CN109803681A - 用于治疗免疫病症的免疫抑制组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开描述了一种药物组合物，所述药物组合物包含靶向选自以下的细胞因子中的一种或多种的至少一种抗体：巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)、白细胞介素‑1β(IL‑1β)、CCL‑1(I‑309)以及嗜酸性粒细胞趋化因子‑2(CCL24)；以及选自以下的至少一种间充质基质细胞衍生蛋白：前列腺素E2(PGE2)、骨保护素(OPG)、CCL7(MCP‑3)、CCL8(MCP‑2)、CCL20(MIP‑3α)、CXCL5(ENA‑78)、白细胞介素10(IL‑10)以及CXCL6(GCP‑2)。在优选的实施方案中，公开了一种包含抗CCL24抗体和CXCL5的组合物。本公开还描述了所述药物组合物用于治疗免疫疾病(例如同种免疫性疾病或自身免疫性疾病)的用途并且进一步公开了所述药物组合物用于免疫调节的用途。

Description

用于治疗免疫病症的免疫抑制组合物
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月19日提交的新加坡临时申请号10201606949Q的优先权益，该新加坡临时申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明大体上涉及分子生物学领域。具体来说，本发明涉及用于治疗免疫病症的组合物。
背景技术
间充质基质细胞(MSC)疗法已经被证实为有效例如调节免疫病症、同种免疫性疾病(在同种异体造血细胞移植之后的移植物抗宿主病(GVHD))以及自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、系统性硬化、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn's disease)等)。然而，MSC疗法试验仍面临关于无法预料的长期并发症、潜在的致瘤性以及不受控制地分化成不需要的细胞或组织类型的挑战。此外，使用人类间充质基质细胞引起了从不同来源分离的细胞和使用不同扩增方法的等同性的问题。
因此，需要间充质基质细胞(MSC)疗法的替代方案来治疗免疫疾病。
发明内容
在一个方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，其中所述抗体靶向选自由以下各项组成的组的细胞因子中的一种或多种：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。
在一个实例中，本申请公开了本文所述的药物组合物，其中所述药物组合物如下表中所示：
在另一个实例中，本申请公开了如本文所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL24抗体(C32a)。
在又另一个实例中，本申请公开了如本文所述的药物组合物，其中所述抗体以约0.05μg/ml至约5μg/ml的浓度存在。
在另一个实例中，本申请公开了如本文所述的药物组合物，其中所述抗体以约1μg/ml或约2μg/ml的浓度存在。
在一个实例中，本申请公开了如本文所述的药物组合物，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白以约0.5ng/ml至约75ng/ml的浓度存在。
在另一个实例中，本申请公开了如本文所述的药物组合物，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白以约10ng/ml或50ng/ml的浓度存在。
在另一个方面，本发明涉及治疗免疫病症的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和/或至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，其中所述抗体靶向选自由以下各项组成的组的细胞因子中的一种或多种：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。
在又另一个方面，本发明涉及一种调节免疫系统的方法，所述方法包括施用如本文所述的药物组合物。
在一个实例中，本申请公开了本文所述的方法，其中所述药物组合物如下表中所示：
在另一个实例中，本申请公开了如本文所述的方法，其中所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL24抗体(C32a)。
在又另一个实例中，本申请公开了如本文所述的方法，其中所述免疫病症是同种免疫性疾病或自身免疫性疾病。
在另一个实例中，本申请公开了如本文所述的方法，其中所述同种免疫性疾病选自由以下各项组成的组：在同种异体造血细胞移植之后的移植物抗宿主病(GVHD)、由皮肤移植引起的同种免疫性疾病、由肾移植引起的同种免疫性疾病、由肝移植引起的同种免疫性疾病以及胎儿和新生儿的溶血性疾病。
在又另一个实例中，本申请公开了如本文所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下各项组成的组：系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、系统性硬化、炎症性肠病(IBD)以及克罗恩氏病。
在另一个实例中，本申请公开了如本文所公开的方法，其中所述药物组合物在受试者中引起选自由以下各项组成的组的循环促炎性细胞因子中的一种或多种的浓度降低：IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-8、MIP-1β以及MCP-1。
在一个实例中，本发明公开了如本文所述的方法，其中所述药物组合物在受试者中引起至少一种间充质基质细胞衍生蛋白的浓度增加或降低，从而产生免疫抑制作用，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7、CCL8、CCL20、IL-10、CXCL5、CXCL6、M-CSF、IL-1β、CCL-1以及CCL24。
在另一个方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包括如本文所定义的至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白。
附图说明
在结合非限制性实施例和附图考虑时，通过参考详细说明将更好地理解本发明，在所述附图中：
图1示出了柱状图，其中数据表明BM-MSC的免疫抑制作用主要可归因于可溶性因子。使用1.6×105个两种HLA错配的UCB-MNC以15:1E/T比引发混合淋巴细胞反应(MLR)实验20小时。通过LDH检测来确定细胞介导的细胞毒性。使用具有8μm孔径的嵌套小室(transwell)插入物。插入物与孔底之间的不同距离是变化的。结果被表示为平均值±S.D.。对于多重比较，使用邦费罗尼检验(Bonferroni's test)来校正t检验的p值(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图2示出了细胞因子抗体阵列测定的图像，其中收集来自MLR、BM-MSC以及MLR和BM-MSC的培养物的上清液并且根据制造商的说明书施加到Raybio人类细胞因子抗体阵列G系列1000(含有120种细胞因子抗体)上。通过Axon Genepix 6.1扫描并且分析孵育的载片。通过白色框标记阳性对照孔和阴性对照孔，而通过灰色框(上调)和黑色框(下调)标记其中蛋白质表达水平有超过3倍变化的孔。
图3示出了剂量响应曲线，显示了每一种因子的最佳工作浓度的确定。(A-C)上调的因子的剂量响应曲线。(D)针对下调的因子的抗体的剂量响应曲线。在MLR系统上以15:1E/T比进行滴定20小时。通过LDH检测来确定细胞介导的细胞毒性。结果被表示为平均值±S.D.。
图4示出了柱状图，描绘了最佳可溶性因子混合物中使用的确定的因子的组合的功效的数据，这是通过系列析因设计实验(FD)来确定的。(A)在212部分FD中筛选全组12个因子(n＝1)。含有7个因子的条件6(C6)在阻遏细胞介导的细胞毒性方面比全组对照和MSC物理接触更有效(p<0.05)。(B)具有4个因子的第二27部分FD鉴定的C6在阻遏细胞介导的细胞毒性方面甚至比全组对照更有效(n＝3，p<0.05)。(C)在24完全FD中进一步测试这4个因子(n＝2)。与4因子全组对照相比，含有两个因子——CXCL5和抗CCL24抗体的C10在阻遏细胞介导的细胞毒性方面表现出等同的效果。当n≥2时，结果被表示为平均值±S.E.。当n<2时，结果被表示为平均值±S.D.。
图5示出了线图，描绘了在用CXCL5和抗CCL24抗体处理小鼠时的相对体重变化、对中性粒细胞和血红细胞计数的副作用以及肝脏和肾脏中的毒性。(A)体重变化。每周两次用CXCL5和抗CCL24抗体以逐渐增加的剂量处理NSG小鼠(在每组中使用3只小鼠)。(B和C)对中性粒细胞和血红细胞计数的副作用。对经过dPBS、CXCL5以及抗CCL24抗体处理的ICR小鼠进行取血，并且在处理后第1天、第3天、第7天以及第14天时进行血细胞计数(每组使用4只雄性小鼠)。(D和E和F)肝脏和肾脏毒性。在第0天、第4天以及第7天时用dPBS、CXCL5以及抗CCL24抗体处理ICR小鼠。在第1天、第5天以及第8天时收获通过面颊取血获得的小鼠外周血液和尿液。血浆中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST或SGOT)的浓度通过ALT和AST活性测定试剂盒测定。丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶这两者都是与肝脏相关的酶并且因此用作肝脏健康的临床标志物。通过小鼠白蛋白ELISA试剂盒和使用肌酸酐比色测定试剂盒的雅费氏反应(Jaffe's reaction)测定尿液中的白蛋白肌酸酐比(ACR)(每组使用3只雌性ICR小鼠)。
图6示出了线图，描绘了显示2F混合物处理(抗CCL24抗体和CXCL5)改善GVHD症状并且延长存活期的数据。中度GVHD小鼠的(A)临床评分和(B)存活率曲线(n＝5；NdPBS＝28只小鼠，N2F＝21只小鼠，NMSC＝21只小鼠，NCsA＝23只小鼠)。在重度GVHD模型中小鼠的(C)临床评分和(D)存活率曲线(n＝5；NdPBS＝30只小鼠，N2F＝21只小鼠，NMSC＝24只小鼠，NCsA＝23只小鼠)。结果被表示为平均值±SE。借助于广义估计方程(GEE)模型比较不同处理之间的总体趋势差异(*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001)。
图7示出了数据的线图和散点图，显示2F混合物(抗CCL24抗体和CXCL5)抑制了效应细胞的增殖和分化，但是不影响HSC重建。(A)外周血液中的效应细胞群体变化被示为线图。从第18天起每3天从尾部收获30μl-40μl的小鼠外周血液直到PT第36天为止。通过流式细胞术监测效应细胞群体变化。结果被表示为平均值±S.E.(n＝5)。(B)在PT第40天时脾脏和骨髓中的细胞群体变化被示为散点图。结果被表示为平均值和95％CI。
图8示出了线图，描绘了显示2F混合物(抗CCL24抗体和CXCL5)在抑制人类促炎性细胞因子方面优于MSC和CsA的数据。使用从小鼠外周血液中分离的血浆来通过使用17重人类细胞因子试剂盒的Luminex进行蛋白质测定。结果被表示为平均值±SD。借助于广义估计方程(GEE)模型比较不同处理的特征(对于多重比较，*，p<0.0167；**，p<0.0033)。
图9示出了线图和卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)，描绘了显示在重度GVHD模型中观测到的协同效应的数据。患有中度GVHD的小鼠的(A)临床评分和(B)卡普兰-迈耶存活率曲线(n＝5；NdPBS＝28只小鼠，N2F＝21只小鼠，NCXCL5＝23只小鼠，N抗CCL24＝23只小鼠)。患有重度GVHD的小鼠的(C)临床评分和(D)卡普兰-迈耶存活率曲线(n＝5；NdPBS＝30只小鼠，N2F＝21只小鼠，NCXCL5＝23只小鼠，N抗CCL24＝18只小鼠)。结果被表示为平均值±SE。借助于广义估计方程(GEE)模型比较不同处理之间的总体趋势差异(*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001)。
图10示出了表明单一因子在抑制人类效应细胞增殖和分化方面与2F混合物相当的数据。(A)示出了显示外周血液中的效应细胞群体变化的数据的线图。从第18天起每3天从尾部收获30μl-40μl的小鼠外周血液直到PT第36天为止。通过流式细胞术监测效应细胞群体变化。结果被表示为平均值±S.E.(n＝5)。(B)示出了表明在PT第40天时脾脏和骨髓中的细胞群体变化的数据点的散点图。结果被表示为平均值具95％CI(置信区间)的平均值。
图11提供了呈线曲线形式的数据，显示2F混合物的组分中的任一种足以抑制人类促炎性细胞因子。使用从小鼠外周血液中分离的血浆来通过使用17重人类细胞因子试剂盒的Luminex进行蛋白质测定。结果被表示为平均值±SD。借助于广义估计方程(GEE)模型比较不同处理的特征(对于多重比较，*，p<0.0167；**，p<0.0033)。
图12提供了显示2F混合物处理减轻SLE症状并且延长存活期的数据。(A)示出了在经过标准间充质基质细胞治疗(MSC)或2F混合物处理的小鼠中的卡普兰-迈耶存活率曲线(n＝4；NdPBS＝29只小鼠，N2F＝18只小鼠，NMSC＝18只小鼠)。(B)示出了在经过2F混合物或单一因子处理的小鼠中的卡普兰-迈耶存活率曲线(NdPBS＝29只小鼠，N2F＝18只小鼠，NCXCL5＝14只小鼠，N抗CCL24＝10只小鼠)。(C)示出了在经过单次或多次MSC注射处理的小鼠中的卡普兰-迈耶存活率曲线(NdPBS＝29只小鼠，NMSC-S＝18只小鼠，NMSC-M＝23只小鼠)。从(A)到(C)，显著性通过对数秩次检验计算为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；N.S意指没有显著性差异。(D)示出了线图，描绘了显示血浆自身抗体浓度的数据。结果被表示为平均值±SD。(E)示出了点图，描绘了显示Faslpr小鼠中淋巴组织增生减少的数据(*p<0.05)。(F)示出了线图，描绘了显示Faslpr小鼠中的尿白蛋白与肌酸酐的比率的数据。结果被表示为平均值±SD。(G)示出了通过苏木精和伊红(H&E)染色显示的肾脏中的淋巴细胞浸润。(H)至(J)在BM-MSC和2FC处理之后Faslpr小鼠中肠系膜淋巴结、脾脏以及胸腺效应细胞的平均数。结果由散点图以平均值表示(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
具体实施方式
虽然被证实为有效调节或治疗免疫病症，但是间充质基质细胞(也被称为间充质干细胞)疗法带有它们自身独特的一组不需要的副作用。本文公开了用于调节免疫应答(例如无法预料的长期并发症、潜在致瘤性以及不受控制地分化成不需要的细胞或组织)的方法和组合物。
如本文所用的术语“免疫病症”指的是与免疫系统的异常反应有关的病症。免疫病症可以被分为免疫缺陷、自身免疫性疾病以及超敏反应。因此，在一个实例中，免疫病症是同种免疫性疾病或自身免疫性疾病。
如本文所用的术语“同种免疫”或“同种免疫性”指的是对来自相同物种的成员的非自身抗原的免疫应答，所述非自身抗原被称作同种异体抗原或同族抗原。两种主要类型的同种异体抗原是血型抗原和组织相容性抗原。在同种免疫性中，身体产生针对同种异体抗原的抗体，从而攻击输入的血液、同种异体移植的组织，并且甚至在一些情况下攻击胎儿。同种免疫(同族免疫)应答引起移植排斥反应，其表现为移植物功能的恶化或完全丧失。相反，自身免疫性是对自己本身的抗原的免疫应答。(前缀同种意指“其它”，而前缀自身意指“自己”。)同种免疫(同族免疫)是变得具有同种免疫性的过程，即首次产生相关抗体。不受理论所束缚，认为同种免疫性是由供者和移植物受者的高度多态性基因的产物之间的差异引起的，该高度多态性基因主要是主要组织相容性复合体的基因。这些产物由T淋巴细胞和其它单核白细胞识别，它们浸润移植物并且对它造成损伤。
术语“自身免疫”或“自身免疫性”指的是其中生物体的免疫应答系统攻击它自身的健康细胞和组织的情况。由这样的异常免疫应答引起的任何疾病被称作自身免疫性疾病。显著的实例包括但不限于乳糜泻、1型糖尿病、类肉瘤病、系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦氏综合征(syndrome)、伴有多血管炎的嗜酸性肉芽肿病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves'disease)、特发性血小板减少性紫癜、艾迪生氏病(Addison's disease)、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、多发性肌炎(PM)以及皮肌炎(DM)。
一般来说，自身免疫性疾病或免疫病症常常用类固醇等治疗。目的是抑制异常的免疫应答，通常是使用免疫抑制剂，类固醇化合物属于所述免疫抑制剂。术语“免疫抑制(immune suppressive)”、“免疫抑制(immunosuppressive)”或“免疫抑制(immunosuppression)”指的是免疫系统的功效或激活/启动的减少。这可能影响或可能不影响免疫系统对抗感染的能力。免疫抑制可以由某些疾病，如AIDS或淋巴瘤引起，或可以由使用某些药物(如用于治疗癌症的一些药物)诱导或引起。免疫抑制也可以用药物有意诱导，例如在为骨髓移植或其它器官移植作准备时，目的在于预防宿主对移植物的排斥反应。免疫抑制也可以被称为免疫压抑。
自身免疫性疾病的另外的实例是但不限于心肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、抗肾小球基底膜肾炎、间质性膀胱炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎、抗合成酶综合征、斑秃、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性孕酮皮炎、自身免疫性荨麻疹、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、疱疹样皮炎、盘状红斑狼疮、后天性大疱性表皮松解症、结节性红斑、妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、线性IgA病(LAD)、硬斑病、寻常型天疱疮、急性痘疮样苔癣样糠疹、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、银屑病、系统性硬皮病、白癜风、艾迪生氏病、1型自身免疫性多内分泌腺综合征(APS)、2型自身免疫性多内分泌腺综合征(APS)、3型自身免疫性多内分泌腺综合征(APS)、自身免疫性胰腺炎(AIP)、自身免疫性甲状腺炎、奥德氏甲状腺炎(Ord'sthyroiditis)、格雷夫斯病、自身免疫性卵巢炎、子宫内膜异位症、自身免疫性睾丸炎、斯耶格伦氏综合征、自身免疫性肠病、乳糜泻、显微镜下结肠炎(microscopic colitis)、溃疡性结肠炎、抗磷脂综合征(APS、APLS)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、自身免疫性血小板减少性紫癜、冷凝集素病、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文斯综合征(evans syndrome)、阵发性睡眠性血红蛋白尿、恶性贫血、单纯红细胞再生障碍性贫血、血小板减少症、痛性肥胖症、成人发病型斯蒂尔氏病(adult-onset Still's disease)、强直性脊柱炎、CREST综合征、药物诱发性狼疮、附着点炎相关的关节炎、嗜酸性筋膜炎、费尔蒂综合征(Felty syndrome)、IgG4相关疾病、幼年型关节炎、莱姆病(Lyme disease)(慢性)、混合型结缔组织病(MCTD)、复发性风湿病、帕-罗二氏综合征(Parry Romberg syndrome)、帕森尼奇-特纳氏综合征(Parsonage-Turner syndrome)、银屑病关节炎、反应性关节炎、复发性多软骨炎、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、施尼茨勒综合征(Schnitzler syndrome)、未分化结缔组织病(UCTD)、皮肌炎、纤维肌痛、包涵体肌炎、肌炎、重症肌无力、神经性肌强直、副肿瘤性小脑退行、多发性肌炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性运动轴索性神经病变、抗N-甲基-D-天冬氨酸(抗NMDA)受体脑炎、巴洛同心圆性硬化(balo concentric sclerosis)、比克斯塔夫氏脑炎(Bickerstaff's encephalitis)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)、桥本氏脑病、特发性炎症性脱髓鞘疾病、朗-伊二氏肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、多发性硬化症(II型)、奥斯托兰综合征(Oshtoran Syndrome)、与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍(PANDAS)、进行性炎症性神经病变、不宁腿综合征、僵人综合征、西登哈姆舞蹈病(Sydenham chorea)、横贯性脊髓炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性葡萄膜炎、科根综合征(Cogan syndrome)、格雷夫斯眼病(Graves ophthalmopathy)、中间葡萄膜炎、木样结膜炎、莫伦氏溃疡(Mooren'sulcer)、视神经脊髓炎、斜视眼阵挛肌阵挛综合征、视神经炎、巩膜炎、苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)、交感性眼炎、托-亨二氏综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、自身免疫性内耳病(AIED)、美尼尔氏病(Ménière's disease)、白塞氏病嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、巨细胞性动脉炎、肉芽肿并多发性血管炎(GPA)、IgA血管炎(IgAV)、川崎氏病(Kawasaki's disease)、白细胞破碎性血管炎、狼疮性血管炎、类风湿性血管炎、显微镜下多血管炎(MPA)、结节性多动脉炎(PAN)、风湿性多肌痛、荨麻疹性血管炎、血管炎、原发性免疫缺陷以及克罗恩氏病。
在另一个实例中，免疫病症是但不限于心肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病以及克罗恩氏病。
免疫病症也可以通过受所述病症影响的器官和/或组织来分类。举例来说，受免疫病症影响的器官和组织类型是但不限于主要器官，如心脏、肾脏、肝脏、肺、皮肤；腺体，例如内分泌腺、肾上腺、多腺、胰腺、甲状腺；外分泌器官，如生殖器官、唾液腺；消化系统的器官；各种类型的组织，例如血液、结缔组织、全身组织和多器官组织、肌肉、神经系统、眼睛、耳朵以及血管系统。
术语“GVHD”也被称为移植物抗宿主病，如本文所用，指的是可能在干细胞或骨髓移植之后发生的医学并发症。在GVHD的情况下，新移植的供者细胞攻击移植受者的身体。GVHD可能在骨髓或干细胞移植之后发生，其中某人接受来自供者的骨髓组织或细胞。这种类型的移植被称作同种异体移植。新移植细胞将受者的身体视为外源的。当发生这种情况时，新移植的细胞会攻击受者的身体。当某人在移植期间接受他或她自己的细胞时，GVHD不会发生。这种类型的移植被称作自体移植。在移植之前，检查来自可能的供者的组织和细胞以查看它们与具有移植物的人匹配的紧密程度。当匹配紧密时，GVHD不太可能发生，或症状将是更轻微的。GVHD的概率在供者和受者有亲戚关系(related)时是约30％至40％并且在供者和受者无亲戚关系时是约60％至80％。存在两种类型的GVHD：急性和慢性。急性GVHD和慢性GVHD这两者中的症状从轻度到重度不等。急性GVHD通常在移植后的前6个月内发生，而慢性GVHD通常在移植后超过3个月开始，并且可以持续一生。
术语“SLE”指的是疾病“系统性红斑狼疮”，这是一种自身免疫性疾病，其中病因尚不完全已知。在这种疾病中，身体的免疫系统会错误地攻击健康组织并且可以影响皮肤、关节、肾脏、脑以及其它器官。SLE也可能由某些药物所引起。
不受理论所束缚，已经提出，间充质基质细胞(MSC；也被称为间充质干细胞)介导的免疫抑制经由旁分泌信号传导起作用，这包括多种可溶性因子，例如像转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10、肝细胞生长因子(HGF)、吲哚胺、双加氧酶(IDO)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)、TNF-a刺激基因/蛋白6(TSG-6)、血红素加氧酶-1(HO)、半乳糖凝集素-1以及HLA-G。因此，在本公开中证实的是，有可能使用影响旁分泌信号传导的可溶性因子，如MSC分泌蛋白质组(即由间充质基质细胞分泌的一群有效可溶性因子)中存在的那些来模拟MSC疗法的作用或甚至完全取代MSC疗法。
如本文所用的术语“MSC衍生的”或“间充质基质细胞衍生的”指的是从特定来源获得或衍生的物质。在本公开中，术语“间充质基质细胞”是多能基质细胞，其可以分化成多种细胞类型，包括但不限于成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(chondrocyte/cartilage cell)、肌细胞(肌肉细胞)以及脂肪细胞(脂细胞)。这些细胞由于它们的多能性也被称为“间充质干细胞”。这种生物学上重要的细胞群体能够支持造血，可以在体外沿着间充质和非间充质谱系分化，能够抑制同种应答并且似乎是非免疫原性的。已知这些细胞分泌某些蛋白质和/或化合物，这些蛋白质和/或化合物转而会影响细胞周围的微环境，或当本身不直接表达蛋白质时，已知间充质基质细胞影响其它蛋白质的下游表达，其例如可能受到间充质基质细胞的存在或不存在的影响。也就是说，在另一种细胞的环境内间充质基质细胞的存在可以引起其他细胞开始产生或甚至分泌某些蛋白质。因此，本文公开了化合物和/或蛋白质，它们由间充质基质细胞本身分泌并且因此被认为衍生自MSC，这是因为它们特定地从MSC中获得；以及由于细胞环境内间充质基质细胞的存在而产生和/或分泌的蛋白质和化合物。其中还包括由于微环境中间充质基质细胞的存在而经由一个或多个表达级联引发的蛋白质的下游表达。
因此，在一个实例中，本公开描述了药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白。在另一个实例中，所述药物组合物包含1种至12种抗体和蛋白质。在另一个实例中，所述药物组合物包含1种、2种、3种或4种抗体和1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种或8种蛋白质。在另一个实例中，所述药物组合物包含至少两种抗体和至少两种蛋白质。在一个实例中，如本文所公开的治疗方法包括使用至少一种抗体和/或至少一种间充质基质细胞衍生蛋白。在另一个实例中，如本文所公开的药物组合物包含至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，其中所述抗体靶向选自由以下各项组成的组的细胞因子中的一种或多种：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。
如本文所用的术语“系列析因设计”指的是一种类型的统计实验设计。存在两种类型的“析因设计”。一种是“完全析因设计”并且另一种是“部分析因设计”。在统计学中，完全析因设计是一种实验，其设计由两个或更多个因子组成，这些因子各自具有离散的可能值或“水平”，并且其实验单元采用所有这些因子的这些水平的所有可能组合。这样的实验允许研究人员研究每一个因子对响应变量的影响以及因子之间的相互作用对响应变量的影响。如果完全析因设计中的组合数量太高而在逻辑上不可行，那么可以进行部分析因设计，其中一些可能的组合(通常是至少一半)被省略。在本公开中，使用了两个部分析因设计和一个完全析因设计，因此本文用于描述所进行的分析实验的术语是“系列析因设计”。
如本文所公开，经由使用析因设计(FD)筛选MSC旁分泌分泌蛋白质组鉴定出两种间充质基质细胞(MSC)衍生因子，其在混合淋巴细胞反应(MLR)中表现出协同的免疫调节作用。
术语“混合淋巴细胞反应(MLR)”指的是离体细胞免疫测定，其在两个同种异体淋巴细胞群体(相同物种，但是在遗传上不同)之间发生。测定设置由从外周血液、胸腺、淋巴结或脾脏中纯化应答淋巴细胞以及将这些应答淋巴细胞与刺激细胞一起共培养组成。还含有T细胞的刺激细胞群体(也被称为双向混合淋巴细胞反应)将在应答细胞存在下复制，而在单向混合淋巴细胞反应中，通过辐照或用例如丝裂霉素C(mitomycin C)或DNA交联剂处理以防止细胞复制来防止刺激细胞复制。在研究中使用基于MLR细胞的测定以测试、测量和关联体外T细胞功能以及阐明细胞免疫功能。此外，MLR测定使得能够对参与MLR反应的淋巴细胞、辅助细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞等)以及细胞因子进行表征。
如本文所示，为了避免上述并发症，意图通过MSC分泌蛋白质组来复制和替代MSC免疫调节疗法。通过细胞因子抗体阵列筛选将对免疫抑制负责的十种MSC衍生的潜在可溶性因子纳入其中。它们中的六种(MIP-3α(CCL20)、MCP-3(CCL8)、ENA-78(CXCL5)、OPG、GCP-2(CXCL6)、MCP-2(CCL7))上调并且它们中的四种(M-CSF、IL-1β、I-309(CCL1)以及嗜酸性粒细胞趋化因子-2(CCL24))下调。
在一个实例中，所述抗体引起靶细胞因子的浓度降低。在一个实例中，所述靶细胞因子是但不限于以下一种或多种：M-CSF、IL-1β、I-309(CCL1)、嗜酸性粒细胞趋化因子-2(CCL24)。在另一个实例中，所述间充质基质细胞衍生蛋白引起PGE2、IL-10、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)或CXCL6(GCP-2)的增加。在又另一个实例中，所述抗体引起靶细胞因子的浓度降低；并且所述间充质基质细胞衍生蛋白引起PGE2、IL-10、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)或CXCL6(GCP-2)的增加。在另一个实例中，如本文所公开的药物组合物在受试者中引起至少一种间充质基质细胞衍生蛋白的浓度增加或降低，从而产生免疫抑制作用，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7、CCL8、IL-10、CCL20、CXCL5、CXCL6、M-CSF、IL-1β、CCL-1以及CCL24。
为了获得本申请中所公开的所期望的作用，在一个实例中，所述抗体靶向一种或多种细胞因子。在另一个实例中，所述一种或多种细胞因子是但不限于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)。
在一个实例中，所述蛋白质是间充质基质细胞衍生蛋白。在另一个实例中，所述间充质基质细胞衍生蛋白是但不限于PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。
如本文所用的术语“增加”和“降低”指的是与对照群体(例如无病细胞)中存在的相同靶标或特征相比或与整个群体相比，群体的亚群(例如患病细胞)中所选靶标或特征的相对改变。增加表示正尺度上的变化，而降低表示负尺度上的变化。如本文所用的术语“变化”也指的是与对照群体(例如来自无病受试者的样品)或整个群体中的相同性状或特征相比，分离的群体亚群(例如从患病患者获得的样品)的所选靶标或特征之间的差异。然而，该术语没有评价所看到的差异。在适用的情况下，术语“增加”和“降低”可以用术语“上调”和“下调”替代，例如在提到例如基因和蛋白质的表达谱的变化时。
抑制这些下调的蛋白质中的任一种或促进这些上调的蛋白质中的任一种不能完全模拟MSC的免疫抑制能力，这表明MSC经由因子的相互作用网络调节免疫反应。经由系列析因设计(FD)，最终建立了包含CXCL5和抗CCL24抗体的双因子(2F)混合物。它在MLR(一种体外GVHD模型)中表现出协同的免疫调节作用。在改善GVHD和SLE症状以及提高存活率方面，它也显示出优异的体内免疫抑制作用。这种所鉴定的2F混合物可以是免疫病症疗法中MSC的潜在化学成分确定的替代物。
因此，在第一个方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，其中所述抗体靶向一种或多种细胞因子，其中所述细胞因子是但不限于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；其中所述间充质基质细胞衍生蛋白是但不限于PGE2(前列腺素E2)、IL-10、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)以及CXCL6(GCP-2)。
在一个实例中，一种或多种抗体是抗CCL1或抗CCL24或这两者，而所述一种或多种间充质基质细胞衍生蛋白如本文所定义。在另一个实例中，一种或多种抗体如本文所公开，而所述一种或多种间充质基质细胞衍生蛋白是但不限于CXCL5和OPG。在一个实例中，一种或多种抗体是抗CCL1或抗CCL24或这两者，而所述一种或多种间充质基质细胞衍生蛋白是OPG或CXCL5或这两者。在一个实例中，所述抗体是2μg/ml浓度的抗CCL1，并且所述一种或多种间充质基质细胞衍生蛋白是OPG或CXCL5或这两者。在另一个实例中，所述抗体是2μg/ml浓度的抗CCL24，并且所述一种或多种间充质基质细胞衍生蛋白是OPG或CXCL5或这两者。在另一个实例中，所述抗体是抗CCL24和抗CCL1，这两者各自的浓度是2μg/ml，并且所述一种或多种间充质基质细胞衍生蛋白是OPG或CXCL5或这两者。在一个实例中，所述一种或多种抗体是抗CCL1或抗CCL24或这两者，并且所述间充质基质细胞衍生蛋白是10ng/ml浓度的OPG。在一个实例中，所述一种或多种抗体是抗CCL1或抗CCL24或这两者，并且所述间充质基质细胞衍生蛋白是50ng/ml浓度的CXCL5。在又一个实例中，所述一种或多种抗体是抗CCL1或抗CCL24或这两者，并且所述间充质基质细胞衍生蛋白是10ng/ml浓度的OPG和50ng/ml浓度的CXCL5。
在一个实例中，所述药物组合物可以包含如下表1中所提供的组分，其中在一个实例中，所述药物组合物是除C24a至C27a之外的任何组合物。在另一个实例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物如下表1中所示。
表1：各种组合物的列表
在一个实例中，所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL24抗体(C32a)。
因此，在一个实例中，所述药物组合物是根据如表3中所示的C2至C16中的任一种。在一个实例中，所述药物组合物包含CXCL5、抗CCL1、抗IL-1β、抗M-CSF以及抗CCL24(C2a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CCL8、CCL7、OPG、IL-10以及抗CCL24(C3a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CCL8、CCL7、OPG、IL-10、CXCL5、抗CCL1、抗IL-1β以及抗M-CSF(C4a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CCL20、CCL6、OPG、IL-10、抗IL-1β以及抗M-CSF(C5a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CCL20、CXCL6、OPG、IL-10、CXCL5、抗CCL1以及抗CCL24(C6a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CCL20、CXCL6、CCL8、CCL7、抗IL-1β、抗M-CSF以及抗CCL24(C7a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CCL20、CXCL6、CCL8、CCL7、CXCL5以及抗CCL1(C8a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CXCL6、CCL7、IL-10、抗CCL1以及抗M-CSF(C9a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CXCL6、CCL7、IL-10、CXCL5、抗IL-1β以及抗CCL24(C10a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CXCL6、CCL8、OPG、抗CCL1、抗M-CSF以及抗CCL24(C11a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CXCL6、CCL8、OPG、CXCL5以及抗IL-1β(C12a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CCL20、CCL7、OPG、抗CCL1以及抗IL-1β(C13a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CCL20、CCL7、OPG、CXCL5以及抗M-CSF和抗CCL24(C14a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CCL20、CCL8、IL-10、抗CCL1、抗IL-1β以及抗CCL24(C15a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CCL20、CCL8、IL-10、CXCL5以及抗M-CSF(C16a)。
在另一个实例中，所述药物组合物是根据如表4中所示的C17至C23中的任一种。在一个实例中，所述药物组合物包含CXCL5、CXCL6、抗CCL1以及CCL20(C17a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含IL-10、OPG、抗CCL1以及CCL20(C18a)。在一个实例中，所述药物组合物包含CXCL5、CXCL6、IL-10以及OPG(C19a)。在一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、CXCL6、OPG以及CCL20(C20a)。在一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、CXCL5、OPG以及抗CCL1(C21a)。在一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、CXCL6、IL-10以及CCL1(C22a)。在一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、CXCL5、IL-10以及CCL20(C23a)。
在另一个实例中，所述药物组合物是根据如表5中所示的C24至C38中的任一种。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24和抗CCL1(C28a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含OPG和抗CCL1(C29a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL1(C30a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24和OPG(C31a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24和CXCL5(C32a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含OPG和CXCL5(C33a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、抗CCL1以及OPG(C34a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、抗CCL1以及CXCL5(C35a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含OPG、CXCL5以及抗CCL1(C36a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、OPG以及CXCL5(C37a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含抗CCL24、抗CCL1、OPG以及CXCL5(C38a)。在另一个实例中，所述药物组合物包含PGE2、CCL20、CXCL6、CCL8、CCL7、OPG、IL-10、CXCL5、抗CCL1、抗IL1b、抗M-CSF以及抗CCL24(如表3中所示的全组)。
如本领域技术人员所将了解的是，本文公开的单个组分的浓度将以能够或产生所期望的作用的浓度存在，所述所期望的作用是调节宿主免疫系统。
因此，在一个实例中，所述药物组合物如本文所公开，其中所述抗体以如下浓度存在：约0.05μg至5μg、0.05μg至0.7μg、0.5μg/ml至约5μg/ml、约1μg/ml至约2μg/ml、约2μg/ml至约3.5μg/ml、约4μg/ml至约5μg/ml、约3μg/ml至约4.5μg/ml、约0.05μg、约0.1μg、约0.25μg、约0.5μg/ml、约0.75μg/ml、约1μg/ml、约1.25μg/ml、约1.5μg/ml、约2.25μg/ml、约2.5μg/ml、约2.75μg/ml、约3.75μg/ml或约4.8μg/ml。在一个实例中，所述抗体以约1μg/ml或约2μg/ml的浓度存在。药物组合物中每一种抗体的浓度独立地根据所述药物组合物的所有其它组分来选择。在一个实例中，抗IL-1β、抗M-CSF的浓度独立地小于3μg/ml、小于2μg/ml或小于1.5μg/ml。在另一个实例中，抗CCL1和抗CCL24的浓度独立地小于6μg/ml、小于5μg/ml或小于2.5μg/ml。
在一个实例中，所述药物组合物如本文所公开，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白以如下浓度存在：约0.5ng/mg至约75ng/ml、约0.5ng/ml至约10ng/ml、约0.5ng/ml至约1ng/ml、约0.75ng/ml至约5ng/ml、5ng/ml至约75ng/ml、约10ng/ml至约50ng/ml、约20ng/ml至约40ng/ml、约30ng/ml至约65ng/ml、约40ng/ml至约55ng/ml、约0.5ng/ml、约1ng/ml、约5ng/ml、约8ng/ml、约9ng/ml、约10ng/ml、约15ng/ml、约25ng/ml、约34ng/ml、约40ng/ml、约45ng/ml、约50ng/ml、约55ng/ml、约58ng/ml、约65ng/ml或约70ng/ml。在另一个实例中，所述间充质基质细胞衍生蛋白以约10ng/ml或50ng/ml的浓度存在。药物组合物中每一种间充质基质细胞衍生蛋白的浓度独立地根据所述药物组合物的所有其它组分来选择。在一个实例中，CCL20、CCL8、CCL7、CXCL6、CXCL5、OPG以及IL-10中的每一种的浓度独立地小于60ng/ml、小于50ng/ml或小于30ng/ml。如图3中所示，如果在实验分析期间添加超过50ng/ml的蛋白质，那么单个蛋白质的免疫抑制作用将达到稳定水平。
在一个实例中，所述药物组合物包含约5μg/ml至约15μg/ml的浓度的CXCL6、OPG和IL-10；约45μg/ml至55μg/ml的浓度的CXCL5和CCL20；以及约1μg/ml至2.5μg/ml的浓度的抗CCL1和抗CCL24。在另一个实例中，所述药物组合物包含约10μg/ml的浓度的CXCL6、OPG和IL-10；约50μg/ml的浓度的CXCL5和CCL20；以及约2μg/ml的浓度的抗CCL1和抗CCL24(C6；也被称为7F)。在一个实例中，所述药物组合物包含约1μg/ml至2.5μg/ml的浓度的抗CCL24和抗CCL1；约45μg/ml至55μg/ml的浓度的CXCL5；以及约5μg/ml至15μg/ml的浓度的OPG。在另一个实例中，所述药物组合物包含约2μg/ml的浓度的抗CCL24和抗CCL1；约50μg/ml的浓度的CXCL5；以及约10μg/ml的浓度的OPG(C21)。在一个实例中，所述药物组合物包含1μg/ml至2.5μg/ml范围的抗CCL24和40ng/ml至60ng/ml范围的CXCL5。在另一个实例中，所述药物组合物包含2μg/ml的浓度的抗CCL24和50ng/ml的浓度的CXCL5(C32)。
本文还公开了治疗免疫病症的方法。在一个实例中，所述治疗免疫病症的方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和/或至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，其中所述抗体靶向选自由以下各项组成的组的细胞因子中的一种或多种：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。因此，在一个实例中，免疫病症是同种免疫性疾病或自身免疫性疾病。在一个实例中，所述同种免疫性疾病选自由以下各项组成的组：在同种异体造血细胞移植之后的移植物抗宿主病(GVHD)、由皮肤移植引起的同种免疫性疾病、由肾移植引起的同种免疫性疾病、由肝移植引起的同种免疫性疾病以及胎儿和新生儿的溶血性疾病。在另一个实例中，所述自身免疫性疾病选自由以下各项组成的组：系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病以及克罗恩氏病。
在一个实例中，所述方法包括施用如本文所定义的药物组合物。在另一个实例中，本文公开了调节免疫系统的方法，所述方法包括施用如本文所定义的药物组合物。在另一个实例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物在受试者中引起至少一种间充质基质细胞衍生蛋白的浓度增加或降低，从而产生免疫抑制作用，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白是但不限于PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7、CCL8、CCL20、CXCL5、CXCL6、M-CSF、IL-1β、CCL-1以及CCL24。在另一个实施例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物在所述受试者中引起一种或多种循环促炎性细胞因子的浓度降低，其中所述细胞因子是但不限于IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-8、MIP-1β以及MCP-1。在一个实例中，所述方法包括施用包含CXCL5和抗CCL24抗体的药物组合物(C32a)。
在一个实例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物是根据如表3中所示的C2至C16中的任一种。在另一个实例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物是根据如表4中所示的C17至C23中的任一种。在又另一个实例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物是根据如表5中所示的C24至C38中的任一种。在另一个实例中，所述方法如本文所公开，其中所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL24抗体(例如表5中的C32或表1中的C32a)。
所鉴定的包含CXCL5和抗CCL24抗体的2因子“2F”混合物在改善GVHD和系统性红斑狼疮(SLE)症状以及提高存活率方面也显示出体内免疫抑制作用。在GVHD中，它被显示为减少循环中的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、Th1细胞、Th17细胞、自然杀伤(NK)细胞和脾脏中的巨噬细胞，但是不影响骨髓中的人类造血干细胞(HSC)重建。同时，它被显示为减少循环中的促炎性细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-8、MIP-1β以及MCP-1。在SLE中，它被显示为减少辅助性T细胞、树突状细胞(DC)、单核白细胞和/或巨噬细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。不受理论所束缚，这些结果表明所述2F混合物通过抑制多种效应细胞的增殖和分化并且减少一群促炎性细胞因子的分泌来模拟MSC的免疫调节作用。
因此，在一个实例中，所述药物组合物如本文所公开，其中所述药物组合物引起至少一种细胞类型的存在减少，所述细胞类型是但不限于患GVHD受试者的循环细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、辅助T细胞1(Th1)细胞、辅助T细胞17(Th17)细胞和自然杀伤(NK)细胞以及受试者的脾巨噬细胞和NK细胞；患SLE受试者的辅助性T细胞、DC、单核白细胞/巨噬细胞以及NK细胞。
ENA-78(上皮衍生的中性粒细胞激活蛋白78，也被称为CXCL5)是CXC趋化因子的成员并且经由CXCR2受体充当中性粒细胞的强效化学引诱剂和激活剂。中性粒细胞在传统上被认为是不会再循环的短寿命(6小时-8小时)的终末分化细胞。具有功能和表型异质性的不同中性粒细胞亚群的潜在存在尚未被广泛地考虑或研究。然而，越来越多的证据现在正在挑战这种情况，并且存在显著的证据表明在生理状态和病理状态下不同中性粒细胞亚群的存在。在由创伤或败血病引发的严重全身性炎症中，中性粒细胞发挥关键的作用。它们在败血病的最初炎症阶段期间导致附带组织损伤。然而，大部分的死亡发生在所述疾病的后期代偿性抗炎反应阶段期间，当患者发生免疫抑制并且死于另外的感染时。后者表明尽管有显著的中性粒细胞增多，但是宿主是免疫力低下的并且更容易被感染，这表明了中性粒细胞的效应功能的改变。在其中，揭示了全身性LPS引起先前未描述的中性粒细胞亚群的存在，所述中性粒细胞亚群的特征在于独特的CD16亮CD62L暗表型，这在遭受严重损伤的患者中也检测到。该中性粒细胞亚群表现出分叶过多的核形态、增加的产生ROS的能力和抑制性T细胞增殖(经由Mac-1的表达)以及局部释放的ROS依赖性T细胞增殖抑制。
嗜酸性粒细胞趋化因子-2(嗜酸性粒细胞趋化蛋白-2，也被称为CCL24)是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。CCL24与趋化因子受体CCR3相互作用并且对嗜酸性粒细胞、静息T细胞以及嗜碱性粒细胞发挥它的活性。嗜酸性粒细胞趋化因子已经被充分证实了它在过敏性疾患(如哮喘和鼻炎)和特征在于嗜酸性粒细胞积聚的其它炎症性病症(炎症性肠病、特应性皮炎以及疱疹样皮炎)中经由释放活性氧簇(ROS)和诱导嗜碱性粒细胞中的组胺和LTC-4脱颗粒起作用。它已经被提出作为治疗靶标以使用针对嗜酸性粒细胞趋化因子的抗体或使用修饰的趋化因子、CCR3的小分子特异性拮抗剂以及抗CCR3抗体干扰嗜酸性粒细胞趋化因子受体来治疗这些疾患。
不受理论所束缚，基于这两种趋化因子的生物特性，有可能理解抗CCL24抗体的免疫抑制能力。证实抗CCL24抗体抑制T细胞的增殖，特别是对于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、Th1以及Th17细胞来说。这三个细胞群体的减少引起IFN-γ分泌的减少。因此，自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞的增殖以级联方式进一步减少。所有这些阻遏的效应细胞都有助于免疫抑制。然而，在本申请中发现的趋化因子CXCL5的免疫抑制作用似乎与对CXCL5的作用的一般理解相反。通常，CXCL5是中性粒细胞化学引诱剂并且如果它的浓度增加，那么将募集更多的中性粒细胞。然而，如本文所示，CXCL5抑制多种效应细胞的增殖，并且减少促炎性细胞因子分泌。不受理论所束缚，认为CXCL5经由三种可能的机制发挥它的免疫抑制功能：(1)通过静脉内注射瞬间增加血液中CXCL5的浓度可以逆转血液(高)与炎症组织(低)之间的趋化因子梯度。这有助于将浸润的中性粒细胞和巨噬细胞从炎症组织募集回到血液中并且释放组织中的炎症负担。该概念已经通过如本文所示的GVHD小鼠的皮肤、肠以及肾脏中更少的淋巴细胞浸润所印证。(2)CXCL5可以有助于促进免疫抑制性中性粒细胞的增殖。该中性粒细胞亚群的特征在于独特的CD16亮CD62L暗表型并且已经在遭受严重损伤的患者中显示出免疫抑制能力。该中性粒细胞亚群表现出分叶过多的核形态、增加的产生ROS的能力和抑制性T细胞增殖(经由Mac-1的表达)以及局部释放的ROS依赖性T细胞增殖抑制。在本文所示的异种移植物GVHD模型中，在两轮冷冻/解冻处理之后在冷冻保存的PBMC中没有活的粒细胞。因此，在短期GVHD小鼠模型中，由于动物模型本身的限制而没有人类中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞被移植。然而，当用2FC处理小鼠时，观测到不同的小鼠免疫抑制性中性粒细胞(Ly6G+CD11b+)群体(数据未示)。这种高度促进的小鼠免疫抑制性中性粒细胞也可能有助于改善GVHD症状并且提高小鼠存活率。(3)CXCL5经由其它免疫细胞类型与抗CCL24协同抑制免疫反应。在体外筛选模型中，使用两种HLA错配的单核细胞建立MLR，其中通过Ficoll-paque分离去除粒细胞。即使没有中性粒细胞参与反应，仍然筛选出CXCL5作为关键的免疫调节剂。不受理论所束缚，该结果表明CXCL5经由其它免疫细胞类型发挥它的免疫抑制功能。
本公开还描述了试剂盒，所述试剂盒包括如本文所定义的至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白。
如本文和上文所述的肽、抗体或药物组合物可以被配制成适用于施用的组合物。在适用的情况下，肽和/或抗体可以与药学上可接受的载体一起施用。“载体”可以包括任何药学上可接受的载体，只要所述载体可以与制剂的其它成分相容并且对患者无害即可。因此，供使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规的方式配制，所述载体包括赋形剂和辅剂，它们有助于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。因此，在一个实例中，本公开描述了药物组合物，所述药物组合物包含但不限于如本文所述的至少一种肽和如本文所述的至少一种抗体。在一个实例中，所述药物组合物包含如本文所述的肽。在另一个实例中，所述药物组合物包含如本文所述的抗体。在又另一个实例中，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、媒介物或载体。因此，在一个实例中，如本文所公开的肽还可以包含选自但不限于药学上可接受的载体、脂质体载体、赋形剂、佐剂或其组合的化合物。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂以及其它合适的添加剂，诸如但不限于渗透增强剂、载体化合物以及其它药学上可接受的载体或赋形剂。在一个实例中，本文所述的药物组合物被配制用于肠胃外施用。在另一个实例中，本文所述的药物组合物被配制用于静脉内施用。在另一个实例中，所述药物组合物被配制成混合物，其中例如每一种化合物单独提供以在施用之前不久混合。
如本文所述的组合物包括但不限于溶液、乳液以及含有脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包括但不限于预制液体、自乳化固体以及自乳化半固体。
可以方便地以单位剂型存在的如本文所述的制剂可以根据制药工业中公知的常规技术来制备。这样的技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或一种或多种赋形剂缔合的步骤。一般来说，所述制剂是通过使活性成分与液体载体或微细的固体载体或这两者均匀地和紧密地缔合，然后，如果需要的话，使产物成形来制备的。
如本文所公开的药物组合物的剂型的组成、形状以及类型通常将根据预期用途而变化。举例来说，用于急性治疗疾病或相关疾病的剂型可以含有比用于长期治疗相同疾病的剂型更大量的它所包含的活性化合物中的一种或多种。类似地，肠胃外剂型可以含有比用于治疗相同疾病或病症的口服剂型更少量的它所包含的活性化合物中的一种或多种。其中由本发明所涵盖的具体剂型将彼此不同的这些和其它方式对于本领域技术人员来说将是显而易见的。剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，如软弹性明胶胶囊；扁囊剂；锭剂；糖锭；分散剂；栓剂；软膏剂；泥罨剂(泥敷剂)；糊剂；粉剂；敷料；乳膏剂；膏药；溶液；贴剂；气溶胶(例如喷鼻剂或吸入剂)；凝胶剂；适用于向患者口服或粘膜施用的液体剂型，包括悬浮液(例如水性或非水性液体悬浮液、水包油乳液或油包水液体乳液)、溶液以及酏剂；特别适用于向患者肠胃外施用的液体剂型；以及可以复原以提供适用于向患者肠胃外施用的液体剂型的无菌固体(例如结晶固体或无定形固体)。因此，在一个实例中，如本文所公开的药物组合物是以选自但不限于以下的形式提供的：片剂、囊片、胶囊、硬胶囊、软胶囊、软弹性明胶胶囊、硬明胶胶囊、扁囊剂、锭剂、糖锭、分散剂、栓剂、软膏剂、泥罨剂、泥敷剂、糊剂、粉剂、敷料、乳膏剂、膏药、溶液、可注射溶液、贴剂、气溶胶、喷鼻剂、吸入剂、凝胶剂、悬浮液、水性液体悬浮液、非水性液体悬浮液、水包油乳液、油包水液体乳液、溶液、无菌固体、结晶固体、无定形固体、用于复原的固体或其组合。
给药取决于待治疗的疾病状态的严重程度和响应性，治疗过程持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻为止。最佳的给药方案可以根据患者体内药物积聚或其代谢物的测量来计算。施用医师可以容易地确定最佳剂量、给药方法以及重复率。最佳剂量可以根据组合物的相对效力而变化，并且一般可以基于算术平均值，例如基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50值或基于本文所述的实施例来估计。一般来说，根据本公开的药物组合物的剂量是每公斤体重约0.01μg至100g，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师可以基于所测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度来估计给药的重复率。在成功治疗后，可能期望使受试者接受维持疗法以预防疾病状态的复发，其中以每公斤体重0.01μg至100g范围的维持剂量施用所述组合物，每天施用一次或多次到每2年施用一次。
如上所述，本领域技术人员将能够基于例如疾病严重程度确定实现所期望的临床作用所需的剂量和给药方案。以下用作静脉内注射的说明性实例，其可以根据其它施用方式的需要进行修改。在一个实例中，如本文所公开的方法将作为至少一次注射向受试者施用。在一个实例中，可以在任何给定时间向患者施用不止一次注射。在又另一个实例中，如本文所公开的方法可能需要在指定的治疗时间范围或方案内向患者不止一次施用单次注射。在又另一个实例中，如本文所公开的方法可能需要在指定的治疗时间范围或方案内向患者不止一次施用超过两次或更多次注射。这意味着，根据临床要求，受试者可以被给予呈注射形式的初始治疗，其中随后可以例如3天、7天、每周、2周、每两周、1个月、每月、每季度、每半年、每年或更长时间的时间间隔进行进一步治疗，这取决于被设计用于所述受试者的治疗。如果需要的话，本文公开的方法也可以与其它药物或药物组合物作为组合疗法使用。
还值得注意的是，例如单因子治疗的功效取决于在治疗开始时待治疗的疾病的严重程度。举例来说，基于例如GVHD的临床上已知的严重程度评分，发现使用例如抗CCL24治疗GVHD的功效取决于待治疗的GVHD的严重程度。也就是说，如果GVHD被认为是轻度的或中度的，那么单一化合物治疗是有效的。然而，当待治疗的GVHD的严重程度例如被认为是重度时，单一化合物治疗(例如单独的抗CCL24)被认为不再有效到足以显示出例如疾病缓解或炎症标志物的减少。因此，在免疫疾病的这些重度病例中，本领域技术人员可以考虑使用超过一种如本文所公开的化合物或药物组合物。
本文说明性描述的发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的和所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的其中所体现的发明的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。
在整个本公开中，某些实施方案可以范围的形式被公开。应当了解的是，呈范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁起见并且不应当被理解成对所公开范围的范围的硬性限制。因此，对范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。举例来说，对诸如1至6的范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何，这均适用。
本发明已经在本文中被广泛地并且一般地描述。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明本发明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。
其它实施方案落入以下权利要求和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。
实验部分
细胞制备
使用确立的方案，用Ficoll-paque plus(密度1.077g/l，通用电气医疗公司(GEHealthcare))从获自新加坡脐带血库(Singapore Cord Blood Bank)的新鲜脐带血中分离脐带血单核细胞(UCB-MNC)。
从健康供者(新加坡中央医院的血液科(Singapore General Hospital,Department of Hematology))的BM穿刺液中获得骨髓(BM)-MSC。将它在补充有20％热灭活胎牛血清(FBS)(Gibco公司)的杜氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's modified Eagle'sMedium，DMEM)中培养在37℃、5％CO2孵育箱中。在48小时之后去除非贴壁细胞，并且维持贴壁细胞，其中每3天-4天更换培养基直到达到90％-100％汇合度为止。使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)将它以1:3比率传代并且仅使用10代之前的细胞。
从健康供者(新加坡中央医院的血液科储存库)获得人类冷冻保存的外周血液单核细胞(PBMC)。
在混合淋巴细胞反应(MLR)中MSC的免疫抑制
MLR用作体外GVHD模型并且通过将两种HLA错配的UCB-MNC以15:1的效应细胞/靶细胞(E/T)比在StemSpanTM培养基(干细胞技术公司(Stem Cell Technologies))中在37℃、5％CO2孵育箱中共培养20小时来引发。使用BM-MSC通过在不使用嵌套小室插入物(即物理直接接触)或使用嵌套小室插入物(即经由两种分泌蛋白质组的间接双向调节)的情况下进行共培养来处理或用BM-MSC条件培养基处理混合的淋巴细胞(ML)。将嵌套小室插入物放置在孔底上方0.5mm和0.9mm处，并且使用1日龄BM-MSC培养基作为条件培养基(1d-CM)。使用未处理的MLR作为阴性对照以设定MLR的细胞介导的细胞毒性基线。通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(罗氏公司(Roche))测量细胞介导的细胞毒性。遵循试剂盒说明书，将检测板在暗处于室温孵育20分钟，并且使用Benchmark Plus微孔板分光光度计(伯乐公司(Bio-Rad))在490nm测量吸光度并使用650nm作为参考波长。
检测MSC调节的细胞因子
在20小时孵育之后，收集来自ML、BM-MSC以及ML和BM-MSC的培养物的上清液并且以400g离心10分钟。使用人类细胞因子抗体阵列G系列1000(含有120种细胞因子抗体)，根据制造商的说明书分析上清液。通过Axon Genepix 6.1扫描并且分析孵育的载片。
通过FD鉴定MSC分泌蛋白质组中的关键因子
单独地滴定十二种分子(六种上调的蛋白质：OPG、CCL7、CCL8、CCL20、CXCL5和CXCL6；四种针对下调的蛋白质的抗体：M-CSF、IL-1β、CCL-1和CCL24；以及两种对照分子：IL-10和PGE2(R&D系统公司(R&D systems))。所有蛋白质和抗体都购自派普泰克公司(Peprotech)。对于每一种分子，使用引起对MLR的细胞毒性的最大阻遏的最低工作浓度进行进一步分析。为了确定所关注的细胞因子的最佳组合，将这十二种分子排列成212部分FD表(表3)。十二个因子具有两个水平。水平-1意指没有添加这种所关注的分子，水平-2意指以最佳工作浓度添加这种所关注的分子。没有添加任何所关注的分子的条件-1用作阴性对照；添加了全组所关注的分子的条件-16和设置在MSC上的MLR分别用作阳性对照。
基于最大程度减弱细胞介导的细胞毒性，从212部分FD中的条件-6导出另一个27部分FD(表4)，其包括IL-10、OPG、CXCL5、CXCL6、CCL20、抗CCL1以及抗CCL24。
类似地，从27部分FD中的条件-6进一步导出24完全FD(表5)，其包括OPG、CXCL5、抗CCL1以及抗CCL24。
最大耐受剂量(MTD)研究
在每周的第1天和第3天通过静脉内(IV)注射向8周-10周大的健康NSG小鼠施用两次剂量的抗CCL24抗体和CXCL5趋化因子。在每周开始时逐渐增加注射剂量(表6)。每隔一天监测小鼠体重和存活率，持续连续30天。
小鼠
非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷IL2Rγnull(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，NSG)小鼠和MLR/MpJ-Faslpr/J(Faslpr)小鼠购自杰克逊实验室公司(JacksonLaboratories)。将小鼠饲养在新加坡保健集团实验医学中心(SingHealth ExperimentalMedicine Centre)并且所有动物实验都是在新加坡保健集团机构动物护理和使用委员会(SingHealth Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的批准下进行的。对于GVHD诱导，所有实验中使用的NSG小鼠的年龄都是8周-10周。对于SLE，仅使用雌性Faslpr小鼠并且疾病自发的平均年龄是约(14-16)周大。
GVHD诱导和处理
分别通过经由尾静脉进行静脉内注射向NSG小鼠注射200×106个细胞/公斤和400×106个细胞/公斤的人类冷冻保存的PBMC来诱导中度和重度异种GVHD小鼠模型。在移植之前3小时-4小时向小鼠给予240cGy的辐照。NSG小鼠在移植后(PT)10天-12天时显示出GVHD的发作。因此，在PT第10天、第14天、第17天以及第21天时给予用2F混合物、单一形式的CXCL5和抗CCL24抗体进行的处理。使用接受dPBS注射的NSG小鼠作为阴性对照。使用接受BM-MSC(10×106个细胞/公斤，在第10天单次注射)和CsA(15mg/kg，诺华公司(Novartis))注射的小鼠作为阳性对照。将注射体积相对于小鼠的体重归一化。每天监测小鼠存活率，同时每三天一次进行临床评分。从第18天起每3天一次从尾静脉收集30μl-40μl的小鼠外周血液(PB)直到处理后第36天为止。使用小鼠血浆以及来自PB、骨髓和脾脏的分离的细胞进行luminex测定(伯乐公司)和流式细胞术分析(CyAN，贝克曼库尔特公司(Beckmancoulter))。如本文所用的术语“PT”表示人类PBMC的移植后。在第0天时，将人类PBMC移植到NSG小鼠体内以产生参考的GVHD模型。GVHD的发作发生在PT约第10天至第12天。在PT第10天、第14天、第17天以及第21天时开始对患病小鼠进行处理，并且在PT第18天、第21天、第24天、第27天、第30天、第33天以及第36天时从小鼠获取样品。
系统性红斑狼疮(SLE)处理
对于淋巴组织增生自发突变纯合的MLR/MpJ-Faslpr/J(Faslpr)小鼠显示出全身性自身免疫、与异常T细胞增殖相关的巨大淋巴结病、关节炎以及免疫复合物性肾小球肾病。由于Faslpr小鼠与SLE患者之间的表现相似性，因此可以使用Faslpr小鼠作为SLE小鼠模型。
Faslpr小鼠平均在约16周大时自动显示出疾病发作。向16周大的小鼠给予10次每周一次的2FC处理。向16周大(16w)的雌性Faslpr小鼠每周一次给予十四次剂量的2F混合物处理。使用5-10×106个细胞/公斤的BM-MSC和dPBS作为阳性对照和阴性对照。通过小鼠存活率、肾功能的改善以及自身抗体分泌的减少来评价2F混合物在SLE中的功效。对14w、18w、22w、26w以及30w大的小鼠收集小鼠血浆和尿液。通过抗dsDNA Ig的(A+G+M)ELISA试剂盒(alpha diagnostic international公司)测量自身抗体分泌。通过尿白蛋白与肌酸酐的比率(ACR)评估肾功能。小鼠白蛋白ELISA试剂盒来自艾博抗公司(abcam)，肌酸酐比色测定试剂盒来自开曼化学品公司(Cayman chemical)。自身抗体和ACR检测遵循由制造商提供的标准方案。
临床和组织学评分
每天监测小鼠存活率并且每三天一次监测临床评分(针对GVHD)。临床GVHD指数的评估是基于五个参数：体重减轻、姿势、活动、皮毛质地以及皮肤完整性，从而得到10的最大指数。在处理后第30天时的实验终点时，使用苏木精和伊红(H&E)染色对代表性小鼠的以下组织进行组织学评价：皮肤、小肠以及肾脏。根据不同器官系统中急性GVHD的公认公开标准，所评估的关键组织学参数对于每一种组织类型是不同的。对于皮肤，对基底空泡改变、皮肤海绵层水肿以及淋巴细胞卫星现象进行分级；对于小肠，对隐窝细胞凋亡、淋巴细胞炎症以及上皮内淋巴细胞增多症进行分级；并且对于肾脏，对间质性炎症、肾小管炎以及动脉改变进行分级。所有参数都用4级(无、轻度、中度以及重度)进行分级并且给予0-3的评分，从而得到27的最大指数(表7)。以盲法方式由单个观测人员对载片进行评分。
ELISA和Luminex测定
使用小鼠抗dsDNA抗体总Ig ELISA试剂盒(Alpha Diagnostic公司)测定Faslpr小鼠血浆中的抗dsDNA抗体浓度。从小鼠14周大开始每4周一次通过面颊取血收获150μl-200μl的小鼠外周血液直到26周大为止。将4,000倍稀释的Faslpr小鼠血浆样品在96孔板中孵育1小时。然后，添加抗小鼠Ig HRP缀合物并且孵育30分钟。添加TMB底物15分钟并且最终使用停止溶液终止反应。在每一个孵育步骤之间需要五个完全洗涤步骤。在Bio Rad微孔板光谱仪上在450nm对板进行读数。
使用luminex技术，可以在同一样品中同时检测多种分析物。使用Bio-plex Pro人类细胞因子17重试剂盒(伯乐公司)测量循环人源细胞因子/趋化因子。它包括分析中的G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A、MCP-1、MIP-1β以及TNF-α的分析物。遵循标准方案，在室温将16倍稀释的血浆样品与磁珠一起孵育2小时，与检测抗体一起孵育1小时并且最终与链霉亲和素-PE一起孵育10分钟。在每一个孵育步骤之间需要三个完全洗涤步骤。在Milliplex分析仪(密理博公司(Millipore))上使用Luminex xPONENT软件对板进行读数。
白蛋白和肌酸酐检测
通过测量尿白蛋白与肌酸酐的比率(ACR)的变化来评价Faslpr小鼠的肾功能损伤。从14周大开始每4周一次通过膀胱按摩收获20μl-50μl的尿液直到26周大为止。通过小鼠白蛋白ELISA试剂盒(艾博抗公司)检测白蛋白浓度。遵循标准方案，将100,000倍稀释的Faslpr小鼠尿液样品在一抗包被的96孔板中孵育2小时，与生物素化的抗体一起孵育1小时，与链霉亲和素-过氧化物酶一起孵育30分钟，与发色团一起孵育15分钟并且最终与停止溶液一起孵育。在每一个孵育步骤之间需要五次完全洗涤。在Bio Rad微孔板光谱仪上在450nm对板进行读数。
使用肌酸酐比色测定试剂盒(开曼公司)通过雅费氏反应检测肌酸酐水平。遵循标准方案，将20倍稀释的Faslpr小鼠尿液样品和碱性苦味酸盐溶液添加到96孔板中。将板在室温孵育10分钟并且在Bio Rad微孔板光谱仪上在490nm读数。
流式细胞术分析
使用CyAN(贝克曼库尔特公司)用Summit软件对从自尾静脉收获的NSG小鼠外周血液(PB)、BM以及脾脏中分离的细胞进行流式细胞术分析。对于细胞表面标志物，使用以下抗体：hCD45-PE-Cy7(H130)、hCD3-ECD(UCHT1)(贝克曼库尔特公司)、hCD4-PerCP-Cy5.5(SK3)、hCD8-APC(RPA-T8)、hCD56-FITC(NCAM16.2)、hCD25-PE-Cy7(M-A251)、hFoxP3-PE(259D/C7)、hIFN-γ-BV421(4S.B3)、hIL-17A-AF647(N49-653)、hCD68-BV421(Y1/82A)、hCD19-FITC(H1B19)、hCD34-BV421(581)；以及mCD45-AF700(30-F11)、mCD45-FITC(30F11)(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))、mCD11b-APC(M1/70)、Ly6G-PC7(1A8)。
对于细胞内染色，在37℃用50ng/ml的PMA(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和1μg/ml的离子霉素(西格玛-奥德里奇公司)将细胞刺激过夜(12小时-16小时)。在孵育后1小时添加3μg/ml的布雷菲德菌素A(brefeldin A)(西格玛-奥德里奇公司)。在2℃-8℃通过固定/透化溶液(美天旎生物技术公司)将激活的细胞进一步固定和透化45分钟。然后，将细胞用透化缓冲液洗涤两次并且在2℃-8℃在暗处用细胞内抗体染色30分钟。
对于从Faslpr小鼠脾脏、肠系膜淋巴结以及胸腺中分离的细胞，使用以下抗体：mCD45-PE(30F11)、mCD19-FITC(1D3)、mCD3-PC7(17A2)、mCD4-APC-CY7(GK1.5)、mCD8a-V500(53-6.7)、mCD11c-Percp-cy5.5(HL3)、mCD49b-APC(DX5)、mLy6G-PC-Cy7(1A8)、mCD11b-APC(M1/70)以及mCD1d-BB515(1B1)。除非另外说明，否则所有抗体都购自碧迪生物科技公司(BD Biosciences)。
统计分析
使用ANOVA来分析析因设计实验。使用student成对t检验进行显著性分析。p<0.05被认为具有统计显著性。借助于广义估计方程(GEE)模型来比较总体趋势差异。
MSC经由旁分泌因子调节同种异体免疫反应
来自24小时的纯BM-MSC培养物的条件培养基能够在体外GVHD模型MLR中将细胞介导的细胞毒性降低到83.9％±8.1％(图1)。当将BM-MSC与嵌套小室插入物中的ML共培养时，细胞毒性进一步降低；这表明BM-MSC分泌蛋白质组可能部分地受到ML调节。细胞毒性的降低程度受这两种细胞类型之间的物理距离的影响。它在0.9mm时降低到62.2％±3.2％并且在0.5mm时降低到47.5％±6.5％。当所述细胞处于物理直接接触时，发生最大程度的降低(27.9％±3.6％)。这些结果表明MSC的免疫抑制作用在性质上部分或完全是旁分泌并且与ML与MSC之间的间距呈负相关。
通过细胞因子抗体阵列阐明MSC分泌的旁分泌因子
使用细胞因子抗体阵列鉴定BM-MSC/ML共培养物和单一培养物中存在的因子(图2)。根据细胞因子表达水平有至少三倍变化的选择标准，鉴定出五种上调的蛋白质，即CCL20、CCL8、CXCL5、OPG和CXCL6，以及三种下调的蛋白质，即IL-1β、CCL1和CCL24(表2)。为了确定相关因子没有因任意三倍截止值而被遗漏，随机选择有2至3的倍数变化的2种因子(CCL7和M-CSF)并且添加到后续的验证实验中。
确定免疫抑制相关因子的最佳工作浓度
为了进一步研究以在10个候选者中鉴定出关键因子，必须确定每一种上调因子和针对下调因子的抗体的工作浓度。产生MLR中细胞毒性阻遏的剂量响应曲线并且选择达到一般最大阻遏的最低浓度作为工作浓度(图3)。据报道，PGE2和IL-10可有效调节CD4+辅助性T细胞、CD8+细胞毒性T细胞以及自然杀伤细胞的细胞增殖和细胞毒性；因此，包括它们作为对照分子。最佳体外工作浓度分别是：50ng/ml的CCL20、10ng/ml的CXCL6、50ng/ml的CCL7、10ng/ml的CCL8、10ng/ml的OPG、10ng/ml的IL-10、50ng/ml的CXCL5、2μM的PGE2以及2μg/ml的抗CCL1抗体、1μg/ml的抗IL-1β抗体、1μg/ml的抗M-CSF抗体、2μg/ml的抗CCL24抗体。
在这十二种因子中，抗CCL1抗体影响了最高水平的细胞毒性阻遏(42.7％±4.1％)。但是它仍比来自在BM-MSC与ML之间直接接触的情况下的MLR的22.7％±2.8％显著更高(p<0.001)。这表明抑制或促进来自列表的任何单一因子不能完全模拟MSC的免疫抑制作用。这意味着，虽然单一因子被证实是有效的，但是当比较所得的免疫抑制作用时，它们被认为不如组合有效。话虽如此，但是还应当注意的是，如本申请中先前所提到，待治疗的疾病的严重程度对所选择的治疗的功效有影响。因此，不受理论所束缚，认为MSC经由因子的组合调节免疫抑制，使用析因设计来鉴定和验证最佳组合。
通过FD确定免疫抑制相关因子的最佳组合
析因设计是用于确定多个变量对单个响应的影响的有效方法。它可以通过同时研究多个因子来减少实验次数。在此，使用212部分FD来确定所关注的12个因子的最佳组合和相对重要性(表3)。212部分FD的相对细胞介导的细胞毒性示于图4A中。最佳组合是C6，其包含七个因子：CCL20、CXCL6、OPG、IL-10和CXCL5蛋白以及抗CCL1抗体和抗CCL24抗体，其将相对细胞介导的细胞毒性降低到11.1％±5.8％。它甚至比全组对照(21.1％±6.9％)和直接接触的BM-MSC共培养物(20.7％±6.0％)更有效(p<0.05)。
根据方差分析，确定了这十二个因子在免疫抑制中的相对重要性。抗CCL24(F＝11.09)>IL-10(F＝4.38)>OPG(F＝2.92)>CXCL5(F＝2.62)>抗IL-1β(F＝2.52)>CXCL6(F＝2.14)>抗M-CSF(F＝2.09)>抗CCL1(F＝1.89)>CCL20(F＝0.48)>PGE2(F＝0.12)>CCL7(F＝0.10)>CCL8(F＝0.09)(p<0.05，F统计截止值＝10.10)。当F值大于10.10时，对免疫抑制有显著影响。因此，与其它因子相比，只有抗CCL24抗体显著影响细胞介导的细胞毒性。
此外，抗M-CSF(第7)和CCL7(第11)没有被包括在C21中并且具有低于10.10的截止值的F统计量。这表明候选因子的选择是足够严格的。
为了消除C6(212FD)中不必要的因子，对七个因子进行另一轮部分FD实验(27)(表4)。27部分FD的相对细胞介导的细胞毒性示于图4B中。最佳组合是C21，其由四个因子组成：CXCL5、OPG蛋白以及抗CCL1抗体、抗CCL24抗体。它可以将相对细胞介导的细胞毒性降低到16.1％±2.1％(n＝3)，这优于全组对照的45.8％±14.3％。
在完全FD中进一步分析这四个因子(表5)。相对细胞介导的细胞毒性示于图4C中。最佳组合是C32，其仅由两个因子组成：CXCL5和抗CCL24抗体。它可以将相对细胞介导的细胞毒性抑制到37.7％±6.2％，这与全组对照C38的44.7％±4.9％相当。因此，经由系列FD，最终确定包含CXCL5和抗CCL24抗体的双因子(2F)混合物。
安全施用剂量、对中性粒细胞和血红细胞(RBC)计数的副作用以及毒性测试
在小鼠中验证2F混合物的免疫抑制作用之前，需要确定每一种因子的安全剂量。
向8周至10周大的健康NSG小鼠施用CXCL5和抗CCL24抗体(表6)。监测存活率和体重变化，持续18天(图5A)。当用CXCL5和抗CCL24抗体处理小鼠时，体重稳定保持，这高于接受dPBS处理的小鼠。所有小鼠都存活直到实验结束(18天)。接受所述因子中的任一种注射的小鼠(在所有剂量下)在实验期间没有显示出异常的临床症状。总体而言，每周两次施用6μg/ml的抗CCL24和200ng/ml的CXCL5是良好耐受的并且被认为可安全用于后续的体内研究。总体而言，每周两次施用6μg/ml的抗CCL24和200ng/ml的CXCL5是良好耐受的并且被认为可安全用于后续的体内研究。
在雄性ICR小鼠中评价对中性粒细胞和RBC计数的副作用。施用CXCL5或抗CCL24抗体没有改变中性粒细胞和RBC计数，它仍将它们保持在正常范围内并且在接受单一因子和dPBS处理的小鼠之间没有显著性差异(图5B和图5C)。
还在雌性ICR小鼠中测试了这两种因子的毒性。施用这两种因子对小鼠肝脏和肾脏没有显示出任何毒性。在接受单一因子和dPBS处理的小鼠之间，肝脏中的ALT、AST表达水平和肾脏中的ACR没有显著性差异(图5D、图5E以及图5F)。
2F混合物处理在重度GVHD中表现出惊人的免疫抑制能力
为了验证2F混合物在免疫抑制中的功效，在GVHD发作之后在移植后(PT)第10天、第14天、第17天以及第21天向小鼠施用四次剂量。
在中度GVHD中，2F混合物将36天存活率从61.1％有中度症状提高到88.9％有轻度症状(dPBS：11/18只小鼠；2F：16/18只小鼠，(p<0.05))。这与BM-MSC(88.9％，16/18只小鼠)和CsA(83.3％，14/17只小鼠)相当，所述CsA是常规的临床免疫抑制剂(图6A和图6B、表7)。然而，在重度GVHD中，2F混合物将36天存活率从19.0％有重度症状提高到61.9％有轻度症状(dPBS：4/21只小鼠；2F：13/21只小鼠，(p<0.01))。这显著优于BM-MSC(8.3％，2/24只小鼠(p<0.001))和CsA(26.1％，6/23只小鼠(p<0.05))(图6C和图6D)。
2F混合物经由抑制多种效应细胞的增殖和分化来改善GVHD
在中度GVHD中，2F混合物处理减少了循环中的辅助性T细胞(特别是Th1细胞和Th17细胞)和NK细胞以及脾脏中的巨噬细胞的增殖和分化，但是没有减少CTL和B细胞以及增加调节性T细胞(Treg)(图7)。同时，它还减少了循环中的促炎性细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-17A、MIP-1β以及MCP-1分泌(图8)。这些2F引发的变化没有影响骨髓中CD34+人类造血干/祖细胞(HSC/HPC)的重建。
抗CCL24和CXCL5以协同方式影响免疫抑制
在中度GVHD中，抗CCL24抗体或CXCL5可以有效地模拟2F混合物的免疫抑制作用。它将小鼠36天存活率维持在78.3％(CXCL5：18/23只小鼠)和82.6％(抗CCL24：19/23只小鼠)有轻度症状，而2F混合物处理将存活率维持在81.0％(17/21只小鼠)(图9A和图9B)。然而，在重度GVHD中，单一因子丧失了它的免疫抑制能力。当用CXCL5或抗CCL24抗体处理小鼠时，存活率下降到26.1％(6/23只小鼠)和16.7％(3/18只小鼠)有中度症状(图9C和图9D)。结果显著低于接受2F混合物处理的小鼠(61.9％，13/21只小鼠)(p<0.05)。细胞群体测定证实单独的CXCL5或抗CCL24抗体对循环CTL、Th1细胞、脾巨噬细胞以及NK细胞产生次优的免疫抑制作用(图10A和图10B)。这表明这两种因子在重度GVHD中表现出协同效应。这与我们的体外观测结果一致，即MSC经由多种因子而非经由单一因子调节免疫反应。它也得到了蛋白质测定的支持，这是因为CXCL5仅在抑制促炎性细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-8以及MIP-1β方面与2F混合物相当；而抗CCL24抗体仅在抑制IFN-γ、IL-6以及MIP-1β方面是相当的(图11)。
2FC处理减轻了SLE症状并且延长了小鼠存活期
2FC处理减轻了SLE症状并且延长了小鼠存活期。当移植物排斥宿主时，发生GVHD，而自身免疫性疾病是由对正常身体部分的异常免疫应答引起的疾患。基本原理是关于GVHD中的同种免疫性和自身免疫性疾病中的自身免疫性。在一定程度上，它们共有相同的发病机制。由于在GVHD中显著的免疫抑制能力和发病机制相似性，因此我们意图验证2FC在自身免疫性疾病中的临床前功效。
在SLE模型中，Faslpr小鼠的处理后10周存活率从33.3％(dPBS：9/27只小鼠)显著提高到55.6％(2FC：10/18只小鼠，p<0.05)，这与BM-MSC处理相当(59.3％，16/27只小鼠)(图12A)。它优于单因子CXCL5(28.6％，4/14只小鼠)或抗CCL24抗体(10％，1/10只小鼠)处理(图12B，p<0.05)。该结果表明CXCL5与抗CCL24抗体协同发挥它的免疫抑制功能。此外，单次BM-MSC处理优于多次BM-MSC(每月一次)处理(39.1％，9/23只小鼠)，即使是没有实现显著性(图12C)。对于包括IgA、IgG以及IgM的自身抗体分泌，2FC处理降低了它的增加速率。然而，该现象在BM-MSC处理中没有被观测到(图12D)。当用2FC将小鼠处理3周时，淋巴组织增生减少，这是因为相对于它自身的体重，肠系膜淋巴结、脾脏以及胸腺的重量从8.4％减少到6.3％(p<0.05)。而当用BM-MSC处理小鼠时，该作用仅在一部分Faslpr小鼠中被观测到(图12E)。小鼠肾功能改善，这是因为2FC处理在10周处理期期间持续减慢ACR增加，而BM-MSC处理只能提供持续4周-5周的短期保护作用，然后丧失它的肾保护功能(图12F)。该现象与组织学观测结果一致(图12G)。大量淋巴细胞浸润在接受2FC处理的小鼠中显著减少，而在接受BM-MSC处理的一些小鼠中仅有所减少。通过2FC处理，肠系膜淋巴结(LN)、胸腺以及脾脏中效应细胞，(如树突状细胞(DC)、单核白细胞/巨噬细胞以及自然杀伤细胞(NK细胞))的增殖受到显著抑制(图12H和图12I)。除此之外，胸腺中的辅助性T细胞也受到显著抑制(图12J)。这些作用比使用BM-MSC处理所观测到的作用更强效。
表2：受调节的蛋白质的列表
结果被表示为平均值±S.E.，n＝3
表4：27部分FD中的实验条件
“1”表示所述物质不存在；“2”表示所述物质存在。
表5：24完全FD中的实验条件
“1”表示所述物质不存在；“2”表示所述物质存在。
表6：用于MTD研究的剂量
表7：NSG小鼠的组织学评分
总评分和严重程度：轻度：0-9；中度：10-18；重度：19-27。
Mod：中度；hpf：高倍视野。

Claims (17)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，
其中所述抗体靶向选自由以下各项组成的组的细胞因子中的一种或多种：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；
其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物如下表中所示：
。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL24抗体(C32a)。
4.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体以约0.05μg/ml至约5μg/ml的浓度存在。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述抗体以约1μg/ml或约2μg/ml的浓度存在。
6.如前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白以约0.5ng/ml至约75ng/ml的浓度存在。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白以约10ng/ml或50ng/ml的浓度存在。
8.一种治疗免疫病症的方法，所述方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抗体和/或至少一种间充质基质细胞衍生蛋白，
其中所述抗体靶向选自由以下各项组成的组的细胞因子中的一种或多种：巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、CCL-1(I-309)以及CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；
其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7(MCP-2)、CCL8(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CXCL5(ENA-78)、IL-10以及CXCL6(GCP-2)。
9.一种调节免疫系统的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求8中所定义的药物组合物。
10.如权利要求8至9中任一项所述的方法，其中所述药物组合物如下表中所示：
。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述药物组合物包含CXCL5和抗CCL24抗体(C32a)。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述免疫病症是同种免疫性疾病或自身免疫性疾病。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述同种免疫性疾病选自由以下各项组成的组：在同种异体造血细胞移植之后的移植物抗宿主病(GVHD)、由皮肤移植引起的同种免疫性疾病、由肾移植引起的同种免疫性疾病、由肝移植引起的同种免疫性疾病以及胎儿和新生儿的溶血性疾病。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下各项组成的组：系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、系统性硬化、炎症性肠病(IBD)以及克罗恩氏病。
15.如权利要求8至9中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在所述受试者中引起选自由以下各项组成的组的循环促炎性细胞因子中的一种或多种的浓度降低：IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-8、MIP-1β以及MCP-1。
16.如权利要求8至9中任一项所述的方法，其中所述药物组合物在受试者中引起至少一种间充质基质细胞衍生蛋白的浓度增加或降低，从而产生免疫抑制作用，其中所述间充质基质细胞衍生蛋白选自由以下各项组成的组：PGE2(前列腺素E2)、OPG、CCL7、CCL8、IL-10、CCL20、CXCL5、CXCL6、M-CSF、IL-1β、CCL-1以及CCL24。
17.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1至7中任一项中所限定的至少一种抗体和至少一种间充质基质细胞衍生蛋白。
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