CN116999461A - HLA-DR+CD8+Treg在制备试剂盒或药物中的应用 - Google Patents
HLA-DR+CD8+Treg在制备试剂盒或药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及HLA‑DR+CD8+Treg在制备试剂盒或药物中的应用。
Description
本申请是分案申请，其原申请的申请号为202310134489.0，申请日为2023年2月20日，发明名称为“一种诱导移植免疫耐受的方法、应用和移植耐受性动物模型”。
技术领域
本发明涉及HLA-DR+CD8+Treg在制备用于鉴定移植免疫耐受的哺乳动物的试剂盒或药物中的应用。本发明还涉及一种诱导移植免疫耐受的方法、应用和移植耐受性动物模型。具体而言，本发明涉及一种利用靶向mTOR的耐受性树突状细胞(Rapa-tolDC)诱导移植免疫耐受的方法、Rapa-tolDC在制备移植耐受性动物模型中的应用以及由方法制备的移植耐受性动物模型。
背景技术
器官移植是终末期器官病变的最佳治疗手段，但移植排斥反应是影响受者生活质量和长期存活的主要原因。近30年免疫抑制剂的不断发展，显著改善了移植受者的短期生存获益，但远期生存率并没有明显改变。目前临床常用的免疫抑制方案也存在许多缺陷，长期免疫抑制所致的移植物慢性失功、代谢性疾病、移植物损伤、机会感染、恶性肿瘤严重威胁患者的长期存活，且需终生服用免疫抑制剂。
诱导免疫耐受是控制排斥反应、维持受者无免疫制长期生存的最理想治疗选择。成功建立免疫耐受不仅可以解决长时间应用免疫抑制剂带来的并发症及副作用，还可以维持移植物的长期存活，具有显著医疗经济效益。然而，目前尚缺乏可应用于临床的可操作性移植免疫耐受方案，开发安全、有效诱导器官移植免疫耐受的新型技术方案，促使受体建立对供体特异性的免疫耐受状态，使免疫耐受方案转化成功应用于人，将具有重要的研究价值、巨大的临床应用前景和社会经济效益。
调节性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells，tolDC)是具有负向免疫调节功能，通过抑制T细胞增殖、抑制抗原特异性T细胞活化、介导T细胞凋亡、诱导调节性T细胞等方式发挥诱导免疫耐受的作用。应用tolDC免疫细胞过继回输治疗诱导免疫耐受是目前研究的热点。小剂量免疫抑制剂联合或单独回输tolDC均可以改善移植肝、肾、心脏的存活；活体肝移植患者单次回输利用IL-10、维生素D3联合细胞因子诱导PBMC来源tolDC安全、有效，但并未解决IS戒断，达到免疫耐受的结局。无论是否负载供体抗原，回输自体或同基因型tolDC均可以改善移植物的存活。这些均提示，过继输注tolDC有望成为解决免疫耐受的理想方案。但是，可用于临床治疗的、抑制性强大而功能稳定的tolDC相关报道较少。
诱导产生具有供体特异性免疫抑制的tolDC是目前临床研究面临的首要问题。在目前临床常用的多种免疫抑制剂中，Rapa能诱导具有耐受性的抗成熟tolDC，促进Treg的分化、增殖与抑制性，CsA没有作用，激素与MPA有抑制效应；雷帕霉素(Rapa)戒断具有促进长期生存肝移植产生免疫耐受的优势，虽然样本量小，但提示Rapa可能在诱导免疫耐受方面具有独特的优势；Rapa同时能诱导功能稳定的抗成熟性tolDC，促进Treg的分化，而临床常用的CsA没有作用，激素与MPA有抑制效应。但是目前关于Rapa诱导的tolDC临床研究的尚无报道，在动物肝移植中的研究也较少。
专利CN202210978763.8的公开文本CN115044553A公开了一种靶向mTOR的耐受性树突状细胞及其制备方法与应用，其获得了耐受性稳定的tolDC。
然而，如何确定细胞治疗的剂量、时间与频率以建立标准化的治疗方案仍然是解决tolDC免疫治疗所面临的重要问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种诱导移植免疫耐受的方法。
本发明的另一目的在于提供Rapa-tolDC在制备移植耐受性动物模型中的应用。
本发明的又一目的在于提供由上述方法制备的移植耐受性动物模型。
本发明在同一申请人的先前申请CN202210978763.8的基础上，进一步研究了Rapa-tolDC过继回输逆转或抑制排斥反应、诱导免疫耐受的效果，同时采用对照tolDC(既往方案)进行比较，确定了最有希望成功诱导免疫耐受的治疗方案，能够极大地减少死亡率，而且使受试者的生存时间明显延长。进而，对免疫耐受的机理进行了研究，发现高表达MHC-II+的CD8+CD45RClow/-Treg(MHC-II+CD8+Treg)是发挥供体特异性免疫抑制的主要和关键细胞亚群，此外，还发现MHC-II是来源于Rapa-tolDC，而非CD8+CD45RClow/-Treg自身表达，具有供体特异性抑制作用。从而形成本发明。
具体而言，一方面，本发明提供了一种诱导移植免疫耐受的方法，所述方法包括对经移植的哺乳动物施用靶向mTOR的耐受性树突状细胞(Rapa-tolDC)，其采用术前预刺激和术后回输的方案进行。
本发明的靶向mTOR的耐受性树突状细胞(Rapa-tolDC)，为采用专利CN202210978763.8所述的方法制备，其具有Siglec1、Spp1基因下调的转录谱，PI3K/mTOR表达缺失，具有选择性的负向调控效应。此外，该Rapa-tolDC，表达DC的标记CD11c，与成熟DC相比，低表达表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II，分泌相对较高的IL-10和低水平的INF-γ；能诱导产生多种类型调节性免疫细胞，能产生具有供体特异性的CD8+调节性T细胞。
根据本发明的具体实施方案，所述方法采用术前预刺激+术后1个月内1至3次回输的方案进行。
根据本发明的具体实施方案，所述方法采用术前7天预刺激+术后当天回输的方案进行。
根据本发明的具体实施方案，所述方法采用术前7天预刺激+术后第7天回输的方案进行。
根据本发明的具体实施方案，所述方法采用术前7天预刺激+术后第7天、14天与28天回输的方案进行。
根据本发明的具体实施方案，当所述哺乳动物是大鼠时，根据大鼠的体重和手术实际情况，每次回输的有效细胞数为1×106-1×107。当所述哺乳动物是除大鼠之外的其他哺乳动物时，每次回输的有效细胞数可由本领域技术人员进行适当的换算，例如参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》(2002年)，按照等效剂量系数折算法，经计算，以单位体重的剂量计，大鼠的等效剂量约相当于人的6.3倍。
根据本发明的具体实施方案，所述Rapa-tolDC在移植物中诱导高表达MHC-II+的CD8+CD45RClow/-Treg(MHC-II+CD8+Treg)的产生。
根据本发明的具体实施方案，所述移植包括细胞移植、器官移植或组织移植；其中细胞移植包括干细胞移植、调节性细胞移植、胰岛细胞移植或效应性细胞移植；器官移植包括肾移植、肝移植、心脏移植、小肠移植、肺移植、胰腺移植、或者联合器官移植；组织移植包括角膜移植、肢体移植或脸移植，优选肝移植。
根据本发明的具体实施方案，所述哺乳动物为大鼠、小鼠、猪、兔、犬、猫、马、牛、羊、猴、猩猩或人。
根据本发明的具体实施方案，所述Rapa-tolDC通过包括下述的方法制备：
取骨髓间充质干细胞或外周血PMBC，以含1％-10％的FBS的无酚红的培养液贴壁培养获取DC的前体细胞，加入含有GM-CSF和IL-4的完全培养基；培养第2天全量换液，第4天半量换液，并补充细胞因子GM-CSF与IL-4，维持浓度不变，并且在第2天与第4天换液时加入雷帕霉素；培养至第6天，半量换液，补充GM-CSF维持浓度不变，并且加入LPS，继续培养。
根据本发明的优选实施方案，GM-CSF的浓度为1-40ng/ml，IL-4的浓度为0.5-20ng/ml，雷帕霉素的浓度为1-40nM，LPS浓度为0.01-1μg/ml，
根据本发明的优选实施方案，GM-CSF与IL-4的浓度比例为2:1；在第2天与第4天换液时加入雷帕霉素的浓度分别为10nM，第6天LPS的加入量为0.05μg/mL。
另一方面，本发明还提供了上述方法限定的Rapa-tolDC在制备移植耐受性动物模型中的应用。
又一方面，本发明还提供了通过上述方法制备的移植耐受性动物模型。
又一方面，本发明还提供了制备移植耐受性动物模型的方法，其通过上述方法进行。例如，其可以通过对现有的急性排斥动物模型施用靶向mTOR的耐受性树突状细胞(Rapa-tolDC)进行本发明的方法(即术前预刺激和术后回输)而制备。
本发明中，进一步研究了Rapa-tolDC过继回逆转或抑制排斥反应、诱导免疫耐受的效果，同时采用对照tolDC(既往方案)进行比较，确定了最有希望成功诱导免疫耐受的治疗方案，能够极大地减少死亡率，而且使受试者的生存时间明显延长。同时，利用本发明的方法能够简单、快速地制备移植耐受性动物模型，为tolDC治疗的机理研究提供重要的模型动物。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，使得本发明的其它特征、目的和优点变得更明显。本发明的示意性实施例附图及其说明用于解释本发明，并不构成对发明范围的不当限定。
图1是单次输注Rapa-tolDC大鼠移植肝HE染色与对照组对比结果图。
图2是单次输注不同耐受性DC的大鼠生存时间曲线图。
图3是根据本发明一实施例的过继输注Rapa-tolDC诱导肝移植大鼠免疫耐受的技术方案流程示意图。
图4是按照图3技术流程方案过继输注Rapa-tolDC大鼠的生存时间曲线图。
图5是图4实施例中过继输注Rapa-tolDC大鼠移植肝HE染色结果图。
图6是图5实施例中过继输注Rapa-tolDC大鼠移植肝MHC-II+CD8+Treg及其分泌IL-10、INF-γ的结果图。
图7是MHC-II+CD8+Treg表面MHC-II分子来源的共聚焦成像结果图。
图8是Rapa-tolDC诱导MHC-II+CD8+Treg产生的流式分析结果图。
图9是实施例中诱导产生的MHC-II+CD8+Treg供体特异性抑制作用的流式结果图。
图10是自发临床耐受和稳定存活的肝移植患者体内HLA-DR+CD8+Treg的表达结果图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行更详细地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，本发明并不受限于此。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护范围。
需要说明的是，实施例中所用到的各种生物试剂、材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到发明具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。实际上，任何不违反法律和伦理道德能够获取的生物试剂、材料，包括来源于大鼠、小鼠、猪等哺乳动物或人的离体细胞、或从细胞库取得、或从商业途径购买获得、或按照已有文献制备获取，均可以按照本发明中实施例中的提示进行替换使用。
实施例中未特别注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。
实施例1、致耐受性免疫细胞制剂的制备方法
制备方法严格按照CN202210978763.8的公开文本CN115044553A的实施例1的所述的方法，制备出靶向mTOR的耐受性树突状细胞(Rapa-tolDC)，其为具有致耐受特性的免疫细胞制剂。
实施例2、不同致耐受性免疫细胞制剂逆转排斥反应或诱导耐受的效果分析
本实施例中，考察了本发明的致耐受性免疫细胞制剂(Rapa-tolDC)过继回输逆转或抑制排斥反应、诱导免疫耐受的效果，同时采用对照tolDC(既往方案)进行比较。
方案一：单次输注靶向mTOR的耐受性DC减轻移植肝排斥反应程度，延长生存时间
利用实施例1制备的靶向mTOR，按照术前7天预刺激+术后当天回输的方案，根据大鼠体重和手术的实际情况，每次回输的有效细胞数为1×106-1×107，移植肝大鼠的中位生存时间延长为37天，而对照组tolDC输注后，移植肝大鼠的中位生存时间延长为32天。HE染色提示与急排移植大鼠相比，二者的移植肝中淋巴细胞的浸润明显减少(图1的A-C)。以上提示，移植肝大鼠过继输注耐属性DC抑制急排反应是安全、可行的。
方案二：改变单次输注时间点，有效延长大鼠生存时间同时，降低围手术期死亡率
利用实施例1制备的靶向mTOR，按照术前7天预刺激+术后7天回输的方案，根据大鼠体重和手术的实际情况，每次回输的有效细胞数为1×106-1×107，术中采用小剂量激素干预，移植肝大鼠的中位生存时间延长为45天，围手术期无死亡率发生(图2，包含围手术死亡)，避免手术当天过继输注诱导全身的免疫炎症反应导致的死亡(方案一、对照组输注当天死亡率10-15％)，HE染色可见急性排斥反应的病变程度较轻(图1的D)。
这些均提示进一步证实，靶向mTOR的耐受性DC单次回输安全、可行，改变输注的时间点可以有效提高输注的安全性。
方案三：术前预刺激+术后三次过继输注的方案，具有诱导免疫耐受的潜力
为了进一步验证Rapa-tolDC诱导免疫耐受的有效性，寻找过继输注靶向mTOR的耐受性DC建立免疫耐受的可行性方案，我们在上述单次过继输注Rapa-tolDC研究的基础上，进行了不同过继输注治疗方案安全性及有效性的探索。以BN为受体，Lewis为供体建立大鼠急排模型，以Lewis为受体，BN为供体建立自发性大鼠肝移植模型，以Rapa-tolDC作为干预的手段。我们将回输的时间点改为术后7天，14天与28天，术中方案不变(图3)，可以看到与术后单次过继输注相比，Rapa-tolDC过继输注大鼠的生存时间明显延长，中位生存时间可达65天(急排大鼠中位生存时间9天)(图4)，Rapa-tolDC过继输注大鼠移植肝肉眼可见与自发性耐受大鼠移植肝接近正常，无肉眼可见的排斥反应表现；移植肝组织病理染色发现，肝小叶结构基本正常，炎症反应程度轻，淋巴细胞浸润较少，主要集中在汇管区(图5)，镜下无病理证实的急性排斥反应表现，RAI指数与自发免疫耐受组无差异(1.75±0.957vs.1.25±0.50)。
以上这些均提示，本发明基于靶向mTOR的耐受性DC的过继输注治疗方案能诱导免疫耐受的产生。
实施例3、输注不同耐受性树突状细胞大鼠移植肝中高表达CD8+CD45RClow/-Treg是发生免疫耐受的基础
取新鲜的大鼠移植织组织剪碎、碾磨，组织细胞培养液RMPI-1640稀释制成混悬液，以200目筛网过滤2-3次，提取细胞悬液，以组织淋巴细胞提取液Ficoll离心法提取单个核细胞，加1×PBS洗一次，弃上清，加200μl 1×PBS混匀备用，分别加入5μl小鼠抗大鼠的单克隆抗体FITC-CD8，PE-CD45RC和Percp-TCRαβ(购自美国BD公司)充分混匀后，室温、避光孵育15min，弃上清，以1×PBS 500μl吹打混匀，用流式细胞仪检测CD8+CD45RClow/-Treg的表达水平。
流式细胞检测结果显示，与对照组(tolDC)相比，方案一中回输靶向mTOR的耐受性DC大鼠移植肝中CD8+CD45RClow/-Treg表达分为别(92.8±7.89vs.89.6±3.29)；方案二和方案三移植肝中CD8+CD45RClow/-Treg表达平均维持在92％-95％之间。检测结果表明，靶向mTOR的耐受性DC促进免疫耐受的发生需维持较高水平的CD8+Treg水平。
以上说明，方案三“术前预刺激+术后三次过继输注”，是最有希望成功诱导免疫耐受的治疗方案。下面实施例中如无特殊仅对方案三与对照组进行比较分析。
实施例4高表达MHC-II+的CD8+CD45RClow/-Treg可能在诱导肝移植免疫耐受发生的主要和关键亚群
过继输注Rapa-tolDC和自发耐受的大鼠移植肝中高表达分泌IL-10的MHC-II+CD8+
CD45RClow/-Treg
按照实施例3的实验方法，在染色前先利用莫能霉素、离子霉素刺激4-6h，膜抗体染色方案同前，破膜后加入5μl小鼠抗大鼠的单克隆抗体AF647-IL-10(购自美国BD公司)，充分混匀后，室温、避光孵育60min，加入破膜缓冲液2ml，离心，弃上清，以1×PBS 500μl吹打混匀，用流式细胞仪检测MHC-II+CD8+CD45RClow/-Treg的表达水平。
检测结果表明，在过继输注Rapa-tolDC和自发耐受的大鼠移植肝中高表达MHC-II+CD8+CD45RClow/-Treg，而在急排大鼠移植肝中几乎不表达；在对照组大鼠移植肝中，MHC-II+CD8+CD45RClow/-Treg的水平也明显降低(图6的A)。进一步对其分泌IL-10的水平和INF-γ的能力进行分析发现，过继输注Rapa-tolDC和自发耐受的大鼠表达较高水平IL-10的MHC-II+CD8+CD45RClow/-Treg，明显高于急排和对照组(图6的B)，而INF-γ的水平明显降低(图6的C)。
MHC-II+CD8+CD45RClow/-Treg是CD8+CD45RClow/-Treg中分泌IL-10的主要来源，而并 非MHC-II-亚群，是诱导耐受的关键细胞亚群。
在发明专利申请CN202210978763.8中，我们利用靶向mTOR的耐受性DC诱导产生高分泌IL-10的CD8+CD45RClow/-Treg，根据上述结果，我们利用MHC-II将其分为阳性和阴性群，按照上述相同的染色方案流式检测后，分析可以发现，发现不管是CD8+CD45RClowTreg还是MHC-II+CD8+Treg，其分泌IL-10的水平均在60％以上，进一步分析发现，虽然MHC-II+CD8+Treg的比例仅在20％-30％之间，但MHC-II+CD8+Treg分泌IL-10的水平占CD8+CD45RClowTreg中IL-10分泌总水平的79.97％，是MHC-II-CD8+Treg分泌IL-10水平的3.5倍以上。
以上这些均提示，MHC-II+CD8+CD45RClow/-Treg是在诱导免疫耐受中发生中发挥重要作用的关键细胞亚群。在发明专利申请CN202210978763.8中，我们发现CD8+CD45RClow/-Treg可以特异性的抑制效应T细胞的增殖，基于上述结果，我们认为表达MHC-II+的CD8+CD45RClow/-Treg也是CD8+CD45RClow/-Treg发挥供体特异性免疫科抑制的主要亚群。
实施例5MHC-II是来源于Rapa-tolDC，而非CD8+CD45RClow/-Treg自身表达，是具有供体特异性抑制作用的
我们利用PKH26和CFSE生物荧光素标记分别标记Rapa-tolDC和CD8+CD45RClow/-Treg，混合培养7天后，激光共聚焦显微镜下观察相互融合的细胞；利用流式细胞检测双荧光素标记的双阳性细胞亚群的比例，其表达MHC-II的双阳性细胞亚群的比例。
利用激光共聚焦显微镜成像观察到CFSE标记绿色荧光CD8+CD45RClowTreg表面获得部分PKH26标记的红色Rapa-tolDC部分，流式细胞技术初步证明，生物荧光素标记的两种细胞混合后，MHC-II+CD8+Treg表面的MHC-II分子来源于树突状细胞(图7)，比例显著增加，1-MT干预可以抑制其表达，1-MT可以上调其表达，以上均提示，表面MHC-II来源于Rapa-tolDC(图8的A)。
为了避免生物荧光素对表达量的影响，我们在没有荧光素标记的情况下重复上述实验，利用1-MT阻断IDO通路后，发现虽然CD8+CD45RClowTreg的表达无明显差异，但是MHC-II+CD8+Treg的水平显著降低；而IDO的类似物3-4，DAA干预后可以上调CD8+CD45RClowTreg、MHC-II+CD8+Treg的水平(图8的B-D)。
按照发明专利申请CN202210978763.8中的实验步骤，重复供体特异性的抑制实验，发现MHC-II+CD8+Treg具有很强的供体特异性抑制作用，该特异性抑制效应被第三方来源的抗原刺激打破(图9)。以上均提示，MHC-II是来源于Rapa-tolDC，而非CD8+CD45RClow/-Treg自身表达，是具有供体特异性抑制作用的
实施例6临床自发耐受的患者也出现高表达HLA-DR+CD8+Treg表达
在未服用任何免疫抑制剂的情况下存活1年以上，肝功能维持正常，被认为是临床可操作性耐受。我们在临床诊疗中发现，3例因肝硬化终末期行肝移植达到上述所说的临床可操作性耐受，并在大量长期存活的患者中(大于3年)，通过流式细胞术检测，我们观察到外周血中HLA-DR+CD8+Treg即MHC-II+CD8+Tregs处于高表达水平(图10的A)。这些结果明显高于急性排斥反应患者(图10的B)。这些均提示，在免疫耐受的过程中，HLA-DR+CD8+Treg发挥重要作用，其可能是免疫耐受易于发生的分子标记。
以上实施例仅是为了充分说明本发明所列出的较优的具体实施例，本发明的保护范围不限于此。本领域技术人员，在本发明基础上所进行的任何修改、等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.HLA-DR+CD8+Treg在制备用于鉴定移植免疫耐受的哺乳动物的试剂盒或药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述移植包括细胞移植、器官移植或组织移植。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞移植包括干细胞移植、调节性细胞移植、胰岛细胞移植或效应性细胞移植。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述器官移植包括肾移植、肝移植、心脏移植、小肠移植、肺移植、胰腺移植、或者联合器官移植。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述器官移植是肝移植。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组织移植包括角膜移植、肢体移植或脸移植。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为大鼠、小鼠、猪、兔、犬、猫、马、牛、羊、猴、猩猩或人。
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