JP2002528398A

JP2002528398A - ストローマ細胞の使用

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Publication number: JP2002528398A
Application number: JP2000577888A
Authority: JP
Inventors: プロコツプ，ダーウイン・ジエイ; レイス，ラツセル・ジー; ランゲル，ジヨン
Original assignee: フイラデルフイア・ヘルス・アンド・エデユケーシヨン・コーポレーシヨン
Priority date: 1998-10-26
Filing date: 1999-10-26
Publication date: 2002-09-03
Also published as: CA2348770A1; US20080102058A1; EP1124428A4; AU766064B2; EP1124428A1; US20020058025A1; WO2000024261A1; US20040208861A1; AU1234700A

Abstract

(57)【要約】本発明は哺乳動物における造血を高めるための骨髄ストローマ細胞の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明の分野は造血を高めることにおける骨髄ストローマ細胞の使用である。

【０００２】（発明の背景）骨髄は、造血幹細胞（ＨＳＣ）に加えて、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞およ
び筋芽細胞のような非造血細胞の幹様前駆細胞を含有する（オーウェン（Ｏｗｅ
ｎ）ら、１９８８、ＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＨａｒｄＴｉｓｓｕｅｓ中、ｐ．４２−６０、
ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ１３６、英国チチェス
ター；カプラン（Ｃａｐｌａｎ）、１９９１、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．９：
６４１−６５０；プロコップ（Ｐｒｏｃｋｏｐ）、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７６：７１−７４）。骨髄の非造血前駆細胞は、コロニー形成単位線維芽細胞
、間葉幹細胞、ストローマ細胞および骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）と多様に称
されている。

【０００３】ＭＳＣは、骨髄細胞を哺乳動物から取り出しそしてプラスチック皿に移す場合
のそれらの接着特性を特徴とする間葉前駆細胞である（フリーデンシュタイン（
Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ）ら、１９７６、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．４：２６７−
２７４）。ストローマ細胞は約４時間以内にプラスチックに接着するので、皿か
ら非接着性細胞を除去することにより単離することができる。プラスチックにし
っかりと接着する骨髄細胞は広範囲に研究されている（カストロ−マラスピナ（
Ｃａｓｔｒｏ−Ｍａｌａｓｐｉｎａ）ら、１９８０、Ｂｌｏｏｄ５６：２８９
−３０１；ピエルスマ（Ｐｉｅｒｓｍａ）ら、１９８５、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ
ｌ．１３：２３７−２４３；シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｓ）ら、１９９１、Ｂｌｏ
ｏｄ７８：５５−６２；ベレスフォード（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ）ら、１９９２
、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１０２：３４１−３５１；リースヴェルド（Ｌｉｅｓ
ｖｅｌｄ）ら、１９８９、Ｂｌｏｏｄ７３：１７９４−１８００；リースヴェ
ルド（Ｌｉｅｓｖｅｌｄ）ら、１９９０、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９：６３
−７０；ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、１９９１、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．９
９：１３１−１３９）。

【０００４】ストローマ細胞は、インビボで骨髄内の微小環境の創製に参画していると考え
られている。単離された場合、ストローマ細胞は当初静止状態であるが、しかし
、それらをインビトロで培養することができるようについには分割を開始する。
拡張された数のストローマ細胞を樹立かつ維持することができる。ストローマ細
胞は、適切な条件下で培養される場合に、線維芽細胞、脂肪細胞および骨形成細
胞のコロニーを生成させるのに使用されている。ヒドロコルチゾンの存在下もし
くは他の選択条件下で接着性細胞を培養する場合に、造血前駆細胞もしくは骨原
細胞について濃縮された集団が得られる（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、１９９
２、Ｂｌｏｏｄ７９：３５６−３６４およびビエンツレ（Ｂｉｅｎｚｌｅ）ら
、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３５０−
３５４）。

【０００５】ストローマ細胞の使用のいくつかの例が存在する。欧州特許第ＥＰ０，３８
１，４９０号はストローマ細胞を使用する遺伝子治療を開示する。とりわけ血友
病の治療方法が開示される。ストローマ細胞は、インビボで選択的組織に埋植さ
れる場合に、線維組織、骨もしくは軟骨を生じさせるのに使用されている（大串
（Ｏｈｇｕｓｈｉ）ら、１９８９、ＡｃｔａＯｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．６０
：３３４−３３９；中原（Ｎａｋａｈａｒａ）ら、１９９２、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ
．Ｒｅｓ．９：４６５−４７６；ニエドツヴィエドスキ（Ｎｉｅｄｚｗｉｅｄｓ
ｋｉ）ら、１９９３、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１４：１１５−１２１；およ
び脇谷（Ｗａｋｉｔａｎｉ）ら、１９９４、Ｊ．Ｂｏｎｅ＆Ｓｕｒｇ．７６
Ａ：５７９−５９２）。いくつかの報告では、多孔質セラミックとともに皮下に
（大串（Ｏｈｇｕｓｈｉ）ら、１９８９、Ａｃｔａ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ
．６０：３３４−３３９）、拡散チャンバー中で腹腔内に（中原（Ｎａｋａｈａ
ｒａ）ら、１９９１、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．９：４６５−４７６）、外科
的に誘発された骨欠損に経皮で（ニエドツヴィエドスキ（Ｎｉｅｄｚｗｉｅｄｓ
ｋｉ）ら、１９９３、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１４：１１５−１２１）埋植
される、もしくは関節軟骨中の外科的欠損を修復するためにコラーゲンゲル内で
移植される（脇谷（Ｗａｋｉｔａｎｉ）ら、１９９４、Ｊ．ＢｏｎｅＳｕｒｇ
．７６Ａ：５７９−５９２）場合に、インビボで骨もしくは軟骨を生成させるの
にストローマ細胞を使用した。ピエルスマ（Ｐｉｅｒｓｍａ）ら（１９８３、Ｂ
ｒｉｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９４：２８５−２９０）は、静脈内骨髄移植後に
、造血ストローマを形成する線維芽細胞コロニー形成細胞が宿主骨髄中に入りか
つ留まることを開示している。スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（１９９３、
Ｂｌｏｏｄ８１：２５６６−２５７１）は、全骨髄細胞の異常に大量かつ繰り
返される投与が、骨髄離解を受けていなかったマウスへの造血前駆細胞の長期の
生着を生じさせたことを最近観察した。また、ビエンツレ（Ｂｉｅｎｚｌｅ）ら
（１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３５０−
３５４）は、骨髄離解を伴わないイヌで造血細胞を永続的に生息させるためのド
ナー細胞として長期骨髄培養物を成功裏に使用した。いくつかの報告では、造血
前駆細胞の培養物の微小環境を樹立する細胞（アンクレサリア（Ａｎｋｌｅｓａ
ｒｉａ）、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：
７６８１−７６８５）もしくは造血幹細胞の濃縮された集団の供給源（キーファ
ー（Ｋｉｅｆｅｒ）、１９９１、Ｂｌｏｏｄ７８：２５７７−２５８２）のい
ずれかとしてストローマ細胞を使用した。

【０００６】離解された骨髄を有する哺乳動物における造血の回復を高める方法に対する長
い間の切実なかつ緊急の必要性が存在する。本発明はこの必要性に合致する。

【０００７】（発明の要約）本発明は致死線量の全身照射からの哺乳動物の救助方法に関する。該方法は、
照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの
骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより該哺乳動物を致死線量の全身照射から
救助することを含んで成る。

【０００８】一局面において、哺乳動物はげっ歯類、ウマ、雌牛、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒ
トの霊長類およびヒトより成る群から選択される。別の局面において、哺乳動物
はヒトである。

【０００９】別の局面において、投与は注入である。

【００１０】本発明は哺乳動物における造血を高める方法もまた包含する。該方法は、哺乳
動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ
細胞を投与してそれにより該哺乳動物における造血を高めることを含んで成る。

【００１１】一局面において、哺乳動物はげっ歯類、ウマ、雌牛、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒ
トの霊長類およびヒトより成る群から選択される。別の局面において、哺乳動物
はヒトである。

【００１２】別の局面において、投与は注入である。

【００１３】加えて、致死線量の全身照射を与えられた哺乳動物における造血幹細胞の分化
を高める方法が提供される。該方法は、照射された哺乳動物に同種異系のしかし
それ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれによ
り該哺乳動物における造血幹細胞の分化を高めることを含んで成る。

【００１４】一局面において、哺乳動物はげっ歯類、ウマ、雌牛、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒ
トの霊長類およびヒトより成る群から選択される。別の局面において、哺乳動物
はヒトである。

【００１５】別の局面において、投与は注入である。

【００１６】致死線量の全身照射を与えられた哺乳動物における造血の回復を高める方法も
また本発明に包含される。該方法は、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそ
れ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより
前記哺乳動物における造血の回復を高めることを含んで成る。

【００１７】離解された骨髄を含んで成る哺乳動物の処置方法もまた本発明に包含される。
該方法は、哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの
骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより離解された骨髄を含んで成る哺乳動物
を処置することを含んで成る。

【００１８】本発明は、離解された骨髄を含んで成る哺乳動物における造血を高める方法も
また包含する。該方法は、哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー
哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより離解された骨髄を含ん
で成る哺乳動物における造血を高めることを含んで成る。

【００１９】本発明は、致死線量の全身照射に曝露された哺乳動物の生存の増大方法を包含
する。該方法は、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナ
ー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより致死線量の全身照射
に曝露された哺乳動物の生存を増大させることを含んで成る。

【００２０】（発明の詳細な記述）本発明は、致死的（しかし骨髄離解性(myloablative)でない）線量の全身照射
（ＴＢＩ）を受領するラットを、照射直後に投与される同種異系の骨髄ストロー
マ細胞の腹腔内注入により救助できる可能性があるという発見に基づく。同種異
系のＭＳＣはレシピエント動物における造血の回復を高める。しかしながら、救
助された動物中の循環するＰＢＬは、該細胞がレシピエントの固有のＭＨＣク
ラスＩＩ抗原を発現しかつドナーのクラスＩＭＨＣ抗原を発現しないという事
実により立証されるとおり、ドナー動物由来でなかった。さらに、１μｇのレシ
ピエントの雌性ＷＦのＤＮＡ中の１０ｎｇ程度のドナーの雄性ＬＥＷラットのＹ
染色体特異的ＤＮＡを検出することが可能な高度に感受性の実時間ＰＣＲに基づ
くアッセイは、レシピエント動物の身体からの多様な組織から得られたゲノムＤ
ＮＡのサンプル中で雄性ＬＥＷラットＤＮＡの存在を検出しなかった。さらに、
骨髄離解線量のＴＢＩで照射された動物はドナーのＭＳＣの投与により救助され
なかった。これらの結果は、ドナーのＭＳＣが、放射により排除されていない動
物自身の造血幹細胞（ＨＳＣ）の造血の回復を高めることことにより致死線量の
放射から動物を救助することができることを立証する。定義本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、このセクションでそ
れに関連した意味を有する。

【００２１】冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書で１個もしくは１個以上（すなわち最
低１個）の冠詞の文法上の目的語を指すのに使用する。例として、「１個の（ａ
ｎ）要素」は１個の要素もしくは１個以上の要素を意味する。

【００２２】本明細書で使用されるところの「ストローマ細胞」、「骨髄ストローマ細胞」
、「接着細胞」および「ＭＳＣ」は互換可能に使用され、そして、プラスチック
皿に接着するそれらの能力により骨髄から単離することができる、骨細胞、軟骨
細胞および脂肪細胞などの幹細胞様前駆細胞としてはたらく可能性のある骨髄中
の細胞の小画分を指すことを意味している。骨髄ストローマ細胞はいかなる動物
由来であってもよい。いくつかの態様において、ストローマ細胞はげっ歯類、好
ましくはラット由来である。しかしながら、本発明はげっ歯類のＭＳＣに制限さ
れず；むしろ、本発明は哺乳動物、より好ましくはヒトの骨髄ストローマ細胞を
包含する。

【００２３】その用語が本明細書で使用されるところの「離解された骨髄」という用語によ
り、骨髄は造血が可能でないがしかし成長および分化が可能な造血幹細胞が全く
欠けているわけではないことを意味している。離解は照射、化学療法、もしくは
造血を離解するいずれかの他の方法により引き起こすことができる。

【００２４】該用語が本明細書で使用されるところの「致死線量の全身照射」という用語に
より、骨髄離解性でないがしかし照射された動物の５０％以上を別の方法で殺す
全身照射を意味している。

【００２５】好ましい一態様において、ラットにおける致死線量は９００ｃＧｙの全身照射
であると決定された。しかしながら、当業者は、いずれかの動物に対する致死放
射線量が、動物の大きさ、齢および身体状態などを包含する多様な因子に依存し
て変動することができることを認識するであろう。従って、本発明はいずれかの
特定の致死線量に制限されていると解釈されるべきでなく；むしろ、広範な致死
線量が本発明に包含される。

【００２６】その用語が本明細書で使用されるところの「骨髄離解性」という用語により、
固有の造血をいずれかの方法もしくは治療により回復することができないように
処置が造血幹細胞の全部もしくは相当な部分を破壊することを意味している。

【００２７】本明細書で使用されるところの「固有の造血」という用語は、該動物自身の造
血幹細胞由来の末梢血リンパ球の産生を意味することを意図している。

【００２８】好ましい一態様において、動物のＰＢＬで発現されるＭＨＣ抗原の蛍光表示式
細胞分取器分析により固有の造血を検出した。別の好ましい態様においては、ド
ナーＤＮＡ（例えば雄性ラットＹ染色体特異的ＤＮＡ）に特異的なプローブおよ
びプライマーを使用する実時間ＰＣＲにより、骨髄ストローマ細胞のドナー動物
からの外因性ＤＮＡの欠如を確認した。しかしながら本発明は、観察された造血
の固有の性質を確認するためのＰＢＬの起源のこれらの検出方法に制限されるべ
きでない。さらに、本発明は、開示される特定のＭＨＣ抗体または特定のプライ
マー対もしくはプローブに制限されない。むしろ、本発明は、現在技術的に既知
のもしくは動物における造血細胞の起源を確かめるために開発されるはずである
他の方法を包含する。

【００２９】該用語が本明細書で使用されるところの「造血の回復を高める」という用語に
より、処置前の動物、もしくはそれ以外は同一のしかし処置されない動物におけ
る造血に比較しての、処置により引き起こされる動物で検出される造血のいかな
る増大も意味している。

【００３０】該用語が本明細書で使用されるところの「離解された骨髄を含んで成る哺乳動
物の処置」という用語により、処置前の動物、もしくは処置されないそれ以外は
同一の動物に比較しての、いずれかの方法による動物における固有の造血の増大
を意味している。固有の造血の増大は、本明細書に開示される方法、もしくは動
物における固有の造血のいずれかの他の評価方法を使用して評価することができ
る。

【００３１】本明細書で使用されるところの「致死線量の全身照射からの哺乳動物の救助」
という用語は、処置前の動物における固有の造血、もしくは処置されないそれ以
外は同一の動物における固有の造血に比較しての、致死線量の全身照射に曝露さ
れた動物におけるいずれかの処置による固有の造血の増大を意味する。固有の造
血の増大は、本明細書に開示される方法もしくは動物の固有の造血のいずれかの
他の評価方法を使用して評価することができる。

【００３２】該用語が本明細書で使用されるところの「致死線量の全身照射に曝露された哺
乳動物の生存の増大」という用語により、致死線量の全身照射への曝露後に哺乳
動物が生存する時間の期間の増大を意味している。照射後の生存時間の長さを測
定することができ、また、生存時間のいかなる有意の増大も、処置されないそれ
以外は同一の哺乳動物の生存の長さに比較して照射された哺乳動物の生存を増大
させる方法を決定することができるような、本明細書に開示されるようなもしく
は当該技術分野で公知であるような標準的な統計学的分析方法を使用して、測定
することが可能である。記述本発明は、致死線量の全身照射からの哺乳動物の救助方法を包含する。該方法
は、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物か
らの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより該哺乳動物を致死線量の全身照射
から救助することを含んで成る。本発明は、放射線量が骨髄離解性でない照射さ
れた動物へのＭＳＣの投与が該哺乳動物の造血系の固有の再個体数増加(repopul
ation)を媒介するという本明細書に開示される新規発見に基づく。

【００３３】好ましい一態様において、５００万個のＭＳＣを注入によりラットに腹腔内に
投与した。しかしながら、本発明は、細胞の本投与方法もしくはいずれかの特定
の数の細胞に制限されない。むしろ、細胞は、静脈内輸液などを包含するいずれ
かの手段により動物に投与（例えば導入）してよい。さらに、投与されるべきＭ
ＳＣの数は処置されている動物により変動するであろうし、また、ＭＳＣの適切
な数は、上に引用された参考文献で論考されおよび本明細書の別の場所に開示さ
れるとおり、造血に影響を及ぼすためのストローマ細胞の使用の当該技術分野で
公知の方法により、その動物について容易に決定することができる。

【００３４】ストローマ細胞を単離した後、単離に際して、もしくはインビトロ培養の期間
の後に、細胞を哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。単離された
ストローマ細胞は、単離に際して投与してよいか、もしくは、単離後約１時間以
内に投与してよい。一般には、ドナーが大型でありかつレシピエントが小型であ
る（例えば幼児）状況においては、骨髄ストローマ細胞を単離に際して直ちに投
与してよい。ストローマ細胞を投与に先立ち培養することが好ましい。単離され
たストローマ細胞は１時間から１年を越えるまで培養することが可能である。い
くつかの好ましい態様においては、単離されたストローマ細胞を、投与に先立ち
、それらを非循環細胞から複製する細胞に転化させるのに十分な時間の期間の間
、培養する。いくつかの態様においては、単離されたストローマ細胞は３〜３０
日、好ましくは５〜１４日、より好ましくは７〜１０日間培養する。他の態様に
おいては、単離されたストローマ細胞を４週ないし１年、好ましくは６週ないし
１０ヶ月、より好ましくは３〜６ヶ月間培養する。

【００３５】ストローマ細胞を投与に先立ち培養することが好ましい。単離されたストロー
マ細胞は、投与に先立ち３〜３０日、いくつかの態様において５〜１４日、他の
態様においては７〜１０日間培養することが可能である。いくつかの態様におい
ては、単離されたストローマ細胞を、投与に先立ち４週ないし１年、いくつかの
態様においては６週ないし１０ヶ月、いくつかの態様においては３〜６ヶ月間培
養する。

【００３６】ヒトへのストローマ細胞の投与のために、単離されたストローマ細胞を培養皿
から取り出し、生理的食塩水で洗浄し、ペレットに遠心分離し、そしてブドウ糖
溶液に再懸濁し、これを患者に注入する。いくつかの態様においては、ＭＳＣの
投与に先立ち骨髄離解(bone marrow ablation)（しかし骨髄離解(myloablation)
でなく）に着手する。シクロスポリンのような作用物質により抑制される免疫応
答もまた考慮しなければならない。骨髄離解は、処置されるべき個体のＸ線放射
、シクロホスファミドのような薬物の投与、もしくはＸ線放射および薬物投与の
組み合わせにより達成してよい。いくつかの態様においては、骨髄離解は、例え
ば放射活性ストロンチウム、¹³⁵サマリウムもしくは¹⁶⁶ホルミウムのような転移
性骨細胞を殺すことが既知の放射性同位元素の投与により生じさせる（アップル
バウム（Ａｐｐｌｅｂａｕｍ）ら、１９９２、Ｂｌｏｏｄ８０（６）：１６０
８−１６１３を参照されたい）。

【００３７】体重１００ｋｇあたり約１０⁵個と約１０¹³個との間の骨髄ストローマ細胞を
１注入あたりで投与する。いくつかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約
１．５×１０⁶個と約１．５×１０¹²個との間の細胞を静脈内に注入する。いく
つかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約１×１０⁹個と約５×１０¹¹個
との間の細胞を静脈内に注入する。いくつかの態様においては、体重１００ｋｇ
あたり約４×１０⁹個と約２×１０¹¹個との間の細胞を注入する。いくつかの態
様においては、体重１００ｋｇあたり細胞約５×１０⁸個と細胞約１×１０¹個と
の間を注入する。

【００３８】いくつかの態様においては細胞の単回投与を提供する。いくつかの態様におい
ては複数の投与を提供する。いくつかの態様において、連続する３〜７日の経過
にわたって複数の投与を提供する。いくつかの態様においては、連続する３〜７
日の経過にわたって３〜７回の投与を提供する。いくつかの態様においては、連
続する５日の経過にわたって５回の投与を提供する。

【００３９】いくつかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約１０⁵個と約１０¹³個と
の間の細胞の単回投与を提供する。いくつかの態様においては、体重１００ｋｇ
あたり約１．５×１０⁸個と約１．５×１０¹²個との間の細胞の単回投与を提供
する。いくつかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約１×１０⁹個と約５
×１０¹¹個との間の細胞の単回投与を提供する。いくつかの態様においては、体
重１００ｋｇあたり約５×１０¹⁰個の細胞の単回投与を提供する。いくつかの態
様においては、体重１００ｋｇあたり１×１０¹⁰個の細胞の単回投与を提供する
。

【００４０】いくつかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約１０⁵個と約１０¹³個と
の間の細胞の複数回投与を提供する。いくつかの態様においては、体重１００ｋ
ｇあたり約１．５×１０⁸個と約１．５×１０¹²個との間の細胞の複数回投与を
提供する。いくつかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約１×１０⁹個と
約５×１０¹¹個との間の細胞の複数回投与を、連続する３〜７日の経過にわたっ
て提供する。いくつかの態様においては、体重１００ｋｇあたり約４×１０⁹個
の細胞の複数回投与を、連続する３〜７日の経過にわたって提供する。いくつか
の態様においては、体重１００ｋｇあたり約２×１０¹¹個の細胞の複数回投与を
、連続する３〜７日の経過にわたって提供する。

【００４１】いくつかの態様においては、約３．５×１０⁹個の細胞の５回の投与を５連続
日の経過にわたって提供する。いくつかの態様においては、約４×１０⁹個の細
胞の５回の投与を５連続日の経過にわたって提供する。いくつかの態様において
は、約１．３×１０¹¹個の細胞の５回の投与を５連続日の経過にわたって提供す
る。いくつかの態様においては、約２×１０¹¹個の細胞の５回の投与を５連続日
の経過にわたって提供する。

【００４２】さらに、本発明は哺乳動物における造血を高める方法を包含する。該方法は、
哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストロ
ーマ細胞を投与してそれにより該哺乳動物における造血を高めることを含んで成
る。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、該哺乳動物で造血が高めら
れることを認識するであろう。なぜなら、本明細書で開示されるとおり、哺乳動
物へのＭＳＣの投与が該動物の固有の造血の再構成を媒介するからである。

【００４３】当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、造血の阻害もしくは減少を特
徴とするもしくはそれにより媒介される疾患、障害もしくは病状に罹っている個
体を、個体における造血を高めるＭＳＣの投与により治療することができること
を認識するであろう。

【００４４】本発明は、致死線量の全身照射を与えられた哺乳動物における造血幹細胞の分
化を高める方法を包含する。該方法は、照射された哺乳動物に同種異系のしかし
それ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれによ
り該哺乳動物における造血幹細胞の分化を高めることを含んで成る。該方法は、
致死線量の全身照射への曝露後の哺乳動物へのＭＳＣの投与が該哺乳動物におけ
る固有の造血の再構成を媒介するという本明細書に開示される新規発見に基づく
。こうした再構成は、増殖しかつ多様な造血細胞型に分化する、固有の造血幹細
胞などの分化を必然的に伴う。従って、固有の造血の再構成を媒介するＭＳＣの
投与は、こうした再構成に関与する造血幹細胞の分化を高めることを必然的に伴
う。

【００４５】本発明は、致死線量の全身照射を与えられた哺乳動物における造血の回復を高
める方法もまた包含する。該方法は、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそ
れ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより
該哺乳動物における造血の回復を高めることを含んで成る。

【００４６】当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、哺乳動物における固有の造血
の再構成を媒介するＭＳＣの投与が哺乳動物における造血の回復を高めることを
認識するであろう。すなわち、ＭＳＣの投与は哺乳動物の造血系の再個体数増加
を媒介し、従って哺乳動物における造血の回復を高める。

【００４７】本発明は離解された骨髄を含んで成る哺乳動物の処置方法を包含する。該方法
は、哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ス
トローマ細胞を投与してそれにより離解された骨髄を含んで成る該哺乳動物を治
療することを含んで成る。これは、本明細書に開示されるとおり、哺乳動物への
ＭＳＣの投与が該哺乳動物における造血の再構成、もしくは正に少なくとも固有
の造血の増大を引き起こし、それにより骨髄離解による該哺乳動物における造血
細胞の放射誘発性の減少を治療するためである。

【００４８】本発明は、離解された骨髄を含んで成る哺乳動物における造血を高める方法を
さらに包含する。該方法は、哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナ
ー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を注入してそれにより離解された骨髄を含
んで成る哺乳動物における造血を高めることを含んで成る。該方法は、離解され
た骨髄を含んで成る哺乳動物へのＭＳＣの投与が該哺乳動物自身の造血の固有の
再構成を媒介することを初めて立証する、本明細書に開示されるデータに基づく
。従って、ＭＳＣの投与は、本明細書に立証されるような哺乳動物の再構成に必
要とされる造血を高める。

【００４９】本発明は、致死線量の全身照射に曝露された哺乳動物の生存の増大方法を包含
する。該方法は、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナ
ー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより致死線量の全身照射
に曝露された哺乳動物の生存を増大させることを含んで成る。当業者は、本明細
書に提供される開示に基づき、致死線量のＴＢＩへの曝露の生存が少なくとも部
分的に哺乳動物の造血の再構成に依存することを認識するであろう。本明細書に
開示されるデータは、造血の再構成が致死線量のＴＢＩへの曝露後の哺乳動物へ
のＭＳＣの投与により媒介されることを立証する。さらに、該データは、曝露後
に生存する動物の増大された数により測定されるような生存が、照射されたがし
かしＭＳＣが投与されなかったそれ以外は同一の動物と比較して、動物へのＭＳ
Ｃの投与により大きく増大されたことを立証する。従って、当業者は、本開示に
基づき、哺乳動物による致死線量のＴＢＩへの曝露の生存は、別の状態で致死的
な照射からの生存に必要である高められた造血をＭＳＣが媒介する哺乳動物への
ＭＳＣの投与により有意に増大されることを認識するであろう。

【００５０】本発明は以下の実験的実施例への言及により詳細にさらに記述する。これらの
実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして別に指定されない限り制限す
ることを意図されない。従って、本発明は以下の実施例に制限されるといかなる
方法でも解釈されるべきでないが、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の
結果として明らかとなるいずれかのおよび全部の変形物を包含すると解釈される
べきである。

【００５１】実施例同種異系のラットの骨髄ストローマ細胞は致死的照射後の生存および固有の造血
の回復を高める本実施例に提示される実験は以下のとおり要約することができる。

【００５２】本明細書に開示されるデータは、完全なＭＨＣのクラスＩおよびクラスＩＩの
障壁を横断する骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）の外植が、５×１０⁶個の同種異
系のＭＳＣの単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注入のみで致死的全身照射（ＴＢＩ）から
レシピエント動物を救助することができることを立証する。１０週齢の雄性ルイ
ス（Ｌｅｗｉｓ）（ＬＥＷ）ラットをＭＳＣドナーとして使用し、また、１０週
齢の雌性ウィスター・ファース（ＷｉｓｔａｒＦｕｒｔｈ）（ＷＦ）ラットを
レシピエントとして使用した。ＬＥＷラットの大腿骨および脛骨から全骨髄を収
穫し、そしてプラスチック製培養フラスコに細胞をプレート培養した。収穫後第
３日に全部の付着されない細胞および培地を除去して接着細胞層を残し、そして
新鮮培地をフラスコに添加した。トリプシン処理により細胞を継代し、そして第
二継代の終了まで培地を週２回交換して培養物を維持した。３１匹のＷＦ雌性ラ
ットが、致死線量の９００ｃＧｙのＴＢＩ、および照射後４時間に５×１０⁶個
のＬＥＷのＭＳＣのｉ．ｐ．注入を受領した。２２匹のＷＦ雌性ラットは９００
ｃＧｙのＴＢＩ単独を受領し、そして対照としてはたらいた。対照群の全２２匹
の動物は１５日の平均生存で死亡した。対照的に、実験群の３１匹のラットのう
ち２１匹はＴＢＩから完全に回復し、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の著しいも
しくは組織学的証拠はなかった。骨髄離解性であると思われる１０００ｃＧｙの
ＴＢＩというより大きな放射線量で同種異系のＭＳＣ移植を反復した。１０００
ｃＧｙのＴＢＩで照射された動物（各群においてｎ＝１２）は生存個体を有さず
、平均生存は処置群および対照群についてそれぞれ８．８日および９．０日であ
った。

【００５３】９００ｃＧｙのＴＢＩの全生存個体からの末梢血を、ドナーＭＨＣのクラスＩ
に特異的な、ＦＩＴＣで直接標識されたモノクローナル抗体を使用して細胞分取
した(flow sorted)。ＭＳＣ移植後３０日にはドナーの造血の再個体数増加の証
拠は存在せず、生存および造血の回復はドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ）汚染によ
らなかったことを示唆した。これらの結果は、致死的しかし骨髄離解性でないＴ
ＢＩを受領する動物に、同種異系のＭＳＣが救助を提供することが可能であるこ
とを立証する。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わず、これらの
データは、これらの実験での同種異系のＭＳＣが致死的条件付けにより排除され
ていない固有のＨＳＣに対する支持を提供していることを示唆している。

【００５４】本実施例で提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。動物８週齢のルイス（Ｌｅｗｉｓ）およびウィスター・ファース（Ｗｉｓｔａｒ
Ｆｕｒｔｈ）ラットはインジアナ州インジアナポリスのハランシュプラグ−ド
ーレイカンパニー（ＨａｒａｎＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙＣｏｍｐａ
ｎｙ）から得た。全部の動物はウイルス侵襲なしで獲得し、そしてアレゲニー保
健科学大学（ＡｌｌｅｇｈｅｎｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅＨｅ
ａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅ）の動物施設でウイルスを含まない環境中で飼育した
。全部の動物は、国立医学研究協会（ＮａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏ
ｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）により考案された“Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣａｒｅ”および国立保健
研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ）により
作成された”ＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ“（ＮＩＨ刊行物番号８６−２３、１９
８５年改定）に従って取り扱った。骨髄ストローマ細胞培養物８週齢の雄性ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットを７０％ＣＯ₂／３０％Ｏ₂気体混合
物を用いて安楽死させた。その後、動物の体毛を剃りそしてアルコールおよびプ
ロボジン溶液で調製した。下肢の長い骨を収穫し、そして１０％ウシ胎児血清（
ＦＣＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびアムホテリシンＢを含有する
氷冷細胞培養培地（ＤＭＥＭ、シグマケミカルカンパニー（ＳｉｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）、ミズーリ州セントルイス）中で保存した。滅菌条件
下で、培地を含有する２１ゲージの針を使用して脛骨および大腿骨から骨髄を洗
い流した。その後、１０ｍｌピペットを使用して全骨髄を分散させた。２５ｍｌ
の最終体積の骨髄含有培地を滅菌のＴ−７５（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））プ
ラスチック製培養フラスコに添加し、そして３７℃で３日間インキュベートした
。３日後に非接着層全体を捨て、そしてフラスコに新鮮培地を添加した。その後
、接着性のストローマ細胞層をトリプシンでの分離に先立ち８０％コンフルエン
トまで拡張させた。培地を週２回交換した。移植に使用される細胞は第三継代に
達せさせた。骨髄ストローマ細胞の移植レシピエントは１０週齢の雌性ＷＦラットであった。動物は、ＭＳＣの注入に
先立ち、アレゲニー保健科学大学（ＡｌｌｅｇｈｅｎｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆｔｈｅＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅ）（フィラデルフィア州フィラ
デルフィア）（ＡＵＨＳ）で維持されている直線形加速器から単回線量で１００
０、９００、５００もしくは０ｃＧｙのいずれかの全身Ｘ線照射（ＴＢＩ）を受
領した。培養物中で第三継代まで成長されたＭＳＣを滅菌のリン酸緩衝生理的食
塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてプラスチック製培養フラスコからトリプシ
ン処理により持ち上げた。血清を含まない培地で細胞を２回洗浄し、そしてその
後１ｍｌあたり細胞５×１０⁶個の最終濃度で滅菌の血清を含まない培地に再懸
濁した。トリパンブルー排除アッセイにより細胞の生存率を確認し、そして血球
計算板を使用して細胞を計数した。レシピエント動物は、単回線量のＴＢＩの受
領の４時間以内に、５×１０⁶個のＭＳＣを含有する単回の１ｍｌのｉ．ｐ．注
入を受領した。対照動物は、ＴＢＩおよび１ｍｌの滅菌の血清を含まない培地を
含むｉ．ｐ．注入を受領した。対照群にはＭＳＣを投与しなかった。動物が倒れ
た場合は、移植時点から死亡までの日数で生存を測定した。照射されたＭＳＣＭＳＣは本明細書の別の場所で既に記述されたとおり調製した。５０００万個
の細胞を５０ｍｌの血清を含まない培地に再懸濁し、そして¹³⁷Ｃｓ照射装置か
らの１０，０００ｃＧｙに曝露した。照射された細胞は、その後、ｉ．ｐ．注入
に先立ち、滅菌の血清を含まない培地で２回洗浄しかつ再懸濁した。末梢血算定５００マイクロリットルの全末梢血を、ＥＤＴＡを含有する小児科用全血球算
定（ＣＢＣ）ヴァキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）チューブに収集した。
ＡＵＨＳの臨床血液学教室によりヘモグロビンおよびヘマトクリットを包含する
ＣＢＣを実施した。人的白血球算定および白血球分画もまた各サンプルで実施し
た。フローサイトメトリー蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による分析のため、末梢血リンパ球（ＰＢ
Ｌ）を、ＬＥＷについてＲＴＡ^a,^b,¹ ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）で（ＲＴＡ¹）、また、ＷＦについてＲＴＡ^u ＦＩＴＣ結合ポリクローナル
抗体血清で（ＲＴＡ^u）染色した。細胞は、関連性のないＦＩＴＣ結合抗体アイ
ソタイプ対照でもまた染色した。簡潔には、尾の出血により５００μｌの末梢血
をヘパリン処理された１．５ｍｌエッペンドルフチューブに収集した。末梢血を
１５ｍｌのポリプロピレン製チューブに移し、そしてフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ
）ハイパーク遠心分離勾配を使用してＰＢＬを単離した。ＰＢＬを含有する軟膜
をＰＢＳで２回洗浄し、そしてＦＡＣＳ培地に再懸濁した。細胞を、暗所で３０
分間、ドナーおよびレシピエント特異的な抗体の存在下で水を含む氷上で(on we
t ice)インキュベートした。インキュベーション後に、染色された細胞を再度Ｆ
ＡＣＳ培地で２回洗浄し、そして１％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。そ
の後、ベクトン−ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ）（ニュージャー
ジー州リンカーンパーク）ＦＡＣＳｃａｎを使用して、抗体染色された細胞を蛍
光抗体細胞分取した。製造元により提供されたセルクェスト（ＣｅｌｌＱｕｅ
ｓｔ）ソフトウェアパッケージを使用してデータを解析した。ドナーのＤＮＡサンプルの調製レシピエント動物を殺し、そして門脈血、肝、脾、胸腺、筋、皮膚、骨髄およ
び骨を収穫した。製造元のプロトコルに従ってＤＮＡゾルＢＤ［ＤＮＡｚｏｌ
ＢＤ］（商標）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、門脈血からゲノムＤＮＡを精製し
た。固形組織は収穫直後に液体窒素中で急速凍結させた。凍結された組織を滅菌
の乳鉢および乳棒ですりつぶし、そして分散された組織を１％サルコシルおよび
０．５ｍＭＥＤＴＡの存在下に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中５５℃で
一夜消化することにより、ゲノムＤＮＡを調製した。標準的フェノール−クロロ
ホルム抽出および氷冷エタノール沈殿によりＤＮＡを消化物から精製した。２６
０／２８０分光測光法によりＤＮＡの濃度を測定した。ゲノムＤＮＡの蛍光読み出し実時間ＰＣＲラットＹ染色体に特異的な標的配列を増幅する、特別に設計された一対のオリ
ゴヌクレオチドプライマー、ならびに５’端に蛍光分子６−カルボキシフルオレ
セイン（ＦＡＭ）および３’端に消光体分子６−カルボキシテトラメチルローダ
ミン（ＴＡＭＲＡ）をもつオリゴヌクレオチドレポーター「タックマン（Ｔａｑ
ｍａｎ）」型のプローブを、パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）
（カリフォルニア州フォスターシティ）から得た。ＡＢＩプリズム（Ｐｒｉｓ
ｍ）モデル７７００配列検出系（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ
ｒ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して、ＤＮＡサンプルの蛍光
読み出し「実時間」定量的配列検出（ＱＳＤ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
を実施した。

【００５５】ＰＣＲ混合物は、１μｇのゲノムのＤＮＡ、０．０５Ｕ／μｌのアンプリタッ
クゴールド［ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ］（商標）（パーキンエルマー（
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））、０．０１Ｕ／μｌのアンプイレースＵＮＧ［
ＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ］（商標）（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥ
ｌｍｅｒ））、５．５ｍＭＭｇＣｌ₂、２００μＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰおよび４００μＭのｄＵＴＰ、２００ｎＭの順向きプライマー、２００ｎ
Ｍの逆向きプライマー、１００μＭのタックマン［ＴａｑＭａｎ］（商標）オリ
ゴヌクレオチドプローブ、１×タックマン［ＴａｑＭａｎ］（商標）緩衝液（パ
ーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））ならびにウェルあたり５０μ
ｌの最終反応体積のための適量のｄ．Ｈ₂Ｏを含有した。ＤＮＡを含有するＰＣ
Ｒ混合物を９６穴プレートに負荷し、そして光学的蓋で封止した。熱循環条件は
以下のとおり、すなわち、９４℃１０分間、次いで９４℃１５秒間、６３℃１分
間の３５周期であった。雄性対雌性(male-to-female)ラットＤＮＡの１：０から
１：１００，０００までの標準希釈物を、標準曲線を作成するのに使用される参
照標準としてはたらくように、実験サンプルと一緒に各９６穴プレート上で三重
で負荷した。製造元により提供されるＡＢＩモデル７７００ソフトウェアを使用
して実時間ＰＣＲのデータを解析した。対宿主性移植片病動物は対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の兆候について毎日監視した。これは、
落屑する真皮、腫脹された足蹠、食欲不振、下痢および体重減少についての検査
を包含した。殺す際に脾の重量を測定し、そして小腸および舌の部分を１０％緩
衝ホルマリン中で固定し、パラフィン中に埋込みそして薄片にした。ヘマトキシ
リンおよびエオシンで組織染色を実施し、そして染色された切片をＧＶＨＤの微
視的証拠について光学顕微鏡検査により検査した。心移植８週齢の雌性ＬＥＷラットを心ドナーとして使用した。全部の手術は全身麻酔
下で実施した。ＬＥＷのドナー心は軟氷を用いる低温心停止下で収穫した。大静
脈および肺静脈を４．０絹縫合糸で結紮し、また、大動脈および肺動脈を鋭い鋏
を使用して処理した。小野（Ｏｎｏ）とリンゼイ（Ｌｉｎｄｓｅｙ）の改変技術
を使用して異所性の心移植を実施した。ドナーの大動脈および肺動脈をそれぞれ
レシピエントの腹部大動脈および下部大静脈に吻合した。吻合は、９．０ポリプ
ロピレン単繊維縫合糸を使用して端から側への様式で実施した。移植組織の生存
能力はレシピエント腹部の毎日の触診により決定した。触診が中間であった場合
には移植片を直視下に検分した。拒絶反応は心室収縮の完全な非存在により示さ
れ、そして組織学的に確認された。技術上の誤りが即座の移植片の不具合もしく
は死亡につながる動物は、移植片の生存の統計学に包含しなかった。

【００５６】本実施例で提示される実験の結果を今や記述する。骨髄ストローマ細胞は、５×１０⁶個のＭＳＣの単回ｉ．ｐ．注入のみで、致死
的に照射された宿主の生存を高める致死的照射からの生存は造血系の復帰に依存する。骨髄の微小環境内ではＭＳ
Ｃと造血幹細胞（ＨＳＣ）との間に非常に複雑な関係が起こっていることが既知
である。インビトロでは、ＨＳＣが長期の培養物として生存するのにＭＳＣ層に
頼ることが示されている。しかしながら、ＨＳＣの亜集団およびこの回復を助長
するかも知れない他の細胞での造血の救助の多数の報告にもかかわらず、インビ
ボの関係は未だ定義されていない。本明細書に開示されるデータは、培養物中で
成長されたＭＳＣが、第三継代（およそ５週間）まで、致死線量の９００ｃＧｙ
のＸ線照射、次いでＭＳＣの単回腹腔内注入を受領した実験群の動物の大多数に
おいて、造血のインビボの回復を高めたのみならずしかし完全な回復もまた可能
にしたことを立証する（表１）。さらに、この処置レジメンを生存した動物は対
宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の症状発現を表さなかった。より具体的には、９０
０ｃＧｙおよび腹腔内注入を介する５×１０⁶個のＭＳＣを含有する１ｍｌの血
清を含まない培地を受領した３１匹のウィスター・ファース（ＷｉｓｔａｒＦ
ｕｒｔｈ）（ＷＦ）雌性ラットのうち２１匹が、完全な回復まで生存した。対照
動物の全２２匹は、９００ｃＧｙおよびＭＳＣ成分を含まない１ｍｌの血清培地
の同一のｉ．ｐ．注入を受領した。対照群の動物のいずれも生存せず、平均死亡
は１５日であった。

【００５７】

【表１】

【００５８】この処置レジメンをより高レベルおよび低レベル双方の照射で反復した。１，
０００ｃＧｙの全身照射（ＴＢＩ）で救助効果は喪失され、実験群もしくは対照
群のいずれの動物も９日を越して生存しなかった。理論により束縛されることを
願わないが、このレベルの放射は、最小限の骨髄構成要素のみが曝露後に生存す
ることを可能にする、致死的および骨髄離解性の双方であると考えられる。より
低レベルの５００ｃＧｙでは、実験および対照群の双方が悪影響を経験せず、そ
して生存は１００％であった。同様に、５×１０⁶個のＭＳＣを受領しかつ放射
を受領しない対照動物は悪影響を経験せず、かつ１００％の生存率を立証した。
９００ｃＧｙ＋５×１０⁶個のＭＳＣ後の造血の回復致死的放射を受領する動物は、重症の敗血症および十分な免疫応答の装備かつ
維持の不可能から死亡した。放射後早期にみられた重症の好中球減少症は、その
後、赤血球生成の欠如からのヘマトクリットの定常的下落により複合された。白
血球および赤血球双方の回復を実験および対照動物において２、３および４ヶ月
で監視した（図１）。各群の５匹のラットはＡＵＨＳの臨床検査室により実施さ
れたＣＢＣを有した。この分析は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球算定
、血小板算定および人的白血球分画を包含した。時間にわたるヘマトクリットは
放射を受領しない対照に匹敵するレベルに達した（図１Ａ）。照射された動物の
全部は放射直後の期間に非常に貧血であり、耳および足の白化ならびに網膜の色
の喪失を伴った。しかしながら、３０日まで生存する動物は、身体検査により、
処置されない同腹子と区別がつかなかった。白血球算定は対照と同一のレベルま
で回復しなかったが、３０日後に分析された全部のラットで、免疫能力のある範
囲への十分な白血球の回復が示された（図１Ｂ）。救助された動物はＧＶＨＤの兆候を表さない致死的放射後に全骨髄で再構成されたげっ歯類はＧＶＨＤの多くの兆候を表す
。しばしば、身体検査および組織学的分析の双方により示すことができるこの病
状は、非常に高い死亡率を伴う。従って、同種異系のＭＳＣを受領する全部の動
物を、ＧＶＨＤを暗示する皮膚科学的変化、耳のびらん、足蹠の腫脹、体重減少
もしくは下痢について毎日検査した。剖検に際して脾の重量を測定し、そして小
腸および舌からの組織サンプルを微視的に検査した。どの動物もＧＶＨＤの著し
いもしくは微視的な証拠を表さなかった。照射されたＭＳＣは照射された動物を救助しないＭＳＣは高レベルの放射線抵抗性を保有することが伝統的に立証されているが
、これらの実験におけるＭＳＣの救助特性は高線量放射後に喪失される。５００
０万個の細胞を含有するアリコートを、照射された動物へのｉ．ｐ．注入に先立
ち１０，０００ｃＧｙに曝露した。表２に示されるとおり、救助効果は１匹の動
物以外で喪失された。

【００５９】

【表２】

【００６０】造血の固有の回復いくつかのＨＳＣのみで再構成することにより、照射された宿主で完全な造血
の回復が起こる可能性があることを、いくつかの報告が立証している。従って、
ＭＳＣ培養物中で生存していたかも知れずかつ観察された生存および回復の効果
のありそうな説明となるかも知れない、ドナーのＬＥＷのＨＳＣでのＷＦレシピ
エントの可能性のある汚染を検査した。ＰＢＬのフローサイトメトリー分析は、
ドナーのＬＥＷ細胞がレシピエントのＷＦ動物中に存在しなかったことを立証し
た（図２）。１１匹の実験動物およびそれらの対応する処置されない対照を、Ｍ
ＳＣ移植後３０日に末梢血について採血した。ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体
ＲＴＡ^a,^b,¹を使用してＬＥＷのＭＨＣ−Ｉ陽性成分について、また、ＦＩＴＣ
結合ポリクローナル抗体ＲＴＡ^uを使用してＷＦのＭＨＣ−ＩＩ陽性成分につい
て染色した。図２は、３０日後に９００ｃＧｙおよび５００万個のＭＳＣで処置
された動物からのＰＢＬの分析により生成されたヒストグラムの典型的結果を表
す。図２Ａは対照のフロー分析を表し、ここでは、ＷＦおよびＬＥＷのＰＢＬを
混合しかつＲＴＡ^a,^b,¹（ＭＨＣ−Ｉ）で染色し、ＷＦおよびＬＥＷの輪郭を明
瞭に立証する。強いＬＥＷシグナルが１０，０００事象の収集後に明瞭に存在す
る（図２Ａ）。対照的に、レシピエントラット番号２１により例示されるとおり
、ＬＥＷのＭＳＣで処置されたＷＦレシピエントのいずれにおいても陽性のＬＥ
Ｗ染色（ＲＴＡ^a,^b,¹（ＭＨＣ−Ｉ））は示されなかった（図２Ｂ）。これらの
データは、ＬＥＷのＨＳＣでの汚染が高度にありそうにないこと、および、これ
らの動物における造血の再構成が固有の現象であることを示唆する。雄性ＬＥＷ細胞についての実時間ＰＣＲアッセイ造血の再構成が固有でありかつ照射された動物に投与されたＭＳＣのドナーＨ
ＳＣの汚染により引き起こされなかったことをさらに立証するため、雌性宿主に
存在するつがいの(mate)ラットのＤＮＡの検出のための高度に感受性の実時間Ｐ
ＣＲ定量的配列検出アッセイを開発した。パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＡＢＩモデル７７０
０実時間配列検出器系、ならびにＹ染色体特異的なＰＣＲプライマー対およびタ
ックマン（Ｔａｑｍａｎ）型プローブを使用して、雄性対雌性ＤＮＡの１００，
０００倍希釈（もしくは１μｇの雌性ＤＮＡ中に存在するより少ない１０ｐｇの
雄性ＤＮＡ）の検出限界まで、雌性ＤＮＡ中で雄性ＤＮＡを検出した（図３）。
既知の比率の雄性対雌性ＤＮＡを含有する一組の希釈標準を調製し、そして、Δ
Ｒｎ（検出可能な蛍光の変化）をＰＣＲの周期数の関数としてプロットしてそう
して各サンプルについての増幅プロットを生成させることにより、各希釈につい
て閾値周期（Ｃｔ）（すなわち、蛍光検出のレベルが自由裁量の閾値（この場合
は標準偏差の１０倍に同等であるよう設定した）に達する周期の数）を決定した
（図３Ａ）。閾値周期は、サンプル中に存在する増幅されている標的核酸の量に
相関する。すなわち、より高濃度の標的ＤＮＡ（この場合はラットのＹ染色体特
異的ＤＮＡ）では、閾値周期はより少ない周期数で達せられる。その後、増幅プ
ロットを使用して、１μｇのＤＮＡ中の雄性ＬＥＷのＤＮＡのパーセント（％）
に対する臨界閾値（Ｃｔ）の標準曲線を生成させた（図３Ｂ）。この系を使用し
て、ＭＳＣ移植１および２ヶ月後に、ＷＦレシピエントからの血液、骨、骨髄、
肝、筋、皮膚、脾および胸腺を検査した。１μｇの雌性ＤＮＡ中に存在する１０
ｐｇの雄性ＤＮＡを検出することが可能である本アッセイの高感度にもかかわら
ず、分析されたサンプルのいずれにおいても雄性のＬＥＷドナーのＤＮＡは検出
されなかった（表３）。これらのデータは、レシピエントのラットにおける造血
の回復がドナーのＨＳＣの汚染によらなかったことをさらに立証する。

【００６１】

【表３】

【００６２】固形器官に対する耐性もしくは過感作の欠如実験動物は高レベルの照射およびドナー抗原の双方に曝露されたため、この処
置プロトコルによりドナー特異的な耐性が設立されていたかも知れない可能性を
検査した。１および２ヶ月の４匹のＷＦレシピエントに、異所性の血管形成され
た心移植組織を与えた（表４）。

【００６３】

【表４】

【００６４】２ヶ月群の４匹の動物のうち２匹は技術上の誤りにより除外した（†により示
されるとおり）。しかしながら、残存する６回の手術は手術時の合併症を伴わず
成功であった。心移植片は実験群もしくは対照群のいずれにおいても耐性状態に
達しなかった。耐性は立証されなかったが超急性の拒絶反応も立証されなかった
という事実が興味深い。２ヶ月群での移植された心は６．５日の平均生存を有し
た。４ヶ月群の心は９．３日の平均生存を有した。これらの結果は、７．４日と
いう平均生存を有した対照移植片と統計学的に異ならなかった。

【００６５】本明細書で引用されるそれぞれのかつすべての特許、特許出願および刊行物の
開示は、これによりそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。

【００６６】本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物
が本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により工夫される
ことができることが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部の
こうした態様および同等な変形物を包含するよう解釈されることを意図している
。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】発明にかかる、いかなる細胞も受領しなかった照射されない対照動物と比較した
、照射されかつ同種異系のＭＳＣを注入されたラットにおける造血の回復を描く
グラフである。該グラフは、対照ラット（◆）に比較した時間にわたる照射され
たラット（■）におけるヘマトクリットの上昇を描く。

【図１Ｂ】発明にかかる、いかなる細胞も受領しなかった照射されない対照動物と比較した
、照射されかつ同種異系のＭＳＣを注入されたラットにおける造血の回復を描く
グラフである。該グラフは、対照ラット（◆）に比較した時間にわたる照射され
たラット（■）における白血球の上昇（１μｌあたり１０００個で表現される）
を描く。

【図２Ａ】発明にかかる、ＭＨＣ−１についてＦＩＴＣ結合ｍＡｂ（ＲＴＡ^a,^b,¹）を使用
して染色されたウィスター・ファース（ＷｉｓｔａｒＦｕｒｔｈ）ラット（Ｗ
Ｆ）およびルイス（Ｌｅｗｉｓ）（ＬＥＷ）ラットからのＰＢＬの混合集団のＦ
ＡＣＳプロフィルを描くグラフである。

【図２Ｂ】発明にかかる、レシピエントのＷＦ中のＰＢＬが固有の起源のものでありかつそ
れらがＬＥＷ細胞由来でないことを立証する、ＭＨＣ−１についてＦＩＴＣ結合
ｍＡｂ（ＲＴＡ^a,^b,¹）を使用して染色されたルイス（Ｌｅｗｉｓ）（ＬＥＷ）
ラットからのＭＳＣを既に注入されたウィスター・ファース（ＷｉｓｔａｒＦ
ｕｒｔｈ）ラット（ＷＦ）からのＰＢＬのＦＡＣＳプロフィルを描くグラフであ
る。

【図３Ａ】発明にかかる、雌性ＷＦラットＤＮＡにおける雄性ルイス（Ｌｅｗｉｓ）（ＬＥ
Ｗ）ラットＤＮＡの各希釈物についての閾値周期を立証する実時間ＰＣＲアッセ
イの増幅プロットを描くグラフである。ＷＦ雌性ラットＤＮＡ１μｇ中の雄性Ｌ
ＥＷラットＤＮＡの量を以下のとおりパーセントにより表現する：（ａ）１００
％、（ｂ）１０％、（ｃ）１％、（ｄ）０．１％、（ｅ）０．０１％、（ｆ）０
．００１％および（ｇ）０％の対照。

【図３Ｂ】発明にかかる、図３Ａに描かれる６種の希釈標準品の増幅プロットについての閾
値周期データに基づく標準曲線である。ＷＦ雌性ラットＤＮＡもまた含有するサ
ンプル中の雄性ＬＥＷラットＤＮＡの量は、この標準曲線に基づき、実時間ＰＣ
Ｒを使用して閾値周期を決定することにより算出してよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ランゲル，ジヨンアメリカ合衆国カリフオルニア州95124サンノゼ・マーシーリンコート1760 Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 BB44 BB64 CA04 NA14 ZA51 ZB21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】致死線量の全身照射からの哺乳動物の救助方法であって、照
射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨
髄ストローマ細胞を投与してそれにより前記哺乳動物を致死線量の全身照射から
救助することを含んで成る前記方法。
【請求項２】前記哺乳動物が、げっ歯類、ウマ、雌牛、ブタ、イヌ、ネコ
、非ヒトの霊長類およびヒトより成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】前記哺乳動物がヒトである、請求項２記載の方法。
【請求項４】前記投与が注入である、請求項１記載の方法。
【請求項５】哺乳動物における造血を高める方法であって、哺乳動物に同
種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投
与してそれにより前記哺乳動物における造血を高めることを含んで成る前記方法
。
【請求項６】前記哺乳動物が、げっ歯類、ウマ、雌牛、ブタ、イヌ、ネコ
、非ヒトの霊長類およびヒトより成る群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】前記哺乳動物がヒトである、請求項６記載の方法。
【請求項８】前記投与が注入である、請求項５記載の方法。
【請求項９】致死線量の全身照射を与えられた哺乳動物における造血幹細
胞の分化を高める方法であって、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以
外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより前記
哺乳動物における造血幹細胞の分化を高めることを含んで成る前記方法。
【請求項１０】前記哺乳動物が、げっ歯類、ウマ、雌牛、ブタ、イヌ、ネ
コ、非ヒトの霊長類およびヒトより成る群から選択される、請求項９記載の方法
。
【請求項１１】前記哺乳動物がヒトである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】前記投与が注入である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】致死線量の全身照射を与えられた哺乳動物における造血の
回復を高める方法であって、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は
同一のドナー哺乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより前記哺乳
動物における造血の回復を高めることを含んで成る前記方法。
【請求項１４】離解された骨髄を含んで成る哺乳動物の処置方法であって
、哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物からの骨髄スト
ローマ細胞を投与してそれにより離解された骨髄を含んで成る前記哺乳動物を処
置することを含んで成る前記方法。
【請求項１５】離解された骨髄を含んで成る哺乳動物における造血を高め
る方法であって、哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺乳動物
からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより離解された骨髄を含んで成る前
記哺乳動物における造血を高めることを含んで成る前記方法。
【請求項１６】致死線量の全身照射に曝露された哺乳動物の生存の増大方
法であって、照射された哺乳動物に同種異系のしかしそれ以外は同一のドナー哺
乳動物からの骨髄ストローマ細胞を投与してそれにより致死線量の全身照射に曝
露された哺乳動物の生存を増大させることを含んで成る前記方法。