ES2645018T3

ES2645018T3 - Células madre mesenquimales y usos para estas

Info

Publication number: ES2645018T3
Application number: ES10011226.7T
Authority: ES
Inventors: Mark F. Pittenger; Sudeepta Aggarwal
Original assignee: Mesoblast International SARL
Current assignee: Mesoblast International SARL
Priority date: 2004-03-22
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2025-03-15
Also published as: CA3135582A1; CA2868733C; ES2657382T5; JP2023065486A; JP2020111591A; JP2019014747A; HK1205531A1; JP2012176948A; CA2934682A1; JP5997237B2; CA2934682C; ES2708627T3; JP2018009002A; JP2017080507A; JP2021191771A; HK1205677A1; ES2643030T3; ES2643076T3; JP2015061862A; JP7033159B2

Abstract

Células madre mesenquimales para usar en la promoción de la curación de heridas inflamadas en humanos.

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre mesenquimales y usos para estas

Esta invencion se refiere a celulas madre mesenquimales. Mas particularmente, esta invencion se refiere a celulas madre mesenquimales para usar en la promocion de la curacion de heridas inflamadas en un ser humano.

Las celulas madre mesenquimales (MSC) son celulas madre multipotentes que pueden diferenciarse facilmente en linajes que incluyen osteoblastos, miocitos, condrocitos y adipocitos (Pittenger, et al., Science, vol. 284, pag. 143 (1999); Haynesworth et al., Bone, vol. 13, pag. 69 (1992); Prockop, Science, vol. 276, pag. 71 (1997)). Los estudios in vitro demostraron la capacidad de las mSc para diferenciarse a musculo (Wakitani et al., Muscle Nerve, vol. 18" pag. 1417 (1995)), precursores similares a neuronas (Woodbury, et al., J. Neurosci. Res., vol. 69, pag. 908 (2002); Sanchez- Ramos, et al., Exp. Neurol., vol. 171, pag. 109 (2001)), cardiomiocitos (Toma, et al., Circulation, vol. 105, pag. 93 (2002); Fakuda, Artif. Organs, vol. 25, pag. 187 (2001)) y posiblemente otros tipos de celulas. Ademas, se demostro que las MSC proporcionan capas alimentadoras eficaces para la expansion de las celulas madre hematopoyeticas y embrionarias (Eaves, et al., Ann. NY Acad. Sci., vol. 938, pag. 63 (2001); Wagers et al., Gene Therapy, vol. 9, pag. 606

(2002) ). Estudios recientes con una variedad de modelos animales demostraron que las MSC pueden ser utiles en la reparacion o regeneracion de huesos, cartflagos, meniscos o tejidos miocardicos danados (DeKok, et al., Clin Oral Implants Res., vol. 14, pag. 481 (2003)); Wu, et al., Transplantation, vol. 75, pag. 679 (2003); Noel, et al., Curr. Opin. Investig. Drugs, vol. 3, pag. 1000 (2002); Ballas, et al., J. Cell. Biochem. Suppl., vol. 38, pag. 20 (2002); Mackenzie, et al., Blood Cells Mol. Dis., vol. 27 (2002)). Varios investigadores utilizaron MSC con resultados alentadores para el trasplante en modelos de enfermedades animales, que incluyen la osteogenesis imperfecta (Pereira y col., Proc. Nat. Acad. Sci., vol. 95, pag. 1142 (1998)), parkinsonismo (Schwartz, et al., Hum. Gene Ther., vol. 10, pag. 2539 (1999)), lesion de la medula espinal (Chopp, et al., Neuroreport, vol. 11, pag. 3001 (2000); Wu, et al., J. Neurosci. Res., vol. 72, pag. 393 (2003)) y trastornos cardfacos (Tomita, et al., Circulation, vol. 100, pag. 247 (1999). Shake, et al., Ann. Thorac. Surg., vol. 73, pag. 1919 (2002)). Significativamente, ademas, se informaron resultados prometedores en ensayos clmicos para la osteogenesis imperfecta (Horwitz, et al., Blood, vol 97, pag.1227 (2001); Horowitz, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., vol 99, pag. 8932 (2002)) y el injerto mejorado de trasplantes de medula osea heterologos (Frassoni, et al., Int. Society for Cell Therapy, SA006 (resumen) (2002); Koc et al., J. Clin Oncol, vol. 18, pag. 307 (2000)).

Las MSC expresan el antfgeno del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I en su superficie pero no expresan el MhC clase II (Le Blanc, et al., Exp. Hematol., vol. 31, pag. 890 (2003); Potian, et al., J. Immunol., vol. 171, pag. 3426 (2003)) ni las moleculas coestimuladoras CD40 o B7 (Majumdar, et al., J. Biomed. Sci., vol. 10, pag. 228

(2003) ), lo que sugiere que estas celulas tienen un fenotipo poco inmunogenico (Tse, et al., Transplantation, vol. 75, pag. 389 (2003)). Las mSc inhiben, ademas, las respuestas proliferativas de 1 celula de una manera independiente del MHC (Bartholomew, et al., Exp. Hematol., vol. 30, pag. 42 (2002); Devine et al., Cancer J., vol. 7, pag. 576 (2001); DiNicola, et al., Blood, vol. 99, pag. 3838 (2002)). Estas propiedades inmunologicas de las MSC pueden mejorar su injerto por trasplante y limitar la capacidad del sistema inmune receptor para reconocer y rechazar las celulas alogenicas despues del trasplante. La produccion de factores por las MSC, que modulan la respuesta inmune y respaldan la hematopoyesis, junto con su capacidad para diferenciarse en tipos celulares apropiados bajo estfmulos locales, las convierten en celulas madre deseables para estudios de trasplante celular (Majumdar, et al., Hematother. Stem Cell Res., vol. 9, pag. 841 (2000); Haynesworth, et al., J. Cell. Physiol., vol. 166, pag. 585 (1996).

Los solicitantes examinaron las interacciones de las celulas madre mesenquimales con poblaciones de celulas inmunes aisladas, que incluyen celulas dendnticas (DC1 y DC2), celulas T efectoras (Th1 y Th2) y celulas NK. Sobre la base de tales interacciones, los Solicitantes descubrieron que las celulas madre mesenquimales pueden regular la produccion de diversos factores que pueden regular varias etapas en el proceso de respuesta inmune. Asf, las celulas madre mesenquimales pueden emplearse en el tratamiento de heridas inflamadas.

El alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones anexas.

En general, la terapia de celulas madre mesenquimales (MSC) se basa, por ejemplo, en la siguiente secuencia: extraer el tejido que contiene MSC, aislar y expandir las MSC y administrar las MSC al ser humano, con o sin manipulacion genetica o bioqmmica.

Las celulas madre mesenquimales que se administran pueden ser una poblacion de celulas de composicion homogenea o pueden ser una poblacion de celulas mixtas enriquecida en MSC. Pueden obtenerse composiciones de celulas madre mesenquimales homogeneas mediante el cultivo de celulas del periostio o de la medula adherentes, y las composiciones de celulas madre mesenquimales pueden obtenerse mediante el cultivo de celulas del periostio o de la medula adherentes, y las celulas madre mesenquimales pueden identificarse mediante marcadores de superficie celular espedficos que se identifican con anticuerpos monoclonales unicos. Un metodo para obtener una poblacion celular enriquecida en celulas madre mesenquimales se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos num. 5.486.359. Las fuentes alternativas para las celulas madre mesenquimales incluyen, pero no se limitan a la sangre, piel, sangre del cordon umbilical, musculo, grasa, hueso y pericondrio.

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Las celulas madre mesenquimales pueden administrarse mediante una variedad de procedimientos. Las celulas madre mesenquimales pueden administrarse de manera sistemica, tal como por administracion intravenosa, intraarterial o intraperitoneal. Las celulas madre mesenquimales pueden ser de un espectro de fuentes que incluyen autologas, alogenicas o xenogenicas.

La presente invencion proporciona celulas madre mesenquimales para usar en un metodo para promover la curacion de heridas inflamadas en un ser humano. El metodo comprende administrar a las celulas madre mesenquimales humanas en una cantidad eficaz para promover la cicatrizacion de las heridas en el ser humano.

Aunque el alcance de la presente invencion no debe limitarse a ningun razonamiento teorico, se cree que las celulas madre mesenquimales causan que las celulas Treg y las celulas dendnticas liberen interleucina 10 (lL-10). La IL-10 limita o controla la inflamacion en una herida, y promueve asf la cicatrizacion de una herida.

Ademas, las celulas madre mesenquimales pueden promover la cicatrizacion de heridas y la curacion de fracturas al inducir factores de secrecion por otros tipos de celulas. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales pueden inducir la liberacion mediada por la prostaglandina E2 (PGE2) del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) por las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), asf como la liberacion mediada por PGE2 de la hormona de crecimiento, insulina, factor de crecimiento 1 similar a la insulina (IGF-1), protema-3 de union al factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP-3) y endotelina-1.

Las celulas madre mesenquimales se administran al ser humano en una cantidad eficaz para promover la curacion de heridas en el ser humano. En general, las celulas madre mesenquimales se administran en una cantidad de aproximadamente 1x105 celulas/kg a aproximadamente 1x107 celulas/kg, preferentemente, de aproximadamente 1x106 celulas/kg a aproximadamente 5x106 celulas/kg. La cantidad exacta de celulas madre mesenquimales a administrar depende de una variedad de factores, que incluyen la edad, el peso y el sexo del paciente, y la extension y severidad de la herida que a tratar.

Las celulas madre mesenquimales pueden administrarse junto con un portador farmaceutico aceptable, como se describio anteriormente en esta descripcion. Las celulas madre mesenquimales pueden administrarse de manera sistemica, como se describio anteriormente en esta descripcion. Alternativamente, las celulas madre mesenquimales pueden administrarse directamente a una herida, como en un lfquido en un aposito o reservorio que contiene las celulas madre mesenquimales.

Las celulas madre mesenquimales pueden emplearse en el tratamiento de heridas, tanto internas como externas, asf como en el tratamiento de las ulceras dermicas que se encuentran en los pies, manos, piernas o brazos, que incluyen, entre otras, las ulceras dermicas causadas por enfermedades como la diabetes y la anemia de celulas falciformes.

Las celulas madre mesenquimales pueden manipularse geneticamente con uno o mas polinucleotidos que codifican un agente terapeutico. Los polinucleotidos pueden administrarse a las celulas madre mesenquimales a traves de un vehfculo de expresion apropiado. Los vehfculos de expresion que pueden emplearse para manipular geneticamente las celulas madre mesenquimales incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores adenovirales y vectores de virus adenoasociados.

La seleccion de un polinucleotido apropiado que codifica un agente terapeutico depende de diversos factores, que incluyen la enfermedad o el trastorno que se trata, y la extension y gravedad de esta. Los polinucleotidos que codifican los agentes terapeuticos, y los vehfculos de expresion apropiados se describen adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos num. 6.355.239.

Debe entenderse que las celulas madre mesenquimales, cuando se emplean en las terapias y tratamientos mencionados anteriormente, pueden emplearse en combinacion con otros agentes terapeuticos conocidos por los expertos en la tecnica, que incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, citocinas, farmacos tales como farmacos antiinflamatorios, y celulas diferentes a las celulas madre mesenquimales, tales como celulas dendnticas, y pueden administrarse con portadores solubles para las celulas tales como el acido hialuronico, o en combinacion con matrices solidas, tales como colageno, gelatina u otros polfmeros biocompatibles, segun corresponda.

Debe entenderse que los metodos que se describen en la presente descripcion pueden llevarse a cabo de varias maneras y con diversas modificaciones y permutaciones de estos que se conocen bien en la tecnica. Puede apreciarse, ademas, que cualquier teona establecida en cuanto a los modos de accion o interacciones entre los tipos de celulas no debe interpretarse como que limita esta invencion de ninguna manera, sino que se presenta de manera tal que los metodos de la invencion puedan entenderse mas completamente.

La invencion ahora se describira con respecto a las figuras, en donde:

Fig. 1 Las MSC modulan las funciones de las celulas dendnticas. (A) Analisis por citometna de flujo de celulas DC1 monodticas maduras mediante el uso de anticuerpos contra HLA-DR y CD11c y de celulas plasmocitoides DC2 mediante el uso de anticuerpos contra HLA-DR y CD123 (receptor de IL-3). (—): control de isotipo; (-): Anticuerpos conjugados FITC/PE. (B) Las MSC inhiben la secrecion de TNF-a (eje y primario) y aumentan la secrecion IL-10 (eje y

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secundario) de celulas DC1 y DC2 activadas respectivamente. (C) Las MSC que se cultivaron con celulas DC1 maduras inhiben la secrecion de IFN-y (eje y primario) por las celulas T y aumentan los niveles de IL-4 (eje y secundario) en comparacion con las MSC o DC solas. La disminucion de la produccion de IFN-y proinflamatorio y el aumento de la produccion de IL-4 antiinflamatoria en presencia de MSC indicaron un cambio en la poblacion de celulas T hacia un fenotipo antiinflamatorio.

Fig. 2 Las MSC inhiben la funcion de las celulas T efectoras proinflamatorias. (A) Analisis por citometna de flujo del numero de celulas TReg (en %) mediante la tincion de las PBMC o la fraccion no adherente en el cultivo de MSC PBMC (MSC PBMC) con anticuerpos CD4 conjugados con FITC (eje x) y CD25 conjugados con PE (eje Y). Las regiones se establecieron en base a los anticuerpos de control de isotipo como fondo. Los graficos son representativos de 5 experimentos independientes. (B) Las celulas Th1 que se generaron en presencia de MSC secretaron niveles reducidos de IFN-y (eje Y primario) y las celulas Th2 que se generaron en presencia de MSC secretaron cantidades mayores de IL-4 (eje y secundario) en los sobrenadantes del cultivo celular. (C) Las MSC inhiben la secrecion de IFN-y por las celulas NK purificadas que se cultivaron durante 0, 24 o 48 horas en una placa de 24 pocillos. Los datos que se muestran son la media ± SD de la secrecion de citocinas en un experimento y son representativos de 3 experimentos independientes.

Fig. 3 Las MSC conducen a un mayor numero de poblaciones de celulas TReg y una mayor expresion de GITR. (A) Se aislo una poblacion de celulas TReg CD4+ CD25+ a partir de cultivos de PBMC o MSC + PBMC (relacion MSC a PBMC 1:10) (que se cultivaron sin estimulacion adicional durante 3 dfas) mediante el uso de un procedimiento de aislamiento magnetico de 2 etapas. Estas celulas se irradiaron (para bloquear cualquier proliferacion adicional) y se usaron como estimuladoras en una reaccion de linfocitos mixtos (MLR), donde los respondedores fueron PBMC alogenicas (relacion estimuladoras a respondedores 1:100) en presencia de fitohemaglutinina (PHA) (2,5 mg/ml). Las celulas se cultivaron durante 48 horas, despues de lo cual se anadio timidina 3H, y se conto la radiactividad incorporada despues de 24 horas. Los resultados mostraron que la poblacion TReg, que se genero en presencia de MSC (lmea 3), era funcionalmente similar a las celulas TReg que se generaron en ausencia de MSC (lmea 2). (B) Se cultivaron PBMC durante 3 dfas en ausencia (grafico superior) o presencia (grafico inferior) de MSC (relacion MSC a PBMC 1:10), despues de lo cual se recolecto la fraccion no adherente y se inmunotino con GITR marcado con FITC y CD4 marcado con PE. Los resultados muestran un aumento mayor del doble en la expresion de GITR en las celulas que se cultivaron en presencia de MSC.

Fig. 4 Las MSC producen PGE2 y el bloqueo de PGE2 invierte los efectos inmunomoduladores mediados por las MSC. (A) Secrecion de PGE2 (media ± SD) en sobrenadantes de cultivo que se obtuvieron a partir de MSC que se cultivaron en presencia o ausencia de bloqueadores de PGE2 NS-398 o indometacina (Indometh.) a diversas concentraciones. Las concentraciones del inhibidor estan en |jM y los datos que se presentan son valores que se obtuvieron despues de 24 horas de cultivo (B) Expresion de COX-1 y COX-2 en MsC y PBMC mediante el uso de RT-PCR en tiempo real. Las MSC expresaron niveles significativamente mas altos de COX-2 en comparacion con las PBMC, y cuando se cultivaron las MSC en presencia de las PBMC, hubo un aumento >3 veces en la expresion de COX-2 en las MSC. Se muestran los datos representativos de 1 de 3 experimentos independientes. Los cultivos MSC + PBMC se configuraron en una placa de camara de transpocillo donde se colocaron las MSC en la camara inferior y las PBMC en la camara superior. (C) La presencia de los bloqueadores de PGE2 indometacina (Ind.) o NS-398 aumenta la secrecion de TNF-a de las DC activadas (□) y la secrecion de IFN-y de las celulas Th1 (□) en comparacion con los controles. Los datos se calcularon como % de cambio de los cultivos que se generaron en ausencia de MSC e inhibidores de PGE2 (D) La presencia de los bloqueadores de PGE2 indometacina (Indo) y NS-398 durante el cocultivo MSC+PBMC (1:10) invierte los efectos antiproliferativos mediados por las MSC sobre las PBMC que se trataron con PHA. Los datos que se muestran son de un experimento y son representativos de 3 experimentos independientes.

Fig. 5 La secrecion de citocinas de MSC constitutiva se eleva en presencia de PBMC alogenicas. Mediante el uso de MSC humanas que se caracterizaron previamente, se analizaron los niveles de las citocinas IL-6 y VEGF, mediador lipfdico PGE2 y metaloproteinasa de matriz 1 (pro MMP-1) en el sobrenadante del cultivo de MSC que se cultivaron durante 24 horas en presencia (barras rayadas) o ausencia (barras abiertas) de PBMC (relacion MSC a PBMC 1:10). Las MSC produjeron constitutivamente IL-6, VEGF y PGE2, y los niveles de estos factores aumentaron con el cocultivo con PBMC, lo que sugiere que las MSC pueden desempenar una funcion en la modulacion de las funciones inmunes en un entorno inflamatorio.

Fig. 6 Las MSC inhiben la proliferacion de las celulas T inducida por mitogenos de una manera dependiente de la dosis. Se incubaron cantidades crecientes de PBMC alogenicas con numeros constantes de MSC (2.000 celulas/pocillo) en una placa de 96 pocillos en presencia o ausencia de PHA (2,5 mg/ml) durante 72 horas, y se determino la incorporacion de timidina 3H (en recuentos por minuto o cpm). Hubo una inhibicion dependiente de la dosis de la proliferacion de las PBMC que se trataron con PHA en presencia de MSC. Se muestran los resultados representativos de 1 de 3 experimentos independientes. Resultados similares se informaron por LeBlanc, et al., Scand J. Immunol., vol. 57, pag. 11 (2003).

Fig. 7 Diagrama esquematico del mecanismo de accion de las MSC propuesto. Las MSC median sus efectos inmunomoduladores al afectar a las celulas tanto del sistema inmune innato (vfas 2-4 de las DC y via 6 de las NK) como adaptativo (vfas 1 y 5 de las celulas T y via 7 de las celulas B). En respuesta a un patogeno invasor, las DC inmaduras

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migran al sitio de entrada potencial, maduran y adquieren la capacidad de cebar las celulas T vfrgenes (por medio de senales espedficas coestimuladoras y espedficas del antigeno) para convertirse en celulas T efectoras de proteccion (inmunidad Th1 mediada por celulas u Th2 humoral). Durante la interaccion MSC-DC, las MSC, por medio del contacto directo celula a celula o por medio del factor secretado, pueden alterar el resultado de la respuesta inmune al limitar la capacidad de las DC para inducir una respuesta mediada por celulas (via 2) o al promover la capacidad para inducir una respuesta humoral (via 4). Ademas, cuando las celulas T efectoras maduras estan presentes, las MSC pueden interactuar con ellas para desviar el equilibrio de las respuestas Th1 (via 1) hacia las respuestas Th2 (via 5), y probablemente hacia un aumento de la actividad de las celulas B que producen IgE (via 7), resultados deseables para la supresion de la GvHD y de los smtomas de enfermedades autoinmunes. Las MSC en su capacidad para dar como resultado una mayor generacion de la poblacion de TReg (via 3) pueden dar como resultado un fenotipo tolerante y pueden ayudar a un huesped receptor al amortiguar la inflamacion inespedfica en su microambiente local. La lmea discontinua (—) representa el mecanismo propuesto.

La invencion se describira ahora con respecto a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe entenderse que el alcance de la presente invencion no se limita por ello.

Ejemplo 1

Materiales y Metodos Cultivo de MSC humanas

Las MSC humanas se cultivaron como se describe por Pittenger et al., Science, vol. 284, pag. 143 (1999). Brevemente, se recolectaron muestras de medula osea de la cresta ilfaca de donantes anonimos tras el consentimiento informado por Poietics Technologies, Div de Cambrex Biosciences. Las MSC se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco bajo en glucosa (Life Technologies, Carlsbad, California) que contema un 1 % de solucion antibiotica antimicotica (Invitrogen, Carlsbad, California) y suero bovino fetal al 10 % (FBS, JRH BioSciences, Lenexa, Kansas). Las MSC crecieron como una monocapa adherente y se separaron con tripsina/EDTA (tripsina al 0,05 % a 37 °C durante 3 minutos). Todas las MSC que se usaron se caracterizaron previamente en cuanto a su potencial multilinaje y retuvieron la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimales (condrodtico, adipogenico y osteogenico) (Pittenger, et al., Science, vol. 284, pag. 143 (1999)).

Aislamiento de celulas dendnticas

Se obtuvieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de Poietics Technologies, Div de Cambrex Biosciences (Walkersville, MD). Los precursores de celulas dendnticas (DC) de linaje monodtico (CD1c+) se seleccionaron positivamente a partir de PBMC mediante el uso de un metodo de separacion magnetica de 2 etapas de conformidad con Dzionek, et al., J. Immunol., vol. 165, pag. 6037 (2000). Brevemente, las celulas B que expresan CD1c se separaron magneticamente de las celulas CD19 mediante el uso de perlas magneticas, seguido por el marcado de la fraccion separada de celulas B con anticuerpos CD1c (BDCA1+) marcados con biotina y anticuerpos antibiotina y se separaron de la fraccion celular no marcada mediante el uso de columnas magneticas de conformidad con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Auburn, California). Los precursores de las DC de linaje plasmocitoide se aislaron a partir de PBMC mediante separacion inmunomagnetica de las celulas recubiertas con anticuerpo marcadas positivamente (BDCA2+) (Miltenyi Biotech, Auburn, California).

Cultivo de MSC-DC

En la mayona de los experimentos, se cultivaron MSC y DC humanas en igual numero durante varios penodos de tiempo, y el sobrenadante del cultivo celular se recolecto y almaceno a -80 °C hasta una evaluacion adicional. En experimentos seleccionados, las MSC se cultivaron con celulas maduras DC1 o DC2 (relacion MSC:DC 1:1) durante 3 dfas, y despues los cultivos combinados (MSC y DC) se irradiaron para evitar cualquier proliferacion. A continuacion, se adicionaron celulas T alogenicas (CD4+, CD45RA+) purificadas por anticuerpos, vfrgenes a las MSC/DC irradiadas y se cultivaron durante 6 dfas adicionales. La fraccion celular no adherente (celulas T purificadas) se recolecto de los cultivos, se lavo dos veces y se reestimulo con PHA durante otras 24 horas, despues de lo cual se recolectaron los sobrenadantes del cultivo celular y se analizaron en cuanto a la secrecion de IFN-y e IL-4 por ELISA.

Aislamiento de celulas NK

Se obtuvieron poblaciones purificadas de celulas NK mediante la separacion de celulas no NK que se marcaron magneticamente con un coctel de anticuerpos monoclonales conjugados con biotina (anticuerpos anti-CD3, -CD14, - CD19, -CD36 y anti-IgE) como reactivo primario y anticuerpos monoclonales antibiotina conjugados a microperlas como reactivo de marcaje secundario. Las celulas no NK marcadas magneticamente se retuvieron en las columnas MACS (Miltenyi Biotech, Auburn, California) en un campo magnetico, mientras que las celulas NK pasaron y se recolectaron.

Aislamiento de la poblacion de celulas TReg

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La poblacion de celulas TReg se aislo mediante el uso de un procedimiento de aislamiento de 2 etapas. Primero las celulas T no CD4+ se marcaron de manera indirecta magneticamente con un coctel de anticuerpos marcados con biotina y microperlas antibiotina. Las celulas marcadas se separaron despues por separacion en una columna MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, California). A continuacion, las celulas CD4+ CD25+ se marcaron directamente con microperlas CD25 y se aislaron por seleccion positiva a partir de las CD4+ preenriquecidas. Fraccion de celulas T. Las celulas T CD4+ CD25+ marcadas magneticamente se retuvieron en la columna y se eluyeron despues de separar la columna del campo magnetico.

Con el fin de determinar si el aumento de la poblacion de CD4+ CD25+ que se genero en presencia de las MSC era de naturaleza supresora, las poblaciones de celulas TReg CD4+ CD25+ se aislaron partir de cultivos de PBMC o MSC PBMC (relacion MSC a PBMC 1:10) (cultivados sin ninguna estimulacion adicional durante 3 dfas) mediante el uso de un procedimiento de aislamiento magnetico de 2 etapas. Estas celulas se irradiaron para bloquear cualquier proliferacion adicional y se usaron como estimuladoras en una reaccion de linfocitos mixtos (MLR), en la que los respondedores eran PBMC alogenicas (relacion estimulador a respondedor 1:100) en presencia de PHA (2,5 pg/ml). El cultivo se llevo a cabo durante 48 horas, despues de lo cual se anadio timidina 3H. La radioactividad incorporada se conto despues de 24 horas.

Se cultivaron las PBMC en ausencia o presencia de MSC (relacion MSC a PBMC 1:10), despues de lo cual se recolecto la fraccion no adherente y se inmunotino con el receptor de TNF inducido por glucocorticoide marcado con FITC, o GITR, y CD4 marcado con PE.

Generacion de celulas Th1/Th2

Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) se sembraron a 2x106 celulas/ml durante 45 min a 37 °C para eliminar los monocitos. La fraccion no adherente se incubo en presencia de anticuerpos anti-CD3 (5 pg/ml) y anti-CD28 (1 mg/ml) unidos a la placa bajo condiciones Th1 (IL-2 (4 ng/ml) IL-12 (5 ng/ml) + anti IL-4 (1 pg/ml)) o Th2 (IL-2 (4 ng/ml) + IL-4 (4 ng/ml) + anti-IFN-Y (1 pg/ml)) durante 3 dfas en presencia o ausencia de MSC. Las celulas se lavaron y despues se reestimularon con PHA (2,5 pg/ml) durante otras 24 o 48 horas, despues de lo cual se midieron los niveles de IFN-y e IL-4 en los sobrenadantes del cultivo por ELISA (RD Systems, Minneapolis, Minnesota).

Analisis de los niveles de VEGF, PGE2 y pro-MMP-1 en el sobrenadante del cultivo de MSC.

Mediante el uso de MSC humanas que se caracterizaron previamente, se analizaron los niveles de interleucina-6 (IL-6), VEGF, prostaglandina mediadora de lfpidos E2 (PGE2) y metaloproteinasa de la matriz 1 (pro-MMP-1) en el sobrenadante del cultivo de MSC que se cultivaron durante 24 horas en presencia o ausencia de PBMc (relacion MSC a PBMC 1:10).

Proliferacion de PBMC

Las PBMC purificadas se prepararon mediante la centrifugacion del paquete leucocitario (Cambrex, Walkersville, Maryland) en Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Oslo, Noruega). Las celulas separadas se cultivaron (por triplicado) en presencia o ausencia de MSC (sembradas 3-4 horas antes de la adicion de PBMC para permitir su sedimentacion) durante 48 horas en presencia del mitogeno PHA (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri). En experimentos seleccionados, las PBMC se resuspendieron en medio que contema los inhibidores de PGE2 Indometacina (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) o nS-938 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan). Se anadio (3H)-timidina (20 pl en un cultivo de 200 pl) y las celulas se recolectaron despues de un cultivo adicional durante 24 h mediante el uso de un recolector automatico. Los efectos de las MSC o de los bloqueadores de PGE2 se calcularon como el porcentaje de la respuesta de control (100 %) en presencia de PHA.

RT-PCR cuantitativa

El RNA total de los sedimentos celulares se preparo mediante el uso de un estuche disponible en el mercado (Qiagen, Valencia, California) y de conformidad con las instrucciones del fabricante. El DNA genomico contaminante se elimino con el estuche libre de ADN (Ambion, Austin, Texas). La RT-PCR cuantitativa se realizo en un sistema de deteccion MJ Research Opticon (South San Francisco, California) con el estuche QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, Valencia, California) con iniciadores a una concentracion de 0,5 pM. Los cambios relativos en los niveles de expresion en las celulas cultivadas en diferentes condiciones se calcularon mediante la diferencia en los valores de Ct (punto de cruce) mediante el uso de p-actina como control interno. La secuencia para los iniciadores espedficos de COX-1 y COX-2 fueron: COX-1: 5'-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3' (hacia delante), 5'-CTA GAC AGC CAG ATG CTG ACA G- 3' (inverso); COX - 2: 5'- ATC TAC CCT CCT CAA GTC CC-3' (adelante), 5'-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3' (inverso).

Se incubaron cantidades crecientes de PBMC alogenicas con numeros constantes de MSC (2.000 celulas/pocillo) en una placa de 96 pocillos en presencia de PHA (2,5 pg/ml) durante 72 horas, y se determino la incorporacion de timidina 3H (conteos por minuto, cpm). Las PBMC y las MSC se cultivaron en relaciones de MSC:PBMC de 1:1, 1:3, 1:10, 1:30 y 1:81.

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Resultados

En los estudios presentes, se examino la interaccion de las MSC humanas con poblaciones de celulas inmunes aisladas, que incluyen celulas dendnticas (DC1 y DC2), celulas T efectoras (Th1 y Th2) y celulas NK. La interaccion de las MSC con cada tipo de celula inmune tuvo consecuencias espedficas, lo que sugiere que las MSC pueden modular varias etapas en el proceso de la respuesta inmune. La produccion de factor(es) secretado(s) que modula y puede ser responsable de los efectos inmunomoduladores de las mSc se evaluo y se implico la smtesis de prostaglandinas.

Las celulas dendnticas precursoras mieloides (DC1) y plasmocitoides (DC2) se aislaron mediante separacion inmunomagnetica de las celulas BDCA1 + y BDCA2+ respectivamente y se maduraron mediante incubacion con GM-CSF e IL-4 (1x103 lU/ml y 1x103 lU/ml, respectivamente) para las celulas DC1, o IL-3 (10 ng/ml) para las celulas DC2. Mediante el uso de la citometna de flujo, las celulas DC1 fueron HLA-DR+ y CD11c+, mientras que las celulas DC2 fueron HLA-DR+ y CD123+ (Fig. 1A). En presencia del agente inflamatorio lipopolisacarido bacteriano (LPS, 1 ng/ml), las celulas DC1 produjeron niveles moderados de TNF-a pero cuando estaban presentes las MSC (relaciones examinadas 1:1 y 1:10), hubo una reduccion de > 50 % en la secrecion de TNF-a (Fig. 1B). Por otro lado, las celulas DC2 produjeron IL-10 en presencia de LPS y sus niveles aumentaron mas de 2 veces con el cocultivo MSC:DC2 (1:1) (Fig. 1B). Por lo tanto, las MSC modificaron el perfil de citocinas de las DC activadas en cultivo hacia un fenotipo mas tolerogenico. Adicionalmente, las DC activadas, cuando se cultivaron con MSC, fueron capaces de reducir los niveles de IFN-y y aumentar los de IL-4 secretados por las celulas T CD4+ vfrgenes (Fig. 1C) lo que sugiere un cambio mediado por las MSC del fenotipo de las celulas T de proinflamatorias a antiinflamatorias.

Como el aumento de la secrecion de IL-10 desempena una funcion en la generacion de celulas reguladoras (Kingsley, et al., J. Immunol., vol. 168, pag. 1080 (2002)), las celulas reguladoras T (TReg) se cuantificaron mediante citometna de flujo en cocultivos de PBMC y MSC. Despues del cultivo de las PBMC con las MSC durante 3-5 dfas, hubo un aumento en el numero de celulas TReg segun se determino por la tincion de las PBMC con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD25 (Fig. 2A), lo que apoya adicionalmente una respuesta tolerogenica inducida por las MSC. La poblacion de celulas TReg CD4+ CD25+, que se genero en presencia de MSC expreso niveles aumentados del receptor de TNF inducido por glucocorticoides (GITR), un receptor de superficie celular expresado en poblaciones de celulas TReg, y fue de naturaleza supresora al suprimir la proliferacion de celulas T alogenicas (Fig. 3A, B). A continuacion, se investigaron las MSC en cuanto a su capacidad directa para afectar la diferenciacion de celulas T. Mediante el uso de celulas T purificadas seleccionadas por anticuerpos (celulas Th CD4+), se generaron celulas Th1 productoras de IFN-y y Th2 productoras de IL-4 en presencia o ausencia de MSC. Cuando las MSC estuvieron presentes durante la diferenciacion, hubo una disminucion de la secrecion de IFN-y por las celulas Th1 y un aumento de la secrecion de IL-4 por las celulas Th2 (Fig. 2B). No se observaron cambios significativos en los niveles de IFN-y o IL-4 cuando se agregaron MSC al cultivo despues de que las celulas Th se diferenciaron (a los 3 dfas) en los tipos Th1 o Th2 efectores (datos no mostrados). Estos experimentos sugieren que las MSC pueden afectar directamente la diferenciacion de las celulas T efectoras y alterar la secrecion de citocinas por las celulas T hacia un fenotipo humoral.

Similarmente, cuando se cultivaron las MSC con celulas NK purificadas (CD3-, CD14-, CD19-, CD36-) en una relacion 1:1 durante diferentes penodos de tiempo (0-48 h), hubo una disminucion de la secrecion de IFN-y en el sobrenadante del cultivo (Fig. 2C), lo que sugiere que las MSC pueden modular, ademas, las funciones de las celulas NK.

El trabajo anterior indico que las MSC modifican las funciones de las celulas T por factor(es) soluble(s) (LeBlanc, et al., Exp. Hematol., vol. 31, pag. 890 (2003); Tse, et al., Transplantation, vol. 75, pag. 389 (2003). Se observo que las MSC secretaron varios factores, que incluyen IL-6, prostaglandina E2, VEGF y proMMP-1 constitutivamente, y los niveles de cada uno aumentaron tras el cultivo con PBMC (Fig. 5). Con el fin de investigar los factores derivados de las MSC que conducen a la inhibicion de TNF-a y al aumento de la produccion de IL-10 por las DC, se investigo la posible funcion de la prostaglandina E2, ya que se demostro que inhibe la produccion de TNF-a por las DC activas (Vassiliou, et al., Cell. Immunol., vol. 223, pagina 120 (2003)). Los medios acondicionados del cultivo de las MSC (cultivo de 24 horas de 0,5 x 106 celulas/ml) conteman aprox. 1000 pg/ml de PGE2 (Fig. 4A). No hubo presencia detectable de inductores conocidos de la secrecion de PGE2, p. ej., TNF-a, IFN-y o IL-1p (datos no mostrados) en el sobrenadante del cultivo lo que indica una secrecion constitutiva de PGE2 por las MSC. La secrecion de PGE2 por las hMSCs se inhibio al 60-90 % en presencia de los inhibidores conocidos de la produccion de PGE2, NS-398 (5 pM) e indometacina (4 pM) (Fig. 4A). Como la liberacion de la secrecion de PGE2 se produce como resultado de la actividad enzimatica de la enzima ciclooxigenasa 1 constitutivamente activa (COX-1) y de la enzima ciclooxigenasa 2 inducible (COX-2) (Harris, et al., Trends Immunol., vol. 23, pag. 144 (2002)) se analizo la expresion de mRNA para COX-1 y cOx-2 en MsC y PBMC mediante el uso del sistema de cultivo por transpocillo. Las MSC expresaron niveles significativamente mas altos de COX-2 en comparacion con las PBMC y los niveles de expresion aumentaron mas de 3 veces despues del cocultivo de MSC y PBMC (relacion MSC a PBMC 1:10) durante 24 horas (Fig. 4B). Se observaron cambios modestos en los niveles de COX-1, lo que sugiere que el aumento de la secrecion de PGE2 tras el cocultivo MSC-PBMC (Fig. 5) esta mediado por la regulacion positiva de COX-2. Para investigar si los efectos inmunomoduladores de las MSC en las DC y celulas T estuvieron mediados por la PGE2, se cultivaron MSC con celulas dendnticas activadas (DC1) o celulas Th1 en presencia de los inhibidores de PGE2 NS-398 o indometacina. La presencia de NS-398 o indometacina aumento la secrecion de TNF-a por las DC1 y la secrecion de IFN-y por las celulas Th1 (Fig. 4C), respectivamente, lo que sugiere que los efectos de las MSC en los tipos de celulas inmunes pueden estar mediados por la PGE2 secretada. Estudios

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recientes demostraron que las MSC inhiben la proliferacion de celulas T inducida por diversos estimulos (DeNicola, et al., Blood, vol. 99, pag. 3838 (2002); LeBlanc, et al., Scand. J. Immunol., vol. 57, pag. 11 (2003)). Se observo que las MSC inhiben la proliferacion de celulas T inducida por mitogenos de una manera dependiente de la dosis (Fig. 6) y cuando los inhibidores de PGE2 NS-398 (5 pM) o indometacina (4 pM) estuvieron presentes, hubo un aumento de >70 5 % en la incorporacion de timidina (3H) por las PBMC que se trataron con PHA en cultivos que contienen MSC en

comparacion con los controles sin inhibidores (Fig. 4D).

En resumen, se propone un modelo de interaccion de las MSC con otros tipos de celulas inmunes (Fig. 7). Cuando las celulas T maduras estan presentes, las MSC pueden interactuar con ellas directamente e inhibir la produccion 10 proinflamatoria de IFN-y ^a 1) y promover el fenotipo regulador de las celulas T (via 3) y las celulas Th2 antiinflamatorias (via 5). Ademas, las MSC pueden alterar el resultado de la respuesta inmune de las celulas T a traves de las DC mediante la secrecion de PGE2, que inhibe las celulas DC1 proinflamatorias (via 2) y promueve las celulas DC2 antiinflamatorias (via 4) o DC reguladoras (via 3). Un cambio hacia la inmunidad Th2 a su vez, sugiere un cambio en la actividad de las celulas B hacia una mayor generacion de anticuerpos de subtipo IgE/IgG1 (via 7). Las MSC, por 15 su capacidad para inhibir la secrecion de IFN-y de las celulas NK, probablemente modifiquen la funcion celular de las NK (via 6). Este modelo de las interacciones MSC:celulas inmunes es consistente con la experimentacion que se realizo en varios otros laboratorios (LeBlanc, et al., Exp. Hematol., vol. 31, pag. 890 (2003); Tse, et al., Transplantation, vol. 75, pag. 389 (2003); DiNicola, et al., Blood, vol. 99, pag. 3838 (2002)). Se examinan mas a fondo los mecanismos propuestos y ahora son necesarios estudios en animales para examinar los efectos in vivo de la administracion de MSC.

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Claims

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Reivindicaciones

1. Celulas madre mesenquimales para usar en la promocion de la curacion de heridas inflamadas en humanos.
2. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con la reivindicacion 1, en donde la herida es interna o externa.
3. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con la reivindicacion 1, en donde la herida es una ulcera dermica.
4. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con la reivindicacion 3, en donde la ulcera dermica tiene como causa la diabetes o anemia de celulas falciformes.
5. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con las reivindicaciones 1 o 3, las cuales deben administrarse directamente a la herida.
6. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con las reivindicaciones 1 o 3, las cuales deben administrarse como una suspension de celulas en un medio lfquido farmaceuticamente aceptable o en un aposito o reservorio.
7. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las celulas madre mesenquimales son alogenicas.
8. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las celulas madre mesenquimales son autologas.
9. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las celulas madre mesenquimales se recolectan a partir de un tejido que contiene celulas madre mesenquimales, se afslan, y se expanden en cultivo.
10. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con la reivindicacion 9, en donde el tejido que contiene celulas madre mesenquimales es sangre, piel, sangre del cordon umbilical, musculo, grasa, pericondrio, medula osea o periostio.
11. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las celulas madre mesenquimales no se manipulan geneticamente.
12. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, las cuales deben administrarse en combinacion con un agente terapeutico.
13. Las celulas madre mesenquimales para usar de conformidad con la reivindicacion 12, en donde el agente terapeutico es un farmaco antiinflamatorio.