WO2015133668A1

WO2015133668A1 - 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 함유하는 면역 반응 억제용 조성물

Info

Publication number: WO2015133668A1
Application number: PCT/KR2014/001977
Authority: WO
Inventors: 박현숙; 이순례; 박장미; 모현정; 고은진
Original assignee: (주)세포바이오
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2015-09-11
Also published as: JP2017508758A; KR101646236B1; JP6273036B2; KR20150105126A

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계 및 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 5 kDa 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 면역 반응 억제 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa 의 크기를 갖는 단백질은 면역 반응을 효과적으로 억제함으로써 이와 연관된 다양한 면역 관련 질환 용도로 이용될 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

증간엽 줄기세포 유래 단백질을 함유하는 면역 반웅 억제용 조성물

【기술분야】

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa 의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한， 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1,000 kDa 의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한， 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계 및 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 5 kDa 내지 1,000 kDa 의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 면역 반웅 억제 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

【배경기술】 - 면역 반응은 면역에 관여하는 세포가 외래성 및 내인성 이물질 (항원)에 대하여 일으키는 일련의 반웅으로서, 면역 반응은 크게 2 가지로 구분하여 설명된다. 첫째， B 림프구에 의해 만들어진 항체로 인한 면역 반응인 체액성 면역 반웅 (humoral i麵 unity)과 세포 표면에 표현되는 단백질 흑은 지질 등을 자기 (self) 혹은 비자기 (non-self)인지 인식하여 반웅하는 세포 매개성 면역 반웅 (cell mediated immunity)이 하나로 분류되고， 둘째는 선천성 면역 반응 (innate i瞧 unity)과 적응성 면역 반응 혹은 획득성 면역 반웅 (Adaptive i議 unity)이 다른 한 분류로 나뉘는데， 선천성 면역은 식세포에 의한 이물질 제거와 자연살생세포 (natural killer cell)에 의한 면역 반웅도 포함한다.

적응 흑은 획득 면역 반웅에는 항체 반웅 (체액성 면역)과 세포성 면역이 있고 각각은 항원 특이적인 반웅을 일으킨다. 이에 관계하는 주역은 림프구 (T 세포와 B 세포)이다. 림프구는 다양한 종류의 항원에 대하여 각각 특이적으로 반웅하지만 각 세포는 1 종류의 항원에 대해서만 반웅한다. 즉， 림프구는 각각이 항원 특이 반웅성을 담당하는 많은 종류의 세포 집단이고, 항원 자극에 대해서는 그 항원과 반웅성을 지니는 세포가 분화 증식하여 항체 생산 및 세포성 면역 반웅을 일으킨다. 획득면역반응은 선천성 면역과 완전히 득립된 것이 아니고 대개 경우 B 림프구 뿐만 아니라 대식세포 (macrophage)나 수상세포 (dendr i t ic cel l ) 등과의 협동작용에 의해 일어난다.

염증이란 어떤 자극에 대한 생체 조직의 방어 반웅의 하나로서， 조직 변질， 순환 장애와 삼출， 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다. 중이염과 같은 염증 외에， 결핵， 매독， 이질， 디프테리아 등과 같은 전염성 질환 등에서 볼 수 있는 병변의 총칭으로， 대부분의 병이 이에 속한다. 염증의 다양한 원인 중 세균에 의한 것이 가장 흔하다.

일반적으로 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려고 하는 생체의 방어 반웅 과정이다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직 세포 면역관여 세포 둥이 포함된다. 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인 (cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며， 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다.

지금까지 개발된 약제 중 가장 강력한 항염 작용을 지니고 있는 약제는 스테로이드 제제로 알려져 있다. 그러나 스테로이드 제제는 장기적으로 사용할 때 반드시 부작용을 수반하게 된다. 스테로이드제의 부작용으로는 체액의 저류， 부신억제， 감염에 대한 감수성의 증가와 기타 정신병， 백내장， 녹내장， 소화성 궤양， 창상치유 지연， 초기 감염의 재활성화 등이 보고되어 있다.

한편， 즐기세포는 미분화 세포로서 자기 재생을 통해 오랫동안 분열을 할 수 있으며， 특정 환경 하에서는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원이 되는 조직에 따라 배아 줄기세포 (embryonic stem ce l l )와 성체 줄기세포 (adul t stem cel l )로 나누어진다. 이를 이용한 연구적인 측면에서 성체 줄기세포의 잠재 능력은 배아 줄기세포보다 제한적인 단점이 있으나， 윤리적인 문제가 적어 성체 줄기세포를 대상으로 많은 연구가 진행되고 있다. ,

중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cel l s , MSCs)는 중간엽 기질세포 (mesenchymal stromal cel ls)로도 불리는 다능성 세포 (mul t ipotent cel l )이다. 중간엽 줄기세포는 골모세포, 연골모세포, 지방세포 등을 포함하는 다양한 형태의 세포로 분화될 수 있다.

즐기세포를 이용한 많은 연구가 진행되어 오고 있으며， 이 중 한국 공개특허공보 제 10-2009—0122415호에는 동물에게 효과적인 양으로 중간엽 줄기세포를 투여하여 동물에서 자가 면역 질환， 알레르기 반웅， 암， 염증 질환， 또는 섬유증을 치료하고， 상처 치유를 촉진시키고， 상피 손상을 수복시키고, 동물의 기관과 조직에서 혈관형성을 촉진시키는 방법이 제시되어 있다.

또한， 한국 공개특허공보 제 1으 2010-0076031 호에는 자가 면역 질환이나 염증성 질환과 같은， 과도한, 기능부전성 또는 조절불능성의 자가형 또는 비자가형 T 세포 매개형 반웅을 치료하는데 있어서의 Trl 세포 및 중간엽 줄기세포의 용도가 제시되어 있다. 또한， 한국 공개특허공보 제 1()ᅳ 2011-0127111 호에는 환자의 전신 염증 반웅 증후군 (SIRS)의 치료를 위한 중간엽 줄기세포 (MSC)의 용도가 제시된바 있다. 【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

본 발명은 줄기세포 유래, 특히 중간엽 줄기세포로부터 추출한 단백질을 이용하여 최적의 면역 반웅 (염증) 억제 활성을 나타내는 혁신적인 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

【기술적 해결방법】

이에 본 발명에서는 상기와 같은 목적을 위해 예의 연구를 거듭한 결과， 놀랍게도 중간엽 줄기세포로부터 추출된 특정 크기를 갖는 단백질이 현저히 우수한 염증 억제 활성을 갖는다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

【유리한 효과】

본 발명에 따라중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질은 면역 반응을 효과적으로 억제함으로써 이와 연관된 다양한 면역 관련 질환 용도로 이용될 수 있다.

【도면의 간단한설명】 도 1은 NiS0₄ 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 ILl ci 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 NiS0₄ 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 3은 LPS 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 ILl a 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 LPS 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 Ιίΐ β 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 NiS0₄ 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질 처리에 따른 ILl a 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 6은 NiS0₄ 처리로 면역 반웅을 유발한 후, 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질 처리에 따른 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 7은 LPS 처리로 면역 반웅올 유발한 후， 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질 처리에 따른 ILl a 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 8은 LPS 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 다양한 중간엽 즐기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질 처리에 따른 ILl p 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 9 는 중증 아토피 피부염을 앓고 있는 환자의 오른손 손등의 모습과， 지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질을 10 일 동안 처리한 모습을 나타낸다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만， 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며， 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서， 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1，000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다 .

다른 측면에서， 본 발명은 중간엽 즐기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품에 관한 것이다.

또 다른 측면에서， 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서， 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 크기를 갖는 단백질이다. 가장 바람직한 구현예에서， 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 ,000 kDa의 크기를 갖는 단백질은 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 100 kDa의 크기를 갖는 단백질이다.

본 발명의 면역 관련 질환에 대한 용도는 중간엽 줄기세포로부터 추출된 특정 크기 범위의 분자량을 갖는 단백질이 면역 반웅을 억제하거나 진정시킨다는 사실을 발견하였다는 점에 기인한다.

본 발명의 용도인 면역 관련 질환은 특^히 한정되는 것은 아니나, 베체트병， 다발성 근육염 /피부 근육염， 자가면역 혈구감소증 자가면역 심근염, 아토피성 피부염, 천식， 일차성간경변， 피부근염， 굿파이처 증후군， 자가면역 뇌수막염， 쇼그렌 증후군， 전신 홍반성 루프스， 에디슨병， 원형 탈모증， 강직성 척수염， 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염， 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병， 이영양성 수포성 표피박리증， 부고환염， 사구체 신염， 그레이브스병， 길랑바레 증후군, 하시모토병， 용혈성 빈혈， 다발성 경화증， 중증 근무력증， 심상천포창， 건선， 류마티스열, 류마티스 관절염， 유육종증， 피부 경화증， 척추관절증， 갑상선염, 혈관염， 백반증， 점액수종, 악성빈혈， 궤양성 대장염 등을 예로 들 수 있다.

특히 본 발명은 염증성 질환 용도에 관한 것으로서， 이러한 염증성 질환은 특별히 한정되는 것은 아니나, 알레르기， 피부염 아토피, 결막염， 치주염， 비염， 중이염， 인후염， 편도염， 폐렴， 위궤양， 위염， 크론병， 대장염, 통풍, 강직성 척추염， 류마티스 열, 루푸스， 섬유근통， 건선관절염， 골관절염， 류마티스 관절염， 견관절주위염， 건염, 건초염， 건주위염， 근육염， 간염， 방광염， 신장염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1ᅳ 000 kDa의 크기를 갖는 단백질은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 % 내지 100 ¾로 함유될 수 있으며 , 바람직하게는 1 ¾ 내지 50 ¾>로 함유될 수 있다. 함량은 제형 또는 조성물에 함유되는 기타 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있다. 하지만， 조성물 내 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질의 함량이 0.01 % 미만인 경우 실질적인 효과를 기대하기 어려울 수 있으며， 50 ¾를 초과하는 경우에는 기대 효능 대비 비경제적일 수 있기 때문에， 조성물 총 중량에 대하여 0.01% 내지 50 ¾로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에서， 본 발명의 조성물은 유효 성분인 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질 이외에， 면역 관련 질환에 대한 효과를 상승 또는 보강시킬수 있도록 면역 관련 질환에 효과가 있다고 이미 알려졌거나 앞으로 알려질 여타의 공지된 화합물이나 천연 추출물을 함께 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서， 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 하나 이상의 담체를 추가로 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 특별히 제한되지 않으며 제형화에 통상적으로 사용되는 락토오스， 덱스트로오스 수크로오스, 소르비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알지네이트， 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀를로오스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로오스, 물, 시럽， 메틸 셀를로오스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 탈크， 스테아르산 마그네슘， 미네랄 오일 등일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 담체 이외에 윤활제ᅳ 습윤제, 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적절한 투여량은 제형화 방법， 투여 방식， 환자의 상태, 증상의 정도 등의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으나， 하루 0.01 mg/kg 내지 2 ,000 mg/kg 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고， 비경구로 투여되는 경우， 도포， 정맥 내 주입， 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 약제학적 조성물이 아토피성 피부염 치료에 사용되는 경우 증상이 있는 피부에 국소적으로 도포되는 방식으로 투여되는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서， 본 발명의 건강기능식품은 식품용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 식품용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제는 특별히 제한되지 않으며 식품에 배합될 수 있는 통상적인 성분, 예를 들어 물， 풍미제， 향미제， 착색제, 안정화제 , 방부제， 알코올， 탄산화제 , 과육， 증점제， 비타민， 식물 추출물， 유기산, 미네랄， 영양제 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품의 형태는 특별히 제한되지 않으나， 음료， 껌， 차， 과자， 비타민 복합체 및 건강 보조식품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서， 본 발명의 화장료 조성물은 화장용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 화장용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제는 특별히 제한되지 않으며 일반 화장료에 배합되는 통상적인 성분， 예를 들어 유분， 물， 계면활성제， 보습제, 알코을， 증점제， 색소， 방부제， 향료， 킬레이트제， 부형제， 회석제， 자외선 차단제， 지방산 등일 수 있다ᅳ

본 발명의 화장료 조성물은， 특별한 제한 없이， 스킨， 로션， 크림 , 젤, 에센스， 파운데이션， 화장수， 패치， 팩, 비누， 세안제 및 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

또 다른 측면에서， 본 발명은 a) 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계; 및 b) 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 면역 반웅 억제 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 구현예에서， b) 단계는 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계이다.

본 발명의 중간엽 줄기세포는 인간의 지방， 태반, 제대혈 또는 골수에서 추출된 인간 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하다. 또한， 인간 배아 즐기세포를 분화시켜 중간엽 세포로 유도한 후 추출된 것을 중간엽 줄기세포로 사용할 수 있다. 일례로서， 본 발명의 중간엽 줄기세포는 성인의 지방 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포와 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하며， 이중 지방 유래 중간엽 줄기세포는 지방 조직 내에 존재하는 세포에 대해 몇 단계의 정제 과정을 거쳐서 수득할 수 있고， 골수 유래 중간엽 줄기세포도 지방 유래 세포와는 다른 방식의 정제 과정을 거쳐 수득 가능하다.

본 발명에서는 대표적인 면역 반응 (염증) 유도 물질인 NiS0₄(황산니켈)와 LPS( l ipopolysacchar ide)를 이용하여 사이토카인 ILl a와 Ιίΐ β의 분비를 증가시킨 후， 특정 분자량의 증간엽 즐기세포 유래 단백질을 처리하여 ILl a와 의 분비가 감소되는지를 확인하였다. NiS0₄의 경우는 알레르기 유발 물질로서 선천성 면역 (1 차, 초기 면역 흑은 염증 반웅)에 보다 민감하게 반웅하는 물질이고， LPS는 1차， 2차 면역에 모두 반응하여 면역 반웅을 유발하는 물질로 알려져 있다. .또한， 면역 반웅시 ILl a와 ΙΙΛ β는 분비 수준은 서로 상이할 수 있으며， 일반적으로 ILl a가 더 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

세포의 배양및 배지의 준비

인간 각질세포 (kerat inocyte)는 무혈청 배지인 CEFOgro H (CB^~HK-GM; 한국 CEFO

Co. 제조) 배지를 사용하여 37^°C , C0₂ 배양기에서 배양하였다ᅳ

지방 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro ADMSC(CB-ADMSC-GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로， 골수 유래 중간엽 줄기세포는 CEFOgro BMMSC(CB- MSC— GM; 한국 CEFO Co. 제조) 배지로， 배아 줄기세포 유래 중간엽 즐기세포 (인간 배아 줄기세포를 분화시켜 중간엽 줄기세포로 유도함)는 CEFOgro ESMSC(CB-ESMSC-GM; 한국 CEFO Co. 제조)배지로 배양하였고， 이들 모두 각질세포와마찬가지로 37 ^°C , C0₂ 배양기에서 배양하였다.

조건화 배지 (CM; condit ioned medium)는 T75 플라스크에 중간엽 줄기세포를 1 X 10⁶ 세포가 되도록 배양한 후 무이종성 /무혈청 배지 (CER3-XF-GM)에 넣어 24 시간 동안 배양한 후 배양액만 모아서 3 ,500 g에서 10 분간 원심분리한 후 펠렛은 제거하고 상등액만 취하여 0.45 포어 (pore)로 필터링하여 준비하였다.

중간엽 줄기세포로부터 단백질 추출

1 X 10⁶ 개의 중간엽 즐기세포를 포집하여 4^°C 조건 하에서 초음파 파쇄기 (VCX500; 미국 SONICS&MATERIALS. INC 제조)를 이용하여 15 초간 초음파를 적용한 (Pulse On) 후, 5 초간 휴지기 (Pulse Of f )를 갖도록 조정하고 진폭 파워를 20 ¾로 하여 초음파를 1 분 이내에 총 3 회 반복 처리하였다.

초음파 파쇄된 샘플을 15, 000 g에서 5 분 동안 원심분리하여 상등액만 취하고 펠렛은 제거하였다.

또한, 추출된 단백질과 조건화 배지는 단백질 양을 정량한 후에 동결건조하여 보관하였다.

추출된 단백질의 크기별분리

1 , 000 kDa, 500 kDa, 100 kDa, 5 kDa 분획 분자량 (MWCO)의 포어 크기를 포함하는 폴리에테르술폰 멤브레인이 구비된 20 1 용량의 Vivaspin-20 한외여과 튜브 (영국 Vivascience사 제조)를 사용하였으며， 4°C 조건 하에서 3 ,500 g에서 30 분 동안 원심분리하여 추출된 단백질을 크기별로 분리하였다.

크기별로 분리된 단백질과 조건화 배지는 단백질 양을 정량한 후에 동결건조하여 보관하였다.

사이토카인 분비 측정

각질세포를 24 웰 플레이트 (미국 Corning사 제조)에 1 . 2 X 10⁵의 수로 접종하고

CEFOgro HK 배지로 24 시간 동안 배양하였다. 면역 반응을 유도하기 위하여 대표적인 염증 유도 물질인 LPS(2 와 NiS0₄(75 //g/in )를 각 샘플에 24 시간 동안 처리하였고， 동시에 크기별로 분리된 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 처리하였다. 크기별로 분리된 단백질과 함께 LPS와 NiS0₄가 처리된 샘풀로부터 배양액을 수거하여 ILl a와 Ιίΐ β의 분비 정도 (pg/π )를 ELISA KIT (미국 D SYSTEMS사 제조)를 이용하여 R&D SYSTEMS의 매뉴얼에 따라 측정하여， 그 결과를 도 1 내지 도 8에 나타내었다.

도면의 그래프 중 Contr 은 각질세포 배지를 이용하여 정상적인 방법으로 배양한 대조군 샘플이고， CYT0-N은 Contr 에 NiS0₄를 처리하여 면역 반웅을 유도한 샘플이며， CYTO-L은 Control에 LPS를 처리하여 면역 반응을 유도한 샘플이다. Whole은 NiS0₄ 또는 LPS를 처리한 실험군에 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지의 전체 분자량의 단백질을 처리한 샘플이다 (즉， 크기별 분리하지 않음) . 또한， 도 1 내지 도 4 중 lOOkD above와 lOOkD under는 NiS0₄ 또는 LPS를 처리한 샘폴에 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질을 100 kDa 초과와 100 kDa 이하로 나눈 것을 처리한 실험군이다. 도 5 내지 도 8 중 ADMSC, B醒 SC, ESMSC는 각각 NiS0₄또는 LPS를 처리한 샘폴에 지방， 골수， 배아 줄기 세포 유래 중간엽 즐기세포로부터 추출한 100 kDa 이하의 단백질을 처리한 실험군이다.

구체적으로, 도 1 및 도 2는 각각 NiS0₄ 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 ILl a와 ΙΙΛ β 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 각질 세포에 면역 반웅을 유도하는 NiS0₄를 처리한 경우 사이토카인 ILl a와 ILl p 분비량이 증가됨을 확인하였으며， Whole과 100kD under의 경우가 lOOkD above 및 CYTO-N에 비하여 면역 반웅시 증가되는 사이토카인의 함량이 감소되어 면역 반웅이 진정됨을 확인할 수 있었다.

도 3 및 도 4는 각각 LPS 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 지방 유래 증간엽 줄기세포를 배양한 조건화 배지로부터 추출된 단백질 처리에 따른 ILl a와 Ιίΐ β 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 각질 세포에 면역 반응을 유도하는 LPS를 처리한 경우 사이토카인 ILl a와 ILi p 분비량이 증가됨을 확인하였으며， Whole과 100kD under의 경우가 100kD above 및 CYT0-L에 비하여 면역 반응시 증가되는 사이토카인의 함량이 감소되어 면역 반웅이 진정됨을 확인할 수 있었다.

도 1 내지 도 4에 나타난 바와 같이， 100kD above의 경우에는 오히려 면역 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

도 5 및 도 6은 각각 NiS0₄ 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질 처리에 따른 ILl a와 ΙΙΛ β 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 각질 세포에 면역 반응을 유도하는 NiS0₄를 처리한 경우 사이토카인 ILl a와 ILl p 분비량이 증가됨을 확인하였으며， ADMSC, B醒 SC 및 ESMSC 처리군이 CYTO-N에 비하여 면역 반웅시 증가되는 사이토카인의 함량이 감소되어 면역 반응이 진정됨을 확인할 수 있었다.

도 7 및 도 8은 LPS 처리로 면역 반웅을 유발한 후， 다양한 중간엽 줄기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질 처리에 따른 ILl a와 ΙΙΛ β 분비량의 변화를 나타낸 그래프이다. 각질 세포에 면역 반웅을 유도하는 LPS를 처리한 경우 사이토카인 ILl a와 IL1 |3 분비량이 증가됨을 확인하였으며, ADMSC, 腿 MSC 및 ESMSC 처리군이 CYTO-L에 비하여 면역 반웅시 증가되는 사이토카인의 함량이 감소되어 면역 반웅이 진정됨을 확인할 수 있었다.

아토피 피부염에 대한적용

중증 아토피 피부염을 앓고 있는 환자의 ^른손 손등에 지방 유래 중간엽 즐기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질을 매일 아침， 저녁으로 2 회 2 m£씩 고르게 도포하여 호전 상태를 관찰하였다. 처리전과 처리 10 일째의 모습을 도 9 에 나타내었다. 도 9 에서도 확인할 수 있는 바와 같이， 지방 유래 증간엽 즐기세포로부터 추출된 100 kDa 이하의 단백질을 처리시 아토피 증상이 현저히 호전되었다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 11

증간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 , 000 kDa 의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제,학적 조성물.

【청구항 2】 제 1항에 있어서， 중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 100 kDa 의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.

【청구항 3】

제 1항에 있어서，

중간엽 줄기세포가 인간의 지방， 태반， 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.

【청구항 4】

제 1항에 있어서，

면역 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.

【청구항 5】

제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항에 있어서，

면역 관련 질환이 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.

【청구항 6】

중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 ,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품.

【청구항 7】

제 6항에 있어서，

중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 100 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선ᅳ 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품. ,

【청구항 8】

제 6항에 있어서，

중간엽 줄기세포가 인간의 지방， 태반， 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품.

【청구항 9】

제 6항에 있어서 ,

면역 반웅을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 건강기능식품.

【청구항 10】

제 6항 내지 제 9항 중 어느 한항에 있어서,

면역 관련 질환이 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선, 완화또는 예방을 위한 건강기능식품.

【청구항 11】

중간엽 즐기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 1 ,000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방올 위한 화장료 조성물.

【청구항 12】

제 11항에 있어서，

중간엽 줄기세포로부터 추출된 5 kDa 내지 100 kDa의 크기를 갖는 단백질을 유효성분으로 함유하는 것올 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방을 위한 화장료 조성물.

【청구항 13】

제 11항에 있어서， 중간엽 줄기세포가 인간의 지방， 태반, 제대혈， 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선， 완화 또는 예방을 위한 화장료 조성물.

【청구항 14】

제 11항에 있어서，

면역 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 화장료조성물.

【청구항 15】

제 11항 내지 제 14항 중 어느 한항에 있어서，

면역 관련 질환이 염증성 질환인 것을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 개선, 완화 또는 예방을 위한 화장료 조성물.

【청구항 16】

하기 단계를 포함하는 면역 반웅 억제 활성을 갖는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법 :

a) 중간엽 줄기세포로부터 단백질을 추출하는 단계; 및

b) 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 5 kDa 내지 1 , 000 kDa의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계.

【청구항 17】

제 16항에 있어서，

b) 단계가， 추출된 단백질을 크기별로 분리하여 5 kDa 내지 100 kDa의 크기를 갖는 단백질을 수득하는 단계인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법 .

【청구항 18]

제 16항 또는 제 17항에 있어서，

중간엽 줄기세포가 인간의 지방， 태반， 제대혈, 배아 줄기세포 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 유래 단백질을 제조하는 방법.