KR20190037546A - 피부줄기세포 배양액을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 상처 치료용 조성물, 이의 제조방법, 및 이의 용도를 제공한다.

Description

피부줄기세포 배양액을 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 {Composition for treating wound containing epidermal stem cell conditioned medium and use thereof}

줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 함유하는 약학적 조성물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 신체를 보호하는 방어막으로서 역할을 한다. 피부에 상처가 생기면 생체의 자연 치유 작용에 의해 상처 자리를 혈액이 채우게 되고 혈소판의 과립 감소와 하게만 인자(hageman factor)의 활성화가 시작되어 상처 치유 과정이 진행된다. 혈액의 응고는 임시 방어 작용으로서, 노출된 상처 조직들을 보호하고 치유 과정 동안 세포들이 이동할 수 있는 기반을 제공한다.

상처 치료 및/또는 치유는 크게 3개의 단계로 일어난다. 첫 번째 단계는 외상 부위에서의 염증을 특징으로 하는 염증기(inflammatory phase)이다. 염증기는 중대한 감염이 없는 상태에서 일반적으로 짧게 진행될 수 있다. 두 번째 단계는 증식기(proliferative phase)이며, 이는 상피화, 혈관형성, 육아 조직 형성 및 콜라게 침착을 특징으로 한다. 새로운 모세관 형성을 수반하는 혈관 형성은 영양소를 전달하고 육아조직 형성을 유지하는데 사용된다. 상처 내로 새로운 모세관의 형성 없이 필수 영양소가 상처에 도달하지 못하여 만성적으로 치유되지 않는 상처를 생성시킨다. 손상된 상처의 표면이 표피세포(keratinocytes) 층에 의해 덮이면서 새로운 표피가 생성되고 상피층이 재건되는 재상피화가 일어난다. 재상피화가 완료되면 결합 조직의 증가와 재편성을 통해 상처 면적이 감소되는 일련의 과정이 진행된다. 상처 치유의 최종 단계는 섬유아세포(fibroblast)가 콜라겐으로 분화하는 성숙기(maturational phase)이다. 성숙기 동안 회복기 조직의 엉긴 세포와 모세혈관이 조금씩 사라지게 되는데, 이러한 조직의 세포와 모세혈관이 과형성되거나 정상적으로 분해되지 않는 경우 흉터가 생길 수 있다.

한편, 피부는 표피층, 진피층, 피하지방층의 순서로 구성되며, 표피층는 외부로부터 순서대로 각질층, 과립층, 유극층, 기저층으로 구분되며, 표피층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 표피세포 사이의 세포간 지질들은 모르타르와 같은 역할로 작용하여 피부 장벽을 구성한다. 진피는 섬유아세포가 있어 콜라겐, 엘라스틴 등의 단백질과 여러 가지 뮤코 다당류(mucopolysaccharide)를 생산하여 세포외기질(extra cellular matrix: ECM)을 형성하고 있으며, 적절한 분해 과정을 통해 조직의 흡수와 재형성이 일어난다.

상처 치유과정에서 상처를 신속하게 치료할 뿐만 아니라 부작용이나 흉터 없이 치료하는 것이 중요하기 때문에, 콜라겐을 생산하는 촉진할 수 있는 효능을 가지는 물질을 찾고자 하는 노력이 계속되고 있다.

일 양상은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상처 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 상처를 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 조성물은 피부 재생 효과를 갖는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 피부 조직의 형성 또는 재생을 촉진하기 위한 것일 수 있다.

용어 "상처(wound)"는 조직이 잘려지거나(cut), 찢어지거나(torn), 부서지거나(broken), 타거나(burned), 또는 외상을 입거나(traumatized), 또는 이러한 손상을 유발하는 장애 또는 질환으로부터 발생된 인체에 대한 손상(injury)을 의미한다. 용어 "조직"은 함께 집단을 이루어 특정 기능을 형성하는 인체 중의 세포의 덩어리를 나타낸다. 조직은 눈, 점액, 폐, 신장, 심장, 내장, 힘줄(tendon), 혈관조직, 뼈, 피부, 결합조직, 및 신경, 예컨대 척수를 포함하는 것일 수 있다. 상기 상처는 표면이 개방된 개방된 상처(open wound), 또는 표면이 개방되지 않은 폐쇄된 상처(closed wound)인 것일 수 있다. 상기 상처의 일예는 피부에 있는 개방된 상처인 것일 수 있다.

상기 상처의 일 예는 피부의 표피(epidermis); 진피(dermis); 표피 및 진피; 또는 표피, 진피 및 피하지방층이 손상된 상처일 수 있다.

또한, 상기 상처의 예는 베임(cut), 절개(incisions)(예, 수술적 절개), 창상, 찰과상(abrasions), 타박상(contusions), 자상, 절상, 열상 또는 찢김(lacerations), 골절(fracture), 화상(burns), 또는 절단(amputations)을 포함할 수 있다.

상기 상처는 병변(lesion), 헌데(sore), 괴사(necrosis), 및 궤양(ulcer)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 괴사는 감염, 손상 또는 경색으로부터 생성되는 죽은 조직과 관련된 것일 수 있다. 상기 궤양은 괴사 조직의 탈피에 의해 생성된, 기관 또는 조직의 표면의 국소적인 결함 또는 패임인 것일 수 있다. 상기 상처의 일예는 질환에 의한 족부 궤양 및/또는 괴사인 것일 수 있으며, 구체적으로 당뇨병성 족부 궤양 및/또는 괴사인 것일 수 있다.

피부는 표피층, 진피층 및 피하지방층으로 구성된다. 표피층의 가장 아랫 부분에는 기저층(base layer)이 위치하며, 새로운 표피세포(keratinocyte, 피부조직세포 또는 각질형성세포)는 세포 분열을 통해 이 기저층에서 형성되고, 형성된 표피세포는 표피층 상부의 죽은 세포들을 계속해서 대체한다. 이러한 과정은 피부세포의 재생을 유도한다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 표피층, 예를 들면 기저층을 구성하는 세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 표피세포의 전구세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 이의 분화능 및 자기재생능이 줄기세포에 비하여 제한된 세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 줄기세포 유래 표피전구세포, 분화된 피부전구세포, 분화된 표피세포, 피부줄기세포 또는 표피줄기세포와 호환적으로 사용될 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 케라틴 5(keratin 5: Krt5), 케라틴 1(keratin 1: Krt1) 및 케라틴 14(keratin 14: Krt14)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 발현되는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 케라틴 5, 케라틴 1 및 케라틴 14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 표면 표지 특성이 양성인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 줄기세포에 비하여 케라틴 5, 케라틴 1 및 케라틴 14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가한 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 분화 정도에 따라 Krt10 및/또는 IVL를 다량으로 발현하는 분화 후기에 도달하지 않은 상태로 분화되는 것일 수 있다. 상기 발현은, 예를 들면 실시간 중합효소 연쇄 반응법(real-time PCR: RT-PCR), 또는 면역블롯(Immunoblot: IB)과 같은 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 일정한 크기의 원형의 특이적인 형태를 나타내는 것일 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액의 농축물 또는 이의 동결건조물인 것일 수 있다. 상기 농축물은 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액을 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배 또는 약 20배로 농축한 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 줄기세포 유래 피부전구세포가 배양되는 과정 중에 세포간에 상호작용을 통해서 유용한 단백질을 생산 및 세포 밖으로 분비하는 세포 유래 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 단백질은 사이토카인, 성장인자 등의 유용한 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 하기 도 6에 기재된 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘(Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2(Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2(Ectodysplasin-A2: EDA-A2), X-연관 엑토디스플라신-A 수용체(X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 스팍(secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1(Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3(Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인(TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파(interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘(Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2(Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 엑토디스플라신-A2(Ectodysplasin-A2: EDA-A2) X-연관 엑토디스플라신-A 수용체(X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 스팍(secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1(Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3(Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인(TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파(interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 농도를 약 10 pg/㎖ 이상, 약 15 pg/㎖ 이상, 또는 약 20 pg/㎖ 이상으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 그루초(groucho: GRO), 잠재성 TGF-베타 결합 단백질(latent TGF-beta binding protein 1: latent TGF-beta bp1), 크로스베인리스-2(Crossveinless-2: CV-2), 스매드4(Smad4), 인터루킨-8(interleukin-8: IL-8), 액티빈 C(Activin C) 및 액티빈 A(Activin A)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 미분화 줄기세포 배양액에 비하여, C-C 케모카인 수용체 타입 4(C-C chemokine receptor type 4: CCR4), 과립구 주화성 단백질(granulocyte chemotactic protein-2: GCP-2)/ 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 6(chemokine(C-X-C motif) ligand 6: CXCL6), 엔도칸(Endocan), P-셀렉틴(P-selectin), C-C 케모카인 수용체 타입 5(C-C chemokine receptor type 5: CCR5), 란테스(Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted: RANTES) 및 신경 아교 세포계 유도 신경 영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 0.1% 이하, 0.01% 이하 또는 0.005% 이하의 농도로 포함되거나 또는 포함되지 않은 것일 수 있다.

상기 조성물은 표피 생장 인자 (Epidermal Growth Factor: EGF)를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 활성 성분 또는 유효 성분으로 포함하는 것일 수 있다. "활성 성분 또는 유효 성분"이란 본 명세서에서 언급된 기능을 수행하는 것을 의도한 것이며, 불순물로 소량으로 포함되어 있어서 상기 기능을 수행하지 않은 것을 제외한다.

상기 치료(treat)는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 상처가 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있다. 상기 치료는 상처의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 상처의 개선은 상처의 정도를 낮추는 것을 의미한다. 또한, 상기 치료는 상처 및/또는 상처와 관련된 질환의 치료를 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 치료는 상처로부터 유발되는 손상된 조직의 치유 및/또는 재생을 의미할 수 있다. 상기 상처 치료는 피부 재생의 의미를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치료는 상기 손상된 조직의 원래 조성을 유지하는 것일 수 있다. 또한, 상기 치료는 상처와 관련된 질환의 합병증 및/또는 흉터를 최소화하면서 상기 손상된 조직을 치유 및/또는 재생을 촉진하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 상처 치유 과정의 전단계를 촉진하기 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상처 치유 단계 중 증식기 및/또는 성숙기를 촉진하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 증식기 및/또는 성숙기에 있는 상처를 치료하기 위한 것일 수 있다.

상기 조성물은 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체 또는 세포에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유동물에서 질환 또는 의학적 증상을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감.

상기 조성물은 세포 중 콜라겐 합성 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 줄기세포가 분화된 것일 수 있다.

용어 "줄기세포"는 분화능(potency) 및 자기재생(self-renewal)능을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 또는 단일분화능(unipotency)로 나누어진다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell: ESC)(착상 전 배아의 내세포), 성체줄기세포(adult stem cell)(각 조직 및 장기에 존재하는 미분화된 세포) 및 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)(체세포에 유전자 및/또는 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포, 또는 유도만능 줄기세포)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것일 수 있다. 용어 "중간엽 줄기세포(Mesenchymal sterm cell: MSC)"는 성체 줄기세포로서, 다분화능과 자기재생능을 갖고, 증식능이 우수하고 유전적으로 안정화되어 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 연골, 뼈, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포이며, 다양한 세포 예를 들면, 지방세포, 연골세포, 피부세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있다. 상기 줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 유래한 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 또는 조직의 환경과는 다른 환경에 존재하는 것을 의미한다.

용어 "탯줄(umbilical cord)"은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미하며, 일반적으로 와튼 젤리로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직인 것일 수 있다. 용어 "태반(placenta)"은 포유류의 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 기관을 의미하며, 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하는 것일 수 있다. 태반은 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있다. 양막은 태아를 둘러싸고 있는 얇고 투명한 막으로, 양수가 들어 있으며, 양수 및/또는 양막에는 태아의 줄기세포가 존재한다. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막으로써 모체의 줄기세포가 존재한다. 융모막은 태아나 양수를 둘러싸고 있는 양막과 탈락막 사이에 있는 막으로, 수정란에서 발생하여 난막의 일부를 구성한다. 태반 유래 줄기세포는 태아 또는 모체에서 유래한 것일 수 있다. 양수 유래 줄기세포는 태아에서 유래한 것일 수 있다. 탯줄 또는 태반로부터 유래된 줄기세포는 그 양이 아주 풍부하며 증식이 잘되고 다른 세포로 분화도 가능하다. 용어 "골수(bone marrow)" 는 적혈구, 백혈구 및 혈소판 등을 포함하는 혈액 세포를 만드는 조직을 의미한다. 용어 "제대혈(cord blood)"은 분만 후 신생아의 탯줄에서 나온 혈액을 의미한다. 용어 "지방"은 체지방을 의미하며, 지방으로부터 유래된 줄기세포는 수득이 용이하고, 지방 세포의 1% 정도가 줄기세포로 추정되므로 수득률이 높다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 상기 약학적 조성물 총 부피에 대하여 약 0.01% 내지 약 60%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 상기 약학적 조성물 총 부피에 대하여 약 0.01% 내지 약 60%, 약 0.02% 내지 약 50%, 약 0.05% 내지 약 30%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 17%, 약 0.5% 내지 약 16%, 약 0.6% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 1% 내지 약 13%, 약 2% 내지 약 12%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 7%, 약 4% 내지 약 6% 또는 약 5%인 것일 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 희석제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 조성물은 비경구 또는 경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다. 경구 투여 제형은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제일 수 있다. 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은, 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계; 상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 거쳐 수득된 것일 수 있다. 상기 단계는 아래의 방법에서 자세히 설명한다.

다른 양상은 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계; 상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리된 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수는 통상의 해부학적 방법에 의하여 수득될 수 있다. 상기 분리된 탯줄, 태반, 양수 또는 제대혈은 산모의 모체로부터 출산 후 분리된 탯줄, 태반, 양수 또는 제대혈인 것일 수 있다. 상기 분리된 탯줄, 태반, 양수 또는 제대혈은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다. 상기 태반의 경우 예를 들면, 태반 내에 존재하는 태반 조직들을 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 상기 탯줄의 경우 예를 들면, 탯줄을 태반으로부터 분리하고 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 상기 지방의 경우 예를 들면, 복부 또는 허벅지의 피하지방층에서 지방흡인(liposuction)을 수행함으로써 얻을 수 있다. 얻어진 태반 조직, 탯줄 또는 지방은 항생제, 예를 들면, 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 또는 이들의 조합이 포함된 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)로, 1회, 2회 또는 3회 이상 세척함으로써, 조직에 존재하는 혈액 등의 오염 물질들을 제거할 수 있다. 상기 태반, 탯줄 또는 지방은 직접 효소와 반응시키거나, 또는 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게 세절한 후, 세절된 세포를 효소와 반응시킬 수 있다.

상기 방법은 줄기세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 줄기세포를 수득하는 방법은 통상의 기술자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 탯줄 또는 태반의 경우, 예를 들면, 상기 분리된 탯줄 또는 태반을 배양 용기에 부착하여 5 내지 20일, 10 내지 20일, 또는 10 내지 15일 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄 또는 태반에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인하는 단계; 및/또는 탯줄 또는 태반과 분리 효소를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 탯줄 또는 태반의 경우, 예를 들면, 상기 분리된 탯줄 또는 태반과 분리 효소를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리 효소는 콜라게나아제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 콜라게나아제는 콜라겐의 펩티드 결합을 파괴하는 효소를 의미하며, 콜라게나아제 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리 효소는 10 U/㎖ 내지 4000 U/㎖, 20 U/㎖ 내지 2000 U/㎖, 50 U/㎖ 내지 800 U/㎖, 100 U/㎖ 내지 400U/㎖, 150 U/㎖ 내지 300U/㎖, 또는 200 U/㎖의 콜라게나아제를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분리 효소는 트립신(trypsin), 디스파아제(Dispase) 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 분리 효소를 포함하는 용액은 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 또는 이들의 조합을 포함하는 물, 염수(saline), 예를 들면, HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 탯줄 또는 태반과 분리 효소를 반응시키는 단계는 진탕 또는 정치하여 수행될 수 있다. 상기 진탕 또는 정치는 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃에서 수행될 수 있고, 1 내지 20시간, 2 내지 10시간, 4 내지 9시간, 또는 5 내지 6시간 동안 수행될 수 있다. 지방의 경우, 예를 들면, 상기 분리된 지방과 분리 효소를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리 효소는 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 분리 효소를 포함하는 용액은 콜라게나아제, 트립신, 디스파아제 또는 이들의 조합을 포함하는 물, 염수, 예를 들면, HBSS를 포함하는 것일 수 있다. 상기 지방과 분리 효소를 반응시키는 단계는 진탕 또는 정치하여 수행될 수 있다.

추가적으로, 상기 태반, 탯줄 또는 지방과 분리 효소를 반응시킨 후에, 분리 효소를 불활성화하기 위한 과정을 수행할 수 있으며, 예를 들면, 혈청을 첨가하여 효소 반응을 정지시킬 수 있다. 상기 태반, 탯줄 또는 지방과 분리 효소를 반응시킨 후에, 태반, 탯줄 또는 지방 유래 줄기세포를 얻는 방법은 통상의 기술자에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 원심분리한 후, 세포체(strainer)를 사용하여 세포를 분리하여 수행될 수 있다.

상기 방법은 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계 전에, 수득된 줄기세포를 혈청을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혈청은 우태혈청(fetal bovine serum: FBS), 우아혈청(bovine calf serum: BCS) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 혈청은 분화 배지의 총 부피에 대하여 약 1% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 약 7.5% 내지 약 12.5%, 또는 약 10%인 것일 수 있다. 상기 배지는 섬유아세포성장인자-4(fibroblast growth factor-4: FGF-4) 및/또는 헤파린을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지 중 FGF-4의 농도는 약 10 ng/㎖ 내지 약 40 ng/㎖, 약 20 ng/㎖ 내지 약 30 ng/㎖, 또는 약 25 ng/㎖인 것일 수 있다. 상기 배지 중 헤파린의 농도는 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 2 ㎍/㎖, 약 0.5 ㎍/㎖ 내지 약 1.5 ㎍/㎖, 또는 약 1 ㎍/㎖인 것일 수 있다. 상기 배지는 항생제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지 중 항생제의 농도는 약 10㎍/㎖ 내지 약 250㎍/㎖, 약 25㎍/㎖ 내지 약 100㎍/㎖, 약 40㎍/㎖ 내지 약 65㎍/㎖, 또는 약 50㎍/㎖인 것일 수 있다.

상기 방법은 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계 전에, 줄기세포를 혈청을 포함하는 배지에서 10 내지 350시간 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양은 10 내지 350시간, 20 내지 170시간, 또는 50 내지 70시간, 또는 0.5 내지 14일, 1일 내지 7일, 또는 2 내지 3일 동안 수행되는 것일 수 있다. 상기 배양은 분리된 줄기세포를 P0으로 하는 것일 수 있다. 상기 배양의 계대수는 특별히 제한되는 것은 아니며, 원하는 증식 세포의 수에 따라 적절히 계대수를 선택할 수 있다. 상기 배양의 계대수는 1 내지 20계대, 2 내지 10계대, 3 내지 7계대, 또는 4 내지 5계대 수행함으로써 필요한 수의 누적 증식 세포를 얻을 수 있다.

상기 방법은 상기 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 줄기세포는 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양되어 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화될 수 있다.

용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 분화는 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.

상기 줄기세포는 주변 미세 환경에 따라 세포 분열, 분화 또는 이동하는 등 행동 양상이 달라질 수 있다. 상기 줄기세포는 주변 미세 환경으로부터 오는 자극에 의해 유전자 발현 양상이 달라질 수 있으며, 이에 따라 분화되는 세포가 달라질 수 있다.

상기 분화 배지는 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 것일 수 있다. 아스코르브산(ascorbic acid)은 항산화 특성을 가지는 유기 화합물로, 비타민 C의 일종이며, 수용성이고, 분자식은 C₆H₈O₆을 갖는다. 상기 아스코르브산은 L-아스코르브산인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산은, 아스코르브산 또는 이의 염의 형태인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산의 염은 무기산염, 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염인 것일 수 있으며, 예를 들면 염산염, 질산염, 황산염 등의 무기산염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염 등일 수 있고, 예를 들면 L-아스코르브산나트륨, L-아스코르브산마그네슘, L-아스코르브산칼륨, L-아스코르브산칼슘 등의 L-아스코르브산염인 것일 수 있다. 상기 아스코르브산은 줄기세포 유래 피부전구세포의 증식 및 기저막 형성(basement membrane formation)에 영향을 줄 수 있다. 배지 중에 상기 아스코르브산의 농도는 약 0.03 μM 내지 약 3μM, 약 0.05 내지 약 2 μM, 약 0.1 내지 약 1 μM, 또는 약 0.1 μM 내지 약 0.5 μM인 것일 수 있다.

상기 히드로코르티손(hydrocortison)은 부신 피질 호르몬의 일종이며, 분자식 C₂₁H₃₀O₅ 를 갖는다. 상기 히드로코르티손은, 히드로코르티손 또는 이의 염의 형태인 것일 수 있다. 상기 히드로코르티손의 염은 산 부가염인 것일 수 있으며, 예를 들면 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등의 무기산염, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산 등의 무독성 유기산 등인 것일 수 있다. 히드로코르티손은 피부전구세포로의 분화능을 자극하는 인자로서, 작게는 지질 합성(lipid synthesis)과 세포막(plasma membrane) 구성에 역할을 하며, 표피층의 윗 부분에 위치하는 각질층 형성을 촉진시킬 수 있다. 배지 중에 상기 히드로코르티손의 농도는 약 0.05㎍/㎖ 내지 약 5㎍/㎖, 약 0.075㎍/㎖ 내지 약 3.5㎍/㎖, 약 0.1㎍/㎖ 내지 약 2.5㎍/㎖, 약 0.2㎍/㎖ 내지 약 1.25㎍/㎖, 약 0.3㎍/㎖ 내지 약 1㎍/㎖, 또는 약 0.4㎍/㎖ 내지 약 0.6㎍/㎖인 것일 수 있다.

상기 분화 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM-2 Basal 배지, Chang's Medium 및 MesenCult-XF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 분화 배지는 혈청을 포함하는 것일 수 있다. 상기 혈청은 우태혈청(fetal bovine serum: FBS), 우아혈청(bovine calf serum: BCS) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 혈청은 분화 배지의 총 부피에 대하여 약 1% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 25%, 약 5% 내지 약 20%, 또는 약 7.5% 내지 약 12.5%인 것일 수 있다.

상기 방법은 줄기세포를 분화 배지에서, 120 내지 600시간, 150 내지 500시간, 180 내지 450시간, 또는 200 내지 300시간, 또는 5 내지 25일, 6 내지 21일, 7 내지 18일, 8 내지 15일, 또는 9 내지 12일 동안 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 이의 분화능 및 자기재생능이 줄기세포에 비하여 제한된 세포인 것일 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 분화 배지에서 배양하기 전의 줄기세포에 비하여 케라틴 5(keratin 5: Krt5), 케라틴 1(keratin 1: Krt1) 및 케라틴 14(keratin 14: Krt14)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가한 것일 수 있다. 즉 상기 줄기세포가 피부전구세포로 분화하면서 Krt5, Krt1 및 Krt14로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 증가할 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 분화 정도에 따라 Krt10 및/또는 IVL를 다량으로 발현하는 분화 후기에 도달하지 않은 상태로 분화되는 것일 수 있다. 상기 증가는 유전자의 발현, 즉 mRNA 양 및/또는 단백질 양이 2배 이상, 4배 이상, 8배 이상, 10배 이상, 또는 20배 이상 증가한 것일 수 있다.

상기 방법은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 계대 배양 없이 배양하여 수행될 수 있다. 상기 배지는 단백질 생산에 적합한 배지로서, 줄기세포 유래 피부전구세포가 배양되는 과정 중에 세포간에 상호작용을 통해서 유용한 단백질을 생산 및 세포 밖으로 분비할 수 있는 배지를 의미한다. 상기 배지는 무혈청 배지인 것일 수 있다. 상기 배지는 콜린 클로리드(choline chloride), 페놀 레드(phenol red, 또는 페놀술포프탈레인) 또는 이들의 조합을 포함하지 않는 배지인 것일 수 있다. 상기 배지는 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMaxⅡ complete 배지, EBM-2 Basal 배지, Chang's Medium 및 MesenCult-XF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서, 10 내지 350 시간, 15 내지 200시간, 20 내지 170시간, 또는 40 내지 80시간, 또는 0.5 내지 15일, 1 내지 8일, 1.5 내지 4일, 또는 2 내지 3일 동안 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물은 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 배지, 분화된 피부전구세포, 또는 이의 혼합물을 의미하는 것일 수 있다.

상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포는 배지에서 배양되면서 세포간 상호작용을 통하여 세포 밖으로 피부전구세포 유래 단백질을 분비할 수 있다. 상기 줄기세포 유래 피부전구세포는 주변 환경으로부터 오는 자극에 의해 유전자 발현 양상이 달라질 수 있으며, 이에 따라 줄기세포 유래 피부전구세포로부터 분비되는 단백질의 종류 및 이의 양도 달라질 수 있다. 상기 자극은 줄기세포 유래 피부전구세포가 배양되는 배지 및/또는 배양 시간을 포함하는 것일 수 있다. 즉 배양되는 배지 및/또는 배양 시간에 따라 줄기세포 유래 피부전구세포에서 분비하는 단백질의 종류 및 이의 양이 달라질 수 있고, 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 내에 존재하는 단백질의 조성 및 함량도 달라질 수 있다.

상기 방법은 상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 회수는 분화된 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액을 그대로 수득하는 것일 수 있다. 상기 회수는 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하는 과정 중 또는 배양한 후 수득된, 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물 또는 이의 상층액을 원심분리하거나 또는 필터에 여과하여 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 및/또는 거대 분자를 제거한 후에 수득하는 것일 수 있다.

줄기세포 유래 피부전구세포 배양액, 약학적 조성물 및 상처에 대하여는 상기한 바와 같다.

다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 예를 들면 도포 또는 주사에 의한 것일 수 있다. 상기 도포는 적절한 방법으로 개체의 피부에 상기 조성물을 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통하여 상기 조성물을 피부 내부로 흡수시킬 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 상처 치유를 필요로 하는 개체일 수 있다. 상기 개체는 콜라겐 합성을 촉진시키는 것을 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 방법은 조성물 총 부피에 대하여 약 0.01% 내지 약 60%, 약 0.02% 내지 약 50%, 약 0.05% 내지 약 30%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.2% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 17%, 약 0.5% 내지 약 16%, 약 0.6% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 1% 내지 약 13%, 약 2% 내지 약 12%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 7%, 약 4% 내지 약 6% 또는 약 5%의 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 함유하는 조성물을, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 7일 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상, 또는 5일 내지 150일, 10일 내지 75일, 15일 내지 50일, 20일 내지 40일, 또는 25일 내지 35일 동안, 일당 1회 이상 투여하는 것일 수 있다.

상기 방법은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 또는 이의 농축물을 개체에 약 0.03㎖/kg 내지 약 500㎖/kg, 약 0.06㎖/kg 내지 약 250㎖/kg, 약 0.15㎖/kg 내지 약 100㎖/kg, 약 0.3㎖/kg 내지 약 50㎖/kg, 약 0.6㎖/kg 내지 약 25㎖/kg, 약 1.5㎖/kg 내지 약 10㎖/kg, 또는 약 3㎖/kg 내지 약 5㎖/kg로 투여하는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 상처 치료용 조성물에 의하면, 개체의 피부 재생을 촉진시킬 수 있다. 일 양상에 따른 상처 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법에 의하면, 상기 단계를 반복적으로 수행하는 경우에도 유용한 단백질의 조성 및 이의 농도가 일정한 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 수득할 수 있어, 개체의 상처 치유을 촉진시킬 수 있다.

도 1은 피부 유래 미분화 표피세포(skin derived undifferentiated keratinocyte)를 표피세포로 분화시킨 후, 및 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포를 분화 배지에서 11일 동안 피부전구세포로 분화시킨 후, 각 세포의 형태를 나타내는 도면이다.
도 2는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 3 및 4는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt14의 단백질 수준을 측정한 결과이다.
도 5는 미분화 줄기세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 22종을 나타낸 것이다.
도 6는 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 24종을 나타낸 것이다.
도 7은 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액(분화 배양액), 미분화 줄기세포 배양액(미분화 배양액), 및 통상의 표피세포 배양액(표피세포 배양액)에서 니도겐-1의 농도를 나타낸 것이다.
도 8 및 9는 분화된 피부전구세포 배양액을 함유한 조성물을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 10는 태반 유래 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 제조 및 상처 치유 효과 확인

1. 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 제조

(1) 태반 유래 줄기세포로부터 피부전구세포로의 분화

정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만시에 수집된 태반으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 태반 및 탯줄 각각을 Ca/Mg를 함유하지 않는(free) 둘베코스 인산염 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 태반 조직을 1 내지 5 mm 정도 크기로 잘라내었다. 또한, 탯줄에서 동맥과 정맥을 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 태반 및 탯줄 각각을 배양 용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/㎖의 콜라게나아제 I을 첨가하여 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포를 각각 분리하였다.

태반 유래 줄기세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 나타내는지 확인하기 위하여, 표면 단백질 분석을 위해 유세포 분석을 수행하였다. 세포를 DPBS를 사용하여 세척하고, 2%의 FBS가 함유된 DPBS에 담아 CD44, CD73, CD90, CD105, CD45, CD34, CD31, CD29, CD49, CD9, HLA-ABC, 및 HLA-ER 항체와 약 20분간 반응시켰다. 이 후, 유세포 분석기(FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원 특성을 분석하였다. 도 10은 태반 유래 줄기세포의 표면 항원 특성을 나타낸 결과이다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 태반 유래 줄기세포에서 CD44, CD73, CD90, CD105, CD29, CD49, CD9 및 HLA-ABC의 발현양이 높게 나타난 것으로부터, 상기 태반 유래 줄기세포가 중간엽 줄기세포의 성격을 갖는 것을 알 수 있다.

상기 분리된 세포를 100 내지 5,000 세포/cm²의 농도로 멀티 플라스크(multi-flask)에 접종하고, 상기 세포를 P0으로하여, 25 ng/㎖의 섬유아세포성장인자-4(fibroblast growth factor-4: FGF-4), 1 ㎍/㎖의 헤파린, 50 ㎍/㎖의 겐타마이신, 및 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS)이 함유된 MEM alpha GlutaMAX(PS-CM) 배지에서, 37℃, 5%의 CO₂의 조건에서, 2일 동안, 5계대 동안 계대 배양하였다.

이후, 배양된 세포에, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지와 0.3μM의 아스코르브산(ascorbic acid), 0.5㎍/㎖의 히드로코르티손(hydrocortison) 및 10%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS)을 함유하는 분화 배지를, 멀티 플라스크에 5㎖/cm²가 되도록 첨가하고, 37℃, 5%의 CO₂의 조건에서 11일 동안 배양하였다. 대조군은 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양한 것을 사용하였다.

도 1은 피부 유래 미분화 표피세포를 표피세포로 분화시킨 후, 및 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포를 분화 배지에서 11일 동안 피부전구세포로 분화시킨 후, 각 세포의 형태를 나타내는 도면이다. 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포 각각은 분화 배지에서 피부전구세포의 형태와 유사한 작고 일정한 크기의 원형의 세포 모양으로 분화하였다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 태반 유래 줄기세포 및 탯줄 유래 줄기세포는 분화 배지에서 배양된 후 피부전구세포의 형상를 나타냄을 알 수 있다.

(2) 분화된 피부전구세포에서 유전자 발현 확인

(2.1) 실시간 중합효소 연쇄 반응법(real-time PCR : RT- PCR ) 분석

(1)의 태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중에, 중기 및 말기 단계에 발현하는 유전자인 Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 발현 수준을 RT-PCR로 측정하였다.

태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, 세포를 수득하고 페놀/클로로포름을 사용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 역전사하여 cDNA를 합성하였다. cDNA의 유전자 발현 정도는 Applied Biosystems 700 서열 검출 시스템(Foster City, CA, USA) 상에서, RT-PCR로 분석하였다. 이 때, 합성된 cDNA, 하기 표 1에 기재된 Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10 각각에 특이적인 프라이머 세트, 2 x TaqMan 마스터 혼합물 및 20 x premade TaqMan 유전자 발현 분석(Applied Biosystems) 키트를 이용하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분, 40회 반복. Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10의 mRNA 수준을 인간 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase: GAPDH) 수치로 정규화하였다.

유전자명	정방향 프라이머	역방향 프라이머
Krt5	GTC TCG CCA GTC AAG TGT GT (서열번호 1)	GAC ACG GAG GTG AAG CTG (서열번호 2)
Krt1	GGG TGG TTA TGG TCC TGT CT (서열번호 3)	GGA TCT CAG GGT CAA TCT CC (서열번호 4)
IVL	CCA GGT CCA AGA CAT TCA AC (서열번호 5)	ACT GCG GGT GGT TAT TTA TG (서열번호 5)
Krt14	GAG CAG CAG AAC CAG GAG T (서열번호 7)	GAG AAC TGG GAG GAG GAG AG (서열번호 8)
Krt10	ACT ACT CTT CCT CCC GCA GT (서열번호 9)	TGA GCT AAA TCC TCC ACC AA (서열번호 10)

도 2는 탯줄 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt5, Krt1, IVL, Krt14, 및 Krt10 유전자의 발현 수준을 측정한 결과이다. Y축은 인간 GAPDH로 정규화된 상기 유전자의 발현양을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 분화가 진행되면서 5일 이후 피부전구세포의 분화 단계에서 중기에 발현하는 Krt14의 mRNA 수준이 증가하였다.

(2.2) 면역블롯(Immunoblot : IB )

(1)의 태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중에, 중기 단계에 발현하는 유전자인 Krt14의 단백질 수준을 면역블롯으로 측정하였다.

태반 유래 줄기세포를 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, 세포를 수득하고 수득된 세포를 세포 용해 버퍼에서 용해하였다. 상기 세포 용해 버퍼는 RIPA 버퍼(Thermofisher) 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, Inc., Indianapolis, IN, USA)을 포함하는 것을 사용하였다. 세포 용해물에 함유된 단백질을 정량하고, 각 시험군 및 대조군에 대하여 단백질 20μg을 7.5%의 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE)으로 분리하였다. 분리된 단백질을 폴리비닐덴디플루오리드(polyvinylidene fluoride: PVDF) 막(EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 이동시켰다. 상기 PVDF 막을 1차 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, 상기 PVDF 막을 Tween과 Tris, NaCl이 함유된 TBST 용액으로 세척하고, HRP가 결합된 2차 항체와 상온에서 반응시켰다. 단백질 밴드를 증가된 화학 발광(Enhanced chemiluminescence: ECL) 키트 시스템(EMD Millipore)을 사용하여 가시화하였다.

도 3 및 4는 태반 유래 줄기세포를 분화 배지에서 피부전구세포로 분화시키는 과정 중, 3일, 5일, 7일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 19일 및 21일에, Krt14의 단백질 수준을 측정한 결과이다. 도 3 및 4에서 나타낸 바와 같이, 태반 유래 줄기세포는 분화 배지에서 배양된 후 5일 이후부터 Krt14 단백질 양이 점차적으로 증가하였음을 알 수 있다. 반면, 태반 유래 줄기세포는 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양된 후 Krt14 유전자가 발현되지 않거나 또는 매우 낮은 정도로 발현됨을 확인하였다.

(3) 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 제조

(1)에서 분화된 피부전구세포로부터 배양액을 생산하였다.

(1)에서 분화된 피부전구세포에서 분화 배지를 제거하고, DPBS로 세척하여 잔류 혈청을 제거하였다. 이 후, 콜린 클로리드(choline chloride) 및 페놀 레드(phenol red)를 포함하지 않는 DMEM/F12 배지를 배양 플레이트에 2 내지 3㎖/cm²가 되도록 첨가하고, 37℃, 5%의 CO₂의 조건에서 3일 동안 배양하였다. 이어서, 분화된 피부전구세포 및 배지가 혼합된 피부전구세포의 배양물에서 상층액을 회수하였다. 이어서, 상기 상층액을 0.22μm의 필터에 여과하여 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 수득하였다. 대조군은 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양된 태반 유래 줄기세포(이하, 미분화 줄기세포) 및 통상의 표피세포 각각에, 배지를 첨가하고 배양하여 회수된 배양액을 사용하였다.

(4) 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액의 성분 분석

(3)에서 수득한 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 및 미분화 줄기세포 배양액 내에서 세포 유래 단백질의 성분을 세크리톰 분석으로 확인하였다. 구체적으로 총 507종의 사이토카인의 수준을 확인하였다.

세크리톰분석은 RayBio 인간 사이토카인 항체 어레이(RayBio Human Cytokine Antibody Array)의 프로토콜에 따라 RayBio™ 커스톰 L-시리즈 인간 사이토카인 어레이(RayBio™ Custom C-Series Human Cytokine Array)(RayBiotech, Norcross, GA)를 이용하여 수행하였다. 얻어진 스폿(spot)의 상대 강도는 이미지 J에 의해 측정되었고, 배경 제거(background subtraction)에 의해 보정되었다. 결과는 2회 판독 결과의 평균치로 나타내었다.

(4.1) 미분화 줄기세포 배양액 세크리톰 분석

도 5는 미분화 줄기세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 22종을 나타낸 것이다. 표 2는 미분화 줄기세포 배양액에서 단독으로 발현되는 사이토카인 6종을 나타낸 것이다. 미분화 줄기세포 배양액은 C-C 케모카인 수용체 타입 4(C-C chemokine receptor type 4: CCR4), 과립구 주화성 단백질(granulocyte chemotactic protein-2: GCP-2)/ 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 6(chemokine(C-X-C motif) ligand 6: CXCL6), 엔도칸(Endocan), P-셀렉틴(P-selectin), C-C 케모카인 수용체 타입 5(C-C chemokine receptor type 5: CCR5), 란테스(Regulated on Activation, Normal T Cell Expressed and Secreted: RANTES) 및 신경 아교 세포계 유도 신경 영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF)를 특이적으로 함유하는 것을 알 수 있다.

No.	사이토카인	신호 강도(Signial intensity)
		미분화 배양액	분화 배양액
1	CCR4	107,943	1
2	GCP-2 / CXCL6	58,109	1
3	엔토칸(Endocan)	57,883	1
4	P-셀렉틴(P-selectin)	34,935	1
5	RANTES	24,995	1
6	GDNF	21,206	1

(4.2) 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 세크리톰 분석

도 6는 분화된 피부전구세포 배양액에서 발현양이 높은 사이토카인 가운데 상위 24종을 나타낸 것이다. 표 3은 분화된 피부전구세포 배양액에서 다량으로 발현하는 사이토카인 24종을 나타낸 것이다. 분화된 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘(Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2(Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2(Ectodysplasin-A2: EDA-A2) X-연관 엑토디스플라신-A 수용체(X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 스팍(secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1(Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3(Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인(TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파(interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파) 등을 다량 함유하는 것을 알 수 있다.

No.	사이토카인	신호 강도
1	트롬보스폰딘(TSP)	5,886,805
2	IGFBP-rp1/IGFBP-7	3,970,222
3	TIMP-2	3,950,540
4	EDA-A2	3,938,694
5	XEDAR	1,572,912
6	안지오포이에틴-1	1,167,638
7	SPARC	1,020,366
8	GDF-3	1,009,469
9	sFRP-4	999,123
10	GRO	963,242
11	MIP 2	865,819
12	TIMP-1	785,939
13	잠재성 TGF-베타 bp1	554,608
14	CV-2/크로스베인리스-2	475,676
15	IL-6	441,917
16	TMEFF1/토모레굴린 -1	430,143
17	니도겐-1	413,625
18	Smad 4	391,810
19	액티빈 C	228,189
20	IGFBP-3	182,444
21	트롬보스폰딘-2	112,674
22	TRANCE	100,065
23	액티빈 A	76,102
24	IL-15 R 알파	51,270

(5) 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 내 단백질 농도 분석

상기 분화된 피부전구세포 배양액에서 표 3의 단백질이 다량 분비되는 것을 확인하였으며, 이들의 분비량을 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)으로 정량적으로 분석하였다. 대조군은 아스코르브산 및 히드로코르티손을 함유하지 않는 배지에서 배양된 태반 유래 줄기세포(이하, 미분화 줄기세포)에, 배지를 첨가하고 2 내지 4일 동안 배양하여 회수된 배양액, 및 표피세포에 배지를 첨가하고 2 내지 4일 동안 배양하여 회수된 배양액을 사용하였다. ELISA 키트는 트롬보스폰딘에 대하여 DTP00B(R&D system, Minieapolis, MN), 니도겐-1에 대하여 ELH-Nidogen1(Raybiotec, Norcross, GA), TRANCE에 대하여 MBS262463(Mybiosource), IL-15R 알파에 대하여 ELH-IL15RA(Raybiotec, Norcross, GA)를 이용하였으며, 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 모두 450nm에서 마이크로 플레이트 리더기 Epoch(BioTek Inc.)를 사용하여 흡광도를 측정하였으며, Gen5(2.00) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

하기 표 4는 분화된 피부전구세포 배양액에서 트롬보스폰딘, TRANCE, 및 IL-15R 알파의 농도를 측정한 결과이다. 분화된 피부전구세포 배양액은 니도겐, 트롬보스폰딘 등을 다량 함유하는 것을 알 수 있다. 도 7은 분화된 피부전구세포 배양액, 미분화 줄기세포 배양액 및 통상의 표피세포 배양액에서 니도겐-1의 농도를 나타낸 것이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 분화된 피부전구세포 배양액은 미분화 줄기세포 배양액 및 표피세포 배양액에 비하여 니도겐-1의 함량이 10배 이상 높은 것을 알 수 있다.

No.	사이토카인	농도(pg/㎖)	신호 강도
1	트롬보스폰딘	63.65	5,886,805
2	니도겐-1	15180	413,625
3	TRANCE	29	100,065
4	IL-15R 알파	19	51,270

2. 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액의 피부 재생 및 상처 치유 촉진 효과 확인

(1) 당뇨병 유발 모델에서 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액의 상처 치유 촉진 효능 확인

1에서 제조된 배양액이 당뇨 유발 동물 모델에서 상처 치유 효능을 나타내는지 확인하였다. 모든 절차는 차의과대학 및 위원회의 승인을 받아 수행하였다.

1에서 제조된 분화된 피부전구세포 배양액을 3220 xg, 및 4℃에서 부피가 약 10배로 농축될 때까지 원심 분리하였다. 이때, 아미콘(amicon) (Millipore, massachusetts, USA) 컬럼, 및 원심분리기 5810R (Eppendorff, Ha mburg, Germany) 스윙 버킷(swing buket)을 사용하였다.

스트렙토조토신(streptozotocin, Sigma사)을 0.1M의 시트레이트(citrate) 버퍼(pH 4.5)에 용해한 다음, 용해된 스트렙토조토신을 6 내지 8주령 Balb/c 마우스에 55 mg/kg로 5일 연속 복강 내 주사하여 당뇨를 유발하였다. 이어서, 마우스에서 혈청 글루코스 수준을 Accu-Check Advantage 글루코미터 (Roche, Indianopolis, IN)를 사용하여 측정하였다. 채혈된 혈장 글루코스 수준이 300 mg/dl 이상인 경우를 당뇨가 유발된 것으로 판단 및 분류하였다.

당뇨가 유발된 것으로 확인된 마우스 및 당뇨를 유발하지 않은 대조군 마우스를 아이소플루란으로 마취시키고, 표준 피부 생검 펀치 (직경 0.5cm, Acuderm Inc., Fort Lauderdale, FL, USA)을 사용하여 2군데의 피부 전층을 제거하여, 배면(dorso-lateral)에 피부 창상을 유발하였다. 상부 및 하부 상처는 약 2.5cm이었다. 수술 직후, 기본 배지, 분화된 태반 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 농축액 및 미분화 태반 줄기세포 배양액 농축액 각각을 마우스에 100 ㎕/마우스로 3일 간격으로 총 2회 반복 투여하였다. 또한, 당뇨병 족부 궤양 치료제(대웅제약, Easydew, Easyef Ointment)의 주요 단백질 성분인 표피 생장 인자(Epidermal Growth Factor: EGF) (1㎍/마우스)를 분화된 태반 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액 농축액과 혼합하여, 마우스에 100 ㎕/마우스로 3일 간격으로 총 2회 반복 투여하였다.

개방 창상 면적은 알려진 방법을 사용하여 치료 0, 3, 6, 9, 12 및 15일 후에 측정하였다 (Stem cells, 23:1571-1578; 2005.). 상처 이미지를 Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여, 픽셀 면적을 계산하고 이미지 마진을 추적하여 분석하였다. 픽셀의 수는 각 상처를 촬영한 눈금자의 눈금으로 정규화하였다. 측정은 반복 수행하였고, 개방 창상 면적은 각 시점에서 상처 부위의 면적을 0일째 상처의 면적으로 나눈 값의 퍼센트로 나타내었다.

도 8 및 9는 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 함유한 조성물을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 8 및 9에서, STZ induced-DM은 당뇨 유발 모델을 나타내고, Non-DM은 당뇨를 유발하지 않은 모델을 나타낸다. Pla-CM은 미분화 태반 줄기세포 배양액을 투여한 군을 나타내고, D-Pla-CM은 분화된 태반 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 투여한 군을 나타내며, D-Pla-EGF는 분화된 태반 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액과 표피 생장 인자를 혼합한 것을 투여한 군을 나타내고, SAFC는 기본 배지 (Sigma Aldrich customized product, 86310C-1000ml)를 투여한 군을 나타낸다. 도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 배양액을 함유한 조성물을 상처 유발 동물 모델에 투여한 결과, 대조군에 비하여 상처 면적이 현저하게 감소하였다. 투여 9일 째에, 태반 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 투여한 군에서 미분화 태반 줄기세포 배양액을 투여한 군에 비하여 상처 크기가 감소하는 속도가 약 38% 빠르게 나타났다. 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 미분화 줄기세포 배양액에 비하여, 상처를 빠른 속도로 치유할 수 있음을 확인하였다.

<110> CHA BIOTECH CO., LTD. <120> Composition for treating wound containing epidermal stem cell conditioned medium and use thereof <130> PN119665 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt5 primer <400> 1 gtctcgccag tcaagtgtgt 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt5 primer <400> 2 gacacggagg tgaagctg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt1 primer <400> 3 gggtggttat ggtcctgtct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt1 primer <400> 4 ggatctcagg gtcaatctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL primer <400> 5 ccaggtccaa gacattcaac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IVL primer <400> 6 actgcgggtg gttatttatg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt14 primer <400> 7 gagcagcaga accaggagt 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt14 primer <400> 8 gagaactggg aggaggagag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt10 primer <400> 9 actactcttc ctcccgcagt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Krt10 primer <400> 10 tgagctaaat cctccaccaa 20

Claims (10)

1. 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 상처는 창상, 찰과상, 타박상, 자상, 절상, 또는 열상인 것인 약학적 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 역분화 줄기세포인 것인 약학 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 탯줄, 태반, 지방, 골수, 제대혈 또는 양수로부터 분리된 중간엽 줄기세포인 것인 약학적 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘(Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2(Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2(Ectodysplasin-A2: EDA-A2), X-연관 엑토디스플라신-A 수용체(X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), 스팍(secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1(Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3(Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인(TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파(interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 약학적 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 트롬보스폰딘 (Thrombospondin: TSP), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 1 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 1: TIMP1), 금속단백질분해효소의 조직 억제제 2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2: TIMP2), 엑토디스플라신-A2 (Ectodysplasin-A2: EDA-A2), X-연관 엑토디스플라신-A 수용체 (X-linked ectodysplasin-A receptor: XEDAR), 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1), 스팍 (secreted protein acidic and rich in cysteine: SPARC), 상피세포성장인자 유사 및 두 폴리스타틴 유사 도메인 1을 갖는 막관통 단백질/토모레굴린-1 (Transmembrane protein with EGF-like and two Follistatin-like domains 1/ Tomoregulin-1: TMEFF1/Tomoregulin-1), 니도겐-1 (Nidogen-1), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3 (Insulin-like growth factor-binding protein-3: IGFBP-3), 트롬보스폰딘-2 (Thrombospondin-2), 종양 괴사 인자-관련 활성 유도 사이토카인 (TNF-related activation-induced cytokine: TRANCE), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha: IL-15R 알파)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 농도를 10pg/㎖ 이상으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은 상기 화장료 조성물 총 부피에 대하여 0.01 내지 60%로 포함되는 것인 약학적 조성물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액은
   줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계;
   상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및
   상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 거쳐 수득된 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액, 이의 농축물, 또는 이의 동결건조물을 포함하는 것인 약학적 조성물.
9. 줄기세포를 아스코르브산 및 히드로코르티손을 포함하는 분화 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포로 분화시키는 단계;
   상기 분화된 줄기세포 유래 피부전구세포를 배지에서 배양하여 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물을 생성시키는 단계; 및
   상기 줄기세포 유래 피부전구세포의 배양물로부터 줄기세포 유래 피부전구세포 배양액을 회수하는 단계;를 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법.
10. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법.

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