KR101940787B1

KR101940787B1 - 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지에서 배양하여 수득된 배양액을 포함하는 상처 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101940787B1
Application number: KR1020170053325A
Authority: KR
Inventors: 신승우; 노경백; 정은선; 박덕훈
Original assignee: 바이오스펙트럼 주식회사
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2019-01-22
Also published as: KR20180119771A

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rb3(Ginsenoside Rb3)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물 및 상기 조성물에서 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액을 포함하는 상처 치료용 조성물 등에 관한 것으로, 진세노사이드 Rb3의 처리에 의하여 줄기세포에 의한 IL-6, VEGF, 및 아디포넥틴(adiponectin) 등의 생성을 증가시킬 수 있으며, 세포 증식 및 이동을 촉진하여 상처 등을 치료하는데 효과적이다. 또한, 상기 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 및 의약품의 피부 외용제로 안전하게 사용할 수 있다.

Description

진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지에서 배양하여 수득된 배양액을 포함하는 상처 치료용 조성물 {A composition for treating skin wound comprising a stem cell culture medium treated with ginsenoside Rb3 as an active ingredient}

본 발명은 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물, 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 수득한 줄기세포 배양액을 제조하는 방법, 상기 제조 방법에 의하여 제조된 배양액을 포함하는 피부 재생 및 피부 상처 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 신체를 보호하는 방어막으로서 역할을 한다. 피부에 상처가 생기면 상처 부위에는 손상되거나 파괴되어진 조직이나 괴사된 조직 등 이물질을 제거하기 위해 염증세포를 발생하면서 파손되어진 피부장벽을 복원하기 위한 과정을 진행하는데, 염증세포는 상처가 낫고 새로운 조직이 재생할 수 있도록 유도하는 물질을 분비해 준다. 다음으로 상처가 난 부위에 세포간질세포가 이동하여 증식하고, 상처의 주변부로부터 혈관이 새로이 자라면서 피부 상피의 세포분열을 촉진하는 여러 가지 인자들을 분비하여 빠른 속도로 세포분열이 이루어지도록 유도한다. 그 다음 단계로 손상되어진 피부에 육아조직이라는 새로운 결합조직을 만드는 섬유화 모세포가 상처 부위로 이동하여 인체의 주요 결합조직의 하나인 콜라겐 섬유를 증식, 생산함으로써 상처를 치료하게 된다.

피부에서 줄기세포가 자리하고 있는 곳은 크게 세 곳이다. 첫째는 모낭과 모낭 사이의 표피(interfollicular epidermis)라고 불리우는 표피의 기저층(the basal cell layer of epidermis)에 존재한다. 둘째는 모낭(hair follicle)으로, 이 곳은 세포분화가 일어나기 전의 세포로 표피의 재생과 관련해 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 세포가 존재한다. 셋째는 피하지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다. 이처럼 피부에 존재는 줄기세포는 피부의 건강과 직결된 전체적인 역할을 담당하고 있어 피부건강과 피부 상처 치유와 관련하여 가장 중요한 세포군이라 할 수 있다. 줄기세포들은 살아있는 동안 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포 활성화물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제하고 문제가 있는 부위를 재생하거나 복구한다고 알려져 있다. 그러나 줄기세포 역시 세포군이기 때문에 나이에 따라 점차 그 기능을 서서히 소실하게 된다. 즉 피부의 줄기세포도 노화에 따라 그 활성이 점차 감소하기 때문에 세포분열능력이 떨어지고 점차 비활성화됨으로써 노화에 따른 주름, 검버섯, 더딘 상처치유, 더딘 복구 등의 여러 문제들이 발생하게 된다.

한편, 하기 화학식 1의 구조를 가지는 진세노사이드 Rb3(ginsenoside Rb3)은 식물에서 발견되는 사포닌과 다른 특이한 화학구조를 가지며, 그 효능도 항암효과, 항염증 효과, 중추신경 조절효과, 중성지방 분해억제효과, 플라스민 활성화 작용, 자외선에 의해 유도되는 노화방지 효과, 주름개선 효과 등 매우 다양하다. 분리분석 기술의 발전에 따라 최근까지 화학구조가 밝혀진 진세노사이드는 약 30종으로 protopanaxadiol계 18종, protopanaxatriol계 11종, oleanane계 1종이다. 본 발명의 Rb3(ginsenoside Rb3)는 protopanaxadiol계 진세노사이드로 인삼잎에서 주로 분리되는 것으로 알려져 있으며 Rb3의 효능에 대한 연구결과는 소수 발표되어 있다. Rb3의 신경세포보호효과(Peng. LL etal., Am J Cnin Med, 2009, 37(4), 759-770), 연골분해억제효과(Shin. JS et al., J Ethopharmacol, 2009. 12493), 397-403), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)에 의해 유도되는 유전독성을 억제하는 효과(Khalil WK., Arch Toxicol, 2008, 82(3), 183-195) 등이 보고되어 있다.

이에 본 발명자는 진세노사이드 Rb3의 효능에 관한 연구를 하던 중 진세노사이드 Rb3가 줄기세포의 증식을 촉진하고 유용 물질의 생산능을 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 진세노사이드 Rb3(Ginsenoside Rb3)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 줄기세포 배양 방법에 의하여 배양되어 수득된 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 피부 상처 치료용 조성물을 개체에 투여하여 개체의 피부 상처를 치료 또는 개선하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 진세노사이드 Rb3(ginsenoside Rb3)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 진세노사이드 Rb3(ginsenoside Rb3)는 인삼사포닌 중 4환성의 담마란계 사포닌으로 비당부분에 붙어있는 수산기(-OH)기가 2개인 protopanaxdiol(PPD)계에 속하며 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

상기 화학식 1의 진세노사이드 Rb3는 바람직하게 인삼에서 추출분리 정제할 수 있는데, 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜 등을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 한편, 본 발명의 진세노사이드 Rb3은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 진세노사이드 Rb3은 줄기세포 배양용 배지 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 10.0중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5중량%의 함량으로 포함된다. 상기 진세노사이드 Rb3의 함량이 0.001중량% 미만일 경우 줄기세포의 증식 촉진 효과가 미미하며, 그 함량이 10.0중량% 초과일 경우 함유량에 비하여 줄기세포의 증식 효과가 유의적으로 증가하지 않는다.

본 발명에 있어서, “줄기세포”는 스스로 세포분열할 수 있고 매우 다양한 형태의 특이 세포 타입(specific cell type)으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포이다.

본 발명의 조성물에 의하여 증식 촉진되는 줄기세포는 특정 줄기세포로 한정되지 않으나, 바람직하게는 성체 줄기세포, 보다 바람직하게는 동물 유래의 지방조직 유래 성체줄기세포이며, 보다 더 바람직하게는 인간 유래 성체 지방 줄기세포(Adipose derived stem cells, ADSCs)이다. 상기 성체줄기세포는 배아발달단계 이후에도 성체 전반에서 발견되는 분화되지 않고 세포분열에 의해 증식하여 사멸된 세포를 대체하고 손상된 조직을 재생하는 역할을 하는 줄기세포를 의미한다. 이러한 지방조직 유래 성체줄기세포는 주변조직의 특성에 세포자신을 맞추어 분화하는 조직특이적 분화능력(site-specific differentiation)을 가지고 있다.

본 발명에 있어서, "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro) 상에서 줄기세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지로서, 줄기세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 상기 진세노사이드 Rb3은 줄기세포의 성장, 생장 및 활성을 증가시키는 효과를 나타낸다. 보다 구체적으로, 진세노사이드 Rb3을 포함하는 배양 배지에서 줄기세포를 배양할 경우 진세노사이드 Rb3을 포함하지 않은 무처리 배양 배지와 대비하여 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 15% 이상, 보다 더 바람직하게는 20% 이상 줄기세포의 성장, 생장 및 활성을 증가시키고, 특정 물질(예를 들어, IL-6, VEGF, 및 adiponectin 등)의 생성을 증가시킨다.

IL-6는 단핵세포(monocyte), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibrobalsts), 및 각질형성세포 (keratinocytes)와 같은 다양한 세포에서 분비된다. IL-6는 류코사이트(leukocyte)의 infiltration을 조절하고 혈관생성(angiogenesis)와 콜라겐 축적(accumulation)에 관여한다고 알려져 있다(J Leukoc Biol. 2003 73(6):713-21.; Exp Eye Res. 2014 125:183-92.).

VEGF는 상처치유에 주요한 역할을 하는 인자로, 내피세포 분열인자(endothelial cell mitogen), 주화성 물질(chemotactic agent)로 작용하고 혈관투과성(vascular permeability)을 유도함으로써, 상처치유에 주요하게 작용한다고 알려져 있다(Int J Low Extrem Wounds. 2003 2(2):107-20.).

Adiponectin　역시　최근　연구발표에서　상처치료에　주요한　역할을　하는　것으로　알려져　있으며　각질형성세포의　아디포넥틴　수용체인　AdipoR1/AdipoR2에　결합하여　각질형성세포의　증식과　이동을　촉진한다(J Immunol. 2012 189(6):3231-3241).

따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rb3은 줄기세포의 증식 촉진 효과를 나타낸다. 상기 “세포의 증식촉진”은 세포의 성장, 생장 및 활성이 증가되어 세포의 수 및/또는 세포 자체의 기능이 향상되는 것을 포함하는 의미이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 진세노사이드 Rb3를 상술한 줄기세포 배양용 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 제조 방법이다.

여기서 진세노사이드 Rb3의 첨가량은 상술한 바와 같다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 배양 방법을 제공한다.

하나의 구체적 실시에 따르면, 본 발명에 따른 줄기세포 배양용 배지 조성물에 줄기세포를 분주하여 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 줄기세포를 배양하였다.

본 발명의 줄기세포 배양 방법에 의하여 배양된 줄기세포는 증식이 촉진되고 줄기세포로부터 유용물질(예를 들어, IL-6, VEGF, 및 adiponectin 등)의 생성이 증가되는 효과가 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 진세노사이드 Rb3를 포함하는 배양배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 방법에 의하여 배양되어 수득된 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치료(wound healing)용 조성물을 제공한다.

상기 수득된 배양액은 줄기세포 배양용 배지에서 줄기세포를 배양한 후 배양된 줄기세포를 제거하고 남은 배양액을 의미한다. 이러한 배양액을 제조하는 방법은 공지된 방법을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 세포를 배양한 후 세포배양액을 회수하고, 회수된 배양액을 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과함으로써 세포가 제거된 배양액을 얻을 수 있다. 마이크로 필터의 세공 크기(pore size)는 세포를 제거할 수 있는 크기 내에서 적절하게 선택할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10㎛이다.

상기 배양액은 피부 재생 및/또는 피부 상처 치료(wound healing)용 조성물의 전체 중량을 기준으로 하여 0.001 내지 15.0중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함된다. 상기 배양액이 전체 조성물에 대해 0.0001 중량% 미만으로 포함될 때는 피부 재생 및 피부 상처 치료 효능이 미약하고, 15.0 중량%를 초과하여 포함하면 증가되는 함유량에 비해 증가된 효과를 얻기 어려우며, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

또한, 상기 수득된 배양액은 진세노사이드 Rb3를 포함하지 않는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액과 대비하여 유용물질, 특히 IL-6, VEGF, 및 아디포넥틴(adiponetin)이 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 더 바람직하게는 40% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상 증가한 양으로 함유되어 있다. 따라서, 상기 배양액은 혈관생성, 콜라겐 생성, 피부 재생, 피부상처치유에 우수한 효과를 나타내므로, 피부에 직접 적용 가능한 화장료를 포함한 외용제로 사용 가능하다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 피부 상처 치료(또는 개선)용 조성물은 화장료 조성물로 제공된다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효 성분으로서 진세노사이드 Rb3를 포함하는 배양배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 방법에 의하여 배양되어 수득된 배양액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 피부 상처 치료용 조성물을 피부학적으로 허용 가능한 범위에서 개체에 투여하여 개체의 피부 상처를 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, '개체'는 피부의 불량한 상태, 예를 들어 피부 상처, 흉터 등을 개선 또는 예방하고자 하는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들어 개, 돼지, 말, 소 등을 의미한다.

본 발명에 있어서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 대상, 예를 들어, 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

한편, 본 발명의 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 배양하여 수득한 줄기세포 배양액에 대한 피부누적 자극시험 결과 인체에 무해한 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 배양하여 수득한 줄기세포 배양액 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명의 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물은 줄기세포의 증식을 촉진하고 줄기세포로부터 상처 치료 등에 유용한 물질의 생산을 증가시키는 효과를 나타낸다. 또한 본 발명의 진세노사이드 Rb3를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 배양하여 수득된 줄기세포 배양액은 섬유아세포의 증식 및 이동을 촉진하여 상처 치료에 매우 우수한 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 줄기세포 배양액은 상처 치료 및 개선을 위한 화장료 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 인간 지방 줄기세포에 진세노사이드 Rb3를 처리한 결과, 지방 줄기세포가 증식하였음을 나타낸 그림이다.
도 2는 인간 지방 줄기세포에 진세노사이드 Rb3를 처리한 결과, 인간 지방 줄기세포에 IL-6, VEGF 및 아디포넥틴의 발현이 증가하였음을 나타낸 그림이다.
도 3은 인간 지방 줄기세포에 진세노사이드 Rb3를 처리하여 배양한 줄기세포 배양액이 섬유아세포의 증식을 촉진함을 나타낸 그림이다.
도 4은 인간 지방 줄기세포에 진세노사이드 Rb3를 처리하여 배양한 줄기세포 배양액이 섬유아세포의 이동을 촉진하여 피부 상처를 치료할 수 있음을 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 진세노사이드 Rb3의 줄기세포 증식촉진 효과 측정

진세노사이드 Rb3 처리에 따른 줄기세포의 세포증식 정도를 확인하기 위해 인간 지방 줄기세포(ATCC, USA)를 6 웰-플레이트에 1 x 10⁵ cells/well로 접종시키고, 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 혈청이 없는 새로운 DMEM(Gibco, USA) 배지로 교환 후 농도별로 진세노사이드 Rb3를 각각 10, 100, 200, 500 ppm 의 농도로 처리하고, 60 시간동안 배양 후 세포의 증식정도를 MTT assay를 통해 측정하였다. 음성 대조군은 진세노사이드 Rb3를 처리하지 않은 조건으로 하였으며, 양성 대조군은 지방 줄기세포 배양용 complete medium 조건으로 배양하였다. 그에 대한 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 진세노사이드 Rb3 처리군에서 인간 지방 줄기세포의 세포 성장률이 농도의존적으로 증가하였다.

실시예 2: 진세노사이드 Rb3 처리에 따른 줄기세포의 IL-6, VEGF, 및 adiponectin 생성 증가

실시예 1과 동일한 방법으로 배양한 인간 지방 줄기세포에 진세노사이드 Rb3를 60시간 동안 처리한 후 세포배양액을 덜어내 비드(bead)를 이용한 면역 형광염색(eBioscience, USA)을 통해 각각의 사이토카인 생성정도를 측정하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 진세노사이드 Rb3를 처리한 조건(진세노사이드 Rb3(+))에서 진세노사이드 Rb3를 처리하지 않은 경우(진세노사이드 Rb3(-))보다 IL-6, VEGF 및 adiponectin의 생성 정도가 훨씬 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 3 : 진세노사이드 Rb3로 처리된 줄기세포 배양액의 섬유아세포 증식효과

상기 실시예 2에서와 같이 진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포의 배양액에 의한 인간 섬유아세포(ATCC, USA) 증식효과를 측정하기 위해, 인간 섬유아세포를 12 웰-플레이트에 2 X 10⁵ cells/well로 접종시키고 5% 농도의 CO₂ 배양기에 37℃로 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 혈청이 없는 새로운 DMEM(Gibco, USA) 배지로 교환 후 진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포의 배양액을 처리하고, 60 시간동안 배양 후 세포의 증식정도를 MTT assay를 통해 측정하였다. 음성 대조군으로 진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포의 배양액을 처리하지 않은 DMEM을, 양성 대조군으로는 10% FBS 조건으로 배양하였으며, 진세노사이드 Rb3 처리 유무에 따라 각각 배양한 줄기세포 배양액을 시험군으로 실험하였다. 그 결과를 하기 도 3에 나타내었다.

실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 진세노사이드 Rb3 처리로 배양한 줄기세포 배양액을 처리한 군에서 인간 섬유아세포의 세포 성장률이 증가하였으며, 진세노사이드 Rb3를 처리하지 않은 줄기세포 배양액을 처리한 조건에서는 유의할 만한 세포성장을 보이지 않았다.

실시예 4 : 진세노사이드 Rb3로 처리된 줄기세포 배양액의 상처 치유능 증가효과

진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포 배양액의 상처 치유 정도를 측정하기 위해, 인간 섬유아세포의 이동(migration)이 증가되는지를 확인하기 위해 아래와 같이 실험을 실시하였다. 인간 섬유아세포를 12 웰-플레이트에 2 X 10⁵ cells/well로 접종시키고 70% 정도 컨플루언시가 될 때까지 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 37℃로 배양시킨 후, 배지 중의 세포 단일층을 P10 피펫 팁으로 긁어서 긁힘-손상을 유도하였다.

긁어진 세포 단일층 상에 무혈청 DMEM 배지와 상기 진세노사이드 Rb3 처리에 따른 지방 줄기세포 배양액을 처리하였다. 그 후, 상기한 동일한 배양조건에서 인간 섬유아세포를 24시간 동안 배양시켰다. 음성 대조군으로 진세노사이드 처리를 하지 않은 지방 줄기세포 배양액을 처리하였다. 이후 현미경을 이용하여 긁힘 상처가 회복되는 정도를 확인하였다. 그 결과를 하기 도 4에 나타내었다.

실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군이 처리된 세포의 긁힘 손상은 24시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 진세노사이드 Rb3와 함께 배양한 지방 줄기세포 배양액을 처리한 조건에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 긁힘-손상이 치유되어 24시간 후 긁힌 면적이 감소되었다.

실시예 5 : 진세노사이드 Rb3로 처리된 줄기세포 배양액의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

5-1. 진세노사이드 Rb3로 처리된 줄기세포 배양액을 포함한 피부외용제의 제조

상기와 같이 상처 치유 효과가 우수하다고 판명된 진세노사이드 Rb3로 처리된 인간 지방 줄기세포의 배양액이 인체피부에도 안전한지 확인하기 위하여, 진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포 배양액을 함유한 피부 외용제를 제조하고 이에 의한 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1과 같이 진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포 배양액을 함유한 피부 외용제는 하기 표 1의 성분함량으로 제조하였다. 하기 표 1에서 대조군은 지방 줄기세포 배양액을 포함하지 않은 피부외용제이며, 각각 시험군은 진세노사이드 Rb3로 처리된 지방 줄기세포 배양액을 포함한 피부외용제이다.

피부외용제 제조를 위하여, 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하고 70 ℃에서 용해하였으며(수상파트), 상기 세 성분과 트리메탄올아민을 제외한 나머지 성분을 70 ℃에서 용해하였다(유상파트). 상기 오일파트를 수상파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화하였고, 여기에 트리메탄올아민을 최종 첨가하였다. 혼합액에 생성된 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 피부외용제를 제조하였다.

성분	함량 (%)
성분	대조군	시험군
정제수	72	72
글리세린	8.0	8.0
부틸렌글리콜	4.0	4.0
지방 줄기세포 배양액	0	1.0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0
세테아릴 글루쿠사이드	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4
세테아릴 알코올	1.0	1.0
트리메탄올아민	0.1	0.1
총중량	100	100

5-2. 피부누적 자극 시험

상기 실시예 5-1에서 제조한 각 피부외용제를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적첩포를 시행하는 것에 의하여 진세노사이드 Rb3 처리로 배양한 지방 줄기세포 배양액이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.

첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15ul씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 아래의 공식을 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[수학식 1]

평균반응도=[[반응지수x 반응도/ 총피검자수 x 최고점수 (4점)] x 100 ] ÷ 검사회수 (9회)

이 때, 반응도에서 ± 는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.

시험 물질	반응이 나타난 피검자수									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	1차	2차	3차	1차	2차	3차
	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++
대조군	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
시험군	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
피검인원	30	30	30	30	30	30	30	30	30

실험결과, 대조군과 시험군의 경우, ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명, 0명으로 반응이 나타나지 않았다. 상기 실험식 1에 따라 계산한 결과 대조군, 시험군 1 및 2의 평균 반응도는 모두 0.00으로 모두 3 이하로 나타나 안전한 조성물로 판단되었다.

Claims

진세노사이드 Rb3(Ginsenoside Rb3)를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 증식을 위한 지방 줄기세포 배양용 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rb3는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 내지 10.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포 배양용 배지 조성물.
삭제
삭제
제1항 또는 제2항의 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 지방 줄기세포 배양 방법.
진세노사이드 Rb3(Ginsenoside Rb3)를 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양한 후 수득된 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 배양액은 진세노사이드 Rb3를 포함하지 않는 줄기세포 배양용 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액과 대비하여 IL-6, VEGF, 및 아디포넥틴(adiponectin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 물질 생성이 증가된 것을 특징으로 하는 피부 상처 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 배양액은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 내지 15.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 상처 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 화장료로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부 상처 치료용 조성물.