KR102619727B1 - 스핑고모나스 올레이 배양 추출물을 포함하는 리포좀 조성물 - Google Patents
스핑고모나스 올레이 배양 추출물을 포함하는 리포좀 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 스핑고모나스 올레이(Sphingomonas olei)의 배양 추출물을 포함하는 리포좀 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 스핑고모나스 올레이 배양액의 추출물을 리포좀으로 포집하여 사용함으로써, 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 피부 내로 효율적으로 전달하여 향상된 피부 재생 효능 및 경피 흡수율을 나타낸다.
Description
본 발명은 스핑고모나스 올레이(Sphingomonas olei)의 배양 추출물을 포함하는 리포좀 조성물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이 배양액의 추출물이 리포좀으로 포집됨으로써, 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 피부 내로 효율적으로 전달하여 향상된 피부 재생 효능 및 경피 흡수율을 나타낸다.
사람의 피부 표면에는 각질, 땀, 피지 등의 노폐물이 많기 때문에 다양한 미생물들이 서식하면서 피부 상재균총인 피부 마이크로바이옴(skin microbiome)을 형성하고 있다. 피부 상재균총은 유익균과 유해균이 서로 공생하고 있으며, 건강한 피부일수록 유익균의 분포도가 더 크고, 아토피나 여드름성 피부의 경우 유해균의 분포가 더 크다. 따라서, 피부에 존재하는 상재균의 균형을 유지하는 것이 건강한 피부상태를 유지하는데 도움을 주는 것으로 알려져 있다.
정상적으로 피부에 상주하는 피부 상재균은 다른 더 해로운 미생물(병원균)의 침투를 막아주는 피부 장벽을 형성하며, 피부 면역작용에 도움을 준다. 피부 유익균은 질병을 유발하지 않고 면역계를 자극하지 않기 때문에, 피부 유익균을 이용하여 의약이나 화장품 등을 제조할 수 있다면 피부 자극 등의 부작용없이 안심하고 사용할 수 있을 것이다.
피부에 상처가 나거나 감염이 일어나면 피부 조직의 손상 또는 염증이 발생하는데, 그 정도가 심하지 않은 경우 보통 피부는 스스로 치유된다. 스핑고모나스 올레이는 피부 재생 및 회복, 염증의 치유 과정에 도움을 주는 피부 상재균 중 하나로 보고된 바 있다(특허문헌 1 참조).
한편, 리포좀은 인지질로 구성된 구형의 소포체(vesicle)로서 인지질은 생체막의 주요 구성성분이기 때문에, 리포좀의 인지질막 또한 생체 막과 유사한 생리학적 기능 및 특성을 나타낸다. 따라서 리포좀은 피부 친화적이며 안전성이 우수하기 때문에 제약 및 화장품 산업 분야 등에서 효과적인 약물전달체로서 응용되고 있다.
스핑고모나스 올레이는 피부 재생, 보습, 항염 등 피부 상태를 개선하는 효능이 있으나, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 경우 단순 적용 시 인체 피부 장벽의 물리적 보호막으로 인해 피부로의 흡수에 대한 한계가 있어 그 적용이 용이하지 않다는 문제가 있다.
이에, 본 발명은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 리포좀으로 포집화함으로써 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 피부 내로 효율적으로 전달하여 경피흡수율 및 피부 재생 효능이 향상된 리포좀 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 리포좀 조성물을 포함하는, 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양상은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물 60 내지 94 부피%, 글리세린 5 내지 30 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.05 내지 10 부피%, 세테아릴올리베이트 0.005 내지 5 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.005 내지 5 부피%를 포함하는, 리포좀 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 스핑고모나스 올레이는 생균(살아있는 균)이거나 사균(죽어있는 균)일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 사균은 열처리에 의한 사균일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 스핑고모나스 올레이는 스핑고모나스 올레이 CBN003 균주(수탁번호 KACC 81169BP)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 스핑고모나스 올레이가 시험관 및 발효조 등의 배양장치 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 스핑고모나스 올레이를 일정기간 배양하여 얻는 상기 미생물, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 미생물을 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 미생물 자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 미생물 자체 또는 상기 미생물을 배양하여 배양액으로부터 분리한 미생물을 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
일 태양에 따르면 본 발명의 스핑고모나스 올레이의 배양물은 미생물 배양에 사용되는 배지 중에서 통상의 기술자가 목적에 따라 용이하게 선택한 배지를 사용할 수 있으며, 구체적으로 스핑고모나스 배양에 사용되는 배지, 예컨대 RCM(Reinforced Clostridium Medium) 배지, TSB(Tryptic soy broth) 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지를 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따르면 본 발명의 스핑고모나스 올레이의 배양물은 상기 미생물 배양 배지에 스핑고모나스 올레이를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양 방법(예를 들어, 정치 배양 등)에 따라 제조할 수 있다.
상기 배양액은 미생물을 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 미생물을 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 스핑고모나스 올레이를 적절한 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSB 배지) 에서 10℃내지 40℃중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
미생물의 농축물은 상기 미생물 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
스핑고모나스 올레이를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양 추출물"은 "발효 추출물"과 같은 의미로 사용될 수 있다. 상기 배양 추출물은 미생물을 발효한 배양액을 원심분리나 여과시켜 미생물을 제거하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 배양 추출물은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출하여 얻는 것까지 포함하는 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
스핑고모나스 올레이의 배양 추출물은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.
스핑고모나스 올레이의 배양 추출물은 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 장벽 개선, 피부 보습, 피부 면역 개선, 피부 방어력 증진, 피부 염증 억제, 피부 진정 및 피부 재생으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 피부 상태 개선 효과를 가질 수 있다(한국특허공보 제2361015호 참조).
스핑고모나스 올레이의 배양 추출물은 손상된 피부 표면에서 각질형성세포(keratinocyte)의 이동을 촉진시켜 손상된 표피의 회복을 증진시킬 수 있다. 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물은 피부 장벽 관련 인자(예를 들면, 각질 형성에 필요한 단백질인 로리크린(Loricrin))의 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물은 염증 인자, 예를 들면 아토피 및 가려움증 관련 인자(예를 들면, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)) 및 전염증성 사이토카인(예를 들면, IL-6, IL-8 또는 IL-1α)의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 용어 "리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고, 침투 효과를 극대화하는데에 사용되는 리포좀의 형태를 갖는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "포집(encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 말한다.
본 발명의 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물 60 내지 94 부피%, 글리세린 5 내지 30 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.05 내지 10 부피%, 세테아릴올리베이트 0.005 내지 5 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.005 내지 5 부피%를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물 65 내지 90 부피%, 글리세린 8 내지 25 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.1 내지 7 부피%, 세테아릴올리베이트 0.05 내지 4 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.05 내지 4 부피%를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물 70 내지 85 부피%, 글리세린 13 내지 25 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.2 내지 5 부피%, 세테아릴올리베이트 0.1 내지 3 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.1 내지 3 부피%를 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 60 내지 94 부피%, 65 내지 90 부피%, 또는 70 내지 85 부피%의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀 조성물은 안정화제로 글리세린을 포함한다. 본 발명의 리포좀 조성물은 글리세린을 5 내지 30 부피%, 8 내지 25 부피%, 13 내지 25 부피%, 또는 15 내지 25 부피%의 양으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 글리세린의 함량이 30 부피%을 초과하면 화장품 제조시 끈적거림이 증가하는 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 리포좀 조성물은 계면활성제로 하이드로제네이티드레시틴(hydrogenated lecithin)을 0.05 내지 10 부피%, 0.1 내지 7 부피%, 또는 0.2 내지 5 부피%의 양으로 포함할 수 있다. 레시틴은 다양한 포스포리피드의 혼합물을 지칭하고, 포스포리피드의 조성은 그 기원(origin)에 따라 다양할 수 있다. 하이드로제네이티드레시틴은 레시틴에 수소를 첨가하여 얻을 수 있다. 하이드로제네이티드레시틴이 0.05 부피% 미만이나 10 부피%를 초과하여 포함될 경우 리포좀의 형성에 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 리포좀 조성물은 보조 계면활성제로 세테아릴올리베이트(cetearyl olivate) 및 솔비탄올리베이트(sorbitan olivate)를 포함한다. 세테아릴올리베이트는 세테아릴알코올과 올리브오일에서 유래한 지방산의 에스테르이고, 솔비탄올리베이트는 솔비톨에서 유래한 헥시톨안하이드라이드와 올리브오일에서 유래한 지방산의 에스테르이다
본 발명의 리포좀 조성물은 솔비탄올리베이트를 0.005 내지 5 부피%, 0.05 내지 4 부피%, 또는 0.1 내지 3 부피%의 양으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 리포좀 조성물은 세테아릴올리베이트를 0.005 내지 5 부피%, 0.05 내지 4 부피%, 또는 0.1 내지 3 부피%의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 세테아릴올리베이트 및 솔비탄올리베이트는 하이드로제네이티드레시틴과 함께 리포좀의 지질 이중층을 형성한다. 본 발명에서 세테아릴올리베이트 및 솔비탄올리베이트가 각각 0.005 부피% 미만으로 포함되면 리포좀의 형성에 문제가 있을 수 있고, 5 부피%를 초과하여 포함되면 막 성분의 과다로 인하여 리포좀 내에 포접되는 성분의 양이 적어짐에 따라 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물의 효능이 불충분해질 수 있다는 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물, 글리세린, 하이드로제네이티드레시틴, 세테아릴올리베이트 및 솔비탄올리베이트를 필수적으로 포함하나, 리포좀 조성물의 본질적인 특성에 영향이 없는 범위내에서 필요에 따라 리포좀 안정화제, 항산화제 등과 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 리포좀 조성물에서 리포좀의 입자 직경은 25 내지 300 nm, 구체적으로는 50 내지 200 nm일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상으로, 본 발명은 상기 리포좀 조성물을 포함하는 화장료(cosmetic) 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 장벽 개선, 피부 보습, 피부 면역 개선, 피부 방어력 증진, 피부 염증 억제, 피부 진정 및 피부 재생으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 피부 상태 개선 효과를 가질 수 있다(한국특허공보 제2361015호 참조).
상기 화장료 조성물에는 본 발명에 따른 리포좀 조성물이 0.1 내지 20 부피%, 0.1 내지 15 부피%, 또는 0.1 내지 10 부피%의 양으로 포함된다. 본 발명에서 화장료 조성물이 리포좀 조성물을 0.1 부피% 미만으로 포함하면 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물에 의한 효과가 미비해질 수 있고, 20 부피%를 초과하여 포함하더라도 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물에 따른 효과가 그 첨가되는 것에 비례하여 증가하는 것을 더 이상 기대하기 어려워 경제상 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 금속이온봉쇄제, 활성성분(예를 들면, Sodium Hyaluronate 및 Tocopheryl Acetate 등), 방부제, 점증제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은, 예를 들면 스킨, 로션, 바디 로션, 크림, 에센스, BB(Blemish Balm) 크림 등으로 제형화될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 패취, 분무제 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 일 양상에 따른 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 포함하는 리포좀 조성물은 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물이 리포좀으로 포집화됨으로써 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물을 피부 내로 효율적으로 전달하여 향상된 피부 재생 효능 및 경피 흡수율을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물을 전계방사형 투과전자현미경(FE-TEM)으로 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물(Non-liposome)의 농도%(v/v)에 따른 인간 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존 능력을 WST-1 assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 비처리군을 대조군(control)으로 하여 대조군 대비 세포 생존 능력을 %로 나타내었다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물(Non-liposome)의 농도 %(v/v)에 따른 인간 각질형성세포(HaCaT)의 이동을 보여주는 실험 결과이다. 0시간의 스크래치 간격 대비 시료 처리 후 48시간 뒤 세포 이동에 의한 남아있는 간격을 나타내었다. (N-CNT, 음성 대조군; P-CNT, 양성 대조군; #, N-CNT 값 대비 유의미함; *, 비리포좀 조성물 시료 처리 값 대비 유의미함 *; # p<0.005; ##, ** p<0.0005; ###, *** p<0.00005)
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물의 농도 %(v/v)에 따른 인간 각질형성세포의 이동을 보여주는 사진이다. (N-CNT, 음성 대조군; P-CNT, 양성 대조군; SFE, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물; L-SFE, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물)
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물(Non-liposome)에 대한 경피 흡수 깊이를 시간에 따라 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물(Non-liposome)의 농도%(v/v)에 따른 인간 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존 능력을 WST-1 assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 비처리군을 대조군(control)으로 하여 대조군 대비 세포 생존 능력을 %로 나타내었다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물(Non-liposome)의 농도 %(v/v)에 따른 인간 각질형성세포(HaCaT)의 이동을 보여주는 실험 결과이다. 0시간의 스크래치 간격 대비 시료 처리 후 48시간 뒤 세포 이동에 의한 남아있는 간격을 나타내었다. (N-CNT, 음성 대조군; P-CNT, 양성 대조군; #, N-CNT 값 대비 유의미함; *, 비리포좀 조성물 시료 처리 값 대비 유의미함 *; # p<0.005; ##, ** p<0.0005; ###, *** p<0.00005)
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물의 농도 %(v/v)에 따른 인간 각질형성세포의 이동을 보여주는 사진이다. (N-CNT, 음성 대조군; P-CNT, 양성 대조군; SFE, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물; L-SFE, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물)
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물(Non-liposome)에 대한 경피 흡수 깊이를 시간에 따라 나타낸 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 제조
스핑고모나스 올레이 CBN003 균주(수탁번호 KACC 81169BP)를 TSB(Tryptic soy broth) 배지에서 34℃ 교반 배양하여 생장 곡선상 분열 단계(Log phase)의 최종 시점에서 균주 배양액 및 균체를 채집하였다. 채집된 균주 배양액 및 균체를 6,000 rpm에서 30분동안 원심분리한 후 0.2 μm 필터로 여과 멸균하여 배양 추출물을 제조하였다.
실시예 2.
스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물 제조
실시예 1에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물과 글리세린, 하이드로제네이티드레시틴, 세테아릴올리베이트 및 솔비탄올리베이트를 하기 표 1의 비율로 혼합하여 리포좀을 제조하는 통상적인 방법에 따라 리포좀 조성물을 제조하였다. 제조 후 1일이 지나지 않은 조성물을 사용하여 후술하는 평가 및 활성 분석을 실시하였다.
| 성분 | 함량 (부피%) |
| 스핑고모나스 올레이 배양 추출물 | 78.0 |
| 글리세린 | 20.0 |
| 하이드로제네이티드레시틴 | 1.0 |
| 세테아릴올리베이트 | 0.5 |
| 솔비탄올리베이트 | 0.5 |
| 합계 | 100.0 |
제조된 조성물을 전계방사형 투과전자현미경(FE-TEM)으로 관찰하여 얻은 사진을 도 1에 나타내었으며, 이로부터 리포좀 입자가 잘 형성되었음을 확인할 수 있다.
비교예 1.
스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물 제조
하기 표 2와 같이, 실시예 1에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물에 리포좀을 생성하기 위한 다른 성분은 사용하지 않고 정제수를 첨가하여 비리포좀 조성물을 제조하였다. 제조 후 1일이 지나지 않은 조성물을 사용하여 후술하는 평가 및 활성 분석을 실시하였다.
| 성분 | 함량 (부피%) |
| 스핑고모나스 올레이 배양 추출물 | 78.0 |
| 글리세린 | 0 |
| 하이드로제네이티드레시틴 | 0 |
| 세테아릴올리베이트 | 0 |
| 솔비탄올리베이트 | 0 |
| 증류수 | 22.0 |
| 합계 | 100.0 |
실험예 1. 세포 독성 평가
실시예 2에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물이 세포에 대하여 독성이 있는지 여부를 WST-1(Water Soluble Tetrazolium-1) 분석법을 통해 확인하였다.
인간 각질형성 세포주(human epidermal keratinocyte cell line: HaCaT)를 10% 소혈청(fetal bovine serum: FBS), 100 mg/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린을 포함한 DMEM 배지(Dubelcco's modified eagle medium)에서 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주를 24웰 플레이트에 2105/웰로 분주한 후, 동일 조건에서 24시간동안 배양한 뒤, 리포좀 조성물 및 비리포좀 조성물을 각각 1, 2, 5, 10% (v/v)의 농도로 처리하고 동일한 조건에서 24시간동안 추가 배양하였다. 이 후, 각 세포 배양 웰에 WST-1 용액을 첨가하고 동일한 조건에서 1시간동안 추가 배양한 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 시료 비처리군을 대조군으로 하여 대조군 대비 인간 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존 능력(%)을 도 2에 나타내었으며, 실험 결과에서 볼 수 있듯이 실시예 2에서 제조한 리포좀 조성물로 처리한 경우 대조군 대비 인간 각질형성세포(HaCaT)의 세포 생존 능력이 100% 이상이므로 세포에 대한 독성이 없음을 알 수 있다.
실험예 2. 피부 재생 효능 활성 분석
실시예 2에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물과 비교예 1에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물의 피부 재생 효능을 비교 분석하였다.
인간 각질형성 세포주(HaCaT)를 10% 소혈청(FBS), 100 mg/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린을 포함한 DMEM 배지(Dubelcco's modified eagle medium)에서 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주를 6 웰 플레이트에 2.5106/웰로 분주하고 세포의 부착을 위해 24시간 동안 동일한 조건에서 배양하였다. 이어서 무혈청 DMEM 배지에서 24시간동안 추가 배양한 뒤, 세포 단층에 동일한 간격의 직선 스크래치를 내고 리포좀 조성물 및 비리포좀 조성물을 각각 1, 2, 5, 10%(v/v)를 포함하는 무혈청 DMEM 배지에서 37°C의 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 양성 대조군으로는 EGF(Epidermal growth factor)를 1 ng/mL 처리하여 동일하게 배양하였다. 시료 처리 후 0시간과 48시간째의 스크래치 간격을 현미경으로 관찰하여 비교 분석하였다.
도 3은 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물(Liposome)과 비리포좀 조성물(Non-liposome)의 농도 %(v/v)에 따른 인간 각질형성세포(HaCaT)의 이동을 보여주는 실험 결과이다. 0시간의 스크래치 간격 대비 시료 처리 후 48시간 뒤 세포 이동에 의한 남아있는 간격을 나타내었다. (N-CNT, 음성 대조군; P-CNT, 양성 대조군; #, N-CNT 값 대비 유의미함; *, 비리포좀 조성물 시료 처리 값 대비 유의미함 *; # p<0.005; ##, ** p<0.0005; ###, *** p<0.00005)
도 4는 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물과 비리포좀 조성물의 농도 %(v/v)에 따른 인간 각질형성세포의 이동을 보여주는 사진이다. (N-CNT, 음성 대조군; P-CNT, 양성 대조군; SFE, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물; L-SFE, 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물)
결과에서 볼 수 있듯이 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물과 비리포좀 조성물로 처리한 경우, 모두 전반적으로 0시간의 스크래치 간격 대비 48시간 배양 후 스크래치 간격이 줄어들었으나, 리포좀 조성물로 처리한 경우가 비리포좀 조성물 시료로 처리한 경우보다 스크래치 간격이 현저히 더 줄어드는 것을 확인하였다. 특히, 1%와 2%의 리포좀 조성물로 처리한 경우 양성 대조군보다 스크래치 간격을 줄이는데 더 효과가 있었다. 이러한 결과는 상기 스핑고모나스 발효 추출물의 리포좀 조성물이 리포좀화하지 않은 경우에 비해 피부 재생 효능이 뛰어남을 의미한다.
실험예 3. 경피 흡수 정도 분석
실시예 2에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물과 비교예 1에서 제조한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물의 경피 흡수 정도를 비교 분석하였다.
경피 흡수 정도를 측정하기 위하여 균주 배양액에 형광 시약(Texas Red™, 여기(Excitation) 파장 562 nm/방출(Emission) 파장 582-618 nm)을 섞은 뒤 리포좀 조성물 및 비리포좀 조성물의 시료를 제조하였다. 상기 시료들을 미니돼지 유래의 시험용 피부인 Franz cell membrane(APURES)에 각각 로딩한 뒤 0, 30, 60, 90분 경과 후에 흡수된 깊이를 형광현미경으로 측정하였고, 로딩 직후(0분)의 침투 깊이 대비 시간에 따른 침투 깊이를 비교하여 그 결과를 도 5의 그래프로 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 30분, 60분 경과 후 측정한 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물의 피부 침투 깊이는 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 비리포좀 조성물과 차이가 거의 없었다. 하지만 90분 경과 후 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물은 비리포좀 조성물에 비해 훨씬 많이 흡수되었으며, 비리포좀 조성물의 침투 깊이(7.17 μm) 대비 리포좀 조성물의 침투 깊이(19 μm)가 약 2.6배 크게 나타났다. 이러한 결과는 스핑고모나스 올레이 배양 추출물의 리포좀 조성물이 리포좀하지 않은 경우에 비해 훨씬 더 경피 흡수가 개선됨을 의미한다.
Claims (9)
- 스핑고모나스 올레이(Sphingomonas olei)의 배양 추출물 60 내지 94 부피%, 글리세린 5 내지 30 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.05 내지 10 부피%, 세테아릴올리베이트 0.005 내지 5 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.005 내지 5 부피%를 포함하는, 피부 재생 촉진 및 경피 흡수 개선을 위한 리포좀 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물 65 내지 90 부피%, 글리세린 8 내지 25 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.1 내지 7 부피%, 세테아릴올리베이트 0.05 내지 4 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.05 내지 4 부피%를 포함하는, 리포좀 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 스핑고모나스 올레이의 배양 추출물 70 내지 85 부피%, 글리세린 13 내지 25 부피%, 하이드로제네이티드레시틴 0.2 내지 5 부피%, 세테아릴올리베이트 0.1 내지 3 부피%, 및 솔비탄올리베이트 0.1 내지 3 부피%를 포함하는, 리포좀 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 리포좀 직경의 크기가 25 내지 300 nm인, 리포좀 조성물.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 리포좀 조성물을 포함하는, 피부 재생 촉진 및 경피 흡수 개선을 위한 화장료 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 리포좀 조성물을 0.1 내지 20 부피%로 포함하는, 화장료 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 리포좀 조성물을 0.1 내지 15 부피%로 포함하는, 화장료 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 리포좀 조성물을 0.1 내지 10 부피%로 포함하는, 화장료 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 스킨, 로션, 바디 로션, 크림, 에센스 또는 BB(Blemish Balm) 크림의 제형인, 화장료 조성물.
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|---|---|---|---|---|
| CN117821362A (zh) * | 2024-03-05 | 2024-04-05 | 广州蕊特生物科技有限公司 | 一种胎牛血清冻干粉及其制备方法 |
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|---|---|---|---|---|
| KR102361015B1 (ko) | 2021-10-18 | 2022-02-14 | 큐티스바이오 주식회사 | 스핑고모나스 올레이의 피부 상태 개선 용도 |
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| 웹사이트, 'NEW 혁신개면 비타민A 리포조말 레티날 크림', https://hsgn.co.kr/product/retinal* * |
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