상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 피부의 보습력 향상과 피부의 주름을 개선하는 유효성분으로서 나노리포좀으로 안정화한 팬지 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 팬지 추출물은 나노리포좀 총중량에 대하여 0.001중량% ~ 50.0중량%로 안정화(포집)된 것이 바람직하며, 이와 같이 팬지 추출물이 안정화(포집)된 나노리포좀은 조성물 총중량에 대해서 0.001중량% ~ 30중량%로 함유된 것이 좋다.
본 발명에 따르면, 상기 팬지 추출물은 아쿠아포린-3(aquaporines-3)의 합성을 증가시키고, 히아루론산(Hyaluronic acid)의 합성 증가, 및 히아루론산(Hyaluronic acid)의 결합에 관여하는 효소와 수용체의 합성을 증가시켜 보습력을 향상시키면서 피부의 주름을 개선한다. 또한, 상기 팬지 추출물은 나노리포좀에 안정화(포집)된 상태로 함유되어 피부 침투 효과가 극대화되며 제형의 안정성을 유지한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 피부에 자극이 없고 보습 효과와 주름 개선 효과를 가지는 성분에 대해 연구를 거듭한 결과, 여러 가지 생약재 추출물 중에서 팬지 추출물이 효과적임을 알게 되었다.
팬지(Viola tricolor L.)는 측막태좌목 제비꽃과 한해살이풀로 삼색제비꽃이라고도 한다. 높이는 10~15㎝이며 줄기는 곧게 자라거나 옆으로 뻗으며 가지가 많이 갈라진다. 밑부분 잎은 둥근 달걀꼴이며 윗부분의 잎은 약간 가늘고 긴 주걱꼴이다. 잎자루는 길고 큰 턱잎이 있다. 꽃은 3~6월에 잎겨드랑이에서 긴 꽃자루가 나와 그 끝에 1개씩 달린다. 꽃잎은 5개이고, 꽃의 지름은 3~12㎝이며, 소륜종(小輪種)·중륜종(中輪種)·대륜종(大輪種)이 있다. 흰색·노란색·자주색의 3색으로 피나 원예품종은 단색이나 오렌지색·갈청색·적색·청색 등 변화가 많다. 열매는 삭과이며 달걀꼴이다.
위와 같은 팬지 추출물이, 종래 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.(일본 특허공개 제2002-003336호) 그러나 종래에는 팬지 추출물이 아쿠아포린을 증가하거나 히아루론산의 합성을 촉진하여 보습 효과와 주름 개선 효과를 가질 것이라고는 착상하지 못하였다.
본 발명에 따르면, 팬지 추출물은 표피의 수분 유지와 관련된 아쿠아포린- 3(aquaporins-3)의 합성을 증가시키고, 히아루론산의 합성 촉진, 및 히아루론산의 결합에 관여하는 효소와 수용체의 합성을 증가시켜 표피의 수분증발을 억제하고 각질층의 수분을 유지시킴으로써, 우수한 보습 효과 및 주름 개선 효과를 가짐을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 위와 같은 팬지 추출물을 화장료 조성물에 함유시킴에 있어서 나노리포좀에 안정화(포집)하여 함유시키는 경우 피부 침투 효과가 극대화되고, 제형의 안정성을 유지함을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 나노리포좀으로 안정화(포집)한 팬지 추출물을 표피 수분량 조절을 위한 유효성분으로 함유한다. 구체적으로, 상기 팬 지 추출물은 표피의 수분 유지와 관련된 아쿠아포린-3(aquaporins-3)과 히아루론산(Hyaluronic acid)의 합성을 촉진하는 작용성분으로 함유된다. 또한, 팬지 추출물은 히아루론산(Hyaluronic acid)의 결합에 관여하는 것으로서, 히아루론산 합성 효소-2(hyaluronan synthase-2)와 수용체(CD44)의 합성을 증가시키는 작용성분으로 함유된다. 이에 따라, 팬지 추출물은 표피의 수분증발을 억제하고 각질층의 수분을 유지시킴으로서 표피 수분량을 조절하여 보습력 향상과 주름 개선 효과를 나타낸다.
상기 팬지 추출물은 당업계에서 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 다음과 같이 제조할 수 있다.
팬지를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조한다. 건조한 팬지를 추출용기에 넣고, 적당량의 추출 용매에 적절한 온도에서 일정 시간 추출한다. 이때, 추출물은 여과되고, 진공회전증발기 등을 이용하여 농축될 수 있다.
상기 추출 용매로는 물(정제수), 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 극성용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 열수 추출하는 것이 좋다. 상기 추출 용매의 양은 팬지 건조 중량의 2 ~ 10 배로 하는 것이 좋다. 또한, 상기 추출 방법은 중탕 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중탕 추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것이 좋다. 이때, 중탕 추출의 침적 온도는 30 ~ 90℃로 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 60 ~ 80℃이며, 가장 바람직하게는 60℃ 정도로 유지하는 것이 부패, 변색 및 변취의 예방에 가장 효과적이다. 그리고 침적 시간은 5 ~ 20 시간, 바람직하게는 10 시간이 좋다.
위와 같이 팬지 추출물을 수득한 후에는 거름종이 등을 이용하여 고형분을 제거하고, 현탁액을 원심 분리시키고, 상층액을 감압 여과할 수 있다. 그리고 상기 여과된 추출물을 진공회전농축기로 20 ~ 100℃, 바람직하게는 50 ~ 70℃에서 감압 농축할 수 있다.
본 발명에서 상기 팬지 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 것이면 본 발명에 포함하며, 또한 상기 팬지 추출물은 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 사용되는 팬지 추출물은 추출 용매에 의한 추출물을 그대로 사용하거나, 추출한 후 정제 과정, 예를 들어 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막 등의 분리막을 막 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의 한 분리 등의 정제 과정을 추가적으로 실시하여 사용할 수 있다. 아울러, 상기 팬지 추출물은 감압 증류 및 동결 건조(또는 분무 건조 등) 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 다음, 조성물에 그대로 함유되거나, 또는 용매에 희석되어 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 위와 같은 팬지 추출물이 표피 수분량 조절을 위한 유효성분으로 함유된 것이면 본 발명에 포함한다. 이때, 상기 팬지 추출물은 피부 침투 효과가 향상되고 제형 안정성을 갖도록 나노리포좀으로 안정화되어 함유된다. 구체적으로, 팬지 추출물은 나노리포좀의 내부에 포집된 상태로 화장료 조성물에 배합된다. 그리고 팬지 추출물이 안정화(포집)된 나노리포좀은 조성물 총 중량에 대하여 0.001중량% ~ 30.0중량%(팬지 추출물 + 나노리포좀의 중량)로 함유된 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.01중량% ~ 10.0중량%로 함유된 것이 좋다. 이때, 팬지 추출물이 안정화(포집)된 나노리포좀의 함량이 0.001중량% 미만인 경우, 팬지 추출물의 함유에 따른 효과가 미미할 수 있다. 그리고 30.0중량%를 초과하여 너무 많이 함유되면 초과 함유에 따른 효과가 미미할 뿐만 아니라 상대적으로 다른 성분이 작게 함유되어 화장료의 제형에 부정적인 영향을 끼칠 수 있다. 또한, 상기 팬지 추출물은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.001중량% ~ 50.0중량%로 안정화(포집)되는 것이 좋다. 이때, 나노리포좀 총 중량에 대하여 팬지 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우 팬지 추출물의 함유에 따른 효과가 미미하고 침투 효과가 다소 떨어질 수 있으며, 50.0중량%를 초과하는 경우 나노리포좀 제조 공정이 다소 어렵고 벽 두께가 약하여 취급이 어려울 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "나노리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고, 침투 효과를 극대화하는 데에 사용되는 리포좀의 형태를 갖는 것으로서, 평균 입자 지름이 1 ~ 100nm(나노미터)인 리포좀을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 30 ~ 70nm인 것이 좋다. 상기 나노리포좀의 평균 입자 지름이 70nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부 침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약할 수 있다.
상기 나노리포좀은 팬지 추출물, 폴리올, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있으며, 상기 혼합물에는 1가 알코올(예: 에탄올 등)을 이용하지 않는다는 것이 좋다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 폴리올은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨 및 솔비톨 등로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 프로필렌 글리콜을 사용하는 것이 좋다. 그리고 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10 ~ 80중량%, 바람직하게는 30 ~ 70중량%가 좋다.
또한, 본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있고, 바람직하게 는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용된다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예로는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트 등을 들 수 있다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예로는 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르 등을 들 수 있다. 가장 바람직하게는, 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류가 이용된다. 계면활성제의 사용량은, 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1 ~ 10중량%이고, 바람직하게는 0.5 ~ 5.0중량%가 좋다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질(예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질 (예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜 콜린의 양이 23 ~ 95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 레시틴의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5 ~ 20중량%이며, 바람직하게는 2 ~ 8중량%가 좋다.
본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12 -22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리 스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05 ~ 3.0중량%이고, 바람직하게는 0.1 ~ 1.0중량%가 좋다.
본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0 ~ 40중량%이다.
상기 나노리포좀의 제조는 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물과 팬지 추출물을 고압 호모게나이저에 적용하여 제조한다. 상기 고압 호모게나이저에 의한 나노리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있는 이점이 있다. 이때, 바람직하게는 600 ~ 1200 bar 압력 하에서 1 ~ 5회 고압 호모게나아저를 통과하도록 하여 나노리포좀을 제조하는 것이 좋다.
위와 같이 제조된 나노리포좀은 여러 종류의 난용성 물질을 녹임과 동시에 불안정한 물질을 안정화시켜 피부 침투 효과를 극대화하는 장점을 가지고 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 팬지 추출물을 안정화(포집)한 나노리포좀 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 나노리포좀으로 안정화한 팬지 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 패취, 분무제 등의 제형을 포함한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 팬지 추출물에 의해 보습력 및 주름 개선 효과가 우수하다. 구체적으로, 전술한 바와 같이 팬지 추출물이 피부 수분 유지와 관련한 아쿠아포린-3(aquaporins-3)의 합성을 촉진한다. 또한, 히아루론산의 합성을 촉진하고, 히아루론산의 결합에 관여하는 효소와 수용체의 합성을 촉진하여 피부 수분 보유력 향상 등을 도모하여 피부 보습 효과를 향상시키고, 이러한 보습 효과에 의해 피부의 주름을 개선한다. 아울러, 나노리포좀에 안정화(포집)된 상태로 함유되어 피부 침투 효과가 극대화되어 위와 같은 효과가 보다 상승되며, 제형내의 안정성이 우수하다. 이와 같은 효과는 하기의 실시예에서 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해시키기 위해 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
[
제조예
1]
< 팬지 추출물의 제조 >
팬지 50g을 파쇄기에 곱게 파쇄하여 50% 에탄올 200ml에 침지시켜 80℃ 수욕조에서 2시간 동안 온탕하였다. 얻어진 추출액을 실온으로 냉각시키고 거름종이로 여과하여 여과액을 취하였다. 그리고 질소를 사용하여 여과액에서 에탄올을 증발시켜 농축한 다음, 이를 10% 에탄올에 녹여 팬지 추출물을 제조하였다.
[
시험예
1]
<
아쿠아포린
-3(
aquaporins
-3) 합성 촉진 효과 실험 >
팬지 추출물이 물 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3(aquaporins-3)의 합성을 증가시키는 효과를 알아보고자 다음과 같이 세포에 팬지 추출물을 처리한 후 웨스턴 블럿팅(western blotting)을 통해 확인하였다.
먼저, 각질형성세포를 접종하여 24시간 후, 제조예 1의 팬지 추출물 0.25%, 0.5%과 30ng/ml의 EGF(epidermal growth factor)를 각각 첨가하여 KSFM 배지, 37℃, 5% CO2에서 배양한다. 24시간 배양 후 세포를 회수한 후 파쇄하여 단백질만을 추출하여 -80℃에 보관하였다. 추출된 단백질은 BCA assay(Sigma Cat. No. BCA1)를 통해 단백질을 정량하였다. 각각의 시료의 단백질량 30ug으로 희석한 후 12% SDS-겔에서 전기영동한 후 P membrane(Millipore IPVH, Cat. No. 15150)으로 옮겼다. 1차 항체(rabbit anti-aquaporins-3 antibody)와 반응 시킨 후 남은 항체를 세척하여 제거하고 2차 항체(rabbit HRP-coupled anti-IgG antibody)와 반응시켰다. 남은 항체를 제거한 후 항체와 반응하여 발색 반응을 일으키는 시약(peroxidase substrate and chromogen solution)을 첨가하였다. 발색된 밴드는 이미지 분석(BIO1D, Vilber-Lourmat, France)을 통해 수치화하여 하기 [표 1]에 나타내었다.
구 분 |
Level of aquaporins-3(%) |
Control |
100 |
EFG(30ng/ml) |
146* |
0.25% 팬지 추출물 |
120 |
0.5% 팬지 추출물 |
144* |
*: Significant results according to student's test(P<0.05)
상기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 각질형성세포에 팬지 추출물 0.5% 처리 했을 때 아쿠아포린-3(aquaporins-3)의 합성이 44% 증가한 것을 알 수 있었다.
따라서, 본 시험예 1을 통하여 팬지 추출물은 물의 이동을 원활하게 하여 진피층으로부터 각질층으로의 수분공급을 증가시켜주는 것을 확인할 수 있었다.
[
시험예
2]
< 히아루론산(
Hyaluronic
acid)의 합성 촉진 효과 실험 >
히아루론산(Hyaluronic acid)은 세포사이를 채워주는 시멘트와 같은 점도물질로서 피부의 탄력과 표피의 수분 보유에 중요한 역할을 한다. 팬지 추출물의 히아루론산 합성 촉진 효과를 알아보고자 다음과 같이 세포에 팬지 추출물을 적용한 후 히아루론산 측정 시험을 통해 확인하였다.
먼저, 각질형성세포를 접종하여 24시간 동안 KSFM 배지, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 다음으로 제조예 1의 팬지추출물을 0.5%, 1%를 배지에 첨가하여 72시간 동안 배양한 후 상등액을 취하여 -80℃에 보관하였다. 그리고 히아루론산의 양을 ELISA assay kit(Biogenic Cat. No. O29001)를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 [표 2]에 나타내었다.
구 분 |
Hyaluronic acid(㎍/ml) |
Hyaluronic acid(%) |
Control |
3.19 |
100 |
0.5% 팬지 추출물 |
3.31 |
104 |
1% 팬지 추출물 |
3.94 |
123* |
*: Results significant according to studant's test(P<0.01)
상기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 팬지 추출물 1%를 각질형성세포에 처리하였을 때 배양 상등액에 존재하는 히아루론산의 양이 23% 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 시험예 2를 통하여 팬지 추출물은 히아루론산을 합성을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
[
시험예
3]
< 히아루론산 합성 효소-2(
hyaluronan
synthase
-2) 합성 촉진 효과 실험 >
히아루론산 합성 효소-2(hyaluronan synthase-2)는 히아루론산 합성에 관여하는 효소이다. 팬지 추출물이 히아루론산 합성 효소-2(hyaluronan synthase-2)의 합성을 증가시키는 것을 알아보고자, 히아루론산 합성 효소-2를 암호화하고 있는 mRNA의 발현량 증가를 통하여 확인하였다. 팬지 추출물을 다음과 같이 각질형성세포에 처리하고 RT-PCR을 통해 mRNA 발현양의 증가를 확인하였다.
먼저, 각질형성세포에 제조예 1의 팬지 추출물 1%를 첨가하여 24시간동안 배양하였다. 배양후 RNA를 추출하여 역전사 효소(reverse transcriptase)와 cDNA(complementary DNA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 스탠다드로 베타-엑틴을 사용하였다. 다음으로 아가로즈 겔의 전기영동을 통해 정량하였고, 이미지 분석(BIO-PROFIL system)을 통해 수치화하여, 그 결과를 하기 [표 3]에 나타내었다.
구 분 |
mRNA(%) |
Control |
100 |
1% 팬지 추출물 |
138* |
*: Significant results according to student's test(P<0.05)
상기 [표 3]에 나타난 바와 같이, 각질형성세포에 팬지 추출물 1%를 처리하였을 때 히아루론산 합성 효소-2(hyaluronan synthase-2)의 mRNA 발현이 38% 증가하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 시험예 3을 통하여 팬지 추출물은 히아루론산의 결합에 관여하는 효소의 합성을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
[
시험예
4]
<
CD44
의 합성 촉진 효과 실험 >
CD44는 히아루론산의 수용기이다. 팬지 추출물이 CD44의 합성을 촉진시키는 효과를 알아보고자, 다음과 같이 팬지 추출물을 각질형성세포에 처리한 후 flow cytometry를 통해 측정하였다.
먼저, 각질형성세포에 제조예 1의 팬지추출물 0.5, 1, 2%와 EGF 30ng/ml을 처리한 후 72시간동안 배양하였다. 배지를 제거하고 CD44 항체(R&D systems-UK)와 4℃에서 45분 반응시키고 다시 2차 항체인 Alexa Fluor-488(Interchim, France, Cat. No. A11017)과 반응시켰다. 그리고 FACS Vantage cell sorter(BECTON DICKSON, USA)를 통해 immunolabel된 세포를 분석하고, 그 결과를 하기 [표 4]에 나타내었다.
구 분 |
CD44(%) |
Control |
100 |
EFG(30ng/ml) |
126* |
0.5% 팬지 추출물 |
100 |
1% 팬지 추출물 |
120 |
2% 팬지 추출물 |
129** |
*: Significant result according to student's test(P<0.10)
**: Significant result according to student's test(P<0.05)
상기 [표 4]에 나타난 바와 같이, 각질형성세포에 팬지 추출물 2%를 처리하였을 때 CD44의 합성이 29% 증가됨을 알 수 있었다. 또한 팬지 추출물의 농도가 높을수록 CD44의 합성량이 증가함을 알 수 있었다.
따라서 본 시험예 4를 통하여 팬지 추출물은 히아루론산의 결합에 관여하는 수용체(CD44)의 합성을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
[
제조예
2]
< 팬지 추출물을 함유하는
나노리포좀의
제조 >
하기의 [표 5]의 조성과 함량으로 나노리포좀을 제조하되, 먼저 하기 [표 5]의 A상에 B상을 첨가하고, 균일하게 습윤시킨 후, C상을 첨가한 다음, 75℃까지 가열 혼합하였다. 그리고 상기 용액을 600 ~ 1000 bar의 조건으로 고압 호모게나이저에 2 ~ 4회 통과시킨 후, 냉각하여 지름 30 ~ 70nm 입자 크기의 팬지 추출물이 안정화(포집)된 나노리포좀을 얻었다.
상 |
성 분 |
함량(중량%) |
A |
글리세린 |
To 100 |
B |
수첨 레시틴 |
5.0 |
유동 파라핀 |
1.0 |
마카다미아 넛 오일 |
1.0 |
스쿠알란 |
1.0 |
디메치콘 |
1.0 |
이소프로필 미리스테이트 |
1.0 |
소듐스테아로일 락테이트 |
0.5 |
폴리솔베이트-80 |
0.5 |
스테아린산 |
0.5 |
C |
팬지 추출물 |
20.0 |
수산화 칼륨 |
적량 |
정제수 |
5.0 |
[
실시예
]
제조예 2에서 제조한 것으로서 팬지 추출물이 안정화된 나노리포좀을 함유하는 화장료 조성물을 하기 [표 6]에 보인 성분과 함량으로 조성하여 제조하였다.
[
비교예
]
나노리포좀 형태가 아닌 팬지 추출물을 그리고 함유하는 화장료 조성물(비교예 1) 및 둘 다 함유하지 않은 화장료 조성물(비교예 2)을 본 비교예로 적용하였다. 구체적인 성분과 함량은 하기 [표 6]과 같다.
성 분 |
실시예 |
비교예 1 |
비교예 2 |
함량(중량%) |
함량(중량%) |
함량(중량%) |
팬지 추출물(제조예 1) |
- |
2 |
- |
나노리포좀(제조예 2) |
10 |
- |
- |
세토스테아릴알콜 |
2 |
2 |
|
글리세릴스테아레이트 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
마이크로크리스탈린 |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
스쿠알란 |
5 |
5 |
5 |
유동파라핀 |
3 |
3 |
3 |
트리옥타노인 |
5 |
5 |
5 |
폴리솔레이트 |
1.2 |
1.2 |
1.2 |
솔비탄스테아레이트 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
토코페롤아세테이트 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
마이크로메치콘 |
3 |
3 |
3 |
BHT |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
글리세린 |
4 |
4 |
4 |
1,3-부틸렌글리콜 |
2 |
2 |
2 |
EDTA-2Na |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
정제수 |
To 100 |
To 100 |
To 100 |
향, 방부제 |
적량 |
적량 |
적량 |
[
실험예
5]
< 피부 침투 효과 실험 >
팬지 추출물을 나노리포좀으로 안정화한 것에 대한 피부 침투 효과를 알아보기 위해 피부 등가물(Dermal Equivalent: DE)을 이용하여 다음과 같이 피부 침투 효과를 측정하였다.
피부 등가물은 인체 정상 섬유아세포 1 × 105 세포/㎖ (한국세포주은행)를 인체의 결합조직을 이루는 섬유조직과 유사한 겔 구조의 3 mg/㎖ 콜라겐 수용액:5 × DMEM : 2.2% 소듐바이카보네이트와 200 mM Hepes 완충액이 포함된 0.05 N 수산화나트륨이 7:2:1로 혼합된 배지에 접종하여, 5% CO2, 37℃에서 7일 동안 배양한 것이다. 이를 3 ㎛ 다공성폴리카보네이트 (porous polycarbonate) 재질로 된 막 (membrane)에 의해 안쪽과 바깥쪽이 구분된 플레이트의 안쪽에 넣고 섬유아세포가 배양된 Derma Equivalent(DE) 표면 위에 표피각질형성세포 (Epidermal Keratinocyte) 1 X 105 cell/㎖ 세포를 접종하여 EGF와 BPE가 함유된 K-SFM 배지를 안쪽과 바깥쪽에 넣고 7일 동안 배양하였다. 그 후 플레이트 안쪽의 배지를 버려 공기가 배양세포의 표면에 접촉되도록 하고 바깥쪽에 10% FBS가 함유된 K-SFM과 EGF가 들어있지 않은 DMEM이 동량으로 혼합된 배지를 넣고 2주간 배양하여 다층의 표피와 진피가 형성된 인공피부를 얻었다. 여기에 본 발명의 실시예 및 비교예 1을 맨 위층의 인공피부 조직에 적용하여 4시간 배양 후 침투된 팬지 추출물의 양을 HPLC로 분석하였다. 그 결과를 하기 [표 7]에 나타내었다.
배지 중의 팬지 추출물의 양(㎍/㎖) |
실시예 |
비교예 1 |
26.4 |
3.5 |
상기 [표 7]에 나타난 바와 같이, 팬지 추출물을 안정화하여 나노리포좀 형태로 함유시킨 실시예는 팬지 추출물을 그대로 사용한 비교예 1에 비해 10배 이상의 피부 침투 효과가 우수함을 알 수 있었다. 이는 나노리포좀의 평균입자 크기가 30 ~ 70nm로 아주 작아 피부 침투가 용이하기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 제형 안정성을 평가해본 결과, 팬지 추출물을 나노리포좀 형태로 함유시킨 실시예는 45℃와 4℃에서 12주 보관 후에도 매우 안정한 상태로 존재함을 확인할 수 있었다.
[
시험예
6]
<
보습력
개선 임상 효과 실험 >
본 발명의 팬지 추출물을 함유하는 화장료에 대한 피부 보습력 개선 임상효과를 알아보기 위해 다음과 같이 측정하였다.
36세에서 59세의 여성 20명(평균연령 48세)을 대상(피검자)으로 하였으며 피부 수분량이 65이하인 건성피부를 가진 사람을 선별하였다. 측정하고자 하는 3부위를 정하고 피부의 수분량을 각각 3회에 걸쳐 측정한 후 상기 [표 6]에 따라 조성된 화장료를 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부 수분함량 측정장치인 코네오미터(Corneometer, Courage & Khazaka, Germany)를 이용하여 각질층 바로 아래의 표피층의 수분을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 8]과 같다.
피검자 |
실시예 |
비교예 2 |
비교예 1 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
1 |
39 |
66 |
41 |
55 |
37 |
65 |
2 |
43 |
77 |
42 |
53 |
42 |
54 |
3 |
63 |
75 |
63 |
51 |
49 |
62 |
4 |
48 |
65 |
51 |
49 |
39 |
52 |
5 |
42 |
59 |
45 |
47 |
55 |
69 |
6 |
49 |
55 |
45 |
55 |
44 |
55 |
7 |
33 |
58 |
37 |
36 |
50 |
54 |
8 |
37 |
51 |
29 |
45 |
45 |
61 |
9 |
51 |
67 |
68 |
63 |
38 |
64 |
10 |
41 |
59 |
28 |
26 |
58 |
67 |
11 |
27 |
59 |
28 |
33 |
34 |
45 |
12 |
37 |
67 |
28 |
30 |
40 |
49 |
13 |
48 |
70 |
37 |
41 |
45 |
52 |
14 |
38 |
62 |
41 |
46 |
30 |
61 |
15 |
25 |
52 |
26 |
31 |
40 |
57 |
16 |
60 |
73 |
62 |
60 |
35 |
57 |
17 |
37 |
50 |
47 |
54 |
51 |
65 |
18 |
47 |
68 |
44 |
44 |
29 |
47 |
19 |
55 |
68 |
56 |
61 |
53 |
61 |
20 |
47 |
57 |
55 |
40 |
62 |
66 |
평균 |
43.35 |
62.9 |
43.65 |
46 |
43.8 |
58.15 |
Δ(D28-D0) |
19.55 |
2.35 |
14.35 |
상기 [표 8]에 나타난 바와 같이, 실시예 및 비교예1,2의 적용전/후의 상대적인 수치 계산을 통해 살펴보면, 피부 수분도를 측정하는 코네오미터 측정결과 팬지 추출물을 함유하는 비교예1 적용 28일 후 수분도가 14.35% 증가하였으며 실시예는 19.55% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 효과는 피검자 대부분에서 관찰되었다.
따라서, 본 시험예 6의 보습력 개선 임상 효과 실험을 통하여, 팬지 추출물을 함유하는 화장료(실시예, 비교예1)는 피부 수분도를 증진시켜 피부 보습력에 우수한 효과를 발휘하고 있음을 알 수 있었다. 또한 나노리포좀으로 안정화한 팬지 추출물(실시예)은 피부 침투력이 높아 추출물을 적용한 것(비교예1)보다 약 1.4배 높은 보습효과를 나타냄을 알 수 있었다.
[
시험예
7]
< 주름 개선 임상 효과 실험 >
본 발명의 팬지 추출물을 함유하는 화장료에 대한 피부 주름 개선 임상효과를 알아보기 위해 다음과 같이 측정하였다.
42세에서 55세의 여성 20명(평균연령 50세)을 대상(피검자)으로 하였다. 상기 [표 6]에 따라 조성된 화장료를 28일간 도포(2회/일) 한 후, 모사판을 제작하여 S.I.A (silicone image analysis)를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 하기 [표 9] 내지 [표 11]과 같다.
< 주름 수 >
피검자 |
실시예 |
비교예 2 |
비교예 1 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
1 |
275 |
267 |
197 |
216 |
392 |
257 |
2 |
301 |
291 |
212 |
324 |
297 |
329 |
3 |
185 |
177 |
185 |
162 |
261 |
288 |
4 |
233 |
228 |
344 |
307 |
216 |
277 |
5 |
321 |
319 |
155 |
190 |
190 |
242 |
6 |
174 |
170 |
162 |
153 |
195 |
222 |
7 |
251 |
231 |
167 |
142 |
152 |
150 |
8 |
337 |
319 |
150 |
215 |
144 |
151 |
9 |
370 |
361 |
154 |
165 |
197 |
166 |
10 |
124 |
113 |
73 |
173 |
136 |
135 |
11 |
158 |
146 |
174 |
135 |
- |
123 |
12 |
215 |
191 |
150 |
224 |
292 |
229 |
13 |
120 |
115 |
69 |
108 |
85 |
84 |
14 |
79 |
77 |
194 |
- |
136 |
- |
15 |
117 |
105 |
153 |
185 |
124 |
187 |
16 |
326 |
312 |
116 |
162 |
176 |
137 |
17 |
271 |
261 |
205 |
199 |
152 |
117 |
18 |
229 |
- |
147 |
195 |
218 |
138 |
19 |
92 |
92 |
211 |
179 |
203 |
200 |
20 |
204 |
200 |
233 |
210 |
183 |
161 |
21 |
305 |
295 |
138 |
154 |
135 |
170 |
22 |
271 |
270 |
123 |
127 |
131 |
- |
23 |
108 |
100 |
296 |
222 |
185 |
163 |
24 |
86 |
87 |
226 |
282 |
237 |
239 |
평균 |
215 |
206 |
178 |
198 |
199 |
192 |
Δ(D28-D0) |
-9 |
20 |
-7 |
< 전체 주름부위 >
피검자 |
실시예 |
비교예 2 |
비교예 1 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
1 |
30.24 |
25.47 |
15.36 |
11.89 |
20.98 |
12.5 |
2 |
27.25 |
16.24 |
27.36 |
20.86 |
30.87 |
25.27 |
3 |
18.79 |
10.58 |
16.72 |
20.84 |
15.45 |
13.44 |
4 |
33.25 |
21.57 |
23.44 |
18.33 |
27.22 |
19.93 |
5 |
24.28 |
14.48 |
19.66 |
26.97 |
27.69 |
24.99 |
6 |
31.95 |
20.54 |
17.93 |
14.13 |
27.09 |
16.66 |
7 |
17.99 |
8.28 |
17.41 |
20.27 |
31.57 |
25.53 |
8 |
18.24 |
14.85 |
19.56 |
28 |
19.24 |
16.11 |
9 |
15.42 |
10.21 |
24.75 |
24.56 |
27.63 |
17.24 |
10 |
29.87 |
21.78 |
4.38 |
13.79 |
18.75 |
11.88 |
11 |
33.52 |
24.25 |
21.62 |
11.66 |
- |
24.09 |
12 |
27.77 |
20.98 |
14.32 |
28.94 |
20.97 |
14.01 |
13 |
19.97 |
14.59 |
14.72 |
15.2 |
15.47 |
8.33 |
14 |
24.52 |
- |
20.35 |
- |
19.39 |
- |
15 |
33.34 |
24.86 |
25.32 |
27.6 |
20.41 |
12.58 |
16 |
25.1 |
19.76 |
23.98 |
19.51 |
23.98 |
22.74 |
17 |
30.52 |
23.98 |
20.4 |
17.82 |
10.86 |
7.26 |
18 |
17.76 |
12.68 |
34.7 |
33.8 |
24.57 |
17.32 |
19 |
22.96 |
14.87 |
28.21 |
27.26 |
26.41 |
24.29 |
20 |
32.29 |
24.58 |
39.83 |
28.26 |
26.29 |
24.79 |
21 |
24.48 |
18.57 |
23.28 |
31.59 |
31.73 |
28.98 |
22 |
16.37 |
9.68 |
10.91 |
8.7 |
10.4 |
- |
23 |
20.48 |
18.68 |
13.15 |
8.13 |
20.08 |
18.25 |
24 |
31.19 |
18.82 |
10.57 |
17.66 |
29.98 |
22.5 |
평균 |
25.3 |
17.8 |
20.72 |
21.69 |
22.9 |
18.6 |
Δ(D28-D0) |
-7.5 |
0.97 |
-4.3 |
< 주름 총 길이 >
피검자 |
실시예 |
비교예 2 |
비교예 1 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
D0 |
D28 |
1 |
153.49 |
134.57 |
86.72 |
114.61 |
165.28 |
95.59 |
2 |
125.59 |
105.59 |
153.38 |
171.49 |
189.27 |
168.73 |
3 |
96.98 |
75.64 |
90.74 |
101.49 |
112.36 |
128.78 |
4 |
158.88 |
137.68 |
170.43 |
156.43 |
117.19 |
121.6 |
5 |
127.39 |
119.28 |
84.54 |
127.01 |
162.87 |
159.85 |
6 |
176.68 |
156.57 |
98.7 |
71.82 |
145.99 |
119.16 |
7 |
97.57 |
95.57 |
102.42 |
88.05 |
140.58 |
128.12 |
8 |
175.38 |
168.67 |
81.14 |
135.01 |
102.03 |
98.12 |
9 |
97.48 |
96.57 |
112.58 |
126.07 |
136.1 |
101.95 |
10 |
174.68 |
150.35 |
31.87 |
87.17 |
77.69 |
138.12 |
11 |
85.45 |
84.68 |
107.09 |
52.4 |
34.87 |
50.39 |
12 |
125.57 |
116.65 |
92.19 |
158.44 |
158.01 |
101.69 |
13 |
148.57 |
138.85 |
43.57 |
65.44 |
48.47 |
35.17 |
14 |
79.78 |
77.97 |
118.77 |
126.14 |
92 |
115.39 |
15 |
187.58 |
176.35 |
135.07 |
149.56 |
95.5 |
111.29 |
16 |
198.54 |
185.57 |
101.91 |
98.91 |
113.08 |
96.05 |
17 |
108.87 |
97.57 |
111.33 |
110.74 |
89.27 |
53.93 |
18 |
48.98 |
45.57 |
125.77 |
160.78 |
134.65 |
183.92 |
19 |
176.95 |
158.27 |
145.61 |
140.48 |
120.11 |
125.2 |
20 |
135.54 |
127.95 |
174.48 |
133.66 |
125.86 |
108.57 |
21 |
79.56 |
75.27 |
102.5 |
99.56 |
109.78 |
122.73 |
22 |
147.68 |
135.68 |
58.99 |
59.05 |
62.86 |
90.69 |
23 |
162.47 |
157.62 |
105.59 |
71.95 |
86.64 |
81.56 |
24 |
110.38 |
101.35 |
99.61 |
115 |
170.45 |
120.29 |
평균 |
132.5 |
121.7 |
107.15 |
118.29 |
116.29 |
111 |
Δ(D28-D0) |
-10.8 |
11.14 |
-5.29 |
상기 [표 9] 내지 [표 11]에 나타난 바와 같이, 실시예 및 비교예1의 적용 28일후에는 피부 주름 개선에 효과가 있음을 확인하였다. 특히 실시예의 경우 비교예1에 비해서 2배나 높은 효과를 가짐을 확인할 수 있었다. 비교예1의 경우 총주름 면적과 주름길이가 4.34%, 5.46% 감소하였고 주름수도 6% 줄어들었으며 총 피검자의 86%에서 주름 부위의 감소가 나타났다. 실시예는 총주름 면적과 주름길이가 7.47%, 10.8% 감소하였고 주름수도 9% 줄어들어 보다 향상된 결과를 보였다.
따라서, 본 시험예 7의 주름 개선 임상 효과 실험을 통하여, 팬지 추출물을 함유하는 화장료는 피부 주름 개선 효과를 증진시켜 피부노화방지의 우수한 효과를 발휘하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 실시예와 같이 나노리포좀화시킨 추출물의 경우 그 효과가 더욱 우수해짐을 알 수 있었다. 이는 피부 침투 효과가 우수하기 때문인 것으로 판단된다.
이상의 결과를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라서 나노리포좀으로 안정화(포집)한 팬지 추출물을 함유하는 화장료는 피부 보습력 및 피부 주름 개선 효과가 우수하여 피부노화방지에 효과적임을 알 수 있다.
이하에서는, 상기 시험예의 결과를 근거로 하여 본 발명에 따라서 나노리포좀으로 안정화(포집)한 팬지 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제형예를 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물을 하기의 제형예들로 한정하고자 하는 것은 아니다.
[
제형예
1]
< 유연 화장수 >
나노리포좀으로 안정화한 팬지 추출물을 함유한 유연 화장수를 아래의 [표 12]에 보인 조성과 같이 제조하였다.
원료 |
함량(중량%) |
나노리포좀(팬지 추출물) |
1.00 |
1,3-부틸렌글리콜 |
1.00 |
디소듐이디티에이 |
0.05 |
알란토인 |
0.10 |
디포타슘글리시리제이트 |
0.05 |
시트릭애씨드 |
0.01 |
소듐시트레이트 |
0.02 |
글리세레스-26 |
1.00 |
알부틴 |
2.00 |
하이드로제네이티드캐스터오일 |
1.00 |
에탄올 |
30.00 |
보존제 |
미량 |
착색제 |
미량 |
착향제 |
미량 |
정제수 |
잔량 |
[
제형예
2]
< 영양 크림 >
나노리포좀으로 안정화한 팬지 추출물을 함유한 영양크림을 아래의 [표 13]에 보인 조성과 같이 제조하였다.
원료 |
함량(중량%) |
나노리포좀(팬지 추출물) |
2.0 |
1,3-부틸렌 글리콜 |
7.0 |
글리세린 |
1.0 |
D-판테놀 |
0.1 |
식물 추출물 |
3.2 |
마그네슘알루미늄실리케이트 |
0.3 |
PEG-40 스테아레이트 |
1.2 |
스테아릭애씨드 |
2.0 |
폴리소르베이트 60 |
1.5 |
친유형글리세릴스테아레이트 |
2.0 |
소르비탄세스퀴올리에이트 |
1.5 |
세테아릴알코올 |
3.0 |
미네랄오일 |
4.0 |
스쿠알란 |
3.8 |
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
2.8 |
식물성 오일 |
1.8 |
디메치콘 |
0.4 |
디포타슘글리시리제이트 |
미량 |
알란토인 |
미량 |
소듐 히아루로네이트 |
미량 |
토코페릴아세테이트 |
적량 |
트리에탄올아민 |
적량 |
보존제 |
적량 |
착향제 |
적량 |
정제수 |
잔량 |