KR20150054747A

KR20150054747A - 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20150054747A
Application number: KR1020150062541A
Authority: KR
Inventors: 박병순; 김형기
Original assignee: (주)프로스테믹스
Priority date: 2015-05-04
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2015-05-20
Also published as: KR101592864B1

Abstract

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물, 특히 성체 줄기세포 배양물의 특정 분획물은 피부 조직 세포의 분열과 증식을 촉진시킴으로써, 우수한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써, 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 제제학적 문제점이나 개체편차를 최소화할 수 있다.

Description

상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물{Composition for wound-healing or promoting wound-healing}

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.

상처는 창상(創傷)이라고 칭해지기도 하며, 그 원인에 따라 절창(切創), 자창(刺創), 할창(割創), 좌창(挫創), 열창(裂創), 사창(射創), 교창(咬創) 등으로 나뉘고, 형상에 따라 선상창(線狀創), 판상창(瓣狀創), 결손창 등으로 나뉜다. 상처에 따른 증세로는 통증, 출혈, 기능장애 등이 있으며, 상처를 입는 경우, 생체는 이를 치유하기 위하여 다양한 생리적 반응을 나타낸다. 통상, 상해를 받은 세포의 변성(變性), 사멸 과정을 거처 주위의 조직으로부터의 유주세포(遊走細胞), 조직액의 유출되고, 섬유소의 석출과 육아조직(肉芽組織)이 형성되어 상처를 치유하게 된다.

상처는 주변 세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴우런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬, 및 세포 외 기질로 이루어지는 특이한 미세환경(microenvironment)을 창출한다. 상처 미세환경의 일부 인자는 충분히 오랜 기간 지속하여 말초혈액으로 확산된 후, 골수의 줄기세포에 영향을 미쳐 골수 세포의 말초혈액으로의 이동, 상처 부위로의 공급, 및 상처 치유에의 참여를 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근에는, 폐, 위장관계 및 경색된 심근의 조직 수복에 관여하는 것으로 알려진 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells, MSC)가 상처가 없는 정상적 생리 상태에서는 지방 조직과 익상편(pterygium)과 같은 골수 이외의 조직에서 검출되지만, 말초혈액에서는 거의 검출되지 않는 문제점을 해결하기 위하여, P 물질(Substance P)을 처리하여 MSC 이동 및 MSC 재증식(repopulation)을 유도함으로써, 상처를 치료하거나 상처 치료를 촉진하는 것이 개시된 바 있다 (대한민국 특허등록 제10-0593397호).

한편, 최근 발표된 연구 결과들에 따르면, 줄기세포가 피부 조직의 재생을 촉진하며, 이는 줄기세포에서 분비되는 복합단백질(protein complex)에 의한 작용 (paracrine effect)이라 보고되고 있다(Pankaj K.M. J. Cardiovascular Medicine, 2008). 상기 복합 단백질의 대부분은 성장인자들로 알려져 있으며, 최근 이들 성장인자들에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 이러한 성장인자들은 나이가 증가함에 따라 그 체내 농도가 감소하게 되며, 체내 성장인자 농도의 감소는 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Waisbourd M. et al., Drungs Aging, 2007). 현재 성장인자를 외부에서 공급하여 생체의 노화를 억제하려는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 아울러 개별 성장인자들의 구체적인 효과에 대한 연구도 진행되고 있다. 근래의 연구 보고들에 의하면 피부 주변 줄기세포에서 분비되는 성장인자들이 미백, 항산화 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다(Kim et al., Biol. Pharm . bull. 2008, 31(4):606-610; Kim et al., J Dermatol Sci ., 2008, 49(2):133-142). 또한, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)가 면역억제 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 이는 MSC가 마이토젠(mitogen)이나 동종 세포로 자극된 T-세포의 증식을 억제함으로써 면역반응을 억제시키는 것으로 보고되고 있다(Djouad F. et al., Blood 2003). 일반적으로 EGF(Epidermal Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), TGF-α(Transforming Growth Factor-α), TGF-β, IGF-I (Insulin-like Growth Factor-1) 등의 성장인자들이 상처를 치료하거나 상처치료를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

그러나, EGF 등의 특정 성장인자를 분리하여 임상에 적용할지라도 아직까지 만족할만한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, MSC 등의 줄기세포를 직접 사용할 경우에는 세포의 생존율을 높게 유지하면서 제제화하는 것이 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.

본 발명자들은 상기한 선행기술들의 문제점을 개선하면서, 안정적으로 상처를 치료 또는 상처치료를 촉진할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과 놀랍게도, 성체 줄기세포의 배양물, 특히 그의 특정 분획물이 매우 높은 상처 치료 및 세포증식 활성을 가진다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 성체 줄기세포의 배양물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있으며, 상기 성체 줄기세포의 배양물의 분획물이 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

상기 성체 줄기세포의 배양액은 성체 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지 중에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 상기 혈청 배지는 1∼2 mM의 글루타민, 0.5∼1 mM의 소디움 피루베이트, 0.1∼10 %의 FBS, 1 %의 항생제(100 IU/ml), 및 1∼4.5 g/L의 글루코오스로 보충된 DMEM 일 수 있고, 상기 무혈청 배지는 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지일 수 있다.

성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물, 특히 성체 줄기세포 배양물의 특정 분획물은 피부 조직 세포의 분열과 증식을 촉진시킴으로써, 우수한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써, 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 제제학적 문제점이나 개체편차를 최소화할 수 있다.

도 1은 레이저를 이용하여 상처를 형성시킨 마우스의 사진으로서, A 및 B 는 외피부위까지 상처를 형성시킨 마우스이고, C 및 D는 진피부위까지 상처를 형성시킨 마우스이다.
도 2는 상처를 형성시킨 마우스에 인산화 완충 식염수(왼쪽) 및 본 발명에 따라 얻어진 분획물(오른쪽)을 투여한 후 6일 후 측정한 결과를 나타낸다. A 및 B는 각각 외피부위까지 상처를 형성시킨 마우스에 10-30 kDa 분획 및 30 kDa 초과 농축 분획을 처리한 후 측정한 결과이고, C 및 D는 각각 진피부위까지 상처를 형성시킨 마우스에 10-30 kDa 분획 및 30 kDa 초과 농축 분획을 처리한 후 측정한 결과이다.
도 3은 폭 길이 2㎝의 스크레퍼로 배양 접시의 바닥을 긁어 세포를 제거한 후, 대조군 및 처리군(본 발명에 따라 얻어진 분획물(10∼30 kDa)을 처리)에서 0, 18 시간, 및 24 시간 경과 후 섬유아세포의 증식을 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.

상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다.

성체 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있다. 즉, 골수, 혈액, 제대혈, 지방 등으로부터 유래된 줄기세포는 각각의 줄기세포에 적합한 통상의 줄기세포 배양용 배지 및 배양조건을 사용하여 배양될 수 있다. 바람직하게는 성체 줄기세포(예를 들어, 지방 유래 줄기세포)를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지 중에서 계대 배양함으로써, 얻어지는 배양물 혹은 분획물 중의 단백질 함량을 높일 수 있다.

상기 혈청 배지는 지방 유래 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로서, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 7 ∼ 10 중량%의 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 첨가된 동결건조된 DMEM에 혈청을 함유시켜 얻어진 배지일 수 있다. 상기 혈청으로는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용할 수 있으며, 그 함량은 혈청 배지 총 중량에 대하여 약 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마 억제제를 포함할 수 있다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있으며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신(tylosin), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

바람직하게는, 상기 혈청 배지는 1∼2 mM의 글루타민, 0.5∼1 mM의 소디움 피루베이트, 0.1∼10 %의 FBS, 1 %의 항생제(100 IU/ml), 및 1∼4.5 g/L의 글루코오스로 보충된 DMEM 일 수 있다. 혈청 배지 중에서의 배양은 90∼95 %의 습도 및 35∼39 ℃의 조건으로 5∼10 % CO₂ 배양기에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라, 최종농도가 0.17∼0.22 중량%가 되도록 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가할 수 있으며, 트립신-EDTA를 처리함으로써 성장을 촉진시킬 수 있다. 누적집단 배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85% 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80% 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 수행할 수 있다.

무혈청 배지 중에서 계대 배양은 상기 혈청 배지에서의 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 세척하고 트립신-EDTA로 처리한 후, 세포부유액을 원심분리하여 획득한 펠렛을 인산화 완충 용액으로 2∼3회 세척한 후, 수행할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 산화영양원, 에너지 대사물질, 탄소조절원이 보충된 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 DMEM과 Ham's F-12 영양소 혼합액(SIGMA, Cancer Research Vol 47, Issue 1 275-280)을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지에 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가하여 사용할 수 있다. 상기와 같이, DMEM과 Ham's F-12 영양소 혼합액을 조합하여 사용하는 경우, 줄기세포의 성장과 항상성을 효과적으로 유지시킬 수 있으며, 얻어지는 배양물 또는 분획물 중의 활성 단백질 함량을 더욱 높일 수 있다. 특히, 혈청 배지에 포함된 동물혈청으로부터 야기되는 다양한 변수들을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라, 약 50% 정도의 낮은 비용으로 배양을 효과적으로 수행할 수 있다.

상기 Ham's F-12 영양소 혼합액의 각 구성성분들의 성분 및 함량은 다음 표 1과 같다.

Ham's F-12 함유 영양소

성분	농도 (mg/L)	몰 (mM)	성분	농도 (mg/L)	몰 (mM)
아미노산			비타민
D-판토텐산	2.24	0.00895	바이오틴	0.0035	0.0000143
글라이신	18.75	0.25	콜린 클로라이드	8.98	0.0641
L-알라닌	4.45	0.05	D-칼슘 판토테네이트	2.24	0.0047
L-아르기닌 HCl	147.5	0.699	엽산(Folic Acid)	2.65	0.00601
L-아스파라긴-H₂O	7.5	0.05	i-이노시톨	12.6	0.07
L-아스파르트산	6.65	0.05	니아신아미드 (Niacinamide)	2.02	0.0166
L-시스테인 HCl-H₂O	17.56	0.0998	피리독신 염산염	2.031	0.00986
L-시스틴 2HCl	31.29	0.1	리보플라빈	0.219	0.000582
L-글루탐산	7.35	0.05	티아민 염산염	2.17	0.00644
L-글루타민	365	2.5	비타민 B12	0.68	0.000502
L-히스티딘 HCl-H₂O	31.48	0.15	무기 염류
L-이소류신	54.47	0.416	CaCl₂ (무수물)	116.6	1.05
L-류신	59.05	0.451	CuSO₄-5H₂O	0.0013	0.0000052
L-라이신 HCl	91.25	0.499	Fe(NO₃)₃ 9H₂O	0.05	0.000124
L-메티오닌	17.24	0.116	FeSO₄ 7H₂O)	0.417	0.0015
L-페닐알라닌	35.48	0.215	마그네슘 클로라이드(무수물)	28.64	0.301
L-프롤린	17.25	0.15	MgSO₄ (무수물)	48.84	0.407
L-세린	26.25	0.25	KCl	311.8	4.16
L-트레오닌	53.45	0.449	NaCl	6995.5	120.61
L-트립토판	9.02	0.0442	Na₂HPO₄	71.02	0.5
L-타이오린 디소듐 디히드레이트	55.79	0.214	NaH₂PO₄ (무수물)	54.3	0.45257
L-발린	52.85	0.452	ZnSO₄ 7H₂O)	0.432	0.0015

본 발명의 약학 조성물은 상기한 바와 같이 성체 줄기세포의 배양액으로부터 얻어진 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함한다. 상기 성체 줄기세포의 배양물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 성체 줄기세포의 배양물의 분획물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

상기 원심분리는 줄기세포, 거대 분자, 배지 성분들을 침강시켜 제거할 수 있는 조건, 예를 들어, 300 ∼ 600 g로 5 ∼ 10 분 동안, 바람직하게는 약 300 g로 약 5 분 동안 수행될 수 있다. 필요에 따라, 약 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포와 미지의 거대분자들을 제거할 수도 있다. 또한, 상기 농축물은 상기 배양액 또는 분획을 감압농축 등의 통상의 방법으로 원하는 단백질 농도가 얻어질 때까지 농축함으로써 얻을 수 있다. 또한 상기 분획은 특정 포어 사이즈를 갖는 통상의 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킨 후, 막을 통과한 분획물을 다시 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 외용액제, 에멀젼, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물은 1일 10 내지 1000 ng/kg으로, 바람직하게는 50 내지 500 ng/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 100 ng/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 상처 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지방 줄기세포의 수득

피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 지방조직의 세포외기질을 약 37 ℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 45분간 0.075% 콜라게나아제로 처리한 다음, 얻어진 지방조직을 약 1200g에서 5분간 원심 분리하여 고밀도의 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 얻어진 분획을 PBS로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 다른 조직을 제거한 후 Histopaque-1077(Sigma Co.)로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵 세포를 분리하였다.

분리된 단핵세포를 10% 소 태아 혈청((fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하여 약 37 ℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리하였다.

실시예 2. 줄기세포의 배양

실시예 1에서 얻어진 지방 줄기세포 1.25 × 10⁵ cells를 1000 mg/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트 10 % FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90 %의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO₂ 배양기에서 30일 동안 계대 배양하였다.

파이펫을 사용하여 계대 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 3 회 세척한 후, 365 mg/L의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:1 (중량비) 혼합 배지 중에서 1.2 × 10⁶ cell/dish의 농도로 접종하여 저산소(Hypoxia) 조건으로 72 시간 동안 배양하였다.

실시예 3. 줄기세포의 배양물 농축액 및 분획의 제조

실시예 2에서 최종적으로 얻어진 배양액 500 ml을 300 g로 5 분간 원심분리하여 펠렛으로 가라앉는 줄기세포를 제거하였다. 얻어진 상층액을 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자를 제거하였다. 얻어진 액을 반으로 나누어 감압 농축하여 5 ml의 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액은 동결건조하여 -70 ℃에서 보관하였다.

잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자가 제거된 나머지 액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜고, 멤브레인을 통과하지 못한 여과물에 인산 완충 식염수로 3회 세척하여 30 kDa 이상의 거대 분자 분획과 30 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 30 kDa 이하의 용액과 세척한 인산 완충 식염수를 포함한 용액을 다시 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과 시켜 10 kDa에서 30 kDa의 농축된 분획과 10 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 10 kDa에서 30 kDa의 농축된 분획을 -70℃에서 보관하였다.

시험예 1. 상처에 대한 치료 활성 평가

마우스(n=3) 등의 왼쪽과 오른쪽에 각각 레이저의 강도를 조절하여 표피에 직경 1㎝로 각각 외피층(epidermis)과 진피층(dermis)까지의 깊이로 상처를 형성시켰다. 왼쪽에는 콜라겐, reconstitution buffer(22g/L NaHCO₃, 47.7g/L HEPES, 0.05N NaOH), 10X P-media(DMEM:Ham's F-12=3:1)를 각각 8:1:1의 비율로 혼합한 콜라겐 mix 1㎖당 인산화 완충 식염수 0.4 ㎖을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 굳혀 콜라겐 젤을 만들어 상처에 도포하고 Tegaderm^TM(3M Co.)을 붙였으며, 오른쪽에는 인산화 완충 식염수 대신 실시예 3에서 얻어진 10∼30 kDa 농축 분획을 콜라겐 mix 1㎖당 0.4㎖을 첨가하여 상기와 동일한 방법으로 처리하였다. 또한, 비교를 위하여, 실시예 3에서 얻어진 30 kDa을 초과하는 거대 분자 분획의 농출물을 상기와 동일한 방법으로 처리하였다.

마우스에 상처를 만든 직후에 표피가 손상된 결과는 도 1과 같으며, 상기 상처에 인산화 완충 식염수 또는 지방 유래 줄기세포 분획물(10∼30 kDa 분획 또는 30 kDa 초과 농축 분획)을 처리한 후 6일 후 측정한 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 왼쪽은 인산화 완충 식염수를 투여한 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸다.

상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 6일 후 육안으로도 상처의 직경 크기가 뚜렷하게 작아진 것을 확인할 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 줄기세포의 분획물이 우수한 상처 치료 활성 및 상처치료 촉진 활성을 가짐을 나타낸다.

시험예 2. 세포 증식에 대한 활성 평가

인간 유래 섬유아세포(human diploid fibroblast (HDF), C-004-5C, KDR Co.) 1.2 × 10⁶ cell/dish 를 1000㎎/L의 D 글루코스, 584㎎/L의 L-글루타민, 110㎎/L의 소디움 피루베이트 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 접종하고, 약 90%의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 배양 접시(culture dish)에 90∼100% 정도가 차도록 배양하였다. 2㎝의 스크레퍼로 상기 배양 접시의 바닥을 긁어 약 2㎝의 폭 간격의 섬유아세포를 제거한 다음, 배양액에 아무 처리를 하지 않은 군(대조군)과 실시예 3에서 얻어진 10∼30 kDa 분획물 총 단백질양으로서 0.24 mg/ml 의 농도로 배양액에 처리한 군(처리군)으로 나누어, 24 시간 동안 상기 배양 조건에서 배양하였다. 0, 18 시간, 및 24 시간 경과 후, 배양판에 섬유아세포를 긁어 제거한 간격이 좁아지는 것을 육안으로 측정한 결과는 도 3과 같다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 분획물을 배양액에 처리한 군에서 섬유아세포가 제거된 간격이 유의성 있게(대조군에 비해 약 2.65배) 감소하였으며, 이는 상기 분획물이 세포 증식을 촉진시키는 활성을 가짐을 나타낸다.

Claims

지방 유래 줄기세포를 1000 mg/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트 10 % FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 가하여 계대 배양하는 단계;
계대 배양된 배양물로부터 배양액을 제거하여 얻어진 배양 세포를 인산화 완충 용액으로 세척한 후, 365 mg/L의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:1 중량비의 혼합 배지에 접종하여 저산소(Hypoxia) 조건으로 배양하는 단계;
얻어진 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 얻어진 액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜 0 초과 30 kDa 이하의 분획을 분리하는 단계; 및
상기 0 초과 30 kDa 이하의 분획을 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜 10 kDa 내지 30 kDa의 분획을 얻는 단계를 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 지방 유래 줄기세포는, 지방조직의 세포외 기질을 콜라게나아제로 처리한 후 얻어진 지방조직을 원심 분리하여 스트로마성 혈관 분획을 수득하는 단계;
얻어진 스트로마성 혈관 분획을 인산화 완충 용액으로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통과시켜 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵 세포를 분리하는 단계; 및
분리된 단핵 세포를 10% 소 태아 혈청((fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하여 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리하는 단계로부터 얻어진 것인, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 10 kDa 내지 30 kDa의 분획을 농축하는 단계를 더 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 10 kDa 내지 30 kDa의 분획을 -70℃에서 동결 건조하는 단계를 더 포함하는, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물의 제조방법.