KR100925341B1

KR100925341B1 - 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100925341B1
Application number: KR1020080036725A
Authority: KR
Inventors: 박병순; 김원석; 성종혁
Original assignee: (주)프로스테믹스
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2008-04-21
Publication date: 2009-11-09
Also published as: KR20090111121A

Abstract

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물은 피부 보호막 소실과 이로 인한 2차 감염을 억제하고 피부 보호막을 유지시킴으로써, 아토피성 피부염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써, 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 거부 반응을 최소화할 수 있다.

성체 줄기세포, 아토피성 피부염

Description

아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating atopic dermatitis}

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염은 재발되기 쉬운 만성 피부질환으로서, 유전적 소인, 환경적 원인, 면역학적 원인, 피부장벽 기능 이상 등의 내, 외부의 여러 요인이 복합적으로 관여하여 발생하는 질환으로 생각되고 있으며, 2차적으로 나타나는 증상으로 세균의 침입, 정신적 스트레스 등이 나타난다. 주요 원인으로 환경공해로 인한 알레르기 물질 증가 등이 아토피 피부염과 밀접한 관련이 있는 것으로 추정된다고 보고되고 있으나, 아직 구체적인 원인은 밝혀져 있지 않다. 현재 아토피성 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 그리고 세균감염을 예방하기 위해 항생제 연고 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 지속적으로 적용하기가 곤란하다.

또한, 약물 요법 이외에 아토피성 피부염의 개선이나 증상완화의 목적으로 상대적으로 부작용이 적은 화장료가 연구되고 있다. 상기 화장료에는 주로 보습제 성분이 함유되어 있으며, 예를 들어 세포막을 구성하는 인지질 성분인 세라마이드를 함유한다. 보습제 이외에 천연 식물 추출물이나 심층수로부터 분리한 천연 미네랄 등을 함유하는 기능성 화장료가 시판 중에 있다. 그러나 보습제, 천연 추출물, 혹은 미네랄 등을 함유하는 화장료에 있어서도, 아직 구체적인 임상적 활성이 명확하게 검증되어 있지는 않다.

한편, 최근 발표된 연구 결과들에 따르면, 줄기세포가 피부 조직의 재생을 촉진하며, 이는 줄기세포에서 분비되는 복합단백질(protein complex)에 의한 작용 (paracrine effect)이라 보고되고 있다(Pankaj K.M. J. Cardiovascular Medicine, 2008). 상기 복합 단백질의 대부분은 성장인자들로 알려져 있으며, 최근 이들 성장인자들에 대한 활발한 연구가 진행되고 있다. 성장인자란 체내에 소량 존재하는 신호전달 물질들로 이러한 성장인자들은 나이가 증가함에 따라 그 체내 농도가 감소하게 되며, 체내 성장인자 농도의 감소는 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀진 바 있다(Waisbourd M. et al., Drungs Aging, 2007). 현재 성장인자를 외부에서 공급하여 생체의 노화를 억제하려는 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 아울러 개별 성장인자들의 구체적인 효과에 대한 연구도 진행되고 있다. 근래의 연구 보고들에 의하면 피부 주변 줄기세포에서 분비되는 성장인자들이 상처 치료, 미백, 항산화 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다(Kim et al., J Dermatol Sci ., 2007; Kim et al., J Dermatol Sci ., 2008). 또한, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)가 면역억제 작용을 나타내는 것으로 보고되고 있으며, 이는 MSC가 마이토젠(mitogen)이나 동종 세포로 자극된 T-세포의 증식을 억제함으로써 면역반응을 억제시키는 것으로 보고되고 있다(Djouad F. et al., Blood 2003).

그러나, 아토피성 피부염이 면역반응과 관련된 알러지 뿐만 아니라, 다양한 원인에 의해 발생하므로, 특정 성장인자를 분리하여 임상에 적용할지라도 안정적인 치료 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, MSC의 면역억제 기능을 이용할 경우에도 세포를 직접 사용하여야 하므로 안정성 등의 문제로 통상의 방법에 의한 제제화가 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.

본 발명자들은 상기한 선행기술들의 문제점을 개선하면서, 안정적으로 아토피성 피부염을 예방 또는 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과 놀랍게도, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물이 아토피성 피부염 환자에게서 나타나는 대표적 증상인 피부 보호막 소실과 이로 인한 2차 감염을 억제하고 피부 보호막을 유지한다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 아토피성 피부염 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 성체 줄기세포의 배양물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있으며, 상기 성체 줄기세포의 배양물의 분획물이 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

상기 성체 줄기세포의 배양액은 성체 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 무혈청 배지 중에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 상기 혈청 배지는 584 mg/L의 L-글루타민, 1000 mg/L의 D-글루코스, 110 mg/L의 소디움 피루베이트, 10 %의 FBS, 및 1 %의 항생제(100 IU/ml)로 보충된 DMEM 일 수 있고, 상기 무혈청 배지는 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지에 365 mg/L의 L-글루타민, 15 mM의 HEPES, 55 mg/L의 소디움 피루베이트가 보충된 배지일 수 있다.

본 발명에 따른 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 조성물은 피부 보호막 소실과 이로 인한 2차 감염을 억제하고 피부 보호막을 유지시킴으로써, 아토피성 피부염을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써, 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 거부 반응을 최소화할 수 있다.

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는, 아토피성 피부염의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.

상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기 되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다.

성체 줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있다. 즉, 골수, 혈액, 제대혈, 지방 등으로부터 유래된 줄기세포는 각각의 줄기세포에 적합한 통상의 줄기세포 배양용 배지, 예를 들어 혈청 배지 중에서 계대 배양될 수 있다. 더욱 바람직하게는 성체 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후, 최종적으로 무혈청 배지 중에서 계대 배양함으로써, 얻어지는 배양물 혹은 분획물 중의 단백질 함량을 높일 수 있다.

상기 혈청 배지는 지방 유래 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로서, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 7 ∼ 10 중량%의 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 첨가된 동결건조된 DMEM에 혈청을 함유시켜 얻어진 배지일 수 있다. 상기 혈청으로는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용할 수 있으며, 그 함량은 혈청 배지 총 중량에 대하여 약 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이 코플라스마 억제제를 포함할 수 있다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있으며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신(tylosin), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈청 배지는 584 mg/L의 L-글루타민, 1000 mg/L의 D-글루코스, 110 mg/L의 소디움 피루베이트, 10 %의 FBS, 및 1 %의 항생제(100 IU/ml)로 보충된 DMEM 일 수 있다. 혈청 배지 중에서의 배양은 90∼95 %의 습도 및 35∼39 ℃의 조건으로 5∼10 % CO₂ 배양기에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라, 최종농도가 0.17∼0.22 중량%가 되도록 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가할 수 있으며, 트립신-EDTA를 처리함으로써 성장을 촉진시킬 수 있다. 누적집단 배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85% 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80% 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 수행할 수 있다.

무혈청 배지 중에서 계대 배양은 상기 혈청 배지에서의 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 세척하고 트립신-EDTA로 처리한 후, 세포부유액을 원심분리하여 획득한 펠렛을 인산화 완충 용액으로 2∼3회 세척한 후, 수행할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 산화영양원, 에너지 대사물질, 탄소조절원이 보충된 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 DMEM과 Ham's F-12 영양소 혼합액(SIGMA, Cancer Research Vol 47, Issue 1 275-280)을 1 : 1의 중량비로 혼합 한 배지에 365 mg/L의 L-글루타민, 15 mM HEPES, 55 mg/L의 소디움 피루베이트가 보충된 배지일 수 있다. 상기와 같이, DMEM과 Ham's F-12 영양소 혼합액을 조합하여 사용하는 경우, 줄기세포의 성장과 항상성을 효과적으로 유지시킬 수 있으며, 얻어지는 배양물 또는 분획물 중의 활성 단백질 함량을 더욱 높일 수 있다. 특히, 혈청 배지에 포함된 동물혈청으로부터 야기되는 다양한 변수들을 최소화할 수 있다.

상기 Ham's F-12 영양소 혼합액의 각 구성성분들의 성분 및 함량은 다음 표 1과 같다.

Ham's F-12 함유 영양소

성분	농도 (mg/L)	몰 (mM)	성분	농도 (mg/L)	몰 (mM)
아미노산			비타민
D-판토텐산	2.24	0.00895	바이오틴	0.0035	0.0000143
글라이신	18.75	0.25	콜린 클로라이드	8.98	0.0641
L-알라닌	4.45	0.05	D-칼슘 판토테네이트	2.24	0.0047
L-아르기닌 HCl	147.5	0.699	엽산(Folic Acid)	2.65	0.00601
L-아스파라긴-H₂O	7.5	0.05	i-이노시톨	12.6	0.07
L-아스파르트산	6.65	0.05	니아신아미드 (Niacinamide)	2.02	0.0166
L-시스테인 HCl-H₂O	17.56	0.0998	피리독신 염산염	2.031	0.00986
L-시스틴 2HCl	31.29	0.1	리보플라빈	0.219	0.000582
L-글루탐산	7.35	0.05	티아민 염산염	2.17	0.00644
L-글루타민	365	2.5	비타민 B12	0.68	0.000502
L-히스티딘 HCl-H₂O	31.48	0.15	무기 염류
L-이소류신	54.47	0.416	CaCl₂ (무수물)	116.6	1.05
L-류신	59.05	0.451	CuSO₄-5H₂O	0.0013	0.0000052
L-라이신 HCl	91.25	0.499	Fe(NO₃)₃ 9H₂O	0.05	0.000124
L-메티오닌	17.24	0.116	FeSO₄ 7H₂O)	0.417	0.0015
L-페닐알라닌	35.48	0.215	마그네슘 클로라이드(무수물)	28.64	0.301
L-프롤린	17.25	0.15	MgSO₄ (무수물)	48.84	0.407
L-세린	26.25	0.25	KCl	311.8	4.16
L-트레오닌	53.45	0.449	NaCl	6995.5	120.61
L-트립토판	9.02	0.0442	Na₂HPO₄	71.02	0.5
L-타이오린 디소듐 디히드레이트	55.79	0.214	NaH₂PO₄ (무수물)	54.3	0.45257
L-발린	52.85	0.452	ZnSO₄ 7H₂O)	0.432	0.0015

본 발명의 약학 조성물은 상기한 바와 같이 성체 줄기세포의 배양액으로부터 얻어진 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함한다. 상기 성체 줄기세포의 배양물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 성체 줄기세포의 배양물의 분획물은 성체 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

상기 원심분리는 줄기세포, 거대 분자, 배지 성분들을 침강시켜 제거할 수 있는 조건, 예를 들어, 300 ∼ 600 g로 5 ∼ 10 분 동안, 바람직하게는 약 300 g로 약 5 분 동안 수행될 수 있다. 필요에 따라, 약 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포와 미지의 거대분자들을 제거할 수도 있다. 또한, 상기 농축물은 상기 배양액 또는 분획을 감압농축 등의 통상의 방법으로 원하는 단백질 농도가 얻어질 때까지 농축함으로써 얻을 수 있다. 또한 상기 분획은 특정 포어 사이즈를 갖는 통상의 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킨 후, 막을 통과한 분획물을 다시 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 바람직하게는 외용액제, 에멀젼, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물은 1일 10 내지 1000 ng/kg으로, 바람직하게는 50 내지 500 ng/kg의 용량, 더욱 바람직하게는 약 100 ng/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 아토피성 피부염 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기한 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물은 아토피성 피부염 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물의 유효성분으로 함유될 수 있으며, 그 함량은 아토피성 피부염 개선 또는 증상완화 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ∼ 20.0 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 2 중량%의 함량으로 함유될 수 있다. 상기 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우 원하는 효과를 기대하기 곤란하고, 20.0 중량% 보다 클 경우에는 피부에 자극을 유발할 가능성이 있고, 제형의 안정화에도 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 유연 화장수 (스킨), 영양 화장수 (밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기한 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물 이외에 다른 종래의 아토피성 피부염 개선을 위한 성분들을 더 함유할 수도 있으며, 이들 기존의 성분들의 종류 및 함량은 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지방 줄기세포의 수득

피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 지방조직의 세포외기질을 약 37 ℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 45분간 0.075% 콜라게나아제로 처리한 다음, 얻어진 지방조직을 약 1200g에서 5분간 원심 분리하여 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 얻어진 분획을 PBS로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 다른 조직을 제거한 후 Histopaque-1077로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵 세포를 분리하였다.

분리된 단핵세포를 10% 소 태아 혈청((fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하여 약 37 ℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방 줄기세포를 단리하였다.

실시예 2. 줄기세포의 배양

실시예 1에서 얻어진 지방 줄기세포 1.25 × 10⁵ cells를 1000 mg/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트 10 % FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90 %의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO₂ 배양기에서 30일 동안 계대 배양하였다.

파이펫을 사용하여 계대 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 3 회 세척한 후, 365 mg/L의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:1 (중량비) 혼합 배지 중에서 1.2 × 10⁶ cell/dish의 농도로 접종하여 저산소(Hypoxia) 조건으로 72 시간 동안 배양하였다.

실시예 3. 줄기세포의 배양물 농축액 및 분획의 제조

실시예 2에서 최종적으로 얻어진 배양액 500 ml을 300 g로 5 분간 원심분리하여 펠렛으로 가라앉는 줄기세포를 제거하였다. 얻어진 상층액을 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자를 제거하였다. 얻어진 액을 반으로 나누어 감압 농축하여 5 ml의 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액은 동결건조하여 -70 ℃에서 보관하였다.

잔여 줄기세포 및 미지의 거대분자가 제거된 나머지 액을 30 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과시켜고, 멤브레인을 통과하지 못한 여과물에 인산 완충 식염수로 3회 세척하여 30 kDa 이상의 거대 분자 분획과 30 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 30 kDa 이하의 용액과 세척한 인산 완충 식염수를 포함한 용액을 다시 10 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인을 통과 시켜 10 kDa에서 30 kDa의 농축된 분획과 10 kDa 이하의 분획으로 분리한 다음, 10 kDa에서 30 kDa의 농축된 분획을 -70℃에서 보관하였다

시험예 1. 아토피성 피부염에 대한 억제 활성 평가

20% 트리암시놀론 아세토나아드(triamcinolone acetonide, TCA)를 마우스(n=3) 등의 왼쪽과 오른쪽 각각 1cm 직경으로 도포하여 표피가 손상된 화학적 아토피성 피부염을 유발시킨 후, 왼쪽에는 인산화 완충 식염수 1 ml를 거즈를 이용하여 아토피성 피부염 부위에 도포하고, 오른쪽에는 실시예 3에서 얻어진 10-30 kDa 분획 1 ml를 동일한 방법으로 도포하였다.

마우스에 TCA를 처리한 직후에 표피가 손상된 화학적 아토피 피부염을 유발 시킨 결과는 도 1과 같으며, 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 지방 유래 줄기세포 분획물(10 ∼ 30 kDa)을 투여한 후 2일 후 측정한 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 왼쪽은 인산화 완충 식염수를 투여한 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸다. 도 3 및 도 4는 각각 대조군 및 분획물 처리군의 조직학적 슬라이드 사진이다.

상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 2일 후 육안으로도 상처의 크기가 뚜렷하게 작아진 것을 확인할 수 있었으며, 조직학적 검사에서 표피가 뚜렷하게 생성되었고 피하지방과 진피층 사이에 염증 세포들이 유의성 있게 줄어든 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 줄기세포의 분획물이 아토피성 피부염으로 생긴 상처치료와 면역학적 염증 반응을 억제하여 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 유용함을 나타낸다.

도 1은 TCA를 이용하여 아토피성 피부염을 유발한 마우스의 사진이다.

도 2는 상기 아토피성 피부염 유발 마우스에 지방 유래 줄기세포 분획물(10 ∼ 30 kDa)을 투여한 후 측정한 사진이다. 왼쪽은 대조군이고, 오른쪽은 상기 분획물을 투여한 처리군을 나타낸다.

도 3은 대조군의 조직학적 슬라이드 사진이다.

도 4는 지방 유래 줄기세포 분획물(10 ∼ 30 kDa)을 투여한 처리군의 조직학적 슬라이드 사진이다.

Claims

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지방 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물을 유효성분으로 포함하고, 상기 지방 줄기세포의 배양액이 지방 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후 무혈청 배지 중에서 배양하여 얻어진, 아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 혈청 배지가 584 mg/L의 L-글루타민, 1000 mg/L의 D-글루코스, 110 mg/L의 소디움 피루베이트, 10 %의 FBS, 및 1 %의 항생제(100 IU/ml)로 보충된 DMEM 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제4항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지에 365 mg/L의 L-글루타민, 15 mM의 HEPES, 55 mg/L의 소디움 피루베이트가 보충된 배지임을 특징으로 하는 약학 조성물.
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지방 줄기세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 10 ∼ 30 kDa 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물을 포함하고, 상기 지방 줄기세포의 배양액이 지방 줄기세포를 혈청 배지 중에서 계대 배양한 후 무혈청 배지 중에서 배양하여 얻어진, 아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 개선 또는 증상완화용 화장료 조성물.
제10항에 있어서, 상기 혈청 배지가 584 mg/L의 L-글루타민, 1000 mg/L의 D-글루코스, 110 mg/L의 소디움 피루베이트, 10 %의 FBS, 및 1 %의 항생제(100 IU/ml)로 보충된 DMEM 인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제10항에 있어서, 상기 무혈청 배지가 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1 : 1의 중량비로 혼합한 배지에 365 mg/L의 L-글루타민, 15 mM의 HEPES, 55 mg/L의 소디움 피루베이트가 보충된 배지임을 특징으로 하는 화장료 조성물.