanc et al., Scand J. Immunol., vol. 57, pag. 11 (2003).
Figura 7. Diagrama esquematico del mecanismo de action propuesto de MSC. Las MSC median sus efectos inmunomoduladores al afectar las celulas tanto de los sistemas inmunes innatos (rutas 2 y 4 de DC; y ruta 6 de NK) como adaptativos (rutas 1 y 5 de T y ruta 7 de B). En respuesta a un patogeno invasor, las DC inmaduras migran al sitio de entrada potencial, maduran y adquieren la capacidad de cebar celulas T no alteradas (mediante senales especlficas y coestimuladoras de antlgenos) para convertirse en celulas T efectoras protectoras (inmunidad Th1 mediada por celulas o Th2 humoral). Durante la interaction MSC-DC, las MSC, mediante contacto directo celula-celula o a traves de un factor secretado, pueden alterar el resultado de la respuesta inmune limitando la capacidad de las DC de montar una respuesta mediada por celulas (ruta 2) o promoviendo la capacidad para montar una respuesta humoral (ruta 4). Ademas, cuando las celulas T efectoras maduras estan presentes, las MSC pueden interactuar con ellas para desviar el equilibrio de las respuestas de TH1 (ruta 1) hacia respuestas de TH2 (ruta 5), y probablemente hacia un aumento de la actividad de celulas B productoras de IgE (ruta 7), los resultados deseables para la supresion de GvHD y los slntomas de la enfermedad autoinmune. Las MSC en su capacidad para dar lugar a una mayor generation de poblacion de TReg (ruta 3) puede resultar en un fenotipo tolerante y puede ayudar a un huesped receptor al amortiguar la inflamacion de los vecinos en su microambiente local. La llnea de puntos (—) representa el mecanismo propuesto.
La invention se describira ahora con respecto a los siguientes ejemplos; debe entenderse, sin embargo, que el alcance de la presente invencion no debe limitarse a los mismos.
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Ejemplo 1
Materiales y metodos Cultivo de las MSC humanas
Las MSC humanas se cultivaron como se describe en Pittenger et al., Science, vol. 284, pag. 143 (1999). En resumen, se recogieron muestras de medula de la cresta illaca de donantes anonimos tras el consentimiento informado de Poietics Technologies, Div. de Cambrex Biosciences. Las MSC se cultivaron en una solucion de antibiotico-antimicotico al 1% (Invitrogen, Carlsbad, California) con bajo contenido de glucosa - medio completo de Eagle modificado de Dulbecco (Life Technologies, Carlsbad, California) y suero bovino fetal al 10% (FBS, JRH BioSciences, Lenexa, Kansas). Las MSC crecieron como una monocapa adherente y se separaron con tripsina/EDTA (tripsina al 0,05% a 37°C durante 3 minutos). Todas las MSC utilizadas se caracterizaron previamente por el potencial de multilinaje y conservaron la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimales (condroclticos, adipogenicos y osteogenicos) (Pittenger, et al., Science, volumen 284, pag. 143 (1999)).
Aislamiento de celulas dendrlticas
Se obtuvieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a traves de Poietics Technologies, Div. de Cambrex Biosciences (Walkersville, MD). Los precursores de celulas dendrlticas (DC) de linaje monocltico (CD1c+) se seleccionaron positivamente a partir de PBMC usando un metodo de separacion magnetica de 2 etapas segun Dzionek et al. al., J. Immunol., vol. 165, pag. 6037 (2000). Brevemente, se agoto magneticamente la cantidad de celulas CD19+ en las celulas B que expresan CD1c usando perlas magneticas, seguido por la marcacion de la fraccion agotada en celulas B con CD1c marcados con biotina (BDCA1+) y anticuerpos anti-biotina y separandolos de la fraccion celular no marcada utilizando columnas magneticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Auburn, California). Los precursores de DC de linaje plasmacitoide se aislaron a partir de PBMC mediante clasificacion inmunomagnetica de celulas recubiertas con anticuerpo marcadas positivamente (BDCA2+) (Miltenyi Biotech, Auburn, California).
Cultivo de MSC-DC
En la mayorla de experimentos, las MSC y DC humanas se cultivaron en numeros iguales durante varios periodos de tiempo y se recogio y almaceno el sobrenadante del cultivo celular a -80°C hasta una evaluacion posterior. En experimentos seleccionados, se cultivaron MSC con celulas DC1 o DC2 maduras (relacion de MSC: DC de 1:1) durante 3 dlas y despues se irradiaron los cultivos combinados (MSC y DC) para evitar cualquier proliferacion. A continuacion, se anadieron celulas T alogenicas purificadas no alteradas con anticuerpos (CD4+, CD45RA+) a las MSC/DC irradiadas y se cultivaron durante 6 dlas mas. La fraccion celular no adherente (celulas T purificadas) se recogio despues de los cultivos, se lavo dos veces y se reestimulo con PHA durante otras 24 horas, despues de lo cual se recogieron los sobrenadantes del cultivo celular y se analizaron para determinar IFN-y secretado y lL-4 por ELISA.
Aislamiento de celulas NK
Se obtuvieron poblaciones purificadas de celulas NK mediante el agotamiento de celulas no NK que se marcan magneticamente con un coctel de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina (anticuerpos anti-CD3, anti-CD14, anti-CD19, anti-CD36 y anti-IgE) como reactivo primario y los anticuerpos monoclonales anti-biotina conjugados con microperlas como reactivo de marcacion secundario. Las celulas no NK marcadas magneticamente se retuvieron en columnas MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, California) en un campo magnetico, mientras que las celulas NK pasaron a traves y se recogieron.
Aislamiento de la poblacion de celulas TReg
La poblacion de celulas TReg se aislo usando un procedimiento de aislamiento en dos etapas. Primero, se marcaron indirectamente magneticamente celulas T no CD4+ con un coctel de anticuerpos marcados con biotina y microperlas anti-biotina. Las celulas marcadas se agotaron despues por separacion sobre una columna MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, California). A continuacion, se marcaron directamente las celulas CD4+CD25+ con microperlas de CD25 y se aislaron mediante seleccion positiva a partir de la fraccion de celulas CD4+ previamente enriquecidas. Se retuvieron las celulas T CD4+CD25+ marcadas magneticamente en la columna y se eluyeron despues de retirar la columna del campo magnetico.
Con el fin de determinar si el aumento de la poblacion de CD4+CD25+ generada en presencia de MSC eran de naturaleza supresora, se aislaron poblaciones de celulas TReg CD4+CD25+ a partir de cultivos de PBMC o MSC+PBMC (relacion de MSC con respecto a PBMC de 1:10) (cultivadas sin ninguna estimulacion adicional durante 3 dlas) usando un procedimiento de aislamiento magnetico de 2 etapas. Estas celulas se irradiaron para bloquear cualquier proliferacion adicional y se usaron como estimuladores en una reaccion de linfocitos mixtos (MLR), en donde los respondedores eran PBMC alogenicas (relacion de estimulador con respecto a respondedor de 1:100) en presencia de PHA (2,5 pg/mL). El cultivo se llevo a cabo durante 48 horas, tras lo cual se anadio timidina 3H. La radiactividad
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Las PBMC se cultivaron en ausencia o presencia de MSC (relacion de MSC con respecto a PBMC 1:10), despues de lo cual se recogio la fraccion no adherente y se inmunotino con el receptor de TNF inducido por glucocorticoides marcado con FITC, o GITR, y CD4 marcada con PE.
Generacion de celulas TH1/TH2
Se sembraron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a razon de 2 x 106 celulas/mL durante 45 min a 37°C con el fin de eliminar los monocitos. La fraccion no adherente se incubo en presencia de anticuerpos anti-CD3 (5 pg/mL) y anti-CD28 (1 pg/m1) unidos a la placa bajo condiciones de Th1 (IL-2 (4 ng/mL) + IL-12 (5 ng/mL) + anti-IL-4 (1 pg/mL) o Th2 (IL-2 (4 ng/mL) + IL-4 (4 ng/mL) + anti-IFN-y (1 pg/mL)) durante 3 dlas en presencia o ausencia de MSC. Las celulas se lavaron y luego se estimularon nuevamente con PHA (2,5 pg/mL) durante otras 24 o 48 horas, despues de lo cual se midieron los niveles de IFN-y e IL-4 en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota).
Analisis de los niveles de VEGF, PGE2 y pro-MMP-1 en sobrenadante de cultivo de MSC.
Usando las MSC humanas previamente caracterizadas, se analizaron los niveles de interleuquina 6 (IL-6), VEGF, mediador lipldico de prostaglandina E2 (PGE2) y metaloproteinasa de matriz 1 (pro-MMP-1) en sobrenadante de cultivo de MSC cultivadas durante 24 horas en presencia o ausencia de PBMC (relacion de MSC con respecto a PBMC de 1:10).
Proliferation de PBMC
Las PBMC purificadas se prepararon por centrifugation de leukopack (Cambrex, Walkersville, Maryland) sobre Ficoll- Hypaque (Lymphoprep, Oslo, Noruega). Las celulas separadas se cultivaron (por triplicado) en presencia o ausencia de MSC (sembradas 3-4 horas antes de la adicion de PBMC para permitir que se asentaran) durante 48 horas en presencia del mitogeno PHA (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri). En experimentos seleccionados, las PBMC se resuspendieron en medio que contenla inhibidores de PGE2 Indometacina (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) o NS- 938 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan). Se anadio (3H)-timidina (20 pL en un cultivo de 200 pL) y se recolectaron las celulas despues de un cultivo adicional de 24 horas utilizando un recolector automatico. Los efectos de MSC o bloqueadores de pGe2 se calcularon como el porcentaje de la respuesta de control (100%) en presencia de PHA.
RT-PCR cuantitativa
Se preparo ARN total de sedimentos celulares usando un kit comercialmente disponible (Qiagen, Valencia, California) y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se elimino el ADN genomico contaminante usando el kit libre de ADN (Ambion, Austin, Texas). La RT-PCR cuantitativa se realizo en un sistema de detection MJ Research Opticon (South San Francisco, California) utilizando el kit de RT-PCR QuantiTect SYBR Green (Qiagen, Valencia, California) con cebadores a una concentration de 0,5 pM. Los cambios relativos en los niveles de expresion en celulas cultivadas bajo diferentes condiciones se calcularon mediante la diferencia en los valores de Ct (punto de cruce) usando p-actina como control interno. Las secuencias para cebadores especlficos de COX-1 y COX-2 fueron: COX-1: 5'-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3' (directo), 5'-CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G-3' (inverso); COX-2: 5'-ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC-3' (directo), 5'-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3' (inverso).
Se incubaron cantidades crecientes de PBMC alogenicas con un numero constante de MSC (2.000 celulas/pozo) sembradas en placas de 96 pozos en presencia de PHA (2,5 pg/mL) durante 72 horas, y se determino la incorporation de timidina 3H (recuentos por minuto, cpm). Las PBMC y MSC se cultivaron en relaciones de MSC:PBMC de 1:1, 1:3, 1:10, 1:30 y 1:81.
Resultados
En los presentes estudios, se examino la interaction de MSC humanas con poblaciones de celulas inmunes aisladas, incluyendo celulas dendrlticas (DC1 y DC2), celulas T efectoras (Th1 y Th2) y celulas NK. La interaccion de MSC con cada tipo de celulas inmunes tenia consecuencias especlficas, lo que sugiere que las MSC pueden modular varias etapas en el proceso de respuesta inmune. Se evaluo la production del factor o factores secretado que modulan y puede ser responsables de los efectos inmunomoduladores de MSC y se implico la slntesis de prostaglandinas.
Se aislaron celulas dendrlticas precursoras mieloides (DC1) y plasmacitoides (DC2) mediante clasificacion inmuno- magnetica de celulas BDCA1 + y BDCA2+ respectivamente y maduraron mediante incubation con GM-CSF e IL-4 (1 x 103 IU/mL y 1 x 103 UI/mL, respectivamente) para celulas dC1, o IL-3 (10 ng/mL) para celulas DC2. Utilizando citometrla de flujo, las celulas DC1 fueron HLA-DR+ y CD11c+, mientras que las celulas DC2 fueron HLA-DR+ y CD123+ (Figura 1A). En presencia del lipopolisacarido bacteriano del agente inflamatorio (LPS, 1 ng/mL), las celulas DC1 produjeron niveles moderados de TNF-a, pero cuando estaban presentes MSC (relaciones examinadas 1:1 y 1:10), hubo una
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reduccion de > 50% en la secrecion de TNF-a (Figura 1B). Por otra parte, las celulas DC2 produjeron IL-10 en presencia de LPS y sus niveles aumentaron mas de 2 veces tras el cocultivo de MSC:DC2 (1:1) (Figura iB). Por lo tanto, las MSC modificaron el perfil de citoquinas de las DC activadas en cultivo hacia un fenotipo mas tolerogenico. Ademas, las DC activadas, cuando se cultivaron con MSC, fueron capaces de reducir el IFN-y y aumentar los niveles de IL-4 secretados por celulas T CD4+ sin alterar (Figura 1C), lo que sugiere un desplazamiento mediado por MSC del fenotipo de celulas T proinflamatorias a anti-inflamatorias.
Como el aumento de la secrecion de IL-10 desempena un papel en la generacion de celulas reguladoras (Kingsley et al., J. Immunol., vol. 168, pag. 1080 (2002)), se cuantificaron las celulas T reguladoras (TReg) por citometrla de flujo en cocultivos de PBMC y MSC. Tras el cultivo de PBMC con MSC durante 3-5 dlas, hubo un aumento en el numero de celulas TReg determinado por tincion de las PBMC con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD25 (Figura 2A), soportando ademas una respuesta tolerogenica inducida por MSC. La poblacion de celulas TReg CD4+CD25+, generada en presencia de MSC expreso mayores niveles del receptor de TNF inducido por glucorticoides (GITR), un receptor de superficie celular expresado en poblaciones de celulas TReg, y era de naturaleza supresora, ya que suprimio la proliferacion de celulas T alogenicas (Figura 3A, B). A continuation, se investigaron las MSC en cuanto a su capacidad directa para afectar la diferenciacion de celulas T. Utilizando celulas T purificadas seleccionadas de anticuerpo (celulas Th CD4+), se generaron celulas TH1 productoras de IFN-y y TH2 productoras de IL-4 en presencia o ausencia de MSC. Cuando las MSC estaban presentes durante la diferenciacion, hubo una secrecion reducida de IFN-y por celulas TH1 y un aumento de la secrecion de IL-4 por celulas TH2 (Figura 2B). No se observaron cambios significativos en los niveles de IFN-y o IL-4 cuando se anadieron las MSC al cultivo despues de que las celulas Th se hablan diferenciado (a los 3 dlas) en los tipos efectores Th1 o Th2 (datos no mostrados). Estos experimentos sugieren que las MSC pueden afectar la diferenciacion de celulas T efectoras directamente y alterar la secrecion de citoquinas de celulas T hacia un fenotipo humoral.
De forma similar, cuando se cultivaron las MSC con celulas NK purificadas (CD3-, CD14-, CD19-, CD36-) en una relation 1:1 para diferentes perlodos de tiempo (0-48 horas), se redujo la secrecion de IFN-y en el sobrenadante de cultivo (Figura 2C), lo que sugiere que las MSC pueden modular tambien las funciones de las celulas NK.
Los trabajos previos han indicado que las MSC modifican las funciones de las celulas T por un factor o factores solubles (LeBlanc et al., Exp. Hematol., vol. 31, pag. 890 (2003), Tse et al., Transplantation, vol. 75, pag. 389 (2003). Se observo que las MSC segregaban varios factores, incluyendo IL-6, prostaglandina E2, VEGF y proMMP-1 constitutivamente, y los niveles de cada uno aumentaron tras el cultivo con PBMC (Figura 5). Con el fin de investigar los factores derivados de MSC que conducen a la inhibition del TNF-a y el aumento de la production de IL-10 por las DC, se investigo el papel potencial de la prostaglandina E2, ya que se ha demostrado que inhibe la produccion de TNF-a por las DC activadas. (Vassiliou, et al., Cell. Immunol., vol. 223, pag. 120 (2003)). Los medios acondicionados del cultivo de MSC (cultivo de 24 horas de 0,5 x 106 celulas/mL) contenlan aproximadamente 1.000 pg/mL de PGE2 (Figura 4A). No hubo presencia detectable de inductores conocidos de la secrecion de PGE2, por ejemplo, TNF-a, IFN-y o IL-1 p (datos no mostrados) en el sobrenadante del cultivo indicando una secrecion constitutiva de PGE2 por las MSC. La secrecion de PGE2 por las hMSC se inhibio 60-90% en presencia de inhibidores conocidos de la produccion de PGE2, NS-398 (5 pM) e indometacina (4 pM) (Figura 4A). Como la liberation de la secrecion de PGE2 se produce como resultado de la actividad enzimatica de la enzima 1 de ciclooxigenasa constitutivamente activa (COX-1) y de la enzima 2 de ciclooxigenasa inducible (COX-2) (Harris, et al., Trends Immunol., vol. 23, pag. 144 (2002)) se analizo la expresion de ARNm para COX-1 y COX-2 en MSC y PBMC utilizando un sistema de cultivo de migration entre pozos. Las MSC expresaron niveles significativamente mas altos de COX-2 en comparacion con PBMC y los niveles de expresion aumentan > 3 veces tras el cocultivo de MSC y PBMC (relacion de MSC con respecto a PbMc de 1:10) durante 24 horas (Figura 4B). Se observaron cambios modestos en los niveles de COX-1, lo que sugiere que el incremento en la secrecion de PGE2 tras el cocultivo de MSC-PBMC (Figura 5) esta mediado por la sobrerregulacion de COX-2. Para investigar si los efectos inmunomoduladores de MSC en DC y celulas T fueron mediados por PGE2, se cultivaron MSC con celulas dendrlticas activadas (DC1) o celulas TH1 en presencia de inhibidores de PGE2 NS-398 o indometacina. La presencia de NS-398 o indometacina aumento la secrecion de TNF-a por DC1 y la secrecion de IFN-y de celulas TH1 (Figura 4C), respectivamente, lo que sugiere que los efectos de MSC en los tipos de celulas inmunitarias pueden estar mediados por PGE2 secretada. Estudios recientes han demostrado que las MSC inhiben la proliferacion de celulas T inducida por diversos estlmulos (DeNicola et al., Blood, vol. 99, pagina 3838 (2002), LeBlanc et al., Scand. J. Immunol., vol. 57, pag. 11 (2003)). Se observo que las MSC inhiben la proliferacion de celulas T inducida por mitogenos de una manera dependiente de la dosis (Figura 6) y cuando estaban presentes los inhibidores de PGE2 NS-398 (5 pM) o indometacina (4 pM), hubo un aumento > 70% en la incorporation de (3H) timidina por PBMC tratadas con PHA en cultivos que contienen MSC en comparacion con controles sin inhibidores (Figura 4D).
En resumen, se propone un modelo de interaction de MSC con otros tipos de celulas inmunes (Figura 7). Cuando las celulas T maduras estan presentes, las MSC pueden interactuar con ellas directamente e inhibir la produccion de IFN-y proinflamatoria (ruta 1) y promover el fenotipo de celulas T reguladoras (ruta 3) y celulas Th2 antiinflamatorias (ruta 5). Ademas, las MSC pueden alterar el resultado de la respuesta inmunitaria de las celulas T a traves de las DC segregando PGE2, inhibiendo las celulas DC1 proinflamatorias (ruta 2) y promoviendo las celulas DC2 antiinflamatorias (ruta 4) o las DC reguladoras (ruta 3). Un cambio hacia la inmunidad de TH2, a su vez, sugiere un cambio en la actividad de las celulas B hacia el aumento de la generacion de anticuerpos del subtipo IgE/IgG1 (ruta 7). Las MSC, por su capacidad para inhibir la secrecion de IFN-y de las celulas NK probablemente modifican la funcion de las celulas NK
(ruta 6). Este modelo de interacciones de celulas MSC : inmunes es coherente con la experimentacion realizada en otros laboratorios (LeBlanc et al., Exp. Hematol., vol. 31, pag. 890 (2003), Tse et al., Transplantation, vol. 75, pag. 389 (2003), DiNicola et al., Blood, vol. 99, pag. 3838 (2002)). Se esta llevando a cabo un examen mas detallado de los mecanismos propuestos y ahora se necesitan estudios en animales para examinar los efectos in vivo de la 5 administracion de MSC.

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Celulas madre mesenquimales no manipuladas geneticamente para uso en la reduccion o limitacion de la inflamacion en un humano mediante la mediation de un desplazamiento de la poblacion de celulas T de celulas Th1 proinflamatorias a celulas Th2 antiinflamatorias, en donde la inflamacion esta en el cerebro o en el intestino.
  2. 2. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, en donde la inflamacion comprende inflamacion en el intestino asociada con enfermedad inflamatoria intestinal.
  3. 3. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, inflamatoria intestinal y las celulas madre mesenquimales promueven generation de celulas TReg.
  4. 4. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, en alogenicas.
  5. 5. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, en autologas.
  6. 6. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, que han de administrarse por administration intravenosa, intraarterial o intraperitoneal.
  7. 7. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, que han de administrarse como una suspension de celulas en un medio llquido farmaceuticamente aceptable.
  8. 8. Las celulas madre mesenquimales para uso de la reivindicacion 1, en donde las celulas madre mesenquimales se recolectan de un tejido que contiene celulas madre mesenquimatosas, se alslan y se expanden en cultivo.
    en donde el humano tiene una enfermedad una mayor secretion de interleuquina 10 y
    donde las celulas madre mesenquimales son
    donde las celulas madre mesenquimales son
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