KR101202997B1

KR101202997B1 - 창상 치료용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101202997B1
Application number: KR1020100056318A
Authority: KR
Inventors: 김재호; 허순철
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-15
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2012-11-20
Also published as: KR20110136368A

Abstract

본 발명은 창상 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-alpha, 이하 TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 창상 개선 또는 치료용 조성물로서, 상기 조성물의 배양액은 창상 동물모델에서 상피조직의 재생, 혈관신생의 촉진, 면역세포의 침윤 촉진 등을 통해 피부상처의 재생을 촉진하는 효과가 있을 뿐만 아니라 부작용이 없고 저렴한 비용으로 제공가능하므로 이를 창상 개선 또는 치료용 약학 조성물로 활용할 수 있을 것이다.

Description

창상 치료용 조성물 및 이의 제조방법 {Composition for dermal wound healing and the Method thereof}

본 발명은 줄기세포의 배양액을 이용한 피부 창상 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인간이 살아가는데 있어서, 창상은 필수불가결하게 일어나기에 창상의 빠른 치유를 위한 연구가 활발이 진행되고 있으며, 상처의 치료를 위한 2012년 전체 창상 치료제 시장은 년간 125억 달러에 달할 것으로 예측할 정도로 시장성 또한 크다 (출처 : The Global Market for Advanced Wound Care Products 2008; Espicom Business Intelligence).

최근 창상 치유에 관한 연구는 세포생물학적, 분자생물학적 분야로 더욱 세분화되고 있고, 창상 치유 촉진에 관한 임상적 적용 또한 더욱 광범위해지고 있으나, 아직도 미세한 세포생물학, 분자생물학적 기전에는 의문점들이 많다.

현재까지 밝혀진 바에 의하면, 창상 치유는 손상에 대한 조직의 반응이며, 조직 회복의 과정으로, 주화성 (chemotaxis), 세포의 분화 및 복제 (differentiation and replication), 기질단백질 (matrix protein)의 합성, 혈관의 신생, 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다 (Steed, D.L. et al., Clin. Plast. Surg. 25, 397, 1998). 이러한 창상 치유 과정의 초기에 나타나 이후 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장인자를 들 수 있는데, 이들은 창상 치유 과정 전반에 걸쳐 강력한 영향을 미치면서 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고, 창상 주변환경 또한 조절하므로, 이를 이용한 치료의 개발이 꾸준히 진행되고 있다

이들 중 대표적인 것으로, 표피성장인자 (EGF)(Exp. Cell Res., 164, 1-10, 1986), 산성 및 염기성 섬유아세포성장인자 (acid 및 basic FGF) (J. surg.Res., 45, 145-153, 1988), 형질전환인자 (TGF-α 및 TGF-β) 및 인슈린양 성장인자 (IGF-I 및 II)등의 성장인자 (BIO/Technology, 135-140, 1985), 피브로넥틴, 라미린, 비트로넥틴 (Ann. Rev. Biochem, 52:961, 1983)등의 접착인자, 레티노이드 및 유사화합물 (Am. J.OphtHalmol., 95:353, 1983; Ann. Ophthal., 19:175, 1987)등의 화학물질이 알려져 있다.

피부의 재생 또는 창상 치료는 면역반응 (inflammation), 재상피화 (reepithelialization), 육아조직의 형성 (granulation), 섬유조직형성 (fibroplasia), 상처조직의 수축 (contraction)등 여러 가지 과정을 통해 이루어진다 (Freedberg et al., 2001). 피부 재생의 일련의 과정들은 각질세포 (keratinocytes), 섬유아세포 (fibroblasts), 내피세포 (endothelial cells), 대식세포 (macrophage), 혈소판 (platelets) 등과 같은 여러 세포들의 협력에 의해서 이루어지며 이러한 세포들의 이동, 침윤, 증식, 분화와 같은 복합적인 진행은 다양한 성장인자 (growth factor), 사이토카인, 케모카인에 의해서 조절 받기에 상술한 인자나 화학물질의 유효성이 알려져 있다.

그러나, 상기 성장인자, 사이토카인을 이용한 상처치유기술은 이들 단백질을 생산, 분리하는 데 많은 비용이 소요되며, 상처 치유과정에는 이들 단백질들이 복합적으로 작용하기에 한 가지 종류의 단백질만을 사용할 경우 상처치료제로 부분적인 창상 완화를 제공하지만, 치유기간이 길고 치료에 대한 반응이 최적에 미치지 못하는 등 비효과적이라는 점 때문에 실제 상용화에 문제점이 있다.

한편, 중간엽 줄기세포 중 가장 먼저 발견된 골수기질세포는 1968년 Fiedenstein등의 연구에 의해 처음으로 밝혀졌으며 (Friedenstein et al, 1968), 혈액줄기세포의 분화환경을 조성할 뿐만 아니라 적절한 실험조건하에서 연골, 뼈, 지방조직 등 다양한 결체조직을 형성할 수 있다 (Owen, 1988). 생체 외에서 골수기질세포를 심장근육세포 (Makino et al, 1999), 간세포 (Oh et al, 2001) 및 신경세포 (Woodbury et al, 2000; Deng et al, 2001)로 분화시키기 위한 실험들이 시도되었다. 골수기질세포를 포함한 중간엽 줄기세포는 다양한 손상장기의 세포치료, 유전자전달, 면역반응의 조절 등 다양한 목적에 이용될 수 있다 (Tocci & Forte, 2003).

중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cells, MSCs)는 자가 재생 능력과, 높은 생존력, 다양한 세포로의 잠재적인 분화 능력을 가진 세포주이다. 이러한 재생 능력은 중간엽 줄기세포의 조직세포로의 직적접인 분화능력에 의한 것보다 중간엽 줄기세포로부터 분비되는 사이토카인, 성장인자 등에 의한 간접적인 요인에 의한 영향이 더 크다 (Fox, J.M. et al. (2007) Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. Br. J. Haematol. 137:491-502). 그러나, 활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 경우 세포로부터 분비되는 사이토카인, 성장인자 등의 양이 적은 관계로 활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 배양액은 상처치유를 위한 조성물로 활용하기에 부적합하다.

본 발명에서는 TNF-알파로 처리한 줄기세포의 배양액을 활용하여 창상 치료에 효과적이며 부작용이 없고 저렴한 창상 치료 조성물을 제공하고자 하며, 상기 배양액이 상처치유에 어떤 영향이 있는지 분석하고 배양액 내에 포함된 분비 단백질을 유효성분으로 하는 창상 치료 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 저렴한 비용으로 TNF-알파로 처리한 줄기세포의 배양액을 대량생산할 수 있는 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 창상 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 줄기세포는 척추동물 유래의 것일 수 있다.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈에서 추출된 것이 바람직하다.

상기 TNF-알파를 0.01-1000 ng/ml의 농도로 처리할 수 있다.

상기 TNF-알파로 1일 내지 4일간 처리하는 것이 바람직하다.

상기 배양액 내에는 IL-6, IL-8 및 MCP-1로 구성된 군 중에서 선택된 것이 함유되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 배양액을 0.1-100 중량%로 함유하는 것이 바람직하다.

상기 조성물을 외용제 형태로 제형화된 것이 바람직하다.

본 발명은 줄기세포 배양으로부터 창상 개선 또는 치료용 배양액을 얻는 방법에 있어서, 상기 줄기세포에 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 창상 개선 또는 치료용 배양액의 제조방법을 제공한다.

상기 줄기세포에 TNF-알파로 처리하는 과정 전에 줄기세포에서 혈청성분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 TNF-알파를 0.01-1000 ng/ml의 농도로 처리할 수 있다.

본 발명에 따르면 TNF-알파 (TNF-alpha)를 줄기세포에 처리한 후 얻은 세포배양액은 창상 치료에 우수한 효과를 나타낼 뿐 아니라, 부작용이 없고 경제적인 가격으로 공급이 가능하며, 창상 치료에 유효한 단백질인 IL-6, IL-8, MCP-1등이 농축되어 있어, 본 배양액을 사용하면 창상 재생 과정에 있어서 중요한 과정인 재상피화, 혈관신생, 염증세포의 침윤 등이 촉진되었다. 따라서 TNF-알파 (TNF-alpha)를 줄기세포에 처리한 후 분리한 세포배양액은 창상 개선 또는 치료용 약학 조성물로 활용할 수 있다.

도 1은 TNF-알파로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액을 동물 피부상처 모델에 처리시 피부 상처가 빨리 회복됨을 나타내는 것으로, 하기 도면에서 Hank's balanced salt solution은 PBS를, TNF-alpha를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 배양액은 control CM을, TNF-alpha를 처리하여 얻은 중간엽 줄기세포 배양액은 TNF 알파 CM을 나타낸다.
도 2는 TNF-알파로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액을 동물 피부상처 모델에 처리시 혈관의 생성이 촉진됨을 나타내는 것으로, 하기 도면에서 Hank's balanced salt solution은 PBS를, TNF-alpha를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 배양액은 control CM을, TNF-alpha를 처리하여 얻은 중간엽 줄기세포 배양액은 TNF 알파 CM을 나타낸다.
도 3은 TNF-알파로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액을 동물 피부상처 모델에 처리시 면역세포의 침윤이 촉진됨을 나타내는 것으로, , 하기 도면에서 Hank's balanced salt solution은 PBS를, TNF-alpha를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 배양액은 control CM을, TNF-alpha를 처리하여 얻은 중간엽 줄기세포 배양액은 TNF 알파 CM을 나타낸다.
도 4는 TNF-알파로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액에서 interleukin-6 (IL-6), IL-8, 단구 화학주성 단백질-1 (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)이 증가함을 나타내는 것이다.
도 5는 TTNF-알파로 유도된 중간엽 줄기세포 배양액 내 상처치료 촉진 유효물질로서 IL-6, IL-8의 역할을 제시하는 것이다.

본 발명은 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 TNF-알파 처리 줄기세포 배양액은 미처리 배양액에 비하여 창상 개선 또는 치료에 더 효과적임을 확인하였다.

다른 한편으로, 본 발명은 줄기세포를 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 창상 개선 또는 치료용 배양액의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 종래 창상 치료효과를 나타내는 성장인자, 사이토카인을 생산, 분리하는 데 많은 비용이 소요되며, 이러한 분리된 단백질을 한 가지 종류만을 사용할 경우 효과가 부분적이며 치유기간이 길어지는 등 비효과적임을 인지하고, 이러한 문제점을 해결하기 위해 창상 치료에 복합적으로 작용할 수 있는 단백질들이 고농도로 함유된 저렴한 비용의 창상 치료제를 개발하고자 노력하던 중, TNF-alpha를 줄기세포에 처리하면 상처치료효과가 있는 사이토카인, 성장인자를 고농도로 함유한 배양액을 저렴한 비용으로 중간엽 줄기세포로부터 다량으로 획득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 '줄기 세포'는 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서, 어느 특정한 또는 복수 개의 기능적 세포로 분화되는 능력 및 스스로 동일한 세포를 반복적으로 생산할 수 있는 자기 복제 능력을 가진, 미분화 세포를 일컬을 수 있다. 줄기세포는 분화 가능성에 따라 크게 배아 줄기세포 (embryonic stem cell; ES cell)와 성체 줄기세포 (adult stem cells)로 나뉠 수 있다.

배아 줄기세포는 수정란이 형성된 후 자궁내막에 착상하기 전의 매우 초기 단계인 포배기 (blastocyst) 배아 중 태아로 발생할 세포괴 (inner cell mass; ICM)로부터 분리해낸 줄기세포로서, 내배엽, 외배엽 및 중배엽의 3개의 배엽 (embryonic germ layer)에 의해 생성되는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력이 있는 (pluripotent) 세포일 수 있다.

반면, 성체 줄기세포는 발생과정이 끝난 성인 또는 배아 발생 과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계에 태반에서 얻어지는, 각 장기에 특이적인 줄기세포로서, 그 분화능이 일반적으로 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 (multipotent) 될 수 있다. 이러한 성체 줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 할 수 있다. 대표적인 성체 줄기세포로는 골수 (bone marrow)에 존재하는 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cell)와 혈구 세포 이외의 결합조직 (connective tissue) 세포로 분화되는 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)일 수 있다. 조혈 줄기세포는 적혈구, 백혈구 등 각종 혈구 세포로 분화되고, 중간엽 줄기세포는 골아세포 (osteoblast), 연골아세포 (chondroblast), 지방 세포 (adipocyte) 및 근아세포 (myoblast) 등으로 분화될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 중간엽 줄기세포의 중요한 저장소인 골수로부터 분리될 수 있으나, 채취에 어려움이 있을 수 있으며, 지방조직 등에서도 분리배양될 수 있다. 본 발명에 있어서, 중간엽 줄기세포는 줄기세포능, 즉, 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있다.

본 발명에서 '종양괴사인자 (TNF)'는 단핵구, 섬유아세포, T 세포, 천연 킬러 (natural killer, NK) 세포를 포함한 수 많은 세포 유형에 의해서 생산되고, 주로 활성화된 대식구에 의해 생산될 수 있다. 'TNF-α'는 종양의 신속한 괴사, 면역자극, 자가면역 질환, 이식 거부, 기생충에 대한 내성, 항-바이러스 반응의 발생, 패혈증성 쇼크, 성장 조절, 혈관 내피 작용 및 대사 작용에 있어서 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다.

본 발명에서 '창상 (wound)'은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 창상의 예로는, 이들로 한정하는 것은 아니지만, 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 열상 (laceration), 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 총상 (gun shot wound), 절상, 화상, 동상, 타박상 (contusion or bruise), 피부궤양, 피부건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 창상, 각막창상 등의 창상, 욕창, 와창, 당뇨성피부미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.

본 발명은 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 줄기세포 유래 생물종은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 척추동물에서 유래된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 포유류 예를 들면, 인간 (human), 원숭이 (monkey), 돼지 (pigs), 말 (horses), 소 (cows), 양 (sheep), 개 (dogs), 고양이 (cats), 생쥐 (mice), 토끼(rats) 등에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 줄기세포는 분화되는 잠재력을 지닌 모든 세포를 포함하며, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 태아로부터 유래된 것이든 무관하나, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

성체 줄기세포는 배아줄기세포와는 달리 성장한 자가 신체조직에서 추출하기 때문에 생명 윤리적 문제를 피할 수 있을 뿐 아니라 면역 거부 반응의 우려 또한 없으며, 치료를 위한 세포를 자가 조직으로부터 다량 확보할 수 있다는 점에서도 배아줄기세포와 차별되는 장점을 지니고 있다. 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어 저장하는 자가 재생산 (Self-renewal)을 할 수 있으며, 주변 조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화 능력 (tissue-specific differentiation)을 가지고 있기에 바람직할 수 있다.

본 발명의 상기 중간엽 줄기세포는 그 유래된 조직이나 기관에 무관하나, 바람직하게는 지방, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈에서 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 지방에서 추출된 것일 수 있다.

이는 지방 줄기세포는 골수 유래 줄기세포와 비교해 볼 때 다분화능과 증식력이 거의 비슷하거나 더 우수하며, 실제 임상적 유용성에서 볼 때 소량의 지방 조직에서 충분한 양의 줄기세포를 얻고 배양할 수 있기에 경제적인 이점이 있으며, 실제 시술과정이 골수 채취와는 비교할 수 없을 정도로 고통이 없으며 안전하다. 또한 실제 시술시 국소마취를 하여 전신마취의 위험성을 줄일 수 있을뿐더러, 일주일 이내에 환자의 상처부위가 치유된다는 점 (Rei Ogaw., Current Stem cell research & therapy,1: 13-20 (2006))도 지방 줄기세포의 활용도 및 우수성을 극대화하는 요인으로 작용할 수 있다.

본 발명의 지방 줄기세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수득할 수 있다. 예를 들면, 지방 조직은 지방흡입술 (주사기 또는 동력-어시스트 (assisted) 지방흡인술)에 의해, 또는 지방절제술, 예를 들어 흡입-어시스트 지방성형술 (suction-assisted lipoplasty), 초음파-어시스트 지방성형술 및 적출 지방절제술 (excisional lipectomy) 또는 이들의 조합에 의해 환자로부터 제거되어 폐기된 지방으로부터 기질 줄기세포를 분리할 수 있으므로, 추가적인 침습적 시술이 필요없기 때문에 그 유용성이 높아지고, 줄기세포의 분리에 있어서도 안전하며 저렴할 수 있다.

본 발명에서는 줄기세포에 처리되는 TNF-알파의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 0.01-1000 ng/ml의 농도로 처리한 것이 바람직할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100ng/ml농도로 처리된 것일 수 있다. 상기 농도 이하에서 처리시 세포배양액 내 유효 단백질의 분비량이 적어 상처치유효과를 나타내지 못할 수 있으며, 상기 농도 이상에서 처리시 TNF-알파가 세포배양액 내에 잔존하여 상처치유에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 상기 농도가 적절할 수 있다.

본 발명에서는 TNF-알파로 줄기세포를 처리하는 기간에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 1일 내지 4일간 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 만일 1일 이하로 처리시 세포 배양액 내 단백질의 분비량이 적어 상처치유에 효과가 미미할 수 있으며, 4일 이상 처리시에는 줄기세포의 사멸을 유발할 수 있기에 상기 일수로 처리하는 것이 바람직할 수 있다.

활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 경우 세포로부터 분비되는 IL-6, IL-8, MCP-1 등 상처치유를 촉진하는 단백질의 농도가 부족하여 상처 치유 조성물로 사용하기에 적합하지 않은 데 반하여, 본 발명의 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액을 사용하면 상기 단백질을 포함한 상처치유 단백질의 농도가 농축되어 있어 빠른 시일내에 창상 치료효과를 나타낼 수 있다. 즉, 상기 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액 내에는 IL-6, IL-8, MCP-1 등 상처치유를 촉진하는 단백질의 농도가 증가되어 있기에, 상기 배양액을 창상 부위에 바를 경우 창상 재생 과정에 있어서 중요한 과정인 재상피화, 혈관신생, 염증세포의 침윤 등이 촉진되어 피부상처의 재생을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 창상은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직 등 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함을 포함할 수 있다.

본 발명의 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리된 줄기세포의 배양액은 창상 개선 또는 치료용 조성물, 바람직하게는 약학 조성물에 있어서 유효성분으로 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.

부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락 (shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의 (糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 일례로, 상기 조성물을 창상에 직접 적용될 수 있다. 즉, 창상부위에 산포될 수 있다. 시트의 형태인 경우는 창상 부위에 도포하는데 이때 도포한 부위에 적절히 드레싱하여 창상을 보호하면서 활성 성분의 치료 효과가 감소하는 것을 방지한다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필 (Compeel), 듀우덤 (Duoderm), 타가덤 (Tagaderm) 및 옵사이트 (Opsite)를 들 수 있다.

본 발명의 외용제에서, 약제학상 허용되는 담체로는 그의 제형에 따라 다르나, 바셀린, 유동 파라핀, 겔화 탄화수소 (별명: 플라스티베이스) 등의 탄화수소류; 중쇄지방산트리글리세라이드, 돈지, 하드 팻트, 카카오지 등의 동식물성 오일; 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아린산, 팔미틴산이소프로필 등의 고급지방산 알코올 및 지방산 및 그의 에스테르류; 마크로골 (폴리에틸렌글리콜), 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤, 젤라틴, 백당, 당알코올 등의 수용성 기제; 글리세린 지방산에스테르, 스테아린산폴리옥실, 폴리옥시에틸렌경화 피마자유 등의 유화제; 아크릴산에스테르, 알긴산나트륨 등의 점착제; 액화석유가스, 이산화탄소 등의 분사제; 파라옥시벤조산에스테르류 등의 방부제 등을 들 수 있으며, 본 발명의 외용제는 이들을 사용하여 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 이들 이외에도 안정제, 향료, 착색제, pH 조정제, 희석제, 계면활성제, 보존제, 항산화제 등을 필요에 따라 배합할 수도 있다. 본 발명의 외용제는 사용은 통상의 방법에 의해 국소창상부에 도포 될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 외용제는 통상적인 반창고의 창상 박리 커버 등과 같은 고체 지지체상에 에 점착되어 사용될 수 있다. 본 발명의 양태로서, 고체 지지체를 먼저 점착층으로 피복하여 고체 지지체에 배양액의 부착을 향상시킨다. 점착제의 예로는 폴리아크릴레이트 및 시아노아크릴레이트가 포함될 수 있다.

이러한 형태의 제형은 시판되고 있는 것이 많으며 예로는 천공된 플라스틱 필름 형태의 비부착성 상처 박리 커버를 갖는 반창고 (Smith & Nephew Ltd.), Johnson & Johnson의 얇은 스트립 (strip), 패취 (patch), 스포트 (spot), 가소성 스트립 형태의 밴드-에이드 (BAND-AID*); Colgate-Palmolive Co. (Kendall)의 큐리티 큐러드 (Curity CURAD, 오우취리스(Ouchless)) 반창고; 및 American WhiteCross Laboratories, Inc.의 스틱-타이트 * (STIK-TITE*) 탄성 스트립 등을 들 수 있다.

본 발명의 일례로, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 배양액 분말과 생리식염수를 일정한 부피비로 혼합하고 액상 도포제의 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 일례로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 상기한 본 발명의 배양액 분말과 수용성 연고기제를 혼합하고 여기에 생리식염수를 첨가하여 연고제의 형태로 제형화 할 수 있다.

본 발명의 약학적 유효량은 환자의 창상 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량은 세포 배양액을 창상에 적용시 1 내지 50 ㎕/cm²일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20㎕/cm² 일 수 있다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 (數日) 간격으로 간헐 (間歇)투여해도 된다.

그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 사용량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도, 창상 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 유효량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

상기 줄기세포의 유래 생물종은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류에서 유래된 것일 수 있다.

또한, 상기 줄기세포는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일례로, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액 또는 제대혈에서 추출된 것일 수 있다. 이들 중 지방에서 추출한 지방 유래 줄기세포는 다분화능과 증식력이 뛰어나며, 시술과정이 안전하고, 소량의 지방조직에서 충분한 양의 줄기세포를 얻을 수 있어 경제적이다.

본 발명의 일례로, 상기 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법으로는, 피하지방제거술을 시행한 환자에서 폐기된 지방조직을 HBSS (Hank's balanced salt solution)로 처리한 후 콜라겐나아제 (collagenase), 바람직하게는 0.075% 콜라겐나아제로 37^oC에서 1시간 내지 2시간, 바람직하게는 30분간 처리할 수 있다. 원심분리 후 필렛 (pellet)에 세포배양액 (1 내지 20% fetal bovine serum, 50 내지 200U/ml penicillin, 50 내지 200 μg/ml streptomycin가 첨가된 alpha-minimum essential medium)을 넣어줘서 리서스펜션 (resuspension)시킨 후 nylon mesh 에 통과시켜 콜라겐나아제에 의해 지방조직으로부터 분리된 세포를 얻을 수 있다. 나일론 메쉬 (Nylon mesh)를 통과한 세포는 배양접시 (culture dish)에 플레이팅 (plating)해서 18 내지 36시간 후 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착된 세포를 세포배양액을 교환해주면서 배양할 수 있다.

본 발명의 일례로, 상기 줄기세포를 분리하고 배양하는 방법으로는, 환자로부터 얻은 골수를 피콜-하이파크 비중원심법 (Ficoll-Hypaque gradient) (density = 1.077 g/cm³, Sigma, USA)를 이용한 원심분리법을 이용해 분리한 후 배양접시 (culture dish)에 플레이팅 (plating)한 후 세포배양액을 교환해주면서 배양접시에 부착된 세포를 증식 배양할 수 있다.

또한, 본 발명의 줄기세포에 처리되는 TNF-알파의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 0.01-1000 ng/ml의 농도로 처리한 것이 바람직할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 100 ng/ml농도로 처리된 것일 수 있다. 상기 농도 이하에서 처리시 세포배양액 내 유효 단백질의 분비량이 적어 상처치유효과를 나타내지 못할 수 있으며, 상기 농도 이상에서 처리시 TNF-알파가 세포배양액 내에 잔존하여 상처치유에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 상기 농도가 적절할 수 있다.

또한, 상기 TNF-알파로 줄기세포를 처리하는 기간에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 1일 내지 4일간 처리하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명은 상기 줄기세포에 TNF-알파로 처리하는 과정 전에 줄기세포에서 혈청성분을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 줄기세포에서 혈청성분 (serum component)을 제거는 당업계에서 통상적으로 수행하는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 일례로 HBSS (Hank's balanced salt solution)로 세척함으로 혈청성분을 제거할 수 있다.

본 발명의 줄기세포에 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리하는 단계를 포함하는 창상 개선 또는 치료용 배양액의 제조방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 일례로, (1) 줄기세포를 배양하는 단계; (2) 상기 줄기세포에서 혈청성분 (serum component)을 제거하는 단계; (3) 상기 혈청성분이 제거된 줄기세포를 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리하는 단계; 및 (4)상기 배양액 중 세포부스러기를 제거하는 단계 순으로 제조될 수 있다.

상기 배양액에는 IL-6, IL-8, MCP-1 등 상처치유를 촉진하는 단백질이 농축되어 있는데, 종래에는 비싼 생산 비용으로 제조가능했던 IL-6, IL-8, MCP-1 등 상처치유를 촉진하는 단백질의 농축액을 본 발명의 제조방법에 의해 저렴한 비용으로 대량생산할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의해 제조된 배양액을 창상 부위에 바를 경우 창상 재생 과정에 있어서 중요한 과정인 재상피화, 혈관신생, 염증세포의 침윤 등이 촉진되어 피부상처의 재생을 촉진하는 효과가 우수하기에, 화상조직, 수술 후의 감염, 수술창상 파괴, 내부궤양, 출혈, 골괴저, 욕창, 와창, 타협된 절단부위, 비-치유 외상성 창상, 화장, 면도후, 치과작업, (당뇨병, 정맥류성 정맥, 졸중후의) 만성궤양, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상, 혈관질환 창상, 당뇨성 피부미란, 당뇨성 발, 신체적 외상, 성형수술후 봉합부위, 햇빛화상 (sunburn) 또는 외음절개술 등을 포함한 (이들로 제한되는 것은 아니다) 다양한 상태에 대하여 동물 및 인간에게서 창상 개선 또는 치료에 유용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 실시예 >

실시예 1: 중간엽 줄기세포의 분리

본 발명의 조성물에 포함된 중간엽 줄기세포는 인체 지방 또는 골수로부터 추출한다. 부산대학병원에서 지방제거수술을 시행한 환자에서 얻은 지방으로부터 기질 줄기세포를 분리하였다. 지방조직으로부터 기질줄기세포를 분리하기 위하여 성형외과에서 피하지방제거술을 시행한 환자에서 지방조직을 얻는다. 분리한 지방조직을 HBSS로 씻어준 후 핀셋과 가위를 이용하여 지방조직을 얇게 자른 다음 0.075% collagenase를 37^oC에서 30분간 처리한다. 원심분리 후 pellet에 세포배양액 (10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin가 첨가된 alpha-minimum essential medium)을 넣어줘서 resuspension 시킨 후 100㎛ nylon mesh 에 통과시켜 collagenase에 의해 지방조직으로부터 분리된 세포를 얻는다. Nylon mesh를 통과한 세포는 culture dish에 plating해서 24시간 후 부착되지 않은 세포를 제거해준다. Culture dish에 부착된 세포를 세포배양액을 교환해주면서 배양한다. 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해서는 환자로부터 얻은 골수를 Ficoll-Hypaque gradient (density = 1.077 g/cm³, Sigma, USA)를 이용한 원심분리법을 이용해 분리한 후 culture dish에 plating한 후 세포배양액을 교환해주면서 culture dish에 부착된 세포를 증식 배양한다.

실시예 2: TNF - alpha 를 중간엽 줄기세포에 처리한 후 세포 배양액의 분리

중간엽 줄기세포를 서로 다른 2개의 15cm culture dish에서 sub-confluence에 도달할 정도로 증식 배양한 후, Hank's balanced salt solution으로 2회 세척하여 serum component를 제거한다. 각각의 중간엽 줄기세포를 carrier-free recombinant human TNF-alpha (10ng/ml)가 포함된 20ml의 alpha minimum essential medium과 포함되지 않은 alpha minimum essential medium으로 배양한다. 48시간 후 각각의 배양액을 회수하여 3000rpm에 10분 동안 원심 분리하여 세포 부스러기를 제거한다.

실시예 3: TNF - alpha 에 의해 유도되어진 중간엽 줄기세포의 배양액이 동물 상처 모델에서 상처재생을 촉진.

6주령의 Sprague Dawley Rat를 3군으로 나누어 2% 농도의 Enflurane으로 호흡마취 시킨 후 등허리 부위 털을 전기 클리퍼를 사용하여 제거한다. 노출된 부위를 70%의 에탄올로 소독하고, 8㎜ 바이옵시 펀치 (biopsy punch)로 창상을 유도한 후, 근육층이 손상되지 않도록 가위로 창상면을 둥글게 오려낸다. 3군의 동물에 각각 Hank's balanced salt solution, TNF-alpha를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 배양액, TNF-alpha를 처리하여 얻은 중간엽 줄기세포 배양액을 10ul씩 유도된 창상에 처리하여 준다. 3일, 6일, 9일, 12일째에 창상 부위를 육안으로 관찰하고 (도 1a), 창상의 면적을 측정하였다 (도 1b). CO₂ 가스를 이용하여 희생시킨 후 창상 주위의 조직을 채취한다. 일반적인 조직 처리과정을 거쳐 4um 두께의 절편을 만든 후에 Hematoxylin&Eosin (H&E) 염색과 면역조직화학 염색을 통해 분석하였다. 재상피화 (re-epithelialization) 정도를 확인하기 위해 H&E 염색 결과를 현미경으로 촬영하여 상피층 양 끝단 사이의 간격을 측정하였다 (도 1c).

하기 도 1에 나타난 바와 같이, TNF-alpha로 유도된 배양액을 처리한 군에서 재상피화가 가장 활발히 일어난 것을 알 수 있다. 본 결과는 TNF-alpha로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액이 피부 창상의 재상피화를 촉진하는 효과가 있음을 제시한다.

실시예 4: TNF - alpha 에 의해 유도되어진 중간엽 줄기세포의 배양액이 in vivo 동물 상처 모델에서 신생 혈관 형성을 촉진

상처 재생에 있어서 중요한 과정중 하나인 신생혈관 형성 정도를 확인하기 위해 H&E 염색 (도 2a)과 면역형광염색법 (도 2b)을 통하여 조건 간의 차이를 비교하였다. 면역형광염색법을 시행하기 위하여 파라핀 포매 조직이 부착된 슬라이드의 파라핀을 제거한 후 혈관 표지 항체인 von Willebrand Factor polyclonal antibody와 반응시키고, 이를 관측할 수 있는 2차 항체 (Alexa488-labeled anti-rabbit)을 결합 시켜 confocal microscope를 이용하여 확인한다.

하기 도 2에서 나타난 바와 같이, H&E 결과 TNF-alpha로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액을 처리한 조건에서 가장 많은 신생혈관이 관찰되었다 (도 2a). 또한, TNF-alpha로 유도된 배양액을 처리한 조건에서 혈관 형성이 가장 활발히 일어났음을 알 수 있다(도 2c). 본 결과는 TNF-alpha로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액이 상처조직이나 염증조직 재생의 중요한 과정중 하나인 신생혈관 형성을 촉진시킴을 제시한다.

실시예 5: TNF - alpha 에 의해 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액이 in vivo 동물 상처 모델에서 면역세포의 침윤을 촉진

상처 재생에 있어서 또 다른 중요한 과정중 하나인 면역세포의 침윤 정도를 확인하기 위해 면역조직화학 염색을 통해 분석하였다. 파라핀 포매 조직이 부착된 슬라이드의 파라핀을 제거한 후, 3% 과산화수소를 이용하여 내인성 과산화효소 (endogenous peroxidase)를 제거한다. 면역세포 표지 항체인 CD68 monoclonal antibody와 반응시킨 후, 가시화 시약 (secondary antibody HRP-polymer conjugate)과 결합시킨다. 색소원 (chromogen)으로 diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)을 처리한 후, Mayer’s hematoxylin으로 대비 염색한 후 현미경으로 확인한다 (도 3a).

하기 도 3에서 나타난 바와 같이, TNF-alpha로 유도된 배양액을 처리한 조건에서 면역 세포의 침윤이 가장 활발히 일어난 것을 확인할 수 있었다 (도 3b). 본 결과는 TNF-alpha로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액이 상처조직이나 염증조직 재생의 중요한 과정중 하나인 면역세포의 침윤을 증가시킴을 제시한다.

실시예 6: TNF - alpha 로 유도된 중간엽 줄기세포의 배양액에서 interleukin -6 (IL-6), interleukin -8 ( IL -8), monocyte chemotactic protein -1 ( MCP -1)의 증가

중간엽 줄기세포에 TNF-alpha를 48시간 동안 처리한 후 상층액을 회수한다. 희석된 상층액을 각 분비단백질에 대한 capture 용 항체가 고정된 정량용 plate (96-well)에 넣은 후, 상온에서 4시간 반응시킨다. Tween-20이 첨가된 PBS 용액 (PBST)으로 3회 세척한 다음, 각 분비 단백질에 대한 detection용 항체를 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. PBST로 3회 세척하고 HRP가 결합된 효소 시약을 첨가하고 2시간 동안 상온에서 반응시킨다. PBST로 5회 세척하고 발색제를 첨가하여 20분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정한다.

하기 도 4에서 나타난 바와 같이, TNF-alpha로 유도된 배양액에서는 그렇지 않은 배양액에 비해 중요 inflammatory cytokine인 IL-6, IL-8, MCP-1이 현저히 증가해 있음을 알 수 있다. 본 결과는 TNF-alpha에 의해서 상처 재생과 관련한 중요 생리 활성 인자인 inflammatory cytokine이 중간엽 줄기세포로부터 많이 유도됨을 제시한다.

실시예 7: TNF - alpha 로 유도된 중간엽 줄기세포 배양액 내 IL -6와 IL -8이 상처치료 촉진 유효물질로서 역할함을 제시

중간엽 줄기세포에 TNF-alpha를 48시간 동안 처리한 후 얻어진 배양액에 10ug/ml 농도로 anti-IL-6, IL-8 중화 항체를 첨가하고, 4℃에서 1 시간 동안 rotator에서 회전시켜 섞어준다. 항체와 반응시킨 배양액을 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 protein G agarose와 4℃에서 1시간동안 rotator에서 회전시켜 섞어준다. 다시 원심 분리하여 protein G agarose를 침전시켜 상층액을 회수하여 IL-6와 IL-8이 각각 중화된 배양액을 얻는다. 앞서 확립된 동물 상처 모델에 TNF-alpha를 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 배양액, TNF-alpha를 처리하여 얻은 중간엽 줄기세포 배양액, IL-6와 IL-8이 각각 중화된 배양액을 10ul씩 유도된 창상에 처리하여 준다. 6일째에 창상 부위를 육안으로 관찰하고, 창상 주위의 조직을 채취하여 Hematoxylin&Eosin (H&E) 염색과 면역형광 염색, 면역조직화학 염색을 통해 조건 간의 차이를 비교하였다.

하기 도 5에서 나타난 바와 같이, H&E 염색결과 TNF-alpha CM을 처리한 창상조직은 control CM에 비해 적혈구를 함유한 혈관의 개수가 증가되어 있으며 IL-6 또는 IL-8를 제거한 TNF-alpha CM은 제거하지 않은 TNF-alpha CM에 비해 혈관신생효과가 저하되었으며 (도 5a 위쪽 사진), 혈관내피세포의 표지마커인 vWF에 대한 항체를 이용해 면역염색을 한 결과 vWF를 발현하는 혈관의 개수가 IL-6 또는 IL-8을 제거한 경우 TNF-alpha CM의 혈관신생효과가 저해되었다 (도 5a 아래사진, 도 5b). 본 결과는 TNF-alpha CM에 의한 혈관신생효과는 IL-6, IL-8에 의해 매개됨을 제시한다.

또한, TNF-alpha CM에 의한 면역세포의 침윤과정에 IL-6, IL-8의 역할을 규명하기 위해 IL-6 또는 IL-8을 제거한 TNF-alpha CM의 면역세포침윤 효과를 CD68 항체를 이용한 면역염색을 통해 조사한 결과, IL-6, IL-8를 제거한 TNF-alpha CM은 제거하지 않은 TNF-alpha CM에 비해 창상조직 내 면역세포침윤이 저해되었다 (도 5c, 5d). 본 결과는 TNF-alpha로 유도된 중간엽 줄기세포 배양액 내 IL-6와 IL-8이 창상조직 내 혈관신생촉진, 면역세포의 침윤촉진등을 통해 상처치료 촉진 유효물질로서 작용함을 제시한다.

Claims

2 내지 1000 ng/ml 농도의 TNF-알파(TNF-alpha)로 처리된 중간엽 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 창상 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 척추동물 유래인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수, 말초혈액 또는 제대혈에서 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 TNF-알파의 처리 기간은 1일 내지 4일인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 배양액 내에는 IL-6 (interleukin-6), IL-8 (interleukin-8) 및 MCP-1(monocyte chemotactic protein-1)으로 구성된 군 중에서 선택된 것이 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 배양액을 0.1-100 중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물을 외용제 형태로 제형화하는 것을 특징으로 하는 조성물.
중간엽 줄기세포 배양액으로부터 창상 개선 또는 치료용 배양액을 얻는 방법에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포를 2 내지 1000 ng/ml 농도의 TNF-알파 (TNF-alpha)로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 창상 개선 또는 치료용 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포를 TNF-알파로 처리하는 과정 전에 중간엽 줄기세포에서 혈청성분을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제