JP6757300B2 - 間葉幹細胞及びその使用法 - Google Patents
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Description
ロン−ベータ(INF−β)を産生するように樹状細胞(DCs)を刺激すると考えられる。
む。
ESRD)感染を調節するために用いられ得る。この実施例の範囲は如何なる理論上の推論にも限定されるべきではないが、間葉幹細胞が、糸球体構造形成を促進する血管内皮増殖因子、すなわちVEGFを発現するように抹消血単核細胞を誘導すると考えられる。
得る。あるいは、間葉幹細胞は治療される癌に直接投与され得る。
vehicles)によって間葉幹細胞に送達され得る。間葉幹細胞を遺伝子組み換えするために用いられ得る発現媒体は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。
図1 MSCsの樹状細胞作用の調節
(A)HLA−DR及びCD11cに対する抗体を用いた成熟単球DC1細胞のフローサイトメトリー分析、及びHLA−DR及びCD123(IL−3レセプター)に対する抗体を用いた形質細胞様(plasmacytoid)DC2細胞のフローサイトメトリー分析。(−−−(破線)):アイソタイプ コントロール;(___(実線)):FITC/PE結合抗体。(B)MSCsは、それぞれ活性化したDC1及びDC2からのTNF−α分泌を抑制し(第一y軸)、IL−10分泌を増加させる(第二y軸)。(C)成熟DC1細胞とともに培養したMSCsは、MSCあるいはDC単独の場合と比較して、T細胞によるIFN−γ分泌(第一y軸)を抑制し、またIL−4レベルを増加させる(第二y軸)。MSCsの存在下での炎症誘発性IFN−γの産生の減少、及び抗炎症性IL−4の産生の増加は、抗炎症性表現型に関してのT細胞集団の変動を示唆した。
(A)FITC結合CD4抗体(x軸)及びPE結合CD25抗体(y軸)を用いた、PBMCsあるいは、MSC+PBMC培養(MSC+PBMC)における非接着性画分の染色によるTReg細胞数(%)のフローサイトメトリー分析。ゲートは、バックグラウンドとしてのアイソタイプ コントロール抗体に基づいて設定された。グラフは、5つの独立した実験の代表である。(B)細胞培養上清中で、MSCsの存在下で発生したTH1細胞は減少したレベルのIFN−γを分泌し(第一y軸)、またMSCsの存在下で発生したTH2細胞は増加した量のIL−4を分泌した(第二y軸)。(C)MSCsは、24ウェルプレート中で0、24、あるいは48時間培養された精製NK細胞からのIFN−γ分泌を抑制する。示されたデータは、一つの実験における平均値±SDサイトカイン分泌であり、また3つの独立した実験の代表である。
(A)PRMCあるいはMSC+PBMC(MSCのPBMCに対する比 1:10)培養(3日間さらなる刺激もなく培養された)由来のCD4+CD25+Treg細胞集団は、2ステップ磁気分離法を用いて単離された。これらの細胞は、(さらなる増殖を阻止するために)放射線照射され、混合リンパ球反応(MLR)における刺激因子として用いられた。ここで応答物質(responder)は、フィトヘムアグルチニン(PHA)の存在下(2.5mg/ml)での同種異系PBMCs(刺激因子の応答物質に対する比 1:100)であった。細胞は48時間培養され、その後3Hチミジンが添加され、24時間後に組み込まれた放射能がカウントされた。結果は、MSCsの存在下で発生したTreg集団(レーン3)が、MSCsの不在下で発生したTreg細胞(レーン2)と機能上類似していることを示した。(B)PBMCsは、MSCsの不在下(上段プロット)あるいは存在下(下段プロット)(MSCのPBMCに対する比 1:10)で、
3日間培養され、その後非接着性画分が回収され、FITC標識GITR及びPE標識CD4を用いて免疫染色された。結果は、MSCsの存在下で培養された細胞のGITR発現において、2倍を超える増加を示す。
(A)種々の濃度の、PGE2阻害剤であるNS−398あるいはインドメタシン(Indometh.)の存在下あるいは不在下で培養されたMSCsから得られた培養上清におけるPGE2分泌(平均値±SD)。阻害剤濃度はμMであり、提示されたデータは24時間培養後に得られた値である。(B)リアルタイムRT−PCRを用いたMSCs及びPBMCsにおけるCOX−1及びCOX−2発現。MSCsは、PBMCsと比較してはるかに高いレベルのCOX−2を発現し、MSCsがPBMCsの存在下で培養された場合には、MSCsのCOX−2発現の3倍以上の増加であった。3つの独立した実験のうちの1つからの代表データが示される。MSC+PBMC培養はトランスウェルチャンバープレートに設置され、ここでMSCsは下部チャンバーに播種され、PBMCsは上部チャンバーに播種された。(C)PGE2阻害剤インドメタシン(Ind.)あるいはNS−398の存在が、コントロールと比較して、活性化DCsからのTNF−α分泌と、TH1細胞からのIFN−γ分泌を増加させた。データは、MSCs及びPGE2阻害剤の不在化で発生した培養からの%変化として計算された。(D)MSC−PBMC共培養(1:10)でのPGE2阻害剤インドメタシン(Indo)及びNS−398の存在は、PHA処理したPBMCsに対するMSC媒介抗増殖促進作用を無効にする。示されたデータは、一つの実験からのものであり、また3つの独立した実験の代表である。
予め特性の示されたヒトMSCsを用いて、PBMCsの存在下(MSCのPBMCに対する比 1:10)(斜線バー)あるいは不在下(白抜きバー)で24時間培養したMSCsの培養上清における、サイトカインIL−6及びVEGF、脂質メディエータPGE2、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ1(pro−MMP−1)のレベルが分析された。MSCsはIL−6、VEGF、及びPGE2を構成的に産生し、これらの因子のレベルはPBMCsとの共培養により増加した。これにより、MSCsが炎症設定における免疫機能の調節に関与し得ることを示す。
増加数の同種異系PBMCsが、PHAの存在下(2.5mg/ml)あるいは不在下で、96ウェルプレートに播種された定数のMSCs(2000cells/well)とともにインキュベートされ、3Hチミジン取り込みが(カウント数/分、すなわちcpmで)測定された。MSCsの存在下で、PHAで処理したPBMCsの増殖の用量依存的抑制があった。3つの独立した実験の1つからの代表的な結果が示される。類似の結果は、LeBlanc,et al.,Scand J.Immunol.,Vol.57,pg.11(2003)により報告された。
MSCsは、先天性(DCs経路 2から4;及びNK経路 6)及び適応的(T経路
1及び5、及びB経路 7)免疫システムの双方からの細胞に作用することで、その免疫調節作用を調節する。侵入病原体に対する反応で、未成熟DCsは潜在的入口部位に移動し、成熟して、(抗原特異的及び副刺激シグナルで)保護(protective)エフェクターT細胞(細胞媒介TH1免疫あるいは体液性TH2免疫)となるためのnaiveT細胞を用意(prime)する能力を獲得する。MSC−DC相互作用の間に、MSCsは、直接細胞間接触で、あるいは分泌された因子を介して、細胞媒介反応(経路2)を開始するDCsの能力を制限することによって、あるいは体液性反応(経路4)を開
始する能力を促進することによって、免疫反応の結果を変更し得る。また、成熟エフェクターT細胞が存在する場合は、MSCsは、TH1(経路1)反応のバランスをTH2反応(経路5)の方へ、またおそらくIgE産生B細胞活性の増加(経路7)、GvHD及び自己免疫疾患症状の抑制について望ましい結果の方へ傾けるために、互いに相互作用し得る。MSCsは、TReg集団の発生の増加(経路3)をもたらす能力において、体制表現型をもたらし、また局所微小環境におけるバイスタンダー(bystander)炎症を弱めることで受容者ホストを救済し得る。破線(−−−)は、提案されたメカニズムを表す。
材料及び方法
ヒトMSCsの培養
Pittenger et al.,Science,Vol.284,pg.143(1999)により開示されたように、ヒトMSCsを培養した。つまり、Poietics Technologies、Div of Cambrex Biosciencesによるインフォームドコセントの後に、匿名提供者の腸骨稜から骨髄サンプルを回収した。MSCsを、1%抗生物質−抗真菌(antibiotic−antimycotic)溶液(Invitrogen,Carlsbad,California)と、10%ウシ胎仔血清(FBS,JRH BioSciences、lenexa、Kansas)とを含有する、完全ダルベッコ変法イーグル培地(complete Dulbecco‘s Modified Eagle’s Medium)−低グルコース(Life Technologies,Carlsbad,California)中で培養した。MSCsは接着性の単層として増殖し、トリプシン/EDTA(0.05%トリプシンを37℃で3分間)を用いて分離した。用いた全てのMSCsが多分化能について予め明らかにされており、また間葉系に分化(軟骨、脂質生成、及び骨形成)する能力を保持していた(Pittenger et al.,Science,Vol.284,pg.143(1999))。
末梢血単核細胞(PBMCs)を、Poietics Technologies,Div of Cambrex Biosciences(Walkersville,MD)から獲得した。単球系の樹状細胞(DCs)の前駆体(CD1c+)を、Dzionek、et al.,J.Immunol.,Vol.165,pg.6037(2000)にしたがった2ステップ磁気分離法を用いて、PBMCsからポジティブセレクションした。つまり、CD1c発現B細胞が磁気ビーズを用いてCD19+細胞を磁気的に除去され、その後、ビオチン標識CD1c(BDCA1+)及び抗ビオチン抗体を用いてB細胞除去画分を標識し、それらを、メーカーの使用説明書(Miltenyi Biotech,Auburn,California)にしたがって磁気カラムを利用して非標識細胞画分から分離した。形質細胞様系統のDCsの前駆体が、陽性に標識される抗体でコートされた細胞(BDCA2+)の免疫−磁気ソーティングにより、PBMCsから単離された(Miltenyi Biotech,Auburn,California)。
大部分の実験において、等数のヒトMSCs及びDCsを、種々の期間培養し、細胞培養上清を回収し、さらなる実験まで−80℃で保存した。選択した実験では、MSCsを
成熟DC1あるいはDC2細胞とともに(1:1 MSC:DCの比)3日間培養し、続いて混合培養(MSCsとDCs)を、増殖を阻止するために放射線照射した。続いて、抗体精製、naive、同種異系T細胞(CD4+、CD45RA+)を放射線照射MSCs/DCsに添加し、さらに6日間培養した。その後、非接着性細胞画分(精製T細胞)を培養液から回収し、2回洗浄し、さらに24時間PHAで再刺激した。その後、細胞培養上清を収集し、ELISAにより分泌されたIFN−γ及びIL−4について分析した。
NK細胞の精製集団を、一次試薬としてのビオチン結合モノクローナル抗体(抗CD3、CD14、CD19、CD36及び抗IgE抗体)と、二次標識試薬としてのマイクロビーズに結合した抗ビオチンモノクローナル抗体との混合物で磁気的に標識した非NK細胞を除去することで、獲得した。磁気標識された非NK細胞は、磁気領域中のMACS(Miltenyi Biotech,Auburn,California)カラムに保持され、一方NK細胞は、通過して回収された。
Treg細胞集団を、2ステップ単離法を用いて単離した。第一に、非CD4+T細胞を、ビオチン標識抗体と抗ビオチンマイクロビーズの混合物で間接的磁気的に標識した。続いて標識した細胞を、MACSカラム(Miltenyi Biotech,Auburn,California)での分離により除去した。次に、CD4+CD25+細胞を、CD25マイクロビーズで直接標識し、濃縮前CD4+T細胞画分からポジティブセレクションにより単離した。磁気的に標識したCD4+CD25+T細胞をカラム上に保持し、磁気領域からのカラムの除去の後に溶出した。
末梢血単核細胞(PBMCs)を、単球を除去するために、37℃で45分間2×106cells/mlで播種した。非接着性画分を、MSCsの存在下あるいは不在下で、TH1(IL−2(4ng/ml)+IL−12(5ng/ml)+抗IL−4(1μg/ml))あるいはTH2(IL−2(4ng/ml)+IL−4(4ng/ml)+抗IFN−γ(1μg/ml))条件下、プレート固定抗CD3(5μg/ml)抗体、及び抗CD28(1μg/ml)抗体の存在下で3日間インキュベートした。細胞を洗浄し、その後24時間あるいは48時間、PHA(2.5μg/ml)で再刺激した。その後、ELISA(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota)で、培養上清中のIFN−γ及びIL−4のレベルを測定した。
予め特定されたヒトMSCsを用いて、PBMCsの存在下(MSCのPBMCに対する比 1:10)あるいは不在下で24時間培養したMSCsの培養上清中で、インターロイキン−6(IL−6)、VEGF、脂質メディエータ プロスタグランジンE2(PGE2)、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ1(pro−MMP−1)のレベルを分析した。
精製PBMCsを、Ficoll−Hypaque(Lymphoprep,Oslo,Norway)での遠心分離ロイコパック(centrifuging leukopack)(Cambrex,Walkersville,Maryland)により処理した。分離した細胞を、マイトジェンPHA(Sigma Chemicals,St.Louis,Missouri)の存在下、MSCsの存在下(定着するように、PBMC添加の3から4時間前に播種した)あるいは不在下で、48時間培養した(トリプリケイト(triplicates)で)。選択した実験においては、PBMCsを、PGE2阻害剤インドメタシン(Sigma Chemicals,St.Louis,Missouri)あるいはNS−938(Cayman Chemicals,Ann Arbor,Michigan)を含有する培地中に再懸濁した。(3H)−チミジンを添加し(200μlの培養液中に20μl)、さらなる24時間の培養の後に自動収集器を用いて細胞を収集した。MSCsあるいはPGE2阻害剤の作用効果を、PHAの存在下のコントロール反応(100%)の割合として計算した。
細胞ペレットからの全RNAを、市販のキット(Qiagen,Valencia,California)を用いて、またメーカーの使用説明書にしたがって、処理した。混入ゲノムDNAを、DNAフリーキット(Ambion,Austin,Texas)を用いて除去した。0.5μM濃度のプライマーとともにQuantiTect SYBR
Green RT−PCRキット(Qiagen,Valencia,California)を用いて、MJ Research Opticon検出システム(South
San Francisco,California)で量的RT−PCRを実施した。種々の条件下で培養された細胞における発現レベルの相対的変化を、内在コントロールとしてのβアクチンを用いて、Ct値(交点)の違いにより算出した。COX−1及びCOX−2の特異的プライマーの配列は、COX−1:5’−CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G−3’(フォワード)、5’−CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G−3’(リバース);COX−2:5’−ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC−3’(フォワード)、5’−TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG−3’(リバース)である。
本研究において、ヒトMSCsと、樹状細胞(DC1及びDC2)、エフェクターT細胞(TH1及びTH2)、及びNK細胞を含む、単離された免疫細胞集団との相互作用を調査した。MSCsと各免疫細胞タイプとの相互作用は、MSCsが免疫反応プロセスの複数の段階を調節し得ることを示す特異的な結果であった。MSC免疫調節作用を調節し
、またMSC免疫調節作用の原因となり得る分泌因子の産生が評価され、プロスタグランジン合成が関与することが示された。
−α産生の抑制、及びIL−10産生の増加をもたらすMSC生成因子を調査するために、プロスタグランジンE2の潜在的役割を調査したが、活性化DCsによるTNF−γ産生を抑制することが認められた(Vassiliou,et al.,Cell.Immunol.,Vol.223,pg.120(2003))。MSC培養(0.5×106cells/mlの24時間培養)の条件培地は、おおよそ1000pg/mlのPGE2を含有していた(図4A)。培養上清中に、PGE2分泌の既知の誘導因子、例えばTNF−α、IFN−γあるいはIL−1βの存在は検出できなかったが(不図示)、これはMSCsによるPGE2の構成的分泌を示す。hMSCsによるPGE2分泌は、PGE2産生の既知の阻害剤、NS−398(5μM)及びインドメタシン(4μM)の存在下で、60から90%抑制された(図4A)。PGE2分泌の放出が、構成的活性シクロオキシゲナーゼ酵素1(COX−1)及び誘導性シクロオキシゲナーゼ酵素2(COX−2)の酵素活性の結果として起こるため(Harris,et al.,Trends
Immunol.,Vol.23,pg.144(2002))、MSCs及びPBMCsにおけるCOX−1及びCOX−2のmRNA発現を、トランスウェル培養システムを用いて分析した。MSCsは、PBMCsと比較してはるかに高いレベルのCOX−2を発現し、MSCsとPBMCsの24時間の共培養(MSCのPBMCに対する比 1:10)の場合には、発現レベルは3倍以上増加した(図4B)。COX−1レベルのわずかな変化が見られ、これはMSC−PBMC共培養によるPGE2分泌の増加(図5)が、COX−2の上向き調節により調節されることを示す。DCs及びT細胞に対するMSCの免疫調節効果がPGE2によって調節されたか否かを調査するために、PGE2阻害剤NS−398あるいはインドメタシンの存在下で、MSCsを活性化樹状細胞(DC1)あるいはTH1細胞とともに培養した。NS−398あるいはインドメタシンの存在が、DC1sによるTNF−α分泌と、TH1細胞からのIFN−γ分泌をそれぞれ増加させたが(図4C)、これは免疫細胞タイプに対するMSCの作用が、分泌されたPGE2により調節され得ることを示す。最近の研究が、MSCsが様々な刺激で誘導されるT細胞増殖を抑制することを示した(Denicola,et al.,Blood,Vol.99,pg.3838(2002);LeBlanc,et al.,Scand.J.Immunol.,Vol.57,pg.11(2003))。MSCsがマイトジェン誘導T細胞増殖を用量依存的様式で抑制することが観察され(図6)、PGE2阻害剤NS−398(5μM)あるいはインドメタシン(4μM)が存在した場合には、MSC含有培養液中のPHA処理PBMCsによる3Hチミジン取り込みが、阻害剤を含まないコントロールと比べて、70%以上増加した(図4D)。
文献は、各特許、文献、保管登録番号、及びデータベース登録番号が明確に、また個別に参照として組み込まれているように、同じ範囲で参照としてここに組み込まれている。
発明の態様
[1]動物の心臓以外の器官あるいは組織における血管形成を促進することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
[2]前記動物が、哺乳類であることを特徴とする[1]記載の使用法。
[3]前記動物が、霊長類であることを特徴とする[2]記載の使用法。
[4]前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする[3]記載の使用法。
[5]前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、約1×105cells/kgから約1×107cells/kgの量で投与されることを特徴とする[1]記載の使用法。
[6]前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、約1×106cells/kgから約5×106cells/kgの量で投与されることを特徴とする[1]記載の使用法。
[7]前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、全身に投与されることを特徴とする[1]記載の使用法。
[8]前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、静脈内に投与されることを特徴とする[1]記載の使用法。
[9]前記医薬製剤の前記間葉幹細胞が、前記動物の心臓以外の器官あるいは組織に直接注入により投与されることを特徴とする[1]記載の使用法。
[10]動物の自己免疫疾患を治療することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
[11]前記動物が、哺乳類であることを特徴とする[10]記載の使用法。
[12]前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする[11]記載の使用法。
[13]動物の炎症反応を治療することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法であって、ここで炎症反応の治療が、脳、皮膚、消化管(炎症性大腸炎において)、肝臓(慢性肝炎において)、目、脊髄、妊娠子宮および胎盤、卵巣、精巣、副腎皮質または毛包における炎症を軽減することを含む、使用法。
[14]前記炎症反応が、炎症性大腸炎であることを特徴とする[13]記載の使用法。
[15]前記単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞が、腸の炎症を制限又は軽減する、[13]記載の使用法。
[16]前記動物が、哺乳類であることを特徴とする[13]記載の使用法。
[17]前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする[16]記載の使用法。
[18]前記炎症反応が、乾癬に関連するものであることを特徴とする[13]記載の使用法。
[19]動物の癌を治療することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法であって、ここで前記間葉幹細胞が腫瘍の増殖を抑制する、使用法。
[20]前記動物が、哺乳類であることを特徴とする[19]記載の使用法。
[21]前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする[20]記載の使用法。
[22]動物のアレルギー性疾患又はアレルギー症状を治療するための医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
[23]前記動物が、哺乳類であることを特徴とする、[22]記載の使用法。
[24]前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする、[23]記載の使用法。
[25]前記アレルギー性疾患又はアレルギー症状が関節炎であることを特徴とする、[22]記載の使用法。
[26]動物の創傷治癒を促進することを特徴とする医薬製剤の製造のための、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
[27]前記動物が、哺乳類であることを特徴とする[26]記載の使用法。
[28]前記哺乳類が、ヒトであることを特徴とする[27]記載の使用法。
[29]前記創傷が、火傷、切傷および裂傷からなる群より選択されることを特徴とする、[26]記載の使用法。
[30]動物の線維症を予防することを特徴とする医薬製剤の製造のための、ヒトの、単離された、同種異系の、遺伝子操作されていない間葉幹細胞の使用法。
Claims (16)
- 単離された間葉幹細胞の懸濁液を含む、炎症を抑制することによりヒトにおける炎症を起こした創傷の治癒を促進するための医薬調製物。
- 創傷が、内部の創傷である、請求項1に記載の医薬調製物。
- 創傷が、外部の創傷である、請求項1に記載の医薬調製物。
- 創傷が、皮膚潰瘍である、請求項1に記載の医薬調製物。
- 皮膚潰瘍が、糖尿病または鎌状赤血球貧血により引き起こされる皮膚潰瘍である、請求項4に記載の医薬調製物。
- 直接創傷に投与するための、請求項1および3〜5のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 薬学許容液状媒体中または包帯もしくは貯蔵容器上の細胞懸濁液を含む、請求項1および3〜6のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 間葉幹細胞が、自己の間葉幹細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 間葉幹細胞が、同種異系の間葉幹細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 間葉幹細胞が、間葉幹細胞含有組織から収集され、単離され、かつ培養で増殖させた間葉幹細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 間葉幹細胞含有組織が、血、皮膚、臍帯血、筋肉、脂肪、軟骨膜、骨髄、または骨膜である、請求項10に記載の医薬調製物。
- 間葉幹細胞が、遺伝子操作されていない、培養された、間葉幹細胞である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 薬剤と組み合わせて投与するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 薬剤が、抗炎症剤である、請求項13に記載の医薬調製物。
- 約1×105cells/kgから約1×107cells/kgの量で間葉幹細胞を投与するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の医薬調製物。
- 約1×106cells/kgから約5×106cells/kgの量で間葉幹細胞を投与するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の医薬調製物。
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