JP4740452B2 - 移植で免疫応答の予防と処置のための間葉幹細胞を利用する方法、組成物およびその使用法 - Google Patents

Description

【０００１】
【技術分野】
この出願は１９９８年３月１８日に受理された合衆国暫定特許出願番号第６０／０７８，４６３号および１９９８年６月１９日に受理された合衆国暫定特許出願番号第６０／０８９，９６４号の請求優先権に基づく。
【０００２】
この発明は同種異系抗原に対するＴ細胞応答を阻害することに関し、更に前もって活性化されたＴ細胞の再活性化を阻害しおよびもしくは予防することに関する。より詳細には、この発明は外部組織およびもしくは細胞およびもしくは器官に対し免疫エフェクター細胞により起こされる免疫応答を予防し、減少しあるいは処置することに関する。この発明はまた移植片拒絶およびもしくは対宿主性移植片反応を予防し、減少しあるいは処置することに関する。
【０００３】
（発明の背景技術）
寛容は免疫応答が通常起こす抗原に対する特異的応答の後天性欠如である。典型的には、寛容を誘導するためには寛容化抗原に対する露出がなければならず、それはある種のリンパ球の死滅あるいは機能不活性を来たす。完全な寛容は二次抗原攻撃に対する抗体あるいは細胞媒介での検出可能免疫応答の欠如により特徴付けられる。部分寛容は免疫応答の量的減少により類型化される。
【０００４】
免疫機構の機能は病原体を含む外部物体を排除し、また自己抗原に対する不応答あるいは寛容を維持することである。Ｔ細胞寛容は、１）自己ペプチドに応答する胸腺細胞がクローン欠失により除去される胸腺で（中心寛容）、また２）免疫寛容状態で自己抗原に露出される末梢で（末梢寛容）実現される。クローン欠失はまた抗原提示細胞に対する細胞死分子の発現から生じることもできる。死亡分子の古典的な例はＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）とＴＲＡＩＬリガンドであり、それらはその受容者であるＦａｓとＤＲ４それぞれを活性化Ｔ細胞に連結し、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する。ＴＮＦＲスーパーファミリーの一員であるＣＤ２７の相互作用およびＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）もＴ細胞アポトーシスを誘導する。
【０００５】
不幸なことに、免疫機構は移植組織などの有益な侵入者を有害なものから区別せず、従って免疫機構は移植組織あるいは器官を拒絶する。移植器官の拒絶は供与者同種異系抗原あるいは異種抗原を認識する宿主に存在する同種異系応答性Ｔ細胞により著しく仲介される。
【０００６】
現在移植片に対する免疫応答を予防しあるいは減少するために、患者は強力な免疫抑制剤で処置される。Ｔ細胞免疫応答を予防あるいは減少する薬剤の個体への注入は移植片拒絶を阻害するが、一般的な免疫抑制、毒性だけでなく、日和見感染に起因する死亡さえも起こしかねない。毒性および供与者組織拒絶の従来の処置に対する不完全な応答のため、現在の薬剤療法の方式に抵抗できないかあるいは応答しない患者を処置するための代替的アプローチが必要とされる。
【０００７】
従って、供与者組織の宿主拒絶を避ける方法として免疫エフェクター細胞により移植片に対して宿主による望ましくない免疫応答の予防およびもしくは減少の必要が存在する。更に有利であるのは、対宿主性移植片病として知られる受容者組織に対し供与者組織による望ましくない免疫応答を排除あるいは減少する方法であろう。
【０００８】
（発明の概要）
ヒト間葉幹細胞は免疫機構による応答を改良し、抗原に対する免疫応答が減少あるいは排除されるように移植に使用することができることが発見された。
【０００９】
この発明の一つの見地に従って、同種異系抗原、とりわけ同種異系組織、器官、あるいは細胞に応答するＴ細胞により起きる免疫応答を減少あるいは抑制する方法が提供され、ここで免疫応答は間葉幹細胞の使用により減少あるいは抑制される。間葉幹細胞は（同一宿主から得られた）Ｔ細胞に対して自己由来のものでもよくまたＴ細胞に同種異系のものであってもよい。Ｔ細胞に同種異系である間葉幹細胞の場合には、間葉幹細胞は（同一宿主から得られた）Ｔ細胞が応答する細胞あるいは組織に対して自己由来であるか、あるいは間葉幹細胞がＴ細胞の源およびＴ細胞が応答する細胞あるいは組織の源の両方に同種異系である宿主から得られたものである。
【００１０】
この発明のも一つの見地に従って、外部抗原に対するＴ細胞応答を予防およびもしくは減少するのに有効な量で活性化Ｔ細胞を間葉幹細胞に接触させることにより、（同種異系抗原、とりわけ同種異系器官、組織あるいは細胞に対し活性化された）活性化Ｔ細胞の再刺激を予防するプロセスが提供される。使用される間葉幹細胞はＴ細胞に自己由来のものであり、およびもしくはＴ細胞に同種異系のものである。同種異系間葉幹細胞を使用する時には、間葉幹細胞はＴ細胞を活性化した組織あるいは細胞と同じ宿主から得られ、あるいはＴ細胞とＴ細胞を活性化した細胞あるいは組織を提供した宿主、の両方に同種異系である宿主から得ることができる。
【００１１】
この発明のも一つの見地に従って、間葉幹細胞は移植片に対する免疫応答を抑制あるいは改善するための有効量で間葉幹細胞を移植片受容者に投与することにより、移植片（組織、器官、細胞等）に対する免疫応答を抑制あるいは改善するために使用される。間葉幹細胞は移植片受容者に自己由来であり、または移植片受容者に同種異系である。
【００１２】
従って、この発明の一つの方法は供与者組織の受容者の間葉幹細胞への接触を提供する。この見地の一つの実施例で、この方法は間葉幹細胞の供与者組織への受容者への投与を伴う。間葉幹細胞は受容者に移植の前あるいは移植と同時もしくは移植に続いて投与することができる。間葉幹細胞は受容者に自己由来であり、あるいは同種異系でありまた供与者から得ることができる。この発明のも一つの見地において、同種異系間葉幹細胞は更に供与者以外の源から得ることができ、このような源は供与者の型あるいは受容者の型のいずれかに適合する必要はない。
【００１３】
更にこの方法のも一つの実施例において、移植手順の部分として間葉幹細胞は細胞死を誘導する分子を発現するために修飾される。間葉幹細胞は分子の受容者を運ぶ活性化Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する分子を免疫機構に送達するように使用することができる。これは活性化Ｔリンパ球の欠失と移植片に対する望ましくない免疫応答の抑制をもたらす。この発明の見地に従って、同種異系ヒト間葉幹細胞は細胞死分子を発現するように修飾される。分子は間葉幹細胞に対し外因性あるいは内因性であることができる。ここに記載された方法の望ましい実施例において、間葉幹細胞は細胞死分子ＦａｓリガンドあるいはＴＲＡＩＬリガンドを発現する。
【００１４】
間葉幹細胞は更に移植片の部分として投与することができる。この目的のために、この発明は器官もしくは組織の供与者から得られる間葉幹細胞あるいは第三者からの間葉幹細胞もしくはＴ細胞に自己由来の間葉幹細胞を灌流されもしくはそれらを含む供与者の組織あるいは器官を受容者に提供することにより免疫応答を減少しあるいは改善する方法を提供する。間葉幹細胞はそれが受容者に移植される時外部組織に対する受容者のＴ細胞による免疫応答を改善する。
【００１５】
この発明の更なる実施例において、器官あるいは組織に灌流された間葉幹細胞は更に活性化Ｔ細胞死を誘導する分子を含むことができる。
【００１６】
も一つの実施例において、この発明の方法は供与者組織が受容者に移植された後に供与者組織の受容者に間葉幹細胞を投与することにより、移植片に対する拒絶エピソードの発病度を減少しあるいはそれを排除するために、移植片を受けた患者の処置を提供する。間葉幹細胞は受容者に自己由来あるいは同種異系であることができる。同種異系間葉幹細胞は供与者もしくは第三者源から得ることができる。移植片に対する逆免疫応答を受ける受容者への間葉幹細胞の提示は更なる抗原刺激に対するＴ細胞の不応答性を誘導し、これにより供与者組織あるいは器官に対する活性化Ｔ細胞による逆応答を減少しあるいは排除する。
【００１７】
この発明の更なる見地において、受容者に対して供与者の組織、器官あるいは細胞による免疫応答、すなわち対宿主性移植片病を減少する方法が提供され、これは組織、器官あるいは細胞を受容者に移植する前に供与者の組織、器官あるいは細胞を生体外で同種異系（供与者に対して同種異系）間葉幹細胞で処置することよりなる。間葉幹細胞は、移植片が宿主に対して移植片の逆応答の発生無しで、あるいはその減少で受容者（宿主）の身体に導入されるように受容者抗原提示細胞に対して続いて活性化される移植片内のＴ細胞の応答性を減少し、かくして「対宿主性移植片」病は避けることができる。
【００１８】
望ましい実施例において、供与者移植片は供与者移植片にあるＴ細胞を活性化するために生体外でまず受容者に、第三者にあるいは細胞に露出される。供与者移植片は次いで供与者に自己由来あるいは同種異系の間葉幹細胞に接触させられる。間葉幹細胞は受容者あるいは第三者間葉幹細胞であり得る。間葉幹細胞は供与者移植片が続いて受容者に置かれた時に受容者による抗原刺激に対し供与者移植片でＴ細胞による逆二次免疫応答を減少あるいは阻害するであろう。
【００１９】
従って間葉幹細胞は例えば移植に先立ち受容者から得ることができる。間葉幹細胞は分離され必要とされるまで凍結して貯蔵される。間葉幹細胞は更に望ましい量で培養拡張され必要とされるまで貯蔵される。間葉幹細胞は受容者（宿主）に対し供与者移植片によりひき起こされた進行中の逆免疫応答を減少しあるいは排除するための有効量で受容者に投与される。移植片によりひき起こされた逆免疫応答を受ける受容者への間葉幹細胞の提示は進行中の応答を阻害し、Ｔ細胞の再刺激を予防しそれにより受容者の組織への活性化Ｔ細胞による逆応答を減少しあるいは排除する。
【００２０】
更なる実施例は受容者の間葉幹細胞を活性化Ｔ細胞子を誘導する分子で修飾することを含む。
【００２１】
かくしてこの発明の望ましい実施例に従って、ヒト間葉幹細胞は移植の結果としての移植片拒絶およびもしくは宿主性移植片病を処置し、あるいは移植片拒絶およびもしくは宿主性移植片病を予防しもしくは修飾するために使用される。ヒト間葉幹細胞は、更に異種移植片の使用を促進するために使用することができる。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
ここで定義されるように、同種異系間葉幹細胞は受容者と同じ種の異なった個体から得られる。供与者抗原は受容者に移植される供与者組織により発現される抗原を引用する。同種異系抗原は受容者により発現される抗原とは異なる抗原である。移植される供与者組織、器官あるいは細胞は移植片である。移植片の例には皮膚、骨髄、および固体器官例えば心臓、膵臓、腎臓、肺および肝臓が含まれる。
【００２３】
ヒト間葉幹細胞が試験管内で同種異系Ｔリンパ球と接触すると、同種異系Ｔ細胞は増殖しないことを発明者は発見した。通常異なった個体からの共存培養細胞はＴ細胞の活性化と増殖により明示され、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）として既知であるＴ細胞応答に帰着する。
【００２４】
これらの予期されなかった結果はＴ細胞が不適合間葉幹細胞には応答しないということを示すものである。同種異系Ｔ細胞によるヒト間葉幹細胞の増殖応答の欠如は予想されなかった。というのはヒト間葉幹細胞は表面分子を発現しそれに免疫原性を付与する、すなわちヒト間葉幹細胞は同種異系クラスＩ ＭＨＣ分子を発現するからであった。この発見は間葉幹細胞は免疫機構に対しては免疫原性ではない。
【００２５】
間葉幹細胞が同種異系細胞間のＭＬＲを抑制できることも発明者は発見した。間葉幹細胞は用量依存様式で混合リンパ球反応において同種異系Ｔ細胞応答を活発に減少した。加えて、異なった供与者からの間葉幹細胞はＭＨＣ型に関する応答減少の特異性を示さなかった。かくして間葉幹細胞は間葉幹細胞に対する同種異系Ｔ細胞の増殖応答を減少するために、混合リンパ球反応で標的細胞集団に適合するＭＨＣである必要はなかった。
【００２６】
従って、この発明は供与者組織、器官あるいは細胞の受容者に対して同種異系間葉幹細胞を投与することにより、免疫応答を減少し、阻害しあるいは排除する一つの方法を提供する。一つの実施例において、間葉幹細胞は受容者に投与される。選択肢として、ヒト間葉幹細胞は移植片の投与に先立ち投与することができる。例えばヒト間葉幹細胞は供与者組織の移植の約３−７日前に受容者に投与できる。
【００２７】
かくして間葉幹細胞は供与者組織の移植に先立ち、あるいはそれと同時点で、受容者のＴ細胞により移植片に対する免疫機構を減少あるいは排除するために有効量の間葉幹細胞を受容者に投与することにより、供与者あるいは外部組織に対する受容者の免疫機構を緩和するのに使用できる。間葉幹細胞はＴ細胞応答が供与者あるいは外部組織で提示された時に減少あるいは排除されるように受容者のＴ細胞に影響する。かくして移植片の宿主拒絶は避けられるし、あるいはその発病度は減少する。
【００２８】
抗原刺激に既に露出され、すなわち活性化されたＴリンパ球が間葉幹細胞に続けて露出された時、Ｔ細胞が同種異系細胞による続いて行われた抗原刺激に対する免疫応答を産生しない、あるいは減少された免疫応答を産生するということを発明者は更に発見した。かくして間葉幹細胞はＴ細胞の低応答性の状態を誘導する。
【００２９】
これらの予期しなかった結果は、活性化Ｔ細胞が既に活性化されたＴ細胞をヒト間葉幹細胞に露出することにより更なる同種異系刺激に対し不応答性に作られたことを示している。間葉幹細胞はＴ細胞に対し自己由来あるいは同種異系であることができる。
【００３０】
従ってこの発明は、免疫応答を減少あるいは抑制するのに有効量で患者に間葉幹細胞を投与することにより、移植片に対する逆免疫応答を受けるそのような患者を処置する方法を提供する。間葉幹細胞は組織供与者、移植片受容者あるいは第三者から得られる。
【００３１】
間葉幹細胞は更に活性化Ｔ細胞の排除を高めるために細胞死分子を高めるように修飾される。例えば、細胞死分子は外部細胞死分子を発現するように操作された間葉幹細胞により発現される。
【００３２】
も一つの見地において、この発明は受容者に対する供与者移植片（対宿主性移植片）による免疫応答を減少あるいは阻害もしくは排除する方法を提供する。従ってこの発明は、移植に先立ち供与者器官あるいは組織を間葉幹細胞に接触させることを提供する。間葉幹細胞は受容者に対する供与者移植片による逆応答を改善し、阻害しあるいは減少する。
【００３３】
望ましい実施例において、移植に先立ち供与者移植片は供与者移植片内のＴ細胞を活性化する同種異系（受容者）組織あるいは細胞で処置される。供与者移植片は次いで移植の前に自己由来あるいは同種異系間葉幹細胞で処置される。間葉幹細胞は続く抗原刺激に対しＴ細胞の再刺激を予防しあるいはその低応答性を誘導する。
【００３４】
供与者移植片を予備調整するために、間葉幹細胞は更に間葉幹細胞と接触した活性化Ｔ細胞が排除されるように細胞死分子を発現するように修飾される。
【００３５】
かくして骨髄（造血幹細胞）移植の関連において、移植片による宿主の攻撃を減少あるいは排除することができる。供与者骨髄は、骨髄あるいは末梢血幹細胞の受容者への移植に先立ち受容者間葉幹細胞で前処置することができる。望ましい実施例において、供与者骨髄はまず受容者組織、細胞に露出され、次いで間葉幹細胞で処置される。そこで限定されるものではないが、受容者組織あるいは細胞との最初の接触が骨髄のＴ細胞を活性化するように機能するものと考えられる。続く間葉幹細胞での処置は骨髄におけるＴ細胞の更なる活性化を阻害あるいは排除し、それにより供与者組織による逆影響を減少あるいは排除し、すなわちこの療法は対宿主性移植片応答を減少あるいは排除する。
【００３６】
更なる実施例において、対宿主性移植片病に苦しむ移植片受容者は、宿主の移植拒絶を減少しあるいは排除するための有効量で、同種異系細胞が受容者あるいは第三者の間葉幹細胞であり得る供与者に対し自己由来あるいは同種異系の受容者間葉幹細胞を投与することによりその発病度を減少しあるいは排除するように処置される。間葉幹細胞は受容者に対する免疫応答を備え付けることから供与者にある活性化Ｔ細胞を阻害しあるいは抑制し、これにより対宿主性移植片応答を減少しあるいは排除する。
【００３７】
受容者の間葉幹細胞は移植に先立ち受容者から得られ、宿主に対する進行中の移植片攻撃を処置するのに有効量で間葉幹細胞の予備を提供するために貯蔵されおよびもしくは培養拡張される。
【００３８】
更にこの発明のも一つの方法において、供与者組織は間葉幹細胞が移植に先立ち間葉幹細胞それ自身を器官移植片に組み込むように間葉幹細胞に露出される。この状況において、移植へ拒絶を予防する標準的な処置、例えば薬剤仲介免疫抑制を逃れたいずれかの同種異系反応性受容者細胞により引き起こされる移植片に対する免疫応答は、移植片に存在する間葉幹細胞により抑制されるであろう。間葉幹細胞は望ましくは受容者に対し同種異系にあり供与者間葉幹細胞あるいは供与者もしくは受容者以外から得られる間葉幹細胞である。ある場合には、受容者に自己由来である間葉幹細胞が移植に対する免疫反応を抑制するために使用される。
【００３９】
この方法の更なる実施例において、間葉幹細胞は同種異系宿主Ｔ細胞がこれらの間葉幹細胞との接触で排除されるような細胞死分子を発現するように操作される。
【００４０】
最初の免疫応答を予防しあるいは改善することに加えて、局所部位に残存する間葉幹細胞は更に将来起こり得るいずれかのＴ細胞応答も抑制するであろうと考えられる。
【００４１】
ここで使用されるように、「細胞死分子」はそのコグネイトレセプターをＴ細胞死またはアポトーシスを誘導する刺激Ｔ細胞と相互作用しあるいはそれと結合する分子である。Ｆａｓは再び刺激に露出された最近活性化されたＴ細胞のアポトーシスを媒介する（ファン・パリース他、免疫、４：３２１−３２８（１９９６年））。Ｆａｓはそのコグネイトにより架橋された時リガンドが多様な細胞にアポトーシスを誘導するタイプＩ膜レセプターである。標的細胞に対するＦａｓ分子（ＣＤ９５）および間葉幹細胞に対するそのリガンドＦａｓ Ｌの間の相互作用はレセプター凝集に帰着し、それは標的細胞のアポトーシスに導くシグナルを形質導入する。Ｆａｓ機構は胸腺細胞の負の選択、体内での免疫優先部位の維持、および細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介細胞毒性を含む数多くの生体内細胞機能を伴うものであることが示されてきた（グリーンおよびウエア、全米科学アカデミー紀要、９４（１２）：５９８６−９０（１９９７年））。
【００４２】
腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）科の他のメンバーがプログラムされた細胞死での役割を有する。レセプターＤＲ４と相互作用するＴＲＡＩＬリガンドは、各種の形質導入細胞系にアポトーシスを導入できる（Ｇ．パン他、サイエンス、２７７：８１５−８１８（１９９７年）。またＣＤ２７の発現およびそのリガンドＣＤ７０もアポトーシスを誘導する（プラサド他、全米科学アカデミー紀要、９４：６３４６−６３５１（１９９７年））。Ｆａｓの発現は刺激Ｔ細胞と免疫優先部位に限定される。ＴＲＡＩＬは多くの標準組織で検出される。
【００４３】
Ｆａｓリガンドはそうではないが、ＴＲＡＩＬリガンドとＣＤ２７は両方とも操作されていないヒト間葉幹細胞で発現できる。休止Ｔ細胞ではない活性化Ｔ細胞はＴＲＡＩＬレセプターとＣＤ７０を発現する。身体に見出される大抵のＴ細胞は休止状態にある。Ｔ細胞はそれがＭＨＣと、Ｂ７−１あるいはＢ７−２などの適切な副刺激分子の情況で遭遇した時に活性化される。
【００４４】
かくして細胞死レセプターの間葉幹細胞で発現された活性化Ｔ細胞とそのリガンドへの係合はアポトーシスＴ細胞死に帰着する。前に特異的に記載されたもの以外のリガンドとそのレセプターは間葉幹細胞内に存在するか間葉幹細胞に導入されたものであるかを問わずこの機能を実行する。従って個体に投与された間葉幹細胞は活性化Ｔ細胞を欠失させ、移植片拒絶病の発病度あるいは出現率を減少する。
【００４５】
ここに記載されたこの発明の方法に基づいて、この発明の間葉幹細胞は供与者組織拒絶あるいは対宿主性移植片病を処置する現在の方式と併用して使用することができるものと考えられる。このような使用の一つの利点は、移植片受容者における免疫応答の発病度を改善することにより、処置で使用される薬剤量および薬剤療法の投与頻度を減少することができ、一般的な免疫抑制と望ましくない副作用の軽減をもたらすことに帰着する。
【００４６】
また更にこの発明の間葉幹細胞での単一処置のみが必要であるに過ぎず、慢性的な免疫抑制薬剤療法の必要性が排除されることも考慮される。選択肢として、間葉幹細胞の多重投与が採用される。
【００４７】
従って、ここに記載された発明は、同じ種からの器官、組織あるいは細胞、もしくは異種移植器官あるいは組織移植およびもしくは対宿主性移植片病の移植拒絶の予防あるいは処置もしくは改善のための予防あるいは治療的に有効量で間葉幹細胞を投与することにより移植片拒絶の予防あるいは処置を提供する。
【００４８】
間葉幹細胞の単一用量投与はＴ細胞あるいは「非自己」組織に同種異系である組織に対するＴ細胞を減少あるいは排除するのに有効であり、とりわけＴリンパ球が間葉幹細胞から分離された後同種異系細胞に対しその非応答性格（寛容あるいはアネルギー、エネルギー欠如）を保持する場合はそうである。
【００４９】
間葉幹細胞の用量決定は広い範囲で変化し、当然のことながら各特定の場合でここの必要量に合致するものとなる。一般に非経口投与の場合には、患者の体重のキログラム当り約０．０１乃至５百万細胞を投与するのが通例である。使用される細胞数は患者の重量と状態、投与の回数と頻度、および従来の技術に習熟した人に既知の他の変数に依存する。間葉幹細胞は移植される組織、器官あるいは細胞に適したルートで投与される。それは全身に、すなわち非経口で、静脈内注射で投与でき、あるいは骨髄などのような特定の組織あるいは器官を標的とすることができる。ヒト間葉幹細胞は細胞の皮下移植を経由して、あるいは間葉幹細胞の結合組織、例えば筋への注射によって投与することができる。
【００５０】
細胞は約０．０１乃至約５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で適切な希釈剤に懸濁できる。注射液の適切な賦形剤は緩衝生理食塩水あるいは他の賦形剤などで生物学的にも生理学的にも細胞や受容者と両立できるものである。投与のための組成物は適切な無菌性と安定性を満たす標準方法に従って、処方され、産生され、貯蔵されねばならない。
【００５１】
この発明はそれだけに留まらないけれども、間葉幹細胞はここに記載された方法での使用に十分な数を得るために望ましくは骨髄から分離され、精製され、培養で、すなわち試験管内で拡張される。骨で発見された形成性多能性芽細胞である間葉幹細胞は通常非常に低い頻度で骨髄に（１：１００，０００）また他の間葉組織に存在する。キャプランとヘインズワース、合衆国特許番号第５，４８６，３５９号を参照されたい。間葉幹細胞の遺伝子形質導入はガーソン他、合衆国特許番号第５，５９１，６２５号に開示されている。
【００５２】
別に明言されていない限り、遺伝子操作はサムブルックとマニアティス分子クローニング：ラボラトリーマニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）に記載された通り実施された。
【００５３】
ここに記載された方法は、従来周知である数多くのやり方でまた各種の修飾および変更を用いて実行される。細胞型の間の行為のモードあるいは相互作用に関して設定された何れの理論もこの発明をいずれかのやり方に限定するよう解釈されてはならず、この発明の方法がより完全に理解できるように提示されるべきであることも十分に意識されるべきである。
【００５４】
以下の実施例は更にこの発明の見地を説明する。しかしそれはここに設定された教訓あるいは開示を限定するものでは決してない。
【００５５】
（実施例１）
間葉幹細胞の同種異系反応性の欠如
混合リンパ球反応は供与者表面抗原の適合性を測定し、また供与者組織の尤度の徴候である。移植拒絶を引き起こす原因となる細胞表面抗原はクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ抗原である。Ｔ細胞は外部ＭＨＣ抗原である。クラスＩとクラスＩＩ ＭＨＣ分子は混合リンパ球反応を刺激する。
【００５６】
正常ヒトボランティアがＣＯＢＥ ＳＰＥＣＴＲＡ血漿交換システム（ＣＯＢＥ、レイクウッド、コロラド）で白血球交換された。個体Ａ（Ｔ_Ａ）からの１×１０^５Ｔ細胞が、個体Ｂからのマイトマイシン処置同種異系ＰＢＭＣ_Ｓ（ｍＰＢＭＣ_Ｂ）（Ｔ細胞へのＰＢＭＣ_Ｓの増殖を防ぐため）と７日間平底マイクロタイタウエルで培養された。ｍＰＢＭＣ_ＢＳは２０Ｋと１００Ｋで播種された。培養物はＴ細胞増殖を測定するために培養の最後の１８時間^３Ｈチミジンでパルス標識された。図１で示された結果は細胞がＰＢＭＣ_Ｂを外部のものであると認識したことを示している（「Ｔ_Ａ＋ｍＰＢＭＣ_Ｂ」の下側の棒グラフを参照）。ＰＢＭＣ_Ｂがより多く存在すれば、Ｔ細胞はより増殖した。
【００５７】
ＰＢＭＣ_Ｓと同じ供与者からの２×１０^４ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ_Ｓ）が個体Ａ（Ｔ_Ａ）からの１×１０^５Ｔ細胞と共存保温された。細胞は全部で７日間平底マイクロタイタウエルで培養された。培養物はＴ細胞増殖を測定するために、培養期間の最後の１８時間^３ Ｈチミジンでパルス標識された。Ｔ細胞との共存培養の２日前、ヒト間葉幹細胞は前に与えられた数（密集）でマイクロタイタウエルに播種され、ＭＳＣ_Ｓで表面抗原発現を刺激するためにＩＦＮ−γ（５０単位／ｍｌ）で処置された。非形質導入ｈＭＳＣ_ＳあるいはヒトＢ７−１あるいはヒトＢ７−２同時刺激分子で形質導入されたｈＭＳＣ_ＳがＴ細胞と共に保温された。対照細胞はＮｅｏで形質導入された。
【００５８】
図１で示された結果（図１「Ｔ_Ａ＋形質導入ｈＭＳＣ_Ｓ」参照）は、Ｔリンパ球がヒト間葉幹細胞に非応答性であった（増殖しなかった）、すなわちそれは外部のものであると認識されなかったことを示している。
【００５９】
結果はまた、間葉幹細胞に対する応答の欠如が個体間の遺伝的適合性に起因するものではなく、何故ならＴ細胞はｈＭＳＣ供与者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ_Ｂ）を外部のものであると認識したからであることを示している。
【００６０】
（実施例２）
混合リンパ球反応の抑制
間葉幹細胞が同種異系応答を活発に抑制したかどうかを決定するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）が２個の異なった供与者から得られた付着性間葉幹細胞ありもしくは無しで組織培養平板に設定された。１個の供与者はＭＬＲの刺激細胞と適合し、他の供与者は刺激細胞あるいは応答細胞のいずれにも無関係であった。
【００６１】
個体Ａからの１０^５ＰＢＭＣ_Ｓ（ＰＢＭＣ_Ａ）は標的個体ＢのＰＢＭＣ_Ｓ（ＰＢＭＣ_Ｂ）と混合された。ＰＢＭＣ _ＢＳ はＰＢＭＣ_ＡＳによる活性化に起因する増殖を防ぐために３０００ラドＸ線照射で照射された。かくしてＰＢＭＣ_ＡＳのみが増殖することになる。ＰＢＭＣ_ＡＳとＰＢＭＣ_ＢＳが混合された時、混合リンパ球反応が生じ、ここでＰＢＭＣ_Ａ細胞（応答細胞）はＰＢＭＣ_ＢＳ（刺激細胞）上で表面抗原により活性化された。培養物は７日の間隔で保温され、最後の１８時間に^３Ｈチミジンでパルス標識された。ＰＢＭＣ_ＢＳの存在下で、ＰＢＭＣ_ＡＳは増殖し４０，０００の数に達した。図２、第１棒グラフ参照（「無し」は間葉幹細胞が存在しないことを引用する）。
【００６２】
しかしＰＢＭＣ_ＡＳとＰＢＭＣ_ＢＳが間葉幹細胞の存在の下で混合された時、混合リンパ球反応は抑制された。１０^５ＰＢＭＣ_ＡＳは１０^５ＰＢＭＣ_ＢＳとヒト間葉幹細胞の付着性単層で被覆されたマイクロタイタウエルで混合された。間葉幹細胞は７５００乃至２２，５００間葉幹細胞／ウエルの範囲の量でウエルに平板培養された。２個の間葉幹細胞集団が試験された。１個のヒト間葉幹細胞は個体Ｂから得られ、他のヒト間葉幹細胞は個体ＡからあるいはＢのＭＨＣタイプ（第三者）のいずれにも適合しない個体が得られた。培養物は７日の間隔にわたり保温され、最後の１８時間^３Ｈチミジンでパルス標識された。ヒト間葉幹細胞の存在下で、ＭＬＲは抑制された。図２を参照されたい。かくしてＭＨＣ起源の間葉幹細胞であるにも拘らず、間葉幹細胞は混合リンパ球反応を抑制した。
【００６３】
図２で示された結果は、ヒト間葉幹細胞が用量依存様式で混合リンパ球反応を減少させたことを示している。いずれの供与体からの間葉幹細胞も同じように十分に増殖を抑制したが、それはＭＨＣタイプに関連する抑制は何らの特異性もなかったことを示していた。これらの結果は細胞が一緒に培養された時には間葉幹細胞は混合リンパ球反応を活発に抑制したことを示すものである。
【００６４】
（実施例３）
二次混合リンパ球反応における不応答性
これらの実験はＭＳＣ_Ｓによる予備活性化Ｔ細胞の抑制が二次刺激の間特異的な無応答性に帰着するかどうかを決定するために行われた。
【００６５】
供与者２４８（ｄ２４８）からのＴ細胞が供与者２７３（ｄ２７３）からの同種異系ＰＢＭＣ_Ｓで７日間特発され、次いで更に３日単独であるいは同じ供与者（ｄ２７３）からのＩＦＮ−γ処置ＭＳＣ_Ｓの存在下で培養された。細胞は次いで同じ供与者（ｄ２７３）自己由来（ｄ２４８）あるいは「第三者」（ｄ２４４）ＰＢＭＣ_Ｓで再刺激された。
【００６６】
リンパ球調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）がフィコール−パーク密度勾配遠心（ファルマシア）により調製された。細胞のアリコートは１０％ＤＭＳＯ、９０％のＦＣＢで凍結され、液体窒素で貯蔵された。解凍の後、細胞は２度ＭＳＣ培地（低グルコースＤＭＥＭと１０％ＦＣＳ）で洗浄され、検定培地で再懸濁された（ＩＳＣＯＶＥに２５ｍＭヘペス、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００μＭ可欠アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５．５×１０^−５Ｍ２−メルカプトエタノール（すべてジブコＢＬＲからの試薬）および５％ヒトＡＢ血清（シグマ、ＭＬＲ試験用）。
【００６７】
Ｔ細胞濃縮画分を調製するために、ＰＢＭＣ_Ｓは免疫磁性負選択により単球とＢ細胞を激減させた。ＰＢＭＣ_Ｓはマウス抗ヒトＣＤ１９とＣＤ１４ｍＡｂｓ（アジ化物なし／低エンドトキシン（ＮＡ／ＬＥ）フォーマット）、次いでビオチン接合山羊抗マウスＩｇＧ（多重吸着）Ａｂ（すべてファーミンゲンの試薬）およびストレプトアビジンマイクロビード（ミルテニィ・バイオテック）で保温された。細胞は次いで磁気細胞ソータ（ＭＡＣＳ、ミルテニィ・バイオテック）を使って分離された。Ｔ細胞濃縮画分は約７０−９０％ＣＤ３細胞を含んでいた。
【００６８】
ＭＳＣ培養
ヒトＭＳＣ_Ｓは合衆国特許番号第５，４８６，３５９号に記載のように骨髄から分離され、ＭＳＣ培地で培養を維持され、継代３乃至６で使用された。細胞は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて取り出され、１回ＭＳＣ培地で洗浄され、１０ｃｍ組織培養皿の１×１０^６／平板であった７０−８０％密集密度で平板培養された。平板培養日後、５００Ｕ／ｍｌでＩＦＮ−γ（ベーリンガー・マンハイム）が加えられ、追加で３日保温された。Ｔ細胞を移す前に、ＭＳＣ平板は４回ＨＢＳＳで１回ＩＳＣＯＶＥＳで洗浄され、検定培地が１０ｃｍ組織培養皿に１０ｍｌ／ウエルで加えられた。
【００６９】
一次（１^０）ＭＬＲ
Ｔ細胞（ｄ２４８）は照射ＰＢＭＣ_Ｓ（ｄ２７３）で照射された。刺激に使用されたＰＢＭＣ_ＳはキャビネットＸ線システム（ファクシトロン、Ｘ線、バッファロー、グローブ、イリノイ）を使用して３，０００ラドでＸ線照射された。一次刺激のため、２×１０^７応答細胞が１０ｃｍ組織培養皿で２０ｍｌｓ検定培地で２×１０^７刺激物質と混合された。細胞は３７℃、５％炭酸ガス雰囲気で７日保温された。
【００７０】
活性化Ｔ細胞／ＭＳＣ培養物
１^０ＭＬＲで活性化されたＴ細胞は採取され、１日ＭＳＣ培地で洗浄され、１０^６／ｍｌ、１０ｍｌの検定培地で再懸濁され、自己由来あるいは同種異系ＭＳＣ_Ｓもしくは培地のみを含む１０ｃｍ組織培養皿に加えられ、更に３日保温された。
【００７１】
再刺激検定
ＭＳＣ_Ｓで培養されたＴ細胞が採取され、１度ＭＳＣ培地で洗浄され、もとの供与者、無関係の供与者あるいは自己由来ＰＢＭＣ_Ｓからの照射ＰＢＭＣ_Ｓで再刺激された。検定に対して、５×１０^４特発応答細胞と５×１０^４照射刺激物質が９６ウエル平板で保温された。検定は三つ組みで行われた。培養物は１μＣｉの〔^３Ｈ〕チミジン（エイマシャム）で採取の前８時間パルス標識された。培養物はハーベスター９６（トムテック）を用いて採取され濾過物はマイクロベータ・トリラックス液体シンチレーション・ルミネセンスカウンター（Ｅ、Ｇ、２Ｇウォーラック）を用いて分析された。データは３個の複製の平均値ｃｐｍ±標準偏差で提示される。
【００７２】
単独で培養されたＴ細胞（正の対照）は「同一供与者」再刺激に対し２日でピークの加速応答を示した。「第三者」応答もまた「同一供与者」と事実上同じ連動性で加速されたが、最大値が少し低く開始も少し遅れた（図３）。続いて同種異系ＭＳＣ_Ｓで培養されたＴ細胞は６日の培養期間に「同一供与者」あるいは「第三者」ＰＢＭＣのいずれに対しても応答を示さなかった（図４）。
【００７３】
（実施例４）
二次混合リンパ球反応での不応答性
供与者４１３からのＴ細胞は供与者２７３からの照射ＰＢＭＣ_Ｓで７日間刺激された（それぞれ１．５×１０^６、バルク２０ｍｌ培養）。異なった供与者４１３、４１８および２７３からのＭＳＣ_ＳはＩＦＮ−γで３日前処理され予備活性化Ｔ細胞と混合される前に洗浄され、１０ｃｍ組織培養皿で１×１０^６／皿で平板培養された。
【００７４】
ＭＬＲで７日間予備活性化されＴ細胞は単独であるいはＭＳＣ_Ｓと共に追加の３日間保温された（１．０×１０^６／ｍｌ、Ｔ細胞、１０ｍｌ／皿）。ＭＳＣ_Ｓと共に３日保温した後、Ｔ細胞は採取され、自己由来（ｄ４１３）ＰＢＭＣの存在あるいは不在の下で照射ＰＢＭＣ２７３（もとの供与者）、４１３（自己由来）、ＰＢＭＣ１０（第三者）、あるいはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）で再刺激された。細胞は５×１０^４／ウエルで加えられ、培養物は追加の１８時間の指示された時間点で〔^３Ｈ〕チミジンでパルス標識された。
【００７５】
この結果は自己由来（ｄ４１３）（図６Ｃ）、同じ供与者（ｄ２７３）（図５Ｂ）および第三者（ｄ４１８）（図６Ｄ）の各ＭＳＣ_ＳがＴ細胞の抗原刺激に無応答性を誘導したことを示している。ＭＳＣ処置のない対照培養（図５Ａ）は同種異系ＰＢＭＣ_Ｓに露出した際の細胞の再刺激を示した。
【００７６】
（実施例５）
イヌＭＳＣ _Ｓ による一次ＭＬＲの抑制
イヌＰＢＭＣ_Ｓはフィコール−パーク勾配（１．０７７）での遠心で末梢血から精製された。刺激細胞ＰＢＭＣ_Ｓは２２００ラドＸ線で照射された（７分７０ｋＶ）。１０５照射刺激細胞は予備平板培養イヌＭＳＣ（Ｅ６４７、２×１０^４／ウエル）の存在もしくは不在の下で９６ウエル平板で１０^５応答細胞ＰＢＭＣ_Ｓと一緒に混合された。培養物は６日間保温され追加の１６時間に〔^３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウエル）でパルス標識された。結果は図６Ａ−６Ｄに示される。Ｅ６４７とＥ６４５は一腹子であった（ＤＬＡ同一）。この結果は自己由来同じく同種異系ＭＳＣが一次ＭＬＲを抑制したことを示した。
【００７７】
（実施例６）
非付着性ＭＳＣ _Ｓ による一次ＭＬＲの抑制
ｄ２７３（２×１０^５ウエル）からのＴ細胞はｄ２４４（２×１０^５／ウエル）からの照射ＰＢＭＣ_Ｓと異なった数のＭＳＣ_Ｓで混合された。ｄＤ２４４あるいはｄ２７３からのＭＳＣ_ＳはＩＦＮ―γ（３日間で９００Ｕ／ｍｌ）で前処理されるか未処理のまま残され、実験の日にトリプシン消化され、Ｔ細胞とＰＢＭＣ_Ｓと同じ時点で加えられた。培養物は７日間保温され、〔^３Ｈ〕ＴｄＲ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１μＣｉ／ウエル）が追加の１６−１８時間に加えられた。結果は図９に示され、非付着性ＭＳＣ_Ｓも一次ＭＬＲを抑制したことを示している。
【００７８】
（実施例７）
同種異系ＭＳＣ _Ｓ は皮膚同種移植生存を支援する
研究集団
若いヒヒ（パピオ・アヌビス）が研究された。雄と妊娠していない雌のヒヒが７−２０ｋｇの体重測定され３−１６歳の年齢であった。彼等は乳頭腫ウイルス結核をスクリーンされ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を滴定され、糞便浮遊とスミア（塗抹標本）を含むシミアンウイルスの検査よりなる霊長類ウイルススクリーンで試験された。供与者と受容者の対はＰＣＲ型決めを通じて主要組織適合複合体（ＭＨＣ）不同により決定された。研究期間中はヒヒは付き添い動物の横の個別の区域に収容された。
【００７９】
ＭＳＣ分離と培養拡張のための供与者骨髄の採取
ＭＳＣ_Ｓの分離と培養拡張のために針による骨髄吸引液が腸骨稜から得られた。骨髄吸引液は４連続週にわたり週１回交互の側から得られた。吸引液の量は動物の血液量の推定１０％で決定された。血液量（リットル）は体重の７％であると推定された。従って１０ｋｇのヒヒは０．７リットルの推定血液量であった。血液量の１０％の吸引液は従って７０ミリリットルであった。
【００８０】
処置の前に、手術時抗菌予防のために５００ｍｇのセファゾリンが筋肉内（ＩＭ）投与された。ヒヒは１０ｍｇ／ｋｇＩＭのケタミンと１ｍｇ／ｋｇＩＭのキシラジンの手順で鎮静化され麻酔された。針挿入部位はポピドンヨードでごしごしこすられその後アルコール洗浄された。吸引液は１６ゲージ、２インチ骨髄針を使って腸骨稜から得られた。注射器が針に取りつけられ、骨髄を移動するため吸引が適用された。手術後の痛みのために、鎮痛薬ブプレノルフィンが０．０３ｍｇ／ｋｇＩＭ Ｑ１２×２用量で与えられた。
【００８１】
供与者骨髄吸引液の出荷
骨髄吸引液は注射器からヘパリンナトリウムを含む無菌バキュテーナー（登録商標）に移された。チューブはスタイロフォーム（登録商標）コンテナーに置かれ、室温（ＲＴ）で翌日配達便で細胞処理設備に出荷された。
【００８２】
ＭＳＣの分離と培養定着
骨髄の５乃至１０ｍｌアリコートが５０ｍｌにダルベッコ食塩加リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）でポリプロピレン培養チューブに希釈された。細胞懸濁液は２２００ＲＰＭで１０分室温（ＲＴ）で遠心分離された。全有核細胞数は４％酢酸で測定された。細胞は次いでＤＰＢＳで２０×１０^６細胞の最終濃度に希釈された。１０ｍｌすなわち２００×１０^６細胞は５０ｍｌの円錐チューブで２０ｍｌのパーコル（比重１．０７３ｇｍ／ｍｌ）に負荷され、１３００ＲＰＭで２０分間遠心分離を受けた。単核細胞を含む細胞界面はＤＰＢＳで洗浄され、完全培地で再懸濁され、回収をまって計数された。パーコル界面で得られた洗浄単核細胞は次いで３０ｍｌの完全培地と１５−２０×１０^６細胞／フラスコ（ＭＳＣ／ｃｍ^２）を含むＴ−１８５フラスコに定着され（８．１×１０^２４、ＭＳＣ／ｃｍ^２）、５％炭酸ガスで３７℃恒温器に置かれた。
【００８３】
ＭＳＣの採取
三つ組みフラスコの培地は傾瀉され、フラスコは５０ｍｌＤＰＢＳで洗浄された。ＤＰＢＳの傾瀉の後、０．０５％トリプシン２３ｍｌが３個の各フラスコに加えられた。フラスコは３７℃恒温器に３分置かれた。細胞剥離の後、２３ｍｌの完全培地が各フラスコに加えられた。細胞懸濁液は５０ｍｌ円錐チューブに移され、フラスコは３０ｍｌＨＢＳＳで洗浄された。チューブは室温で５分２２００ＲＰＭで遠心分離された。
【００８４】
処方／包装
採取されたＭＳＣ_Ｓは、約１０×１０^６細胞／ｍｌで、８５％プラズマ−ライトＡ（バクスターＩＶセラピー）、１０％ＤＭＳＯ、５％ＭＳＣ供与者血清よりなる抗凍結液で処方され、１５−２０ｍｌを含むバッグで冷凍保存された。
【００８５】
ラベル表示／貯蔵／発送
細胞は１分当り１−２℃乃至９０℃で比率制御フリーザー（クリオメド、フォルマ・サイエンティフィック）を用いて冷凍保存された。標本は次いで気相で液体窒素貯蔵フリーザーに移された（−１２０乃至−１５０℃）。
【００８６】
用量
２０×１０^６細胞／ｋｇのＭＳＣ用量を達成するために、最終産物は注入日に必要とされる用量の１１５％で調製された。
【００８７】
皮膚の採取
手術の前に、ヒヒは手術時抗菌予防薬としてセファリゾンを５００ｍｇＩＭで与えられた。ヒヒは１０ｍｇ／ｋｇＩＭのケタミンで鎮静化され、静脈内チオペンタール誘導、１−２％イソフルラン吸入麻酔剤によって麻酔された。皮膚は腹前壁から採取され、予めラベル表示された湿潤食塩水ガーゼパッドに置かれた。創傷欠損部は閉じられた。麻酔からさめた後、ヒヒはコロニーに戻された。術後疼痛に対しては鎮痛薬ブプレノルフィンがＱ１２×２用量とアンセフ（Ａｎｃｅｆ）を毎日２日間投与された。
【００８８】
受容者皮膚移植とＭＳＣ注入
手術の前に、ヒヒは手術時抗菌予防薬としてセファリゾンを５００ｍｇＩＭで与えられた。ヒヒは１０ｍｇ／ｋｇＩＭのケタミンで鎮静化され、静脈内チオペンタール誘導、１−２％イソフルラン吸入麻酔剤によって麻酔された。皮膚は腹前壁から採取され、予めラベル表示された湿潤食塩水ガーゼパッドに置かれた。この皮膚は２個の移植片に分割された。この一つはもう一匹の受容者ヒヒの第三者対照として使用され、も一つはこの同一動物の自己由来対照として使用された。動物は次いで腹臥位に置かれた。皮膚の３個の３×２ｃｍの切片は、背部から脊椎に沿って肩甲骨の間に移動された。前に採取されたＭＳＣ_Ｓ供与体、第三者供与体および自己からの皮膚移植片は脱脂され、創出された皮膚欠損部に適合するため形を整えられ、適所に縫合された。
【００８９】
移植の後、ヒヒは２０×１０^６供与者ＭＳＣ／ｋｇの用量でＭＳＣの静脈内注入を受けた。末梢血標本はＭＳＣ注入前、注入１時間、ＭＳＣ注入後１−３日後に得られた。骨髄吸引液はＭＳＣ後、０日、３日、１４日、および３０日に得られた。
【００９０】
手術後疼痛に対しては、鎮痛薬ブプレノルフィンがＱ１２×２用量でアンセフと共に毎日２日間投与された。動物は毎日観察され、移植片は移植後７日に開始され１日おきに写真を撮られた。
【００９１】
物理試験と診断検査
それぞれのヒヒは試験のためにケタミン１０ｍｇ／ｋｇＩＭで鎮静化された。鎮静化の間に２−３ｍｌの骨髄が針吸引で腸骨稜から得られヘパリンナトリウムで４日、１３日、および研究の最後の３０日に採取された。皮膚生検は骨髄を得たのと同じ日に採取された。
【００９２】
結果
皮膚同種異系移植片生存に関するＭＳＣ注入の効果
未処置対照動物（Ｎ＝２）は平均皮膚同種異系移植片の生存時間が８±０日であった。無関係ＭＳＣ供与者ＭＳＣ_Ｓの供与者（Ｎ＝２）への注入は皮膚移植片生存時間を平均生存日１１．５±０．７１日とした（マン−ホイットニーＵ試験、Ｐ＜０．０５）。無関係第三者供与者ＭＳＣの供与者同種異系移植片（Ｎ＝４）は皮膚移植片の生存時間を大きく延ばし、平均１２．３±０．９６日とした（マン−ホイットニーＵ試験、Ｐ＜０．００３）。
【００９３】
受容者６１４０と６２００はＭＳＣ供与者６２４３から、お互いから（第三者移植片）、および彼等自身から（自己由来）同種（異系）移植片を受けた。ＭＳＣ供与者６２４３からの皮膚移植片採取の２４時間前に、６２４３からのＭＳＣは移植のためにスケッチされた腹部前壁の下側に注射された。移植後受容者は２０×１０^６ＭＳＣ／ｋｇ（６２４３）の静脈内注入を投与された。第三者同種異系移植片は両方とも１３日に拒絶された。ＭＳＣ供与者（６２４３）同種異系移植片は４日に出血していることが発見され、発見は通常技術的失敗に帰属していた。病理学試験では、ケラチンが真皮の下にトラックライン状に徐々に注入されたことが認められた。これらのトラックの性質は、それが皮下ＭＳＣ注射の時に針で形成されたことを示唆している。これらの細胞の存在は途方もなく大きい炎症応答を引き出した。この炎症応答は皮膚移植片が付着したり適切に「取り出す」能力を妨げ、またこれらの移植片は７日までに完全に壊死した。自己由来移植片は拒絶されなかった。
【００９４】
受容者６６５４と６６５９はＭＳＣ供与者６５９３から、お互いから（第三者移植片）、および彼等自身から（自己由来）同種異系移植片を受けた。移植後、受容者は２０×１０^６ＭＳＣ／ｋｇの静脈内注入を投与された。ＭＳＣ供与者同種異系移植片は１１日と１２日に拒絶され、また第三者同種異系移植片は１１日と１２日に拒絶された。自己由来移植片は拒絶されなかった。
【００９５】
同様に受容者６６６３と６６５８はＭＳＣ供与者６６５６から、お互いから（第三者移植片）また彼等自身から（自己由来）同種異系移植片を受けた。移植後受容者は２０×１０^６ＭＳＣ／ｋｇの静脈内注入を投与された。ＭＳＣ同種異系移植片は１１日と１２日に拒絶され、第三者供与者同種異系移植片は１０日と１２日に拒絶された。自己由来移植片は拒絶されなかった。
【００９６】
研究の対照部門である受容者６５３２と６７２０は注入あるいは注射によりＭＳＣの投与なしで自己由来および同種異系移植片を受けた。この同種異系移植片は８日に拒絶された。自己由来移植片は拒絶されなかった。
【００９７】
同種異系ＭＳＣ注入と関連する識別できる毒性は存在しなかったし、また続く３０日のフォローアップ期間に逆臨床後遺症もなかった。血液標本はＭＳＣ投与前、移植後およびＭＳＣ注入の１時間、２時間、１日、２日、および３日に得られた。骨髄吸引液は移植後およびＭＳＣ注入後４日と１３日に得られた。
【００９８】
これらの結果は、同種異系ヒヒＭＳＣ_Ｓの単一注入が同種異系皮膚移植の拒絶を遅らすことができることを示している。他の免疫抑制治療薬は投与されなかった。同種異系あるいは第三者ＭＳＣ_Ｓの一用量は拒絶までの時間を５０％増加した（このモデルでの標準拒絶時間は８日であった）。（グッドマン他、Ａｍ Ｓｕｒｇ６２（６）：４３５−４４２（１９９６）を参照のこと）。
【００９９】
（実施例８）
この研究の目的は比較的高い容量のイヌ白血球抗原（ＤＬＡ）同一一腹子間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）を１０×１０^６細胞／ｋｇの同種異系骨髄移植設定で注入されたイヌでの実行可能性と安全性を示すためであった。第二の目的は供与者ｎｅｏ−とＧＦＰ−標識ｃＭＳＣの移植後５０日と１００日での分布と機能を試験することにあった。
【０１００】
材料と方法
実験動物
ビーグル犬がこの研究に使用された。雄２匹雌２匹のＤＬＡ同一一腹子がこの研究で使用され、年齢は０日に７ヶ月あるいは９ヶ月であった。使用された類別方法は主要組織適合遺伝子複合体のイヌ等価物であるイヌ白血球抗原（ＤＬＡ）にあるクラスＩＩ ＤＲＢ区域の遺伝形質に従う高度に多形性の微小付随体マーカーの使用を伴う。微小付随体は小さなジヌクレオチド、トリヌクレオチドあるいはテトラヌクレオチド反復であり、これはそれらのものが多世代交差を通じて染色体分節の遺伝形質に従うために使用される対立遺伝子で十分な長さの変化を示している。対立遺伝子の分離は各反復をとり囲むＤＮＡのユニーク配列から誘導されるプライマーで単一ステップポリメラーゼ連鎖反応を用いて典型的にモニターされる。加えて混合白血球反応はＰＣＲ微小付随体マーカー検定結果の確認を提供するための研究に選ばれたＤＬＡ同一一腹子で行われた。
【０１０１】
研究の設計
イヌが同じＤＬＡ同一一腹子供与者からのｃＭＳＣと骨髄の移植を受けた。骨髄移植片は全身照射（ＴＢＩ）に先立ち０日に２匹のＤＬＡ同一一腹子のそれぞれから採取され交換された。骨髄切除はイヌを０日に９２０センチグレー（ｃＧｙ）の単一ＴＢＩ用量に露出して誘導された（７ｃＧｙ（９．３Ｒ）／分の速度で送達される２個の対向する^６０Ｃｏ源からの正中線空気露出）。移植に先立ち４週あるいはそれ以上前に供与者骨髄吸引液から分離された培養拡張ｃＭＳＣは、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）の遺伝子を含むパップ＠０Ｔ−２４で形質導入された。ｃＭＳＣは継代１（Ｐ１）あるいは継代２（Ｐ２）の後冷凍保存された。ＴＢＩに続き、ｃＭＳＣは解凍され１５分間にわたりポータブル注入ポンプを介して静脈内に送達された。ｃＭＳＣ注入の１乃至２時間後以内に、骨髄移植片は１×１０^８全有核細胞（ＴＮＣ）／ｋｇと同じもしくはそれ以上の用量で静脈内に注入された。
【０１０２】
シクロスポリンが対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）予防のために０日乃至５日に１０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ（２０ｍｇ／ｋｇ／日）の用量で４匹すべてに静脈投与された（サンディミューン（登録商標）インジェクション・ソリュージョン、サンドス・ファーマシューティカルス・コーポレイション）。グループＩ．１．ａには６日乃至５０日（研究終了日）まで、あるいはグループＩ．１．ｂには６日乃至１００日までシクロスポリンが１０ｍｇ／ｋｇＢＩＤ ＰＯ（２０ｍｇ／Ｋｇ／日）で投与された（ネオラール（登録商標）ソフトゼラチンカプセル、サンドス・ファーマシューティカルス・コーポレイション）。受容者に対する経口抗生物質での通常の支持ケアは５日までに始まり、全身用抗生物質は０日に開始され移植が達成されるまで続けられた。液体サポートは必要に応じて与えられた。血小板移入は回復の間４匹のイヌのいずれにも必要でなかった。もしも血小板数が絶えず１０，０００／ｍｍ^３以下に低下し、あるいは処置スタッフが出血の徴候を観察した場合には、全血の移入が投与されるという標準イヌ手順が必要となる。血小板移入は必要とあれば任意の供与者からの５０ｍｌ全照射（２０００ｃＧｙ）血液として投与されねばならない。移植は５００絶対好中球細胞ｍｍ^３以上、１，０００／ｍｍ^３以上、また血小板１０，０００／ｍｍ^３以上、５０，０００／ｍｍ^３以上、および１００，０００／ｍｍ^３以上の３回の連続測定の最初の時点で確立された。
【０１０３】
造血回復をフォローするために、全血球算定（ＣＢＣ_Ｓ）が１００日研究グループで０日乃至５０日まで、またそれ以後は２週毎に得られた。血清化学分析は０日、２日およびその後は週毎に行われた。末梢血標本はＭＳＣ注入前の０日、ＤＮＡ分離のための５分と１５分、１時間と２時間、および１日、２日、３日および４日の時点で行われた。ＤＮＡは産物に組み込まれたジゴキシゲニンでの抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザ、および第２段階抗ジゴキシゲニン比色分析によりＧＦＰ標識細胞の存在を評価された。骨髄吸引液は血小板数が絶えず５０，０００／ｍｍ^３以上に達し同じＰＣＲ法を用いてＧＦＰ標識細胞の存在が検査された時に得られた。ｃＭＳＣ培養物はコロニー形成単位（ＣＦＵ）を検査し更に抗ＥＧＦＰ ＰＣＲ分析のためのｃＭＳＣを培養して確立された。剖検に際して末梢血、骨髄吸引液および骨髄生検が抗ＥＧＰＦ ＰＣＲ分析のために得られた。ＣＦＵ検定は骨髄吸引液で行われ、抗ＥＧＦＰ ＰＣＲ分析は培養拡張ｃＭＳＣで行われた。組織分析は各種組織でＧＦＰの存在を確かめるため行われた。
【０１０４】
ｃＭＳＣ分離、培養拡張、形質導入と冷凍保存
両側性骨髄吸引液がイヌＣＡＮ０７−０１とＣＡＮ０７−０２では４週までに、ＣＡＮ０７−０３とＣＡＮ０７−０４では９週までにｃＭＳＣ分離と培養確立のために得られた。１５ｍｌの骨髄（各上腕骨から７ｍｌ）がそれぞれのイヌから得られた。イヌはブトルファノールの注射に続くジアゼパムと塩酸ケタミンの混合物の注射により麻酔された（アベコ・カンパニー、インコーポレイテッド、フォートドッジ、アイオワ）。針挿入の部位はポビドンヨードでごしごしこすられ、その後アルコールで洗浄された。吸引液が１６ゲージ、２インチ骨髄針を用いて各イヌの各上腕骨顆から得られた。注射器は針に装着され、また各上腕骨から８ｍｌの骨髄を取るために吸入装置が適用された。骨髄吸引液は無菌技術を使って１５ｍｌポリプロピレン円錐チューブに移された。手順に従って、イヌは次いで回復のため加温パッド上に置かれた。
【０１０５】
骨髄の５乃至１０ｍｌアリコートがポリプロピレン培養チューブ内でダルベッコ食塩加リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で５０ｍｌに希釈された。細胞懸濁液は２２００ＲＰＭ、１０分室温（ＲＴ）で遠心分離された。全有核細胞数は４％酢酸で決定された。細胞は次いで最終濃度２０×１０^６細胞／ｍｌになるようにＤＰＢＳで希釈された。１０ｍｌあるいは２００×１０^６細胞は５０ｍｌ円錐チューブ内で２０ｍｌのパーコル（比重１．０７３ｇｍ／ｍｌ）に負荷され１３００ＲＰＭで２０分遠心分離された。単核細胞を含む細胞界面はＤＰＢＳで洗浄され、完全培地で再懸濁され、回復割合を得るために計数された。細胞は次いで完全培地で希釈され、培養物は下記の通り確立され、３７℃恒温器に５％炭酸ガスで置かれた。
【０１０６】
バイシストロンＭｕＬＶレトロウイルスベクター
グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レトロウイルスはＥＧＦＰ−１遺伝子を刺胞動物オワンクラゲから分離することで構築された（クロンテック、カリフォルニア）。ＥＧＦＰ遺伝子はレトロウイルスベクターｐＪＭ５７３−ｎｅｏにクローンされた（生成プラスミドはｐＯＴ−２４と名付けられた）。プラスミドｐＪＭ５７３−ｎｅｏは下記の修飾を行ってｐＮ２から誘導された（ケラー他、１９８５、ネイチャー、３１８：１４９）。マウスレトロウイルスｇａｇ開始部位は組み立て（インフレーム）停止コドンに置換された。５′ＬＴＲと３′ＬＴＲは同じカセットに構築された。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）と内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）はｐＮ２に挿入された。ＥＧＦＰ ｐＯＴ−２４プラスミドの概略図は図８で示される。
【０１０７】
組換えレトロウイルスの調製
ｐＯＴ−２４は製造業者が示唆しているようにＤＯＴＡＰを用いてＧＰ＆Ｅ８６エコトロピック生産者細胞に形質移入された（ベーリンガー・マンハイム）。形質移入細胞はＤＭＥＭ高グルコース（ＨＧ）培地に１０％熱不活性化ＦＢＳ，ペニシリン−ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ）、および選択マーカーとしての硫酸プロタミン−Ｇ４１８（シグマ）０．５ｍｇ／ｍｌ補充したもので成長した。培養物は７０％密集になるまで維持され、その時点で培地は新鮮レトロウイルス培地（Ｇ４１８無し）に取り替えられ細胞は３２℃で２日維持された。レトロウイルスを含む培養培地は収集され、０．４５ｍｍフィルターで濾過され−７０℃で貯蔵された。両種性レトロウイルスは遠心分離形質導入手順を用いてＰＡ３１７細胞を２度エコトロピックウイルスで形質導入し、次いでＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ）での選択で調製された。レトロウイルス上澄みは収集された。３Ｔ３細胞上にプールされたＥＧＦＰレトロウイルスの滴定量は１．２×１０^６ＣＦＵ／ｍｌであった。ＧＦＰレトロウイルス上澄みは−７０℃で冷凍保存された。
【０１０８】
ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２
パーコル界面で得られた洗浄単核細胞は３０ｍｌの完全培地と１０×１０^６細胞／フラスコを含む１０個のＴ−１８５フラスコに確立された。
【０１０９】
培養の２日、６日、９日にフラスコの培地は完全に新鮮完全培地に取り替えられた。一次培養の１２日に写真が撮られ、細胞は継代０（Ｐ０）から継代１（Ｐ１）まで取り出された。培地は吸引され、フラスコは２回８ｍｌＤＰＢＳで洗浄された。８ｍｌのトリプシンが加えられ、フラスコは３７℃恒温器で３分置かれた。細胞が引き上げられた時、反応は８ｍｌの完全培地の追加で停止した。細胞は５０ｍｌ円錐チューブに移されプールされた。フラスコはＤＰＢＳで洗浄されプールされた細胞は室温で２０００ＲＰＭ、５分遠心分離された。上澄みが除去され細胞ペレットは完全培地に再懸濁された。細胞はプールされ、計数され生産能力が試験された。細胞は１８ｍｌの完全培地とフラスコ当り０．４×１０^６細胞を含む１５個のＴ８０フラスコで平板培養された。
【０１１０】
培養の１５日に、最初の形質導入が１８個のフラスコの１５個で行われた。レトロウイルスの上澄みのアリコートは解凍され、形質導入カクテルを作るためにポリブレンが最終濃度の８μｌ／ｍｌに加えられた。培養培地は１０ｍｌの形質導入カクテルで取り替えられ、フラスコは３０００ＲＰＭで１時間３２℃で遠心分離された。遠心分離の後、熱不活性化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を用いて調製された１０ｍｌの完全培地が各フラスコに（形質導入カクテルと共に）加えられフラスコは恒温器に戻された。３個のフラスコは形質導入されず、新鮮培地は取り替えられた。培養の１６日に、培地は新鮮完全培地で取り替えられた。培養の１７日に形質導入手順が反復された。
【０１１１】
培養の１８日に、細胞は前に記載の通り採取されＰ１乃至Ｐ２から取り出された。３×１０^６細胞が１００ｍｌの完全培地に加えられ、三つ組みフラスコ（５００ｃｍ^２）に注がれた。１５個の三つ組みフラスコが形質導入細胞で準備され、別に３個が未形質導入細胞に準備された。残存細胞はいずれも冷凍保存された。１０％ＤＭＳＯと９０％ＦＢＳを含む凍結液が準備された。１０×１０^６細胞で１ｍｌの凍結液に再懸濁された。小びんはラベル表示されナルジーンクリオコンテナーで少なくとも４時間−７０℃で冷凍保存され、−７０℃で貯蔵された。
【０１１２】
Ｐ２培養の２２日に、細胞の分布と形態を記録するために写真が撮られ、Ｐ２細胞は採取され、下記に記載の通り冷凍保存された。
【０１１３】
ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４
パーコル界面で得られた洗浄単核細胞は２０ｍｌの完全培地と１２×１０^６細胞／フラスコを含む１５個のＴ−７５フラスコに固定された。
【０１１４】
培養の２日に、フラスコと皿にある培地は新鮮培地で完全に取り替えられた。ｃＭＳＣの一次培養の６日に、最初の形質導入が前に記載の通り行われた。３個のフラスコは形質導入されず、新鮮培地が６日に取り替えられた。培養の７日に培地は新鮮培地で取り替えられた。
【０１１５】
培養の８日に形質導入手順が反復された。培養の９日に写真が撮られ、細胞は前に記載の通りＰ０からＰ１に継代した。３×１０^６細胞が１００ｍｌの完全培地に加えられ、三つ組みフラスコに注がれた。１５個の三つ組みフラスコが形質導入細胞のために準備され、３個のフラスコは未形質導入細胞のため準備された。
【０１１６】
１５ｍｌの骨髄吸引液は供与者ＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４に対しそれぞれ９１０×１０^６，１２１２×１０^６，８５６×１０^６および１９４８×１０^６有核細胞を産出した。パーコル界面から得られた単核細胞数は６１２×１０^６，６６６×１０^６，５８８×１０^６および４６２×１０^６であり、それぞれ６７．２，５５，６８．７および２３．７％の回復に帰着した。Ｐ１に対し細胞生存率の平均値は９７．１％（９３．３乃至１００％の範囲）であった。供与者ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２にとってのＰ２、および供与者ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４にとってのＰ１細胞として、形質導入細胞の細胞生存能力は平均値９６．７％（９６．３乃至９７．７％の範囲）であった。未形質導入細胞は９５．４％（９３．３乃至９６．９％の範囲）生存可能であった。ｃＭＳＣの冷凍保存のための採取に際して、形質導入細胞の生存能力は平均値９９．４％（９７．４乃至１００％の範囲）であり、未形質導入細胞は９９．４％（９７．６乃至１００％の範囲）で生存可能であった（図４）。
【０１１７】
継代２の４日後に採取されフラスコ当り３×１０^６で平板培養された供与者 ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２に対するフラスコ当り形質導入ｃＭＳＣ産出量は５．９×１０^６と６．７×１０^６であり、またフラスコ当り未形質導入ｃＭＳＣ産出量は８．４×１０^６と７．５×１０^６であった。継代１の４日後（異なった形質導入と継代設計）に採取されフラスコ当り３×１０^６で平板培養された供与者ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４に対するフラスコ当り形質導入ｃＭＳＣ産出量は２０．０×１０^６と１４．０×１０^６であり、またフラスコ当り未形質導入ｃＭＳＣ産出量は２５．３×１０^６と１８．０×１０^６であった。
【０１１８】
Ｐ０培養からのｃＭＳＣについてのＣＦＵ検定
ＣＦＵコロニー検定は０．５×１０^６細胞を三つ組みで１０ｍｌ完全培地を含む１００ｍｍ皿に平板培養することで一次培養固定の時点で準備された。皿は３７℃、５％炭酸ガスで保温された。培地は新鮮培地で２日乃至４日毎に取り替えられた。培養の１０日に、ＣＦＵ検定皿はＨＢＳＳで２回洗浄され、１％グルタルアルデヒドで１５分固定され、ＨＢＳＳで２回洗浄され、空気乾燥された。皿のｃＭＳＣは次いで０．１％クリスタルバイオレットで染色され、脱イオン水で３回洗浄され、空気乾燥された。コロニーは平板培養された１０^６細胞当り形成コロニー数を計算するため計数された。
【０１１９】
単核細胞分離と培養固定の日に平板培養され１０日に採取されたＣＦＵ検定は、イヌＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４に対し１０^６細胞当り５６，４６．７，１１４および７２コロニーをそれぞれ産出した。
【０１２０】
Ｐ１培養の１３日に細胞分布と形態を記録するために写真が撮られＰ１細胞はトリプシン消化により採取され以下に記載の通り冷凍保存された。
【０１２１】
三つ組みフラスコの培地は傾瀉され、フラスコは５０ｍｌＤＰＢＳで洗浄された。ＤＰＢＳの傾瀉後、２３ｍｌの０．２５％トリプシンが各三つ組みフラスコに加えられた。フラスコは３７℃恒温器で３分置かれた。細胞剥離後、２３ｍｌの完全培地が各フラスコに加えられた。細胞懸濁液は５０ｍｌ円錐チューブに移されフラスコは３０ｍｌＨＢＳＳで洗浄された。チューブは２２００ＲＰＭで５分室温で遠心分離された。形質導入細胞あるいは未形質導入細胞それぞれを含むペレットはプールして計数された。１×１０^７細胞の１個のアリコートが抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザ分析により形質導入割合を決定するためにとっておかれた。
【０１２２】
採取の後、回収されたＰ１あるいはＰ２形質導入培養拡張ｃＭＳＣ_Ｓは１３００ＲＰＭで５分遠心分離され、８５％プラズマライトＡ（バクスターＩＶセラピー）、１０％ＤＭＳＯ、および５％自己由来イヌ血清を含む氷冷冷凍防止液で１×１０^７ｃＭＳＣ／ｍｌの１ｍｌアリコートに再懸濁された。細胞アリコートはそれぞれ１ｍｌを含む別個の冷凍小びんに分配された。チューブはイヌ供与者番号と全生存細胞数でラベル表示された。ｃＭＳＣは細胞小びんをナルジーン氷結コンテナーに置いて冷凍保存され、−７０℃フリーザーで４時間置かれ、次いで−７０℃で貯蔵するために移動された。
【０１２３】
産物の冷凍保存するための細胞採取に際して、１×１０^７細胞のアリコートが形質導入効率を測定するために得られた。形質導入効率は産物へのジゴキシゲニン取り込みの抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザにより、また第２段階抗ジゴキシゲニン比色分析により分析された。
【０１２４】
ｃＭＳＣ注入産物
注入の１乃至２時間前、ｃＭＳＣの小びんは３７℃水浴での渦動で解凍され、７０％エタノールでスプレーされ、生物学的安全性キャビネットで開かれた。ｃＭＳＣ産物はＤＭＥＭ−ＬＧプラス細胞供与者に自己由来である３０％の血清を含む５０ｍｌの注入培地に懸濁された。ｃＭＳＣ産物の生存能力は現実の生存可能用量を決めるためにトリパンブルー排除により決定された。各ｃＭＳＣ産物のアリコートは酵母菌分離、好気性および嫌気性成長に委ねられた。ｃＭＳＣは組織培養プラスチックに付着し、Ｐ２（ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２の場合はＰ３）培養で増殖する能力を評価された。１×１０^６と０．１６×１０^６ｃＭＳＣのアリコートがＴ２５プラスチック培養フラスコに三つ組みで完全イヌ培養培地に平板培養された。２４時間後、１×１０^６ｃＭＳＣで平板培養されたフラスコ、および３日、０．１６×１０^６ｃＭＳＣで平板培養されたフラスコがトリプシン消化で採取され計数された。
【０１２５】
ＴＢＩに続き、ｃＭＳＣ懸濁液は１５−２０分間で５０ｍｌを受け渡しするために手持ハーバード・バード・ミニインヒューザーを使って橈側皮静脈内に挿入されたカテーテル経由で注入された。
【０１２６】
適度に高用量の７．４９×１１０^６、７．３５×１０^６、１０．０×１０^６および１０．０×１０^６（平均値８．７×１０^６）生存可能ｃＭＳＣ／Ｋｇが０日にイヌＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３，ＣＡＮ−０７−０４それぞれに注入された。これらの用量は患者が受ける典型的な用量の４倍乃至１０倍の増加を表す。注入された全生存可能ｃＭＳＣは６７．７×１０^６乃至１２９×１０^６（平均値９３．９×１０^６）ｃＭＳＣにわたった。細胞の生存能力はトリパンブルー排除で決定されるように９２．１×１０^６乃至９７．６×１０^６（平均値９３．９×１０^６）の範囲にあった。ｃＭＳＣ注入はＴＢＩ後７１分乃至１４６分（平均値１１０分）の間で与えられた。
【０１２７】
注入後血液標本
ｃＭＳＣ注入前（ｐｒｅ）およびｃＭＳＣ注入の間、注入開始後５分と１５分、同じく１時間、２時間および１日、２日、３日、４日の時間点で血液標本（２ｍｌ）が得られた。細胞ライゼート（溶菌液）が産物へのジゴキシゲニン組み込み抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザで、また第２段階抗ジゴキシゲニン比色分析で血流のＧＦＰ標識ｃＭＳＣの水準を検出するのに使用するため、ピュアジーン（登録商標）（ジェントラ・システムズ、インコーポレイテッド）ＤＮＡ分離キットを用いて調製された。
【０１２８】
骨髄採取と移植片注入
移植用移植片として使用される骨髄はＴＢＩの前にＤＬＡ同一一腹子から採取された。吸引液は１００ｍｌ組織培養培地１９９と４ｍｌ（４０００Ｕ）ヘパリンを含む真空フラスコから始まるポリビニルチューブに取り付けられた１１ゲージ、４−６インチ、ボールトップステンレススチール骨髄採取針を用いて各上腕骨から得られた。骨髄は３００ｕｍと２００ｕｍ孔サイズを通過し、当日遅く注入されるまで４℃で移動パックコンテナーに貯蔵され、供与者と受容者でラベル表示された。骨髄全有核細胞数（ＢＭ−ＴＮＣ）は、骨髄採取の間に得られた末梢血量に存在する何らかの有核細胞を除くように補正される。
【０１２９】
骨髄の全有核細胞数（ＴＮＣ）は骨髄採取の間に得られた末梢血量に存在するいずれかのＴＮＣも排除するように補正された。骨髄の補正用量はイヌＣＡＮ−０７−０１，ＣＡＮ−０７−０２，ＣＡＮ−０７−０３，ＣＡＮ−０７−０４それぞれに対して４．３×１０^８、３．５×１０^８、３．１×１０^８、２．０×１０^８（平均値３．２×１０８）ＴＮＣ／ｋｇであった。未補正骨髄用量は５．６×１０^８、４．２×１０^８、４．５×１０^８、２．７×１０^８（平均値４．３×１０^８）ＴＮＣ／ｋｇであった。
【０１３０】
注入２０分前、骨髄は室温で置かれた。ｃＭＳＣ注入１時間後、骨髄は１分乃至２分バッグに圧を加えて橈側皮静脈に挿入されたバタフライ針を経由して静脈内注入された。
【０１３１】
支持ケア
５日までに抗生物質（硫酸ネオマイシンと硫酸ポリミキシン）が１日３回与えられた。これらの抗生物質は絶対好中球数が５００／ｍｍ^３に達するまで投与さされた。０日に、全身用抗生物質ベイトリルが１日２回静脈内投与され絶対好中球がたえず１，０００／ｍｍ^３に到達するまで続けられた。一過性照射毒性の結果失われた体液と電解質は食物と水が受け入れられるまで５００ｍｌのリンゲル液を１日２回皮下投与して取り替えられた。
【０１３２】
示差的血球算定
血液標本（２ｍｌ）が０日から５０日、およびその後は研究終了まで２週毎にｃＭＳＣ分離のために骨髄吸引液採取の朝、頸動脈あるいは橈側皮静脈のいずれかから収集された。血液はＥＤＴＡを含む真空コンテナーに移された。ｍｍ^３当りの全白血球（ＷＢＣ）および血小板数はシスメックスＥ２５００を用いて測定され、示差的細胞数は固定とライト染料での染色で手動で決定された。
【０１３３】
剖検
血液標本はＣＢＣ、化学２３分析、およびＰＣＲ評価で得られた。イヌはブトルファノールに続きジアゼパムと塩酸ケタミンの混合物で鎮静化された。鎮静化の後、生検と側方骨髄吸引液が上腕骨、大腿骨および腸骨稜から得られた。次いで鎮静剤ソジウムペントバルビタールの過剰用量で安楽死が行われた。イヌの５０日グループ（ＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２）は研究の４３日に安楽死を受けた。イヌの１００日グループ（ＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４）は研究の１００日に安楽死された。組織の完全なセットが動物の剖検に際して収集された。
【０１３４】
組織検査のために組織の収集がその後すぐに続いた。組織のサブセットが抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザ分析のために使用された。骨髄吸引液と生検が抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザ分析、更なるＰＣＲ分析のための培養拡張、またＣＦＵ検定のために使用された。
【０１３５】
組織は約１インチ平方片に仕上げられ、１０％ホルマリン緩衝液（ｐＨ６．８−７．２）で満たされた個別のラベル表示５０ｍｌ円錐チューブに置かれた。組織はパラフィンに包埋され、切断されヘマトキシリンとエオシンで染色された。骨髄標本は過ヨウソ酸シッフ染色で染色された。
【０１３６】
剖検に先立ち得られた骨髄吸引液は各イヌの左右の上腕骨、大腿骨、および腸骨稜から１５ｍｌラベル表示チューブに収集された。組織標本のサブセットが剖検で得られ、約１／４インチ方片に仕上げられ、ＰＢＳ浸漬ガーゼに包まれラベル表示ジップロックバッグに置かれた。骨髄吸引液は氷上で保持された。
【０１３７】
ＣＦＵ検定のための骨髄吸引液の調製
ＰＣＲ分析のために得られた各イヌからの左右上腕骨、大腿骨、および腸骨稜からの骨髄吸引液のアリコートが別個の１５ｍｌラベル表示チューブアリコートされた。骨髄標本は氷上で保持された。
【０１３８】
剖検で得られた骨髄からのｃＭＳＣについてのＣＦＵ検定
剖検で得られた骨髄から得られたｃＭＳＣについて行われたＣＦＵコロニー検定は１０ｍｌ完全培地を含む１００ｍｍ皿に三つ組みで０．５×１０^６細胞を平板培養することにより調製された。皿は３７℃と５％炭酸ガスで保温された。培地は２−４日毎に新鮮培地で取り替えられた。培養の１０日に、ＣＦＵ検定皿はＨＢＳＳで２回洗浄され、１％グルタルアルデヒドで１５分固定され、ＨＢＳＳで２回洗浄され、空気乾燥された。皿のｃＭＳＣは次いで０．１％クリスタルバイオレットで染色され、脱イオン水で３回洗浄され空気乾燥された。コロニーは平板培養された１０^６細胞当りコロニー数を計算するために計数された。
【０１３９】
ＤＮＡの分離と精製
ＤＮＡは各組織の一部から分離された。標本の残りの片は冷凍保存され−７０℃フリーザーで貯蔵された。ＤＮＡは、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に標本を置き、プロティナーゼＫ溶液を加え、５５℃で３時間、あるいは組織が溶解するまで保温することにより分離された。標本は続いてリボヌクレアーゼで３７℃、６０分処置された。標本は室温まで冷却されタンパク質は沈殿した。標本は遠心分離され水相は１００％イソプロパノールでゆっくり収集された。標本は混合され遠心分離されペレットは７０％エタノールで洗浄された。チューブは遠心分離され上澄みは汲み出されペレットは約１乃至６時間かけて乾燥された。ＤＮＡは室温で一晩水和され続いて４℃で貯蔵された。
【０１４０】
末梢血と骨髄標本はまずＲＢＣ溶菌液（塩化アンモニウム緩衝液）で溶解された。ＤＮＡは次いで前に記載のライゼートから分離された。ＤＮＡは９９８μｌ脱イオン水と標本から２μｌＤＮＡのキュベットへの追加で定量され渦動された。光学密度（不透明度）（ＯＤ）を決定するために分光測光器が使用された。ＯＤは２６０と２８０で読み取られ、ＤＮＡ濃度がμｇ／ｍｌで計算された。ＤＮＡ濃度は脱イオン水を用いて１μｇ／ｍｌに調節された。
【０１４１】
抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザ
この研究で使用された抗ＥＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲエリザはＧＦＰに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用する注入ｃＭＳＣを検出する。遺伝子発現の分析に関して、我々はＰＣＲ−エリザ（ＤＩＧラベル標示／検出）キット（ベーリンガー・マンハイム）を利用した。要約すると、ＰＣＲは増幅産物を標識するジゴキシゲニン標識ヌクレオチドの存在下で行われた。次いで２５μｌのＰＣＲ産物は変性され、溶液で雑種形成を許されて３７℃でストレプトアビジン被覆マイクロタイタ平板で５′ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブとなった。結合プローブＰＣＲ産物は抗ジオキシゲニンペルオキシダーゼ接合体により、また比色基質２，２′アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）の使用により検出された。標準滴定曲線は検定で使用されるＤＮＡ量当り濃度を概算するために形質移入対照ｃＭＳＣを用いて創り出された。まずＤＬＡクラスＩＩゲノムＤＮＡのＰＣＲに内部標準と相関させ、次いでＤＮＡ濃度を細胞等価物に相関させ、また形質導入細胞当り一つのレトロウイルス組み込み事象を想定することで細胞数の推定値を得ることができる。
【０１４２】
ＧＦＰに対するＤＮＡの定量測定がすべての骨髄スクープ／生検で記録された。
【０１４３】
移植後血球回復
血小板の（３連続値に対する）閾値に達する平均日は１０，０００／ｍｍ^３には１２．８（１１−１７の範囲）、５０，０００／ｍｍ^３には１９．８（１６−２５の範囲）、また１００，０００／ｍｍ^３には２３．０（２０−２７の範囲）であった。絶対好中球の５００／ｍｍ^３に達する（３連続日に対する）閾値に達する平均日は９．３（８−１１の範囲）であり、また１，０００／ｍｍ^３には１０．５（９−１３の範囲）であった。
【０１４４】
暫定骨髄吸引液
血小板が５０，０００／ｍｍ^３以上の値に絶えず回復した時、暫定骨髄吸引液が腸骨稜から収集された。この手順には研究の２７日にＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２に対して、また２９日にＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４に対して行われた。
【０１４５】
結果
４３日に安楽死されたＣＡＮ−０７−０１とＣＡＮ−０７−０２からのすべての組織の病理学的評価に際して、異所性結合組織および亜急性ＧＶＨＤに関して発見は負であった。
【０１４６】
検出可能ＤＮＡシグナルは注入の１時間以内および再度２日に発見することができた。１個の標本は注入３日後にＧＦＰ ＤＮＡを量的に測定することができた。この時点は、シグナルが２日と３日で発見された自己由来イヌ移植研究でこれまでに観察されたものと一致する。
【０１４７】
ＧＦＰ＋細胞に対するＣＡＮ−０７−０３とＣＡＮ−０７−０４の１００日剖検データはＣＡＮ−０７−０３の大腿骨と上腕骨で、またＣＡＮ−０７−０４の上腕骨でＧＦＰシグナルを示した（１０マイクログラムＰＣＲインプットＤＮＡ当り１ＧＦＰ＋細胞等価物）。
【０１４８】
このモデルにおいて、動物の眼と耳の赤さを観察することにより、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を検出することが可能であった。この指標を用いて、間葉幹細胞を受けた動物は間葉幹細胞で処置されなかった対照動物と比べてＧＶＤＨの発生数が少なくおよびもしくは発病度が低かったことが確認された。
【０１４９】
これらの結果は、同種異系ＭＳＣ_Ｓが骨髄造血細胞の急速な移植を支援できることを示している。輸血の支援は必要でなかった。ＧＶＨＤの臨床的徴候は存在しなかった。血小板回復は組織的対照よりも速やかであった。同種異系移植片移植の後、支質細胞にキメラ現象の徴候が見られた。同種異系ＭＳＣ_Ｓを使用することによる同種異系組織を移植する選択肢は臨床移植シナリオで使用できる移植材料の範囲を広げる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 同種異系間葉幹細胞は免疫応答を誘導しない。ＡからのＴ細胞はＢからの異なった量のＰＢＭＣ_ｓと混合した時用量依存様式で増殖した。ＡからのＴ細胞は、たとえ間葉幹細胞が全Ｔ細胞活性化を提供するよう操作された時でさえＢからの間葉幹細胞との接触に応答して増殖しなかった（間葉幹細胞はＩＦＮ−γで処置され副刺激分子Ｂ７−１あるいはＢ７−２で形質導入された）。
【図２】 間葉幹細胞は２個の異なった個体からのリンパ球の間で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を活発に抑制した。受容者（第三者あるいは供与者）に対し同種異系であるｈＭＳＣ_ｓはＭＬＲで刺激細胞と応答細胞の両方（オープン棒グラフ）のどちらにも不適合であった。あるいはｈＭＳＣ_ｓはＭＬＲの刺激細胞（線影棒グラフ）に対し適合した（受容者）。かくして間葉幹細胞はＭＨＣ型に関し特異性なくてもＭＬＲを抑制した。間葉幹細胞は用量依存様式でＭＬＲを抑制した。
【図３】 刺激細胞（同種異系）ＰＢＭＣ_ｓで特発され、ＭＳＣ_ｓに露出されず、次いで自己由来ＰＢＭＣ_ｓ、同種異系ＰＢＭＣ_ｓ（刺激細胞あるいは第三者）もしくは細胞なしに露出された応答Ｔ細胞の二次応答を示す。
【図４】 刺激細胞（同種異系）ＰＢＭＣ_ｓで活性化され、続けて同種異系ＭＳＣ_ｓ（刺激細胞）で培養され、次いで自己由来ＰＢＭＣ_ｓ、同種異系ＰＢＭＣ_ｓ（刺激細胞あるいは第三者）もしくは細胞無しに露出された応答Ｔ細胞の二次応答を示す。
【図５】 （図５Ａ−６Ｄは）刺激細胞同種異系ＰＢＭＣ_ｓで前に活性化され、活性化後に同種異系（同じ供与体（図５Ｂ）あるいは第三者（図６Ｄ））もしくは自己由来ＭＳＣ_ｓ（図６Ｃ）で培養され、次いで自己由来あるいは同種異系（同じ供与者もしくは第三者）刺激細胞に露出された応答Ｔ細胞の二次応答が抑制されたことを示す。
【図６】（図５Ａ−図６Ｄは）刺激細胞同種異系ＰＢＭＣ_ｓで前に活性化され、活性化後に同種異系（同じ供与体（図５Ｂ）あるいは第三者（図６Ｄ））もしくは自己由来ＭＳＣ_ｓ（図６Ｃ）で培養され、次いで自己由来あるいは同種異系（同じ供与者もしくは第三者）刺激細胞に露出された応答Ｔ細胞の二次応答が抑制されたことを示す。
【図７】 （図７Ａ−図８Ｄは）イヌモデルの内でＭＳＣ_ｓによる一次ＭＬＲの抑制を示す。ａｕｔｏｌ＝自己由来、ｉｄｅｎｔ＝ＤＬＡ同一一腹子、ｕｎｒｅｌ＝無関係。
【図８】 （図７Ａ−図８Ｄは）イヌモデルの内でＭＳＣ_ｓによる一次ＭＬＲの抑制を示す。ａｕｔｏｌ＝自己由来、ｉｄｅｎｔ＝ＤＬＡ同一一腹子、ｕｎｒｅｌ＝無関係。
【図９】 非装着性ＭＳＣ_ｓによる一次ＭＬＲの抑制を示す。
【図１０】 実施例８で使用されたＥＧＦＰ ｐＯＴ２４プラスミド概略図を示す。

Claims (47)

1. 免疫エフェクター細胞を、免疫応答を減少するのに有効な量の分離した間葉幹細胞に生体外で接触させることを含むことを特徴とする同種異系抗原に対する免疫応答を減少する方法。
2. エフェクター細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 同種異系抗原により前もってこれまでに活性化されたＴ細胞を、該活性化されたＴ細胞の再刺激を抑制するのに有効な量の分離した間葉幹細胞に生体外で接触させることを含むことを特徴とする、活性化Ｔ細胞の再活性化を予防しあるいは減少する方法。
4. 供与者移植片による受容者に対する免疫応答を減少することを特徴とする組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
5. 分離した間葉幹細胞が受容者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
6. 分離した間葉幹細胞が受容者にとって同種異系のものであることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
7. 分離した間葉幹細胞が移植片の供与者から得られることを特徴とする請求項６記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
8. 分離した間葉幹細胞が移植片の供与者と受容者の双方にとって同種異系のものであることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
9. 移植片が皮膚であることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
10. 分離した間葉幹細胞が活性化Ｔ細胞死を誘導する分子を発現するように更に修飾されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
11. 分子がＦａｓリガンドおよびＣＤ２７から選択されることを特徴とする請求項１０記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
12. 分離した間葉幹細胞が移植片投与の前に受容者に投与されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
13. 分離した間葉幹細胞が移植片の投与と同時に投与されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
14. 分離した間葉幹細胞が移植片の一部として投与されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
15. 分離した間葉幹細胞が移植片の後に投与されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
16. 分離した間葉幹細胞が受容者による移植片の拒絶を処置するために、移植片受容者に投与されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
17. 分離した間葉幹細胞がヒトのものであることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための間葉幹細胞の使用法。
18. 更に組成物が免疫抑制剤を含む請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
19. 移植片が固形器官であることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
20. 固形器官が心臓、膵臓、腎臓、肺あるいは肝臓から選択されることを特徴とする請求項１９記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
21. 分離した間葉幹細胞が活性化Ｔ細胞死を誘導する分子を発現するよう修飾されることを特徴とする請求項４記載の組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
22. 同種異系組織への免疫応答を減少することを特徴とする組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
23. 移植片を移植片受容者から得た組織と生体外で接触させ、次いで供与者移植片を供与者移植片による受容者に対する免疫応答を減少するのに有効な量の分離した間葉幹細胞に生体外で接触させることを含むことを特徴とする、供与者移植片により生じる免疫応答を減少する方法。
24. 分離した間葉幹細胞が供与者移植片と移植片の受容者双方にとって同種異系のものであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
25. 分離した間葉幹細胞が移植片の受容者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
26. 分離した間葉幹細胞が供与者移植片にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
27. 供与者移植片が骨髄であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
28. 更に受容者に免疫抑制剤が投与されていることを特徴とする請求項２３記載の方法。
29. 分離した間葉幹細胞が活性化細胞死を誘導する分子を発現するよう修飾されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
30. 分子がＦａｓリガンドおよびＣＤ２７から選択されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
31. 対宿主性移植片病に関して移植片受容者を処置する組成物調製のための分離した間葉幹細胞の使用法。
32. 分離した間葉幹細胞が受容者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項３１記載の組成物調製のための分離した間葉幹細胞の使用法。
33. 分離した間葉幹細胞が供与者移植片にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項３２記載の組成物調製のための分離した間葉幹細胞の使用法。
34. 分離した間葉幹細胞が供与者と受容者双方にとって同種異系のものであることを特徴とする請求項３１記載の組成物調製のための分離した間葉幹細胞の使用法。
35. 更に組成物が免疫抑制剤を含むことを特徴とする請求項３１記載の組成物調製のための分離した間葉幹細胞の使用法。
36. 供与者移植片に対する有害な免疫応答を阻害しあるいは減少するのに有効な量の分離したヒト間葉幹細胞、および薬理担体を含むことを特徴とする供与者移植片に対する有害な免疫応答を減少する組成物。
37. 分離した間葉幹細胞が受容者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項３６記載の組成物。
38. 分離した間葉幹細胞が供与者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項３６記載の組成物。
39. 分離した間葉幹細胞が受容者と供与者の双方にとって同種異系のものであることを特徴とする請求項３６記載の組成物。
40. 移植片により生じる移植片受容者に対する有害な免疫応答を縮小するための組成物であって、移植片により生じる移植片受容者に対する有害な免疫応答を減少するのに有効な量の分離したヒト間葉幹細胞、および薬理担体を含むことを特徴とする移植片により生じる供与者移植片に対する有害な免疫応答を減少する組成物。
41. 分離した間葉幹細胞が受容者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項４０記載の組成物。
42. 分離した間葉幹細胞が供与者にとって自己由来のものであることを特徴とする請求項４０記載の組成物。
43. 分離した間葉幹細胞が受容者と供与者の双方にとって同種異系のものであることを特徴とする請求項４０記載の組成物。
44. 同種異系抗原に対する免疫応答を減少する組成物調製のための分離した間葉幹細胞の使用法。
45. 免疫応答がＴ細胞応答であることを特徴とする請求項４４記載の分離した間葉幹細胞の使用法。
46. 同種異系抗原により活性化されたＴ細胞の再活性化を減少する組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。
47. 移植片受容者での供与者組織への免疫応答を減少する一つの組成物を調製するための分離した間葉幹細胞の使用法。

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