CN113813288B

CN113813288B - 间充质干细胞及包含其的组合物用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途

Info

Publication number: CN113813288B
Application number: CN202110921024.0A
Authority: CN
Inventors: 谢岩; 肖金丽; 朱永朝; 谢楠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2024-02-13
Anticipated expiration: 2041-08-11
Also published as: CN113813288A; US20230046306A1; AU2021106523A4

Abstract

本申请提供了间充质干细胞用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途。发明人发现，本申请的间充质干细胞，用于治疗烧伤创面，疗效显著，能有效促进烧伤难愈创面修复、提高烧伤难愈创面愈合率、缩短创面愈合时间，具有无毒副作用、容易吸收等优势，因此所述间充质干细胞及包含其的组合物能够用于制备治疗烧伤难愈创面的药物。

Description

间充质干细胞及包含其的组合物用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途

技术领域

本申请涉及间充质干细胞新用途技术领域，特别是涉及间充质干细胞及包含其的组合物用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途。

背景技术

烧伤是一种严重的创伤形式，其损害的主要是皮肤及软组织。烧伤不仅会导致全身多器官系统的结构损伤和功能缺陷，更多是形成难愈性创面，给患者家庭和社会带来深远的危害。临床上，烧伤难愈创面是指严重烧伤引起的伤口在经过1个月的治疗后尚未愈合且无愈合趋势的创面。烧伤创面与其他类型创面有很大区别，如撕裂伤、压迫性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病溃疡等，烧伤的热量会破坏身体的稳态。大部分烧伤难愈创面具有创面散在分布,多见组织水肿、患者免疫炎症损伤较重、创缘上皮生长停滞且易脱落,造成创面不断扩大、已愈合的创面因感染形成溃疡，经久不愈、创面换药时疼痛常难忍、或愈后再发可能性大、并且有癌变的风险。烧伤难愈合创面与一般创面有很大区别，烧伤难愈创面表现出促炎细胞因子、活性氧自由基和衰老细胞水平增加，基质金属蛋白酶升高。有研究表明，慢性创面中的PDGF-AB、bFGF、EGF以及TGF-β的表达均低于急性创面；急性创面中可以检测到TGF-β1mRNA的表达，而在慢性创面中，TGF-β1mRNA的表达检测却为阴性。有研究表明，慢性创面创液中的金属蛋白酶MMP-2和MMP-9维持较高水平。组织学原位酶谱显示慢性创面肉芽组织中尿激酶含量增加，且基质金属蛋白酶水平升高，其提示慢性创面通常具有高的蛋白水解潜能。Yager等人发现，相比急性创面，慢性创面创液中的胶原酶的含量显著升高，且创液中基质金属蛋白酶与其抑制剂的水平失衡。慢性创面存在过多的基质降解酶的激活形式，从而阻碍了这些创面的愈合。慢性创面中的成纤维细胞迁移能力降低，对生长因子信号无反应，其TGF-β受体及其下游级联成分降低。除此之外，慢性创面中的IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性因子的表达以及凋亡信号因子caspase-3较急性创面增高。烧伤难愈创面的治疗是临床上较棘手的问题，也是烧伤领域的研究重点和难点。

发明内容

发明人在研究中发现，间充质干细胞对烧伤创面，尤其是烧伤难愈创面具有优异的治疗效果，并基于该发现完成了本发明。

本申请第一方面提供了间充质干细胞用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途。

本申请第二方面提供了一种组合物，其包含间充质干细胞1×10⁶～10×10⁶个/ml，氯化钠0.8-1.0％(w/v)和注射用水。

本申请第三方面提供了一种凝胶剂，其包含间充质干细胞。

本申请第四方面提供了本申请第二方面的组合物或第三方面的凝胶剂用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途。

本申请第五方面提供了包含胎盘间充质干细胞的组合物用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途，其中，所述药物为注射剂，所述组合物由1×10⁶～10×10⁶个/ml胎盘间充质干细胞分散于生理盐水中制成。

发明人发现，本申请的间充质干细胞，用于治疗烧伤创面，疗效显著，能有效促进烧伤难愈创面修复、提高烧伤难愈创面愈合率、缩短创面愈合时间，具有无毒副作用、容易吸收等优势，因此所述间充质干细胞及包含其的组合物能够用于制备治疗烧伤难愈创面的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。

图1为原代培养第二代PMSCs显微照片；

图2显示了流式细胞学分析PMSCs表面标志物结果；

图3显示了不同给药处理后大鼠烧伤难愈创面愈合过程；

图4为愈合率随时间变化曲线。

图5显示了创液对HK细胞和HF细胞增殖的影响。

图6显示了创液对HK细胞和HF细胞形态的影响。

图7A显示了不同条件下迁移的HK细胞的染色结果。

图7B显示了不同条件下迁移的HF细胞的染色结果。

图8A显示了不同条件下HK细胞迁移的定量结果。

图8B显示了不同条件下HF细胞迁移的定量结果。

图9A显示了不同条件下HK细胞增殖情况。

图9B显示了不同条件下HF细胞增殖情况。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案、及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本申请进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

一方面，本申请提供了间充质干细胞用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途。

另一方面，本申请提供了间充质干细胞用于治疗烧伤难愈创面物的用途。

在一些实施方式中，所述间充质干细胞选自胚胎间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞中的至少一种。

发明人出人意料地发现，胎盘间充质干细胞(PMSCs)用于治疗烧伤难愈创面具有更好的效果，进一步，胎盘间充质干细胞来源广泛，异体排斥性低、几乎不存在道德伦理问题，因此在一些优选的实施方式中，所述间充质干细胞选自胎盘间充质干细胞。

发明人在研究中发现，间充质干细胞通常需要通过原代培养获得，第一代和第二代细胞数量较少，难以满足用量需求；而细胞传代次数过多，如超过六代，细胞容易出现老化现象，影响细胞性能，进而影响治疗效果，因此，在本申请的一些实施方式中，所述间充质干细胞为第三代至第五代的间充质干细胞。

本申请对间充质干细胞的制备方法不做限定，可采用现有技术的原代培养间充质干细胞的方法和常规的细胞传代操作获得本申请的间充质干细胞。

本申请第二方面提供了一种组合物，其包含间充质干细胞1×10⁶～10×10⁶个/ml，氯化钠0.8-1.0％(w/v)和注射用水。发明人发现，间充质干细胞在此浓度下，组合物对烧伤难愈创面具有更好的治疗效果，细胞浓度太低，对于创面的愈合作用不明显，细胞浓度过高，组织过度修复，容易形成瘢痕。

在一些实施方式中，所述组合物的剂型为注射剂。

在一些实施方式中，所述组合物还可以包括药学上可接受的载体，例如可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等；所述注射剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿瓶和小瓶。

本申请第三方面提供了一种凝胶剂，其包含间充质干细胞。

本申请中所述“凝胶剂”意指间充质干细胞与能形成凝胶的辅料制成混悬或乳状液型的稠厚液体或半固体制剂。本申请中的凝胶剂可以外敷于烧伤难愈创面的方式使用。所述凝胶剂中的辅料可为药学上可接受的载体凝胶或生物活性凝胶，如普通水凝胶、复合水凝胶、可降解水凝胶、具有生物活性凝胶等。发明人在研究中发现，间充质干细胞治疗的成功依赖于活细胞有效植入病变组织并实现理想的疗效，凝胶剂有利于保护烧伤难愈创面中的间充质干细胞，使其存活并发挥作用。

在一些实施方式中，所述间充质干细胞选自胎盘间充质干细胞。

在一些实施方式中，所述间充质干细胞为第三代至第五代的间充质干细胞。

另一方面，本申请还请提供了一种治疗烧伤难愈创面的方法，包括在距离创面边缘5mm-10mm处，皮下注射本申请的组合物。发明人意外地发现，本申请的组合物在此范围内注射，治疗烧伤难愈创面效果更显著。

本申请第四方面提供了本申请第二方面的组合物和本申请第三方面的凝胶剂用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途。

发明人在研究中出人意料地发现，当将胎盘间充质干细胞分散于生理盐水中，制备成注射剂，用于治疗烧伤难愈创面时，能够获得更好的效果。进一步地，发明人还发现，胎盘间充质干细胞在此浓度下，组合物对烧伤难愈创面具有更好的治疗效果，细胞浓度太低，对于创面的愈合作用不明显，细胞浓度过高，组织过度修复，容易形成瘢痕。

在本申请的一些实施方式中，所述胎盘间充质干细胞通过促进皮肤角质细胞和成纤维细胞迁移和/或增殖治疗烧伤难愈创面。

在一些优选的实施方式中，所述胎盘间充质干细胞通过以下方法制备：

1)在生物安全柜中，将健康的胎盘组织用预冷的包含双抗和庆大霉素的PBS缓冲液冲洗三遍以上，洗去红细胞；在冰上，剪取胎盘基底膜及绒毛膜0.5-1.0cm厚的组织；

2)将羊膜揭去，剪取0.4-0.6cm厚度肉片，放入盛放含双抗的PBS缓冲液的培养皿中；

3)将所述肉片分别剪成1-3mm²的肉块，在剪的同时，将血管剔除；

4)用PBS缓冲液将组织内的血水洗净；将清洗干净的组织收集到离心管中，加入I型胶原酶消化液，37℃下，摇床震荡1-3h，用PBS缓冲液中止反应；

5)混匀后，500g-550g离心4-6min，收集上清；沉淀加PBS缓冲液定容至20-40ml，涡旋震荡25-35s，重悬细胞；

6)重复步骤(5)直至上清液无色，合并所收集的上清液，500g-550g离心4-6min，合并沉淀，用无血清细胞培养基重悬沉淀，用100目细胞筛过筛，补足无血清细胞培养基培养过夜；

7)根据细胞生长情况进行换液或补液处理，5-7天后观察到细胞爬出，即为一代PMSCs；

8)当细胞融合度大于80％，进行常规传代操作，获得第二代至第五代PMSCs。

优选地，揭去羊膜后，挑选血管少、肉紧密的部位剪取肉片，本领域技术人员知晓血管越少，血细胞越少，肉紧密的部位中含有更多的胎盘间充质干细胞。

发明人发现，采用所述方法获得的胎盘间充质干细胞用于治疗烧伤难愈创面具有更好的效果。

在一些实施方式中，所述包含双抗和庆大霉素的PBS缓冲液中，包含青霉素99-110U/ml，链霉素0.08-0.12mg/ml和庆大霉素0.3-0.35mg/ml。

在一些实施方式中，所述无血清细胞培养基包括3-4vol％Ultroser G和0.8-1vol％GlutaMAX，其中，Ultroser G为血清替代品，GlutaMAX为L-谷氨酰胺替代品，发明人发现，采用具有上述成分含量的无血清细胞培养基培养胎盘间充质干细胞，获得的细胞具有更好的治疗烧伤难愈创面的性能。

制备例1.PMSCs制备与鉴定

无血清培养基成分包括：UltraCULTURE^TM，LONZA,12-725F，500ml；Ultroser G：Pall，15950-017，20ml；GlutaMAX：Gibco，35050061，5ml。

I型胶原酶消化液：Collagenase Type I，Gibco^TM，17018029

清洗液：含青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml和庆大霉素0.32mg/ml的磷酸缓冲液(PBS)

实验操作：

1)在生物安全柜中，将健康的胎盘组织用预冷的清洗液冲洗三遍以上，洗去红细胞；剪取胎盘基底膜及绒毛膜0.5-1.0cm厚的组织，以上操作需在冰上进行，；

2)将羊膜揭去，挑血管少、肉紧密的部位剪取0.5cm厚度肉片，放入盛放清洗液的培养皿中；

3)将所述肉片分别剪成2mm²的肉块，在剪的同时，将小血管剔除；

4)用磷酸缓冲液PBS将组织内的血水尽量洗净；将清洗干净的组织收集到50ml离心管中，加入I型胶原酶消化液，37℃恒温箱中的摇床上震荡2h，用PBS中止反应，稀释，定容至50ml；

5)混匀后，540g离心5min，收集上清；沉淀加PBS定容至30ml，涡旋震荡30s，重悬细胞；

6)重复上步直至上清液无色，合并所收集的上清液，540g离心5min，合并沉淀，用无血清培养基重悬沉淀，用100目细胞筛过筛，补足培养基培养过夜；

7)将皿中的培养基倒掉后加入新鲜培养基，观察细胞生长情况，根据培养基量及颜色及时换液补液，一般5-7天后会观察到细胞爬出，即为一代PMSCs；

8)当细胞融合度大于80％，进行常规传代操作，其中，第二代PMSCs在4倍镜(4×)和十倍镜(10×)下的显微照片如图1所示。从图1中可见，PMSCs纺锤形贴壁涡旋生长。

9)PMSCs鉴定：选取第5代正常生长的对数期PMSCs，消化收集细胞于15ml离心管，PBS漂洗2次，无菌300目细胞筛过滤；细胞计数后，调整细胞密度为1×10⁷/ml，取100μl分装于流式细胞管；分别加入10ul流式抗体：PE-CD73、PE-CD105、PE-IgG1、FITC-CD14、FITC-CD34、FITC-CD45、FITC-CD90和FITC-HLA-DR；避光室温静置20min，期间振荡1次，PBS漂洗2次，PBS重悬细胞制备成400μl细胞悬液；用流式细胞仪进行检测。细胞表面标志物表达情况如图2所示。从图2中可以看出，鉴定标志分子CD73、CD90和CD105表达阳性，CD14、CD34和CD45表达阴性，符合典型的间充质干细胞表面标志分子特征，说明第5代细胞仍保持PMSCs特性。

实施例1PMSCs促进烧伤难愈创面愈合

1、大鼠烧伤难愈创面模型建立

本申请中采用烫伤结合盐酸阿霉素处理建立大鼠烧伤难愈创面模型。

本研究所用实验动物为SPF级SD大鼠(宁夏医科大学动物实验室)，体重280-300g，雌性。实验操作经宁夏医科大学动物伦理委员会批准(2019-274)，实验过程遵守“动物保健和保护法”的相关规定。

盐酸阿霉素(meilunbio，货号25316-40-9)，用生理盐水配置成2mg/ml溶液，现用现配。

本申请组合物：采用第三代PMSCs，重悬于生理盐水中，获得PMSCs含量为1×10⁶个/ml的本申请的组合物。

模型建立：

用异氟烷诱导SD大鼠麻醉后，腹腔注射0.5ml 3％戊巴比妥钠，麻醉满意后，给予大鼠背部脱毛；

在大鼠背部中线旁开1cm处左右对称范围内，两侧各制造两个创面；创面以直径2cm的烫伤模具(铝块)，95℃接触30s，创面四周边缘皮0.2cm内的3点、6点、9点、12点和创面中心共5个点每个点皮下注射60ul盐酸阿霉素(2mg/ml)；操作后第28天给予大鼠背部创面掀痂后，获得大鼠烧伤难愈创面模型。

2、PMSCs移植对烧伤难愈创面愈合的影响

模型大鼠随机分为3组，每组3只，每只大鼠4个创面。三组分别为PMSCs组、外用重组人表皮生长因子组(GF组)和NS(空白对照)。PMSCs组大鼠背部创面分别注射本申请的组合物，其中创面边缘的3点、6点、9点和12点，各自距离创面边缘5mm处的四个点，每个点皮下注射本申请的组合物250ul；GF组喷生长因子4000IU/10cm²/创面；NS组在于PMSCs组相应的位置注射等量生理盐水。操作结束后无菌纱布覆盖，弹力绷带松紧适度包扎，每3天重复一次上述操作，共3次。

2.1愈合时间

给药处理第0、4、8、12、16天以及创面完全愈合(愈合率为100％)时，创面附标尺，数码相机拍照，记录大鼠的创面情况，结果如图3所示，其中A代表PMSCs组，B代表NS组，C代表GF组。从图3中可以看出，PMSCs组18天创面完全愈合、NS组30天完全愈合、GF组20天完全愈合，PMSCs愈合时间明显短于NS组，也快于GF组；PMSCs组愈合过程无明显红肿，痂薄，在掀痂后第16天创面愈合(愈合率大于90％)；NS组愈合过程痂厚，创面四周向中心的表皮生长缓慢，在掀痂后第16天创面较大；GF组愈合过程创面无明显感染，痂薄，在掀痂后第16天创面残余小面积。PMSCs组创面愈合明显快于NS组，稍快于GF组，说明PMSCs能够明显缩短烧伤难愈创面的愈合时间。

2.2愈合率

给药处理第0、4、8、12、16天，创面附标尺，数码相机拍照，记录大鼠的创面情况，使用数码图像分析软件分析创面面积，计算愈合率。创面愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。所测得数据均用均数±标准误表示，使用TUKEY’S test检验，P＜0.05表示差别具有统计学意义。采用ImageJ计算小鼠创面面积；采用GraphPadPrism7进行结果计算并绘图。结果如图4所示，*表示差异显著(P＜0.05)；**表示差异极显著(P＜0.01)。从图4中可以看出，在4、8、12、16天，PMSCs组治疗烧伤难愈创面的愈合率逐渐增大，分别为28.96％±2.54、57.63％±4.35、79.15％±3.85、91.25％±1.87；NS组治疗烧伤难愈创面的愈合率分别为19.43％±3.55、31.52％±3.19、46.35％±3.81、47.72％±5.99；GF组分别为44.29％±3.96、46.28％±3.88、62.47％±4.48、77.81％±2.62。TUKEY’Stest检验分析结果显示与NS组相比，PMSCs组的创面愈合率明显提高，差异具有统计学意义；与GF组相比，PMSCs组的创面愈合率提高，差异具有统计学意义，由此说明，PMSCs具有比外用重组人表皮生长因子具有更好的促进烧伤难愈创面愈合的作用。更出人意料的是，发明人发现，将胎盘间充质干细胞分散于生理盐水中，相比于采用其他类型的注射液，如复方生理盐水等，对烧伤难愈创面具有更高好的治疗效果。

实施例2烧伤难愈创面微环境对角质细胞(HK)和成纤维细胞(HF)的影响

临床收集烧伤难愈创面患者创面创液(CWF)，-80度冰箱保存。HK细胞和HF细胞分别分为三组，HK细胞按4×10³个/100ul密度，HF细胞按3×10³个/100ul密度接种于96孔板，在无血清高糖培养基(DMEM)中培养12小时后，弃去培养基，HF细胞分别加入100μL CWF(HF-CWF组)、DMEM(HF-SFM组)和含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(HF-10％FBS组)，HK细胞分别加入100μL CWF(HK-CWF组)、DMEM(HK-SFM组)和KMII培养基(Gibco^TM,M-EPI-500-CA)(HK-MEM组)，培养48小时后，用阿尔玛蓝试剂(Alamar Blue)测试细胞增殖，结果如图5所示，图中以OD值大小反映细胞数量多少；再用4％福尔马林固定细胞20min后用0.1％结晶紫进行复染，观察细胞形态变化，结果如图6所示。

HF和HK细胞在无血清DMEM培养基中增殖情况较差，用作阴性对照，在含10％FBS的DMEM和KMII培养基中增殖能力较强，用作阳性对照，从图5中可以看出，CWF处理后的HK细胞，细胞浓度分别低于阴性对照组(HK-SFM)30.7％(P＜0.01)，低于阳性对照组(HK-MEM)56.6％(P＜0.01)(A图)；CWF处理后的HF细胞，细胞浓度分别低于阴性对照组(HF-SFM)27.8％(P＜0.01)，低于阳性对照组(HF-10％FBS)42.6％(P＜0.01)(B图)；说明CWF抑制角质细胞和成纤维细胞增殖。

从图6中可以看出，加入CWF后，HF纺锤形形态消失，无螺旋纹(A图)，与正常细胞(B图)相比，细胞数量减少；加入CWF后，HK呈铺路石形态，小片状散在分布(C图)，且与正常细胞(D图)相比，细胞数量减少。说明CWF抑制HK和HF生长。

实施例3PMSCs对HK和HF迁移和增殖的影响

HK细胞以4×10⁴个/孔，HF细胞以2×10⁴个/孔，分别接种在不同Transwell小室，DMEM培养基培养过夜，将DMEM培养基替换为300μL CWF，对应的下室加入600μL DMEM培养基，24小时后，将HF细胞下室的DMEM分别替换为DMEM(记为HF-SFM组)、6×10⁴个PMSCs(无血清细胞培养基培养，记为HF-PMSCs组)和含10％FBS的DMEM培养基(记为HF-10％FBS组)，HK细胞下室的DMEM分别替换为2×10⁴个HF细胞(10％FBS DMEM培养基培养，记为HK-HF组)、DMEM(记为HK-SFM组)、6×10⁴个PMSCs(无血清细胞培养基培养，记为HK-PMSCs组)和KMII培养基(记为HK-KMII组)。分组孵育12小时后，各处理组部分样品用4％福尔马林固定细胞20min后用0.1％结晶紫进行复染，观察细胞迁移情况，酶标仪检测结晶紫染色后的吸光度OD值，以定量反映迁移细胞数量，染色结果如图7A和图7B所示，定量结果如图8A和8B所示，图中以吸光度OD值大小反映细胞数量的多少。另外部分的样本继续孵育36小时(共孵育48小时)，用Alamar Blue试剂检测transwell小室膜上方与下方细胞的总量，以反映HK和HF细胞增殖情况，结果如图9A和9B所示，图中以OD值大小反映细胞数量多少。

图7A第一列为HK-PMSCs组中迁移的角质细胞染色结果、第二列为HK-SFM组中迁移的角质细胞染色结果；图7B第一列为HF-PMSCs组中迁移的HF细胞染色结果，第二列为HF-SFM组中，迁移的HF细胞染色结果；可以看出，与PMSCs共培养后，HK和HF的迁移数量显著增多，说明PMSCs可促进烧伤难愈创面微环境下HK和HF的迁移，图中4×、10×代表不同放大倍数。

HK和HF细胞迁移数量定量结果如图8A和8B所示，从图8A中可见，HK-PMSCs组迁移细胞数量分别高于HK-HF组36.9％(P＜0.01)、HK-SFM组192.2％(P＜0.01)和HK-KMII组64.6％(P＜0.01)，说明PMSCs可促进病理微环境下HK的迁移；从图8B中可见，HF-PMSCs组迁移细胞数量分别高于HF-SFM组91.8％(P＜0.01)、HF-10％FBS组45.4％(P＜0.01)，说明PMSCs可促进病理微环境下HF的迁移。

图9A显示了HK-PMSCs组的细胞数量分别高于HK-HF组23.3％(P＜0.01)、HK-SFM组157.4％(P＜0.01)和HK-KMII组53.5％(P＜0.01)；图9B显示了HF-PMSCs组细胞数量分别高于HF-SFM组65.5％(P＜0.01)和HF-10％FBS组31％(P＜0.01)。可见，PMSCs能够促进病理微环境下HF和HK细胞的增殖。

综合上述结果可见，PMSCs能够促进HK和HF细胞在创面环境下的增殖和迁移，从而能够治疗烧伤难愈创面。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims

1.间充质干细胞用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途；其中，所述间充质干细胞为胎盘间充质干细胞；所述间充质干细胞为第三代至第五代的间充质干细胞。

2.组合物用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途；其中，所述组合物包含间充质干细胞1×10⁶~10×10⁶个/ml，氯化钠0.8-1.0%(w/v)和注射用水；所述组合物的剂型为注射剂；所述间充质干细胞为胎盘间充质干细胞；所述间充质干细胞为第三代至第五代的间充质干细胞。

3.凝胶剂用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途；其中，所述凝胶剂包含间充质干细胞；所述间充质干细胞为胎盘间充质干细胞；所述间充质干细胞为第三代至第五代的间充质干细胞。

4.包含胎盘间充质干细胞的组合物用于制备治疗烧伤难愈创面的药物的用途，其中，所述药物为注射剂，所述组合物由1×10⁶~10×10⁶个/ml胎盘间充质干细胞分散于生理盐水中制成；所述胎盘间充质干细胞为第三代至第五代的胎盘间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述胎盘间充质干细胞通过促进皮肤角质细胞、成纤维细胞的迁移和/或增殖治疗烧伤难愈创面。

6.根据权利要求4-5中任一项所述的用途，其中，所述胎盘间充质干细胞通过以下方法制备：

1）在生物安全柜中，将健康的胎盘组织用预冷的包含双抗和庆大霉素的PBS缓冲液冲洗三遍以上，洗去红细胞；在冰上，剪取胎盘基底膜及绒毛膜0.5-1.0cm厚的组织；

2）将羊膜揭去，剪取0.4-0.6cm厚度肉片，放入盛放含双抗的PBS缓冲液的培养皿中；

3）将所述肉片分别剪成1-3mm²的肉块，在剪的同时，将血管剔除；

4）用PBS缓冲液将组织内的血水洗净；将清洗干净的组织收集到离心管中，加入I型胶原酶消化液，37℃下，摇床震荡1-3h，用PBS缓冲液中止反应；

5）混匀后，500g-550g离心4-6min，收集上清；沉淀加PBS缓冲液定容至20-40ml，涡旋震荡25-35s，重悬细胞；

6）重复步骤（5）直至上清液无色，合并所收集的上清液，500g-550g离心4-6min，合并沉淀，用无血清细胞培养基重悬沉淀，用100目细胞筛过筛，补足无血清细胞培养基培养过夜；

7）根据细胞生长情况进行换液或补液处理，5-7天后观察到细胞爬出，即为一代PMSCs；

8）当细胞融合度大于80%，进行常规传代操作，获得第二代至第五代PMSCs。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述无血清细胞培养基包括3-4vol% Ultroser G和0.8-1vol% GlutaMAX。